Анализы воды на кишечную палочку

Исследованию подлежит вода:

1) централизованного водоснабжения;

2) из колодцев различного типа;

3) открытых водоемов (рек, озер, морей);

Примечание. Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором (гипосульфитом).

Отбор проб воды. Из открытых водоемов воду берут с помощью специальных бутылей или батометров, снабженных грузилами. Пробу воды рекомендуют брать на глубине 10-15 см от поверхности (так как поверхность подвергается воздействию атмосферных факторов) и на расстоянии 1,5 м от берега (вода у самого берега может быть загрязнена микрофлорой почвы).

Для отбора проб водопроводной воды используют стерильные флаконы вместимостью 500 мл, закрытые ватно-марлевыми пробками и покрытые бумажными колпачками.

Кран предварительно обжигают тампоном, смоченным спиртом, после чего воду спускают в течение 10-15 мин и набирают во флаконы. Заполненные флаконы закрывают стерильными пробками.

Примечание. Исследуют 333 мл воды (табл. 54).

Таблица 54. Эмпирическая таблица ГОСТ 16963-73

В распределительной сети водопровода отбор проб воды осуществляют в зависимости от количества населения, проживающего в зоне обслуживания.

Стандартные методы исследования регламентированы для воды центрального водоснабжения (ГОСТ 18963-73) и предусматривают:

1. Определение общего числа микроорганизмов (в 1 мл исследуемой воды должно быть не более 100).

2. Определение коли-индекса и коли-титра (коли-индекс 3, коли-титр 333 и выше; для Москвы и Ленинграда коли-индекс не более 2, а коли-титр более 500).

3. Исследование по эпидемиологическим показаниям на патогенную микрофлору (патогенных микроорганизмов не должно быть обнаружено).

Согласно ГОСТу 18963-73 общее число бактерий — это то количество микроорганизмов, которое содержится в 1 мл исследуемой воды, способных в течение суток при температуре 37° С образовывать колонии, видимые невооруженным глазом (или при увеличении с помощью лупы).

При исследовании водопроводной воды засевают 2 чашки. В одну из них вносят 1 мл неразведенной воды, в другую 1 мл воды, разведенной в 10 раз (т. е. 0,1 мл исходной пробы).

При исследовании более загрязненной воды засевают 1 мл воды, разведенной в 100 раз. Это соответствует 0,01 и 1 мл .воды, разведенной в 1000 раз (0,001 мл) и т. д. Для получения таких объемов готовят последовательно десятикратные разведения, по 1 мл каждого разведения вносят в чашку и заливают тонким слоем (12-15 мл) растопленного и остуженного до 45° С питательного агара. Для равномерного распределения исследуемой воды залитые агаром чашки перемешивают путем вращения их. После застывания агара посевы ставят в термостат и инкубируют при температуре 37° С 24 ч.

Чашки с посевами вынимают из термостата и подсчитывают число выросших колоний. Учитывают только те чашки, где число колоний находится в пределах 30-300. Если колоний немного, их подсчитывают невооруженным глазом или при помощи лупы.

Если колоний много, то подсчет можно вести с помощью специального прибора для счета микробных колоний (рис. 54).

Рис. 54. Прибор для счета колоний микроорганизмов. 1 — столик для чашки Петри; 2 — игла с пружинным устройством; 3 — показатель счетчика; 4 — тумблер для включения импульсного счетчика; 5 — тумблер для включения лампы освещения счетчика

Подсчитанное количество колоний умножают на разведение и узнают число микробов в 1 мл исследуемой воды.

Наличие БГКП (бактерий группы кишечной палочки) является показателем фекального загрязнения, интенсивность которого характеризуют:

Коли-индекс — количество кишечных палочек, обнаруженных в 1 л воды.

Коли-титр — наименьшее количество воды, в котором обнаруживают присутствие кишечной палочки * .

* ( Коли-титр и коли-индекс — это один показатель, различно выраженный.)

Для выявления в воде БГКП можно пользоваться двумя методами: титрационным (бродильным) и методом мембранных фильтров.

Для исследования воды используют среду накопления глюкозопептонную (ГПС) среду Эйкмана с индикатором и бродильными трубками. Среда готовится концентрированной (в 10 раз) и нормальной концентрации — для посева 1 мл воды.

Исследуемую воду засевают по 100 мл в 3 колбы, по 10 мл в 3 пробирки (с концентрированной средой) и по 1 мл в 3 пробирки (со средой нормальной концентрации) — всего 333 мл. Посевы инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.

Вынимают посевы из термостата и просматривают их.

При наличии помутнения в колбах или пробирках из них производят посев петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри. Посевы инкубируют в термостате при 37° С.

Вынимают чашки из термостата. Из подозрительных колоний делают мазки. При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазную активность. Положительная проба на оксидазу дает право дать отрицательный ответ.

Проба на оксидазу. 1-й способ: со среды Эндо снимают петлей 2-3 колонии каждого типа и наносят на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной диметилпарафенилендиамином. Положительная реакция характеризуется посинением штрихов, сделанных из колоний.

2-й способ: реактив можно нанести на изолированную колонию на среде Эндо (красная колония — синеет) (рис. 55).

Рис. 55. Определение коли-индекса воды титрационным методом

Отрицательная проба на оксидазу свидетельствует о наличии в воде БГКП. В этом случае вычисляют коли-индекс и коли-титр с помощью стандартных (эмпирических) таблиц ГОСТа 16963-73 (см. табл. 54).

Эти таблицы предусматривают любую возможную комбинацию объемов посева, из которых выделена кишечная палочка.

Для фильтрации воды можно использовать воронку Гольдмана вместимостью 700-800 мл.

В воронку смонтированного и простерилизованного фильтровального прибора Зейтца наливают отмеренный объем исследуемой воды. С помощью насоса создают вакуум в приемном сосуде (обычно воду фильтруют через фильтры № 2 и 3). По окончании фильтрации стерильным или обожженным в огне пинцетом снимают фильтр и накладывают его на среду Эндо в чашке Петри так, чтобы поверхность с осевшими на ней микробами была обращена вверх (на одну чашку можно помещать 3-4 мембранных фильтра).

Посевы инкубируют в термостате при температуре 37° С 18-24 ч.

Чашки с посевами (фильтрами) вынимают из термостата. Отсутствие подозрительных колоний дает право дать отрицательный ответ.

Учету подлежат все красные и розовые колонии с металлическим блеском или без него. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму (рис. 56).

Рис. 56. Определение коли-индекса воды методом мембранных фильтров

При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Положительная оксидазная проба дает право дать отрицательный ответ. При отрицательной оксидазной пробе производят посев на полужидкую среду с глюкозой и индикатором или на среду ГПС с бродильными трубками — для выявления ферментации углевода до кислоты и газа. При наличии кислоты и газа вычисляют коли-индекс. Например, на всех фильтрах, находящихся на среде Эндо, выросло 3 колонии, пропущено через фильтр было 300 мл воды.

Примечание. Титрационный метод более точный и может быть использован при наличии в воде примесей. Метод мембранных фильтров экономичнее и дает возможность дать ответ на 2-й день.

Для определения наличия в воде свежих фекальных кишечных палочек производят посев воды (3-х объемов) на лактозопептонную среду с борной кислотой. Инкубируют при 43° С 24 ч. Наличие кислоты и газа свидетельствует о свежем фекальном загрязнении.

По эпидемиологическим показаниям в воде определяют сальмонеллы, шигеллы, энтеровирусы.

Примечание. Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения питьевой воды являются энтерококки. При проведении бактериологического исследования определяют все группы энтерококков, хотя санитарное значение имеют преимущественно фекальные стрептококки, обнаружение которых является показателем свежего фекального загрязнения.

1. Какова основная задача санитарной микробиологии?

2. Что такое санитарно-показательные микроорганизмы?

3. Что такое коли-индекс и коли-титр?

4. Какие Вы знаете методы определения БГКП?

Определите общее число микробов в исследуемой пробе воды. Среда ГПС (Эйкмана).

ГПС (Эйкмана) концентрированная. В 1 л воды растворяют 100 г пептона, 50 г хлорида натрия. Нагревают смесь до кипения, фильтруют, прибавляют 100 г глюкозы, устанавливают рН 7,4-7,6 и разливают по 10 мл в колбы вместимостью 250 мл, по 1 мл в 3 пробирки (концентрированной среды) и по 1 мл в 3 пробирки со средой нормальной концентрации (во всех емкостях среду до нужной концентрации доводят стерильной водой).

Примечание. При исследовании особенно загрязненных вод делают большие разведения (например, 10 -6 , 10 -7 и т. д.).

источник

Цель работы: изучение методов оценки санитарнобактериологического состояния питьевой воды и воды из естественных водоемов.

Вода, используемая на предприятиях пищевой промышленности, должна отвечать требованиям, предъявляемым к питьевой воде действующими нормативными документами. Безопасность воды в эпидемиологическом отношении определяют по общему числу микроорганизмов и количеству бактерий группы кишечных палочек в ее определенном объеме.

Качество воды централизованных систем питьевого водоснабжения определяют в соответствии с санитарными правилами и нормами. Питьевая вода должна быть безопасна в эпидемиологическом и радиационном отношениях, безопасна по химическому составу и иметь благоприятные органолептические свойства (табл. 12.1).

Таблица 12.1. Безопасность питьевой воды в эпидемиологическом отношении (по микробиологическим и паразитологическим показателям) СанПиН 2.1.4.1074-01

Общее микробное число (ОМЧ)

Термотолерантные колиформные бактерии

Число бактерий в 100 см 3

Общие колиформные бактерии

Споры сульфитредуцирующих бактерий

* БОЕ — бляшкообразующие единицы.

12.1. Отбор проб и подготовка их к анализу

Воду для санитарно-бактериологического контроля отбирают в количестве 500 см 3 в бутылки, предварительно простерилизованные в бумажных пакетах, с ватно-марлевой пробкой, покрытой сверху бумажным колпачком.

Перед отбором пробы кран или край трубы обжигают зажженным ватным тампоном, пропитанным спиртом. Открывают кран и в течение 10-15 мин воду спускают, затем производят отбор пробы. Вода подлежит анализу не позже чем через 2 ч после отбора.

Пробы воды из открытых водоемов — колодцев, бассейнов, рек, озер — отбирают с помощью батометров, представляющих собой металлический каркас с массивным свинцовым дном — грузилом. В металлический каркас вставлена бутылка. Батометр погружают на заданную глубину и открывают бутылку, потягивая за веревку, привязанную к пробке. После наполнения бутылки батометр извлекают и закрывают ее стерильной пробкой.

Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором, так как под действием хлора микробы в воде погибают. В качестве дехлоратора используют серноватистый натрий из расчета 10 мг на 500 см исследуемой воды.

К отобранным пробам воды прилагают сопроводительный документ с указанием соответствующих данных. Доставку проб питьевой воды осуществляют в контейнерах-холодильниках при температуре от 4 до 10 °С.

12.2. Определение общего микробного числа воды

Общее микробное число (ОМЧ) — это количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, образующих колонии на мясопептонном агаре при посеве 1 см 3 воды с последующей инкубацией посевов при температуре 37±0,5 °С в течение 48 ч. ОМЧ должно быть не более 50 КОЕ/см 3 .

В зависимости от степени предполагаемого загрязнения производят посев не менее двух различных объемов воды, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках вырастало от 30 до 300 колоний. Водопроводную и артезианскую воду засевают в неразведенном виде по 1 см 3 . При бактериологическом исследовании загрязненных вод делают посевы разведенной воды. Разведения готовят так, как указано в разделе 8.3.

Из исследуемого образца и из пробирок с его разведениями в соответствии со степенью предполагаемого микробного загрязнения отбирают по 1 см 3 , вносят в стерильные чашки Петри и заливают 10-12 см расплавленного и остуженного до температуры 45 °С мясопептонного агара. Круговыми движениями руки, вращая чашки по горизонтальной поверхности стола, распределяют их содержимое равномерным слоем по всей площади дна. После застывания агара чашки с посевами помещают на 24 ч в термостат при температуре 37 °С. После инкубации подсчитывают число выросших колоний.

Определение микробного числа указанным методом позволяет выявить лишь мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы.

12.3. Определение содержания колиформных бактерий в воде

С эпидемиологической точки зрения особенно важным является обнаружение в воде патогенных микроорганизмов — возбудителей кишечных инфекций (брюшного тифа, дизентерии, холеры и др.) Однако в связи с большой трудностью обнаружения патогенных микроорганизмов при бактериологических анализах ограничиваются определением так называемых санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ). К санитарно-показательным относят микроорганизмы, постоянно находящиеся в естественных полостях человека или животных. Присутствие СПМ в различных объектах внешней среды является индикатором их загрязнения человеком. Чем больше СПМ во внешней среде, тем более вероятным становится присутствие специфических возбудителей инфекционных заболеваний.

В качестве СПМ наибольшее значение имеют бактерии группы кишечных палочек (БГКП). К группе кишечных палочек относят колиформные бактерии родов Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia.

При определении количества СПМ в воде используют следующие характеристики:

• коли-титр — наименьший объем воды, в котором обнаружена одна кишечная палочка. Для питьевой воды, прошедшей очистку, титр кишечной палочки должен быть не менее 300 см 3 ;

• коли-индекс — количество кишечных палочек в 1 дм 3 воды. Коли-индекс для питьевой воды должен быть не более 3.

Колиформные бактерии определяют в воде методом мембранных фильтров или бродильным методом.

Бродильный метод. Сущность бродильного метода заключается в посеве определенных объемов исследуемой воды, инкубации

посевов при температуре 37 °С в средах накопления с последующим высевом на среду Эндо, дифференциацией выросших колоний и определением наиболее вероятного числа БГКП в 1 дм 3 воды.

При исследовании воды централизованного водоснабжения исследуемый материал дважды засевают в три объема: 100, 10 и 1 см 3 . Для исследования речной, озерной, прудовой воды готовят десятикратные разведения 1:10, 1:100, 1:1000 и засевают еще 10 см 3 и 1 см 3 без разведения. Посев воды производят в бродильные сосуды (колбы, бутылки, пробирки с поплавками), заполненные глюкозопептонной средой Эйкмана. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 24 ч.

Обработка результатов анализа. По окончании инкубации посевы просматривают и делают следующие выводы:

а) при отсутствии газообразования и изменения цвета среды дают отрицательный ответ на наличие БГКП в исследуемом объеме воды, дающим право закончить исследование через 24 ч;

б) при образовании кислоты и газа производится высев материала из бродильных сосудов на среду Эндо. Высев делается бактериологической петлей густым штрихом для получения изолированных колоний. Чашки с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч. После инкубации посевы просматривают. Отсутствие на среде Эндо характерных для кишечных палочек колоний дает основание на выдачу отрицательного ответа и окончание исследования;

в) при обнаружении на среде Эндо лактозоположительных темно-красных колоний, с металлическим блеском или без него, необходимо установить принадлежность выросших микроорганизмов к семейству кишечных бактерий. С этой целью производится микроскопирование препарата из колоний и постановка оксидазного теста.

Оксидазный тест предложен для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonodaceae и других водных сапрофитов, которые, в отличие от кишечных бактерий, вырабатывают фермент оксидазу.

Для постановки оксидазного теста со среды Эндо снимают петлей по 2-3 колонии каждого типа. Микробную массу наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную специальным реактивом (30 г α-д-нафтола растворяют в 2,5 см 3 этанола, прибавляют 7,5 см 3 дистиллированной воды и 40 мг диметил-парафенилендиамина. Раствор готовят непосредственно перед определением).

При отрицательном результате оксидазного теста бумага при контакте с колонией цвета не меняет. Если же бумага синеет в течение 1 мин при контакте с колонией, то оксидазный тест считают положительным.

Наличие в препарате грамотрицательных неспорообразующих палочек, не обладающих оксидазной активностью, позволяет немедленно дать ответ о наличии в воде БГКП.

При обнаружении на среде Эндо розовых и бесцветных колоний ведут подсчет и пересевают 2-3 изолированные колонии каждого типа в глюкозо-пептонную среду Эйкмана. Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение 3-4 ч. При образовании кислоты (изменение цвета среды) и газа, накапливающегося в поплавке, результат считается положительным, при отсутствии кислото- и газообразования — отрицательным.

После проведения анализа записывают в лабораторный журнал окончательные результаты (положительные и отрицательные) по каждому засеянному объему и определяют коли-титр и коли-индекс.

Метод мембранных фильтров. Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема воды на мембранных фильтрах с последующим выращиванием их на среде Эндо при температуре 37 °С, дифференцированием выросших колоний и подсчетом количества БГКП в 1 см 3 воды.

Подготовка мембранных фильтров. Для фильтрования воды отбирают мембранные фильтры № 3, помещают их в подогретую до температуры 80 °С дистиллированную воду и ставят на небольшой огонь для кипячения. Кипячение проводят трижды по 10 мин. После первого и второго кипячения воду сливают, а после третьего фильтры оставляют в воде до употребления.

Подготовка фильтровального аппарата. Фильтровальный аппарат стерилизуют в автоклаве или протирают ватным тампоном, смоченным в спирте, и обжигают в целях стерилизации. На столик фильтровального аппарата стерильным пинцетом помещают мембранный фильтр. Во избежание повреждения фильтра под него подкладывают кружок стерильной фильтровальной бумаги. На фильтровальный столик с положенными на него фильтрами устанавливают и закрепляют верхнюю часть прибора — воронку (рис. 12.1).

Рис. 12.1. Определение количества микроорганизмов методом мембранных фильтров

Фильтрование воды и выращивание микроорганизмов. В воронку фильтровального аппарата стерильно наливают исследуемый объем воды и с помощью водоструйного насоса создают вакуум в приемном сосуде. При анализе питьевой воды, поступающей в водопроводную сеть, необходимо брать объем не менее 333 см 3 . По окончании фильтрования мембранный фильтр профламбированным пинцетом переносят на поверхность питательной среды Эндо в чашки Петри. В настоящее время выпускают фильтры, пропитанные соответствующими питательными средами. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 18-24 ч.

Обработка результатов анализа. По окончании инкубации посевы просматривают и делают следующие выводы:

а) отсутствие микробного роста на фильтрах или обнаружение на них колоний, не характерных для БГКП, позволяет закончить исследования на этом этапе анализа с выдачей отрицательного результата на присутствие БГКП в анализируемом объеме воды;

б) при обнаружении на фильтре колоний, характерных для БГКП, исследование продолжают. Из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Отсутствие в мазках мелких грамотрицательных неспороносных палочек является основанием для прекращения анализа с выдачей отрицательного результата на присутствие БГКП в исследуемом объеме воды;

в) при наличии в мазках грамотрицательных палочек, морфологически сходных с кишечными, ставится оксидазная проба. При обнаружении на мембранных фильтрах однотипных лактозоположительных колоний (темно-красных с металлическим блеском или без него), не вырабатывающих оксидазы, анализ воды на этом этапе заканчивают и подсчитывают число выросших на мембранном фильтре колоний кишечных палочек. Результат выражают в виде коли- индекса в пересчете на 1 дм 3 воды;

г) при обнаружении на мембранных фильтрах розовых и бесцветных колоний подсчитывают их число и пересевают 2-3 изолированные колонии каждого типа в глюкозо-пептонную среду Эйкмана. После инкубации в течение 3-4 ч при температуре 37 °С отмечают изменение цвета среды за счет образования кислоты и накопления газа в поплавке. В этом случае результат считается положительным. Если изменений в среде нет, то дают отрицательный результат на присутствие БГКП.

Пример определения колииндекса: профильтровано три объема воды по 100 см 3 . На первом и втором фильтрах выросло по три колонии, на третьем — девять колоний. Всего выросло пятнадцать колоний. Таким образом, колииндекс исследуемого образца воды равен: (1000 х 15):300 = 50. Колииндекс переводится в колититр следующим образом: 1000:50 = 20.

Контрольные вопросы

1. Какие Вы знаете показатели эпидемиологической безопасности питьевой воды?

2. Что такое общее микробное число, колититр и колииндекс?

3. Какие роды микроорганизмов входят в БГКП?

4. Какими методами определяют колиформные бактерии?

5. Каковы основные критерии, по которым устанавливают присутствие колиформных бактерий в питьевой воде?

6. С какой целью проводят тест на оксидазу?

источник

Цель занятия. Ознакомить студентовс микрофлорой воды, источниками ее загрязнения патогенной микрофлорой. Студенты должны овладеть различными методами бактериологического исследования воды: определения количества МАФАнМ, коли-титра и коли-индекса воды.

Материальное оснащение. Пробы речной воды и стерильные пробирки для взятия водопроводной воды; чашки Петри, расплавленный МПА в пробирках столбиком, стерильные пипетки на 1 мл, стерильный физраствор по 9 мл, спирт для факела, пинцет, вата.

Для демонстрации – прибор Зейтца, водоструйный вакуумный насос, кипяченые мембранные фильтры №3 в стакане с дистиллированной водой, среда Эндо в чашках Петри; глюкозо-пептонная среда (ГПС) с индикатором и поплавками, разлитая по колбам и пробиркам.

Для демонстрации – 3 колбы и 6 пробирок с ГПС с готовыми посевами воды для определения коли-титра воды методом бродильных проб. Только в первой колбе с посевом 100 мл исследуемой воды должно быть помутнение, изменение цвета индикатора (красный цвет индикатора меняется на желтый) и наличие пузырьков газа в поплавках. Агар Эндо в чашках Петри с 4 мембранными фильтрами после фильтрации воды и наличием красных колоний на поверхности белого фильтра.

Вода является естественной средой обитания многих микроорганизмов. Особую опасность для здоровья человека и животных представляют патогенные бактерии, которые могут быть в воде.

Источниками загрязнения воды патогенными микроорганизмами являются выделения больных животных и людей, трупы животных, сточные воды, особенно предприятий, перерабатывающих сырье животного происхождения и др. Длительность выживания патогенных микробов в воде зависит от их вида, условий окружающей среды и может составлять от нескольких часов до нескольких лет. Так, возбудитель сибирской язвы может сохраняться в воде до 3 лет, возбудитель туберкулеза до 1 года, а бруцеллы — до 100 дней. Имеется группа болезней, для которых характерен водный путь распространения (паратифы, лептоспирозы).

Таким образом, вода может стать источником распространения инфекционных болезней и возникновения эпидемий и эпизоотий.

Для санитарно-микробиологической оценки воды проводят следующие исследования:

1.Определение количества МАФАнМ в 1 мл воды;

2. Определение коли-титра (КТ) и коли-индекса (КИ);

3. Обнаружение в воде патогенных микроорганизмов по эпидпоказаниям.

При санитарно-микробиологических исследованиях пробы воды забирают в объеме не менее 0,5 л. Из открытых водоемов пробу воды отбирают батометром. Батометр – стерильная емкость с пробкой, в металлическом каркасе и свинцовым грузилом. На нужной глубине пробку открывают, подтягивая ее за веревочку. Воду из рек, озер отбирают с глубины 10-15 см от поверхности, а при небольшой глубине на расстоянии 10-15 см от дна.

Для отбора проб водопроводной воды из крана используют стерильные колбы на 0,5 л с ватной пробкой. Кран предварительно стерилизуют обжиганием, горящим спиртовым тампоном, затем в течение 10 мин спускают воду. Пробы воды исследуют тотчас же или не позднее 2 ч с момента взятия. Если это невозможно, то хранят не более 6 ч при 1-5 0 С.

Определение количества МАФАнМ в водопроводной воде. В чашку Петри с соблюдением правил асептики вносят 1 мл водопроводной воды без разведения, заливают 15 мл расплавленного и охлажденного до 45 0 С МПА. Посевы инкубируют в термостате при 30 0 С 72 ч. Количество бактерий в 1мл воды определяют по количеству выросших колоний.

Для определения количества МАФАнМ в воде открытых водоемов исследуемую воду в зависимости от предполагаемого загрязнения предварительно разводят стерильной водой от 1:10 -1 до 1:10 -4 , из двух последних разведений по 1 мл вносят в стерильные чашки (не менее 2 чашек на каждое разведение) и заливают 15 мл расплавленного и охлажденного до 46 0 С МПА. Посевы помещают в термостат при 30 0 С на 72 ч, подсчитывают количество колоний, умножают на степень разведения и определяют количество бактерий в 1 мл воды открытых водоемов.

Определение коли-титра (КТ) и коли-индекса (КИ) воды.

Коли-титром называют наименьший объем воды, в котором обнаружена одна кишечная палочка.

Коли-индекс показывает число кишечных палочек в 1000 мл воды.

Кишечная палочка является постоянным обитателем кишечника человека и животных, следовательно, ее присутствие в питьевой воде является индикатором фекального загрязнения. Чем выше концентрация бактерий группы кишечной палочки, тем вероятнее присутствие таких бактерий, как сальмонеллы, возбудители дизентерии и холеры. Показатели КТ и КИ указывают на санитарное состояние воды, ее пригодность в качестве питьевой. КТ и КИ определяют двумя методами:

2.Метод мембранных фильтров.

Этот метод основан на ферментативной активности бактерий группы кишечной палочки (БГКП), которая выражается в способности расщеплять при помощи ферментов лактозу или глюкозу до кислоты и газа. Исследуемая вода засевается в различных объемах в среду накопления — глюкозо-пептонную среду (ГПС) с индикатором и поплавками. При наличии кишечной палочки появляется помутнение, меняется цвет индикатора, и появляются пузырьки газа в поплавках. Из забродивших посевов делают пересев на дифференциально-диагностические среды.

Методика: засевают водопроводную воду в объеме 333 мл, разделенной на 9 порций (три объема по 100 мл, три – по 10 мл и три — по 1 мл). При этом вода в объемах по 100 мл засевается в три колбы с 10 мл концентрированной ГПС, 10 мл — в три пробирки с 1 мл концентрированной среды, а 1 мл воды вносят – в пробирки с 10 мл среды с нормальной концентрацией. Посевы инкубируют в термостате 24 часа при 37 0 С. При отсутствии БГКП в исследуемой воде, изменение цвета индикатора и образование газа не происходит

Рост кишечной палочки сопровождается помутнением среды, изменением цвета индикатора (красный цвет переходит в желтый) и появлением газа в поплавках. Из колбы и пробирок с признаками роста проводят пересев на агар Эндо штрихом по секторам. Посевы инкубируют при 37 0 С 24 часа. При отсутствии роста на агаре Эндо или при наличии колоний, не характерных для БГКП, дается отрицательный ответ.

Из колоний, характерных для бактерий БГКП (ярко-красных с металлическим оттенком, розовых), готовят мазки, их окрашивают по Граму, микроскопируют. Дополнительно изучают культуру по оксидазному тесту. Для этого на фильтровальную бумагу пропитанную раствором альфа-нафтола-диэтил-n-фенилендиамина наносят штрихом 2-3 колонии снятые с агара Эндо.

Для кишечной палочки характерно: наличие грамотрицательных палочек в мазке и отсутствие изменений в окраске фильтровальной бумаги на оксидазный тест. Следовательно, наличие грамотрицательных палочек и отрицательный оксидазный тест подтверждает наличие кишечной палочки в исследуемой воде.

Для подтверждения свежего фекального загрязнения исследуемой воды посевы выращивают при 43 0 С для дифференциации от кишечных палочек хладнокровных, не растущих при такой высокой температуре. Требования к санитарному состоянию воды приведены в таблице 3.

Микробиологические нормативы санитарного состояния воды

Объект контроля	МАФАнМ, КОЕ, не более	Коли- титр, не менее	Коли- индекс, не более	Периодичность контроля
Вода водопров-я	100 в 1 мл	1 раз в месяц
Вода открытых водоемов	1000 в мл	—

Из таблицы видно, что для питьевой воды установлены следующие нормативы бактериологических показателей:

— общее микробное число – не более 100 в 1 мл;

— коли-индекс не должен превышать 3 кишечных палочек в 1000 мл.

Вода открытых водоемов считается доброкачественной, если общее микробное число – не более 1000 в 1 мл, коли-титр – не менее 111, коли-индекс – не более 9.

Метод мембранных фильтров

Для исследования воды применяется мембранный фильтр №3 из нитроцеллюлозы, с диаметром пор 0,7 мкм, который задерживает на своей поверхности БГКП. Перед использованием мембранные фильтры кипятят 10-15 мин в дистиллированной воде. Фильтр, с соблюдением правил асептики, матовой поверхностью вверх накладывают на сетку фильтрационного прибора Зейтца. В воронку прибора наливают исследуемую воду и в приемной колбе Бунзена создают вакуум при помощи водоструйного насоса. Исследуемую воду фильтруют через мембранный фильтр, а бактерии, находившиеся в ней, остаются на поверхности. После фильтрации мембранный фильтр матовой стороной вверх переносят на поверхность агара Эндо в чашках Петри. Чашки ставят в термостат при 37 0 С на 18-24 ч.

Через поры мембранного фильтра происходит диффузия питательных компонентов среды Эндо, вследствие этого оставшиеся на поверхности БГКП размножаются на поверхности фильтра и образуют типичные колонии — красные с металлическим оттенком. По числу выросших колоний определяют количество кишечных палочек в 1000 мл воды и тем самым устанавливают коли-индекс.

Водопроводную воду исследуют в объеме 333 мл, которую дробно и последовательно пропускают через четыре фильтра в объемах — 200, 100, 30 и 3 мл воды.

Наличие в воде патогенных бактерий устанавливают путем посева на дифференциально-диагностические и селективные питательные среды с последующей их идентификацией методами, принятыми в микробиологии.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Для студентов недели бывают четные, нечетные и зачетные. 9360 — | 7421 — или читать все.

источник

Кишечная палочка считается одним из самых распространенных бактерий. Область ее обитания – кишечник человека и некоторых животных. Считается, что после попадания в окружающую среду (бактерия выводится из организма вместе с каловыми массами), она может в течение длительного периода сохранять свою жизнеспособность даже под воздействием внешних факторов.

Бактерии рода кишечной палочки могут быть как безопасными для организма человека, так и патогенными, способными привести к развитию многочисленных заболеваний. Для этих патологий характерны свои ярко выраженные симптомы. При их появлении человеку необходимо срочно обратиться в медицинское учреждение, иначе недуг, вызванный возбудителем, может привести к развитию серьезных осложнений, жизненно-опасных для человека.

Кишечная палочка представляет собой бактерию рода Escherichia из семейства Enterobacteriaceae. Данный микроорганизм активно размножается в человеческом организме, в частности, в различных отделах кишечника. Попадая вместе с каловыми массами в окружающую среду, бактерия может на протяжении нескольких месяцев сохранять свою жизнеспособность. Активная микрофлора содержится в воде, почве, кале, а также в некоторых продуктах питания (особенно, в молоке, мясе).

Кишечную палочку принято разделять на непатогенную и патогенную. Представители нормальном микрофлоры, обитающие в кишечнике, оказывают ряд полезных для организма действий. Прежде всего, данные микроорганизмы нормализуют кишечную микрофлору, подавляя рост вредных бактерий. Кроме того, они синтезируют витамин К, необходимый для поддержания нормального процесса свертываемости крови и выполнения других важных функций в организме.

Некоторые из представителей данного вида способны выделять ферменты, расщепляющие лактозу. Однако, безопасными данные бактерии остаются лишь тогда, когда они находятся в полости кишечника. При проникновении в другие органы, непатогенная микрофлора может спровоцировать развитие воспаления.

Бактерии группы кишечной палочки могут быть безопасными и патогенными. В свою очередь, непатогенная микрофлора может быть лактозопозитивными (в большинстве случаев), то есть способными расщеплять лактозу, либо лактозонегативными, не имеющими такой способности.

Патогенные микроорганизмы принято разделять на следующие виды:

Энтерогеморрагическая кишечная палочка – группа бактерий, приводящая к развитию диареи и кишечных кровотечений;
Энтеропатогенная – бактерии данного вида негативно воздействуют на эпителиальный слой кишечника, разрушая его ворсинки. Результатом такого воздействия становится продолжительное нарушение стула и метаболических процессов;
Энтероинвазивная – микроорганизмы внедряются в ткани кишечных стенок, что приводит к развитию выраженного очага воспаления.

Необходимо понимать, какие причины способствуют проникновению патогенной кишечной палочки в организм и ее активизации (размножению) в кишечнике. К числу таких причин относят:

Нарушение микрофлоры кишечника, в частности, массовая гибель полезных микроорганизмов в результате заболеваний ЖКТ;
Патологии поджелудочной железы;
Воспаления в кишечнике;
Длительное употребление антибактериальных препаратов (несмотря на то, что данная лекарственная группа предназначена именно для борьбы с патогенной микрофлорой, бесконтрольный прием антибиотиков может привести к обратной ситуации: бактерии приспосабливаются к действию лекарства и теряют чувствительность к его активным веществам. В результате этого происходит усиленный рост численности вредной микрофлоры);
Несоблюдение правил личной гигиены;
Употребление зараженных продуктов питания и воды.

Кишечная палочка, относящаяся к патогенному виду, попадает в организм человека различными способами:

Через продукты питания. Например, если человек употребляет сырое молоко, мясо, не прошедшее должную термическую обработку, сырое молоко;
Контактно – бытовой способ, например, при контакте с больным человеком (через немытые руки), при использовании зараженных вещей и предметов обихода;
Родовой способ, когда бактерия передается новорожденному от больной матери;
Половой. Во время полового акта кишечная палочка также может проникнуть в организм, хотя происходит это довольно редко.

При активном развитии патогенной кишечной палочки в организме человека, появляются специфические симптомы, такие как потеря аппетита, диарея, тошнота и рвота, болезненные ощущения в различных отделах живота. При этом меняется структура, цвет и запах каловых масс. Кал становится более жидким, водянистым, может приобретать слизистую консистенцию. Цвет его становится более светлым, возможно появление в каловых массах кровянистых прожилок. Кал приобретает более резкий и неприятный запах.

У больного наблюдается обильное отхождение рвотных масс. При этом рвота приобретает специфический зеленый оттенок и резкий запах. У пациента отмечается выраженная слабость, отсутствие работоспособности, головокружения. В тяжелых случаях развивается нарушение жидкостного баланса организма со всеми характерными для данного состояния симптомами (бледность, сухость эпидермиса и наружных слизистых оболочек, слабость, постоянная жажда).

Клинические признаки развития опасных заболеваний, возбудителем которых является кишечная палочка патогенного типа, зависят от давности проникновения болезнетворной микрофлоры в кишечник, а также от количества бактерий и продуктов жизнедеятельности, выделяемых ими. В соответствии с этими параметрами, выделяют 3 стадии развития патологического процесса. Для каждой из них характерен свой набор признаков.

Этап	Проявления и симптомы
Начальная стадия патологии, когда в организме человека наблюдается незначительное количество патогенной микрофлоры.	Симптомы и проявления патологического процесса носят умеренный характер. Больного беспокоит периодически появляющаяся слабость, умеренная диарея (или запор), чувство распирания в животе, возникающее через некоторое время после приема пищи.
Этап развития, во время которого увеличивается рост численности патогенных микроорганизмов, полезные бактерии, напротив, начинают отмирать.	Возникает выраженное расстройство желудка, сопровождающееся обильным выделением каловых масс, которые теперь имеют водянистую или слизистую консистенцию. Во время акта дефекации пациент испытывает тянущую боль внизу живота. Усиливается рвота. Пациент теряет аппетит, его самочувствие ухудшается в значительной степени. Имеет место повышение температуры, озноб.
Завершающая стадия.	На данном этапе симптомы имеют наиболее выраженную характеристику. В тяжелых случаях развивается кровавая диарея, обезвоживание, рвотные массы приобретают зеленый цвет. В этом случае пациенту необходима экстренная госпитализация.

При нормальном течении патологического процесса происходит постепенное самоочищение кишечника, после чего наступает улучшение.

Патогенная форма кишечной палочки может приводить к развитию весьма неприятных последствий, заболеваний, значительно нарушающих самочувствие человека, несущих реальную угрозу для его здоровья. У женщин кишечная палочка, проникающая в область уретры или влагалища, может привести к таким патологиям как кольпит, уретрит. Частыми заболеваниями, возникающими у представительниц прекрасного пола, являются цистит, эндометрит, пиелонефрит, аднексит. Также возникают различные неприятные симптомы, такие как сильный и болезненный зуд во влагалище, творожистые, резко пахнущие выделения из половых органов.

У мужчин развиваются такие патологии как обильная диарея, токсическое поражение организма, сопровождающееся рвотой, ухудшением общего состояния. Возможно развитие следующих заболеваний: простатит, орхит, эпидидимит, пиелонефрит, воспаление тканей мочевого пузыря и нарушение его функциональности (анурия, энурез).

Особенно опасной патогенная кишечная палочка считается для детей. У зараженного ребенка наблюдается значительная гипертермия, сильный и зловонный понос, потеря аппетита и массы тела, признаки обезвоживания, истощения. Нарушается работа иммунной системы. Появляются области нагноения, которые могут привести к токсическому заражению крови и внутренних органов.

Для того, чтобы назначить подходящее лечение, необходимо поставить точный диагноз. Для этого используют различные диагностические мероприятия. Прежде всего, врач проводит беседу с пациентом, устанавливает совокупность симптомов и жалоб, беспокоящих больного, длительность и обстоятельства их появления. После этого больному назначают различные лабораторные и инструментальные обследования.

Инструментальные способы диагностики необходимы для того, чтобы выявить поражения кишечника и других органов (почки, желчный пузырь). Использование таких методов необходимо не всегда, а только в том случае, если имеются симптомы соответствующих заболеваний.

Для выявления патологического процесса большое значение имеют именно лабораторные методы исследования, позволяющие не только выявить нарушения микрофлоры, но и определить конкретного возбудителя инфекции, оценить степень его чувствительности к тем или иным антибактериальным веществам. Это необходимо для выбора подходящей схемы лечения.

Анализ крови на кишечную палочку. В норме данный микроорганизм в крови не содержится. Если же бактерию обнаруживают, это говорит о том, что здоровье и жизнь человека находятся в опасности, ведь проникновение возбудителя в кровоток может спровоцировать развитие сепсиса (заражения крови) – жизненно-опасного состояния, способного привести к летальному исходу.
Исследование мочи. Обнаружение возбудителя в моче говорит о заражении органов мочевыделительной системы и необходимости срочной антибактериальной терапии. О стадии развития заражения судят по количеству бактерий, имеющимся признакам;
Мазок из влагалища. В норме кишечная палочка в мазке отсутствует. Если же она обнаружена, это свидетельствует о заражении органов репродуктивной системы;
Исследование кала. При развитии кишечной палочки данные микроорганизмы в большом количестве присутствуют в каловых массах (в норме содержание этих микроорганизмов допускается, но в значительно меньшем количестве). После того, как возбудитель обнаружен, выполняется процедура бактериального посева. То есть бактерию помещают в особую среду, после чего оценивают дальнейшее ее развитие и размножение. Это позволяет определить тип микроорганизма, его чувствительность к различным видам антибиотиков.

Лечение патологий, вызванных кишечной палочкой, включает в себя следующие моменты:

Медикаментозная терапия и прием витаминов для восстановления иммунитета;
Использование средств – пробиотиков для нормализации кишечной микрофлоры и устранения дисбактериоза;
Соблюдение особого режима питания.

Медикаментозное лечение предполагает использование лекарственных средств различных групп. Это, прежде всего антибиотики, препараты для устранения воспалений в мочевыводящих органах, органах половой системы, средства, предотвращающие развитие обезвоживания, препараты, восстанавливающие здоровую микрофлору в кишечнике, витаминные препараты для укрепления иммунной системы.

Диета предполагает употребление большого количества кисломолочных продуктов, обогащенных полезными бактериями, овощей и фруктов, нормализующих процесс пищеварения, травяных отваров, обладающих противовоспалительным действием. Запрещено употребление блюд, тяжелых для переваривания и продвижения по пищеварительному тракту. Это жирные и жареные блюда, острые, соленые, сладкие продукты, газированная вода, полуфабрикаты, консервы и колбасные изделия, а также же продукты, вызывающие чувство дискомфорта у конкретного человека.

источник

Вода является неотъемлемой составляющей всех живых систем. В среднем, человек потребляет 2,5 литра воды в день. Наряду с полезным кальцием, магнием и калием вода несет в себе и вредные для здоровья человека элементы, такие как нитраты, нитриты, кадмий и тому подобное. Характеристики употребляемой нами жидкости определяют качество и продолжительность жизни. Согласно докладу Всемирной организации здравоохранения (WHO, 2007), около 1,1 миллиарда человек не имеют доступа к безопасным источникам водоснабжения, а около 2 миллиона человек ежегодно умирают от заболеваний, передающихся через питьевую воду. Тошнота и диарея – не самое опасное, что вызывают микроорганизмы. Бактерии и вирусы в прямом смысле могут отравлять нашу жизнь, вызывая болезни с летальным исходом (например, Clostridium botulinum – возбудитель ботулизма) или опосредовано приводя к смертельным случаям (Helicobacter pylori – возможная причина рака ЖКТ). В Российской Федерации состояние воды регламентируются несколькими нормативами в зависимости от предназначения (смотреть таблицу).

Требования к микробиологическим показателям качества воды в Российской Федерации в зависимости от хозяйственной деятельности человека

Показатель	Природная вода 1	Вода бассейнов 2	Нецентр. водоснаб. 3	Центр. водоснаб. 4	Бутилированная вода 5
Общая микробная численность (ОМЧ), КОЕ / 1 мл	–	–	не более 100	не более 50	не более 20
Общие колиформные бактерии (ОКБ), КОЕ / 100 мл	не более 1000 (питьевая вода) не более 500 (рекреационное назначение)	не более 1	отсутствие в 100 мл	отсутствие в 100 мл	отсутствие в 300 мл
Термо-толерантные колиформные бактерии (ТКБ), КОЕ / 100 мл	не более 100	отсутствие в 100 мл	отсутствие в 100 мл	отсутствие в 100 мл	отсутствие в 300 мл
Колифаги, БОЕ / 100 мл	не более 10	отсутствие в 100 мл	отсутствие в 100 мл	отсутствие в 100 мл	отсутствие в 1000 мл
Споры сульфит-редукторов	–	–	–	отсутствие в 20 мл	отсутствие в 20 мл
Возбудители кишечных инфекций	отсутствие в 1000 мл	отсутствие в 1000 мл	отсутствие в 1000 мл	отсутствие в 1000 мл	отсутствие в 1000 мл
Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa)	–	отсутствие в 100 мл	–	–	отсутствие в 1000 мл
Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus)	–	отсутствие в 100 мл	–	–	–

СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод»
СанПиН 2.1.2.1188-03 «Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества»
СанПиН 2.1.4.1175-02 «Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников»
СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества»
СанПиН 2.1.4.1116-02 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества»

Оценка качества по микробиологическим показателям сводится к определению в объекте доли микроорганизмов, связанных с человеком и его продуктами жизнедеятельности.

Прежде всего, определим единицы измерения количества микробов. КОЕ/мл (колониеобразующие единицы) – количество жизнеспособных микробных клеток в миллилитре. Если производится оценка вирусных частиц в среде, то указывается БОЕ/мл (бляшкообразующие единицы) – количество вирусных частиц в миллилитре.

Выявляет бактерии, потенциально способные причинить вред здоровью. Этот показатель достаточно информативен, так как высокая ОМЧ является индикатором загрязнения органическими соединениями (например, содержащихся в фекалиях) и различными формами азота. С другой стороны, в ОМЧ входят как опасные бактерии (например, высокопатогенный штамм кишечной палочки Escherіchіa colі), так и практически безвредные и повсеместно встречаемые сенные палочки (Bacillus subtillis).

Группу ОКБ формируют бактерии семейства Enterobacteriacea (Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella). Многие представители этой группы относятся к нормальной микрофлоре желудка, поэтому превышение ОКБ может говорить о возможном фекальном загрязнении, связанном с деятельностью человека. Однако в данной группе могут встречаться и свободноживущие микробы, которые не представляют опасности для здоровья.

ТКБ – более достоверный индикатор загрязнения продуктами жизнедеятельности. Этот показатель свидетельствует о свежем фекальном загрязнении. В большинстве случаев в этой группе обнаруживается кишечная палочка Escherіchіa colі.

Колифаги являются вирусами палочки Escherichia coli и рассматриваются эпидемиологами как более чувствительный метод определения загрязнения жидкости микроорганизмами группы кишечной палочки. Вирусные частицы более устойчивы к окружающей среде, чем бактерии, в которых они обитают, поэтому этот показатель качества служит достоверной меткой давнего фекального загрязнения. Содержание колифагов свидетельствует о наличии опасных для человека энтеровирусов в воде.

Рекомендуется проводить исследование этой характеристики в случае, если ранее источник не был проверен, а также для оценки эффективности методов дезинфекции источников и систем подачи-распределения воды.

Спорообразующие клостридии (Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani) являются дополнительным микробиологическим показателем фекального загрязнения. Клостридии встречаются в кишечнике, однако при попадании в организм в большом количестве могут вызывать пищевые отравления и смертельные заболевания, в том числе, ботулизм. В отличие от относительно неустойчивых ОКБ и ТКБ, споры клостридий могут сохраняться долгое время, поэтому этот микробиологический показатель, как и колифаги, свидетельствует о наличии давнего загрязнения. Относительно высокая устойчивость позволяет использовать споры в качестве индикатора эффективности проведения водоподготовки (хлорирования, озонирования и т.п.).

Определение этого микробиологического показателя качества воды рекомендуется проводить при наличии посторонних запахов и образовании чёрного налёта на трубах, а также для оценки эффективности методов дезинфекции источников и систем подачи-распределения жидкости.

Pseudomonas aeruginosa – распространённый организм, который встречается практически во всех средах, в т. ч. входит в состав микрофлоры кожи. Однако при снижении иммунитета человека и высоком содержании в воде синегнойная палочка может вызывать серьёзные заболевания, поражая лёгкие и почки и приводя к сепсису. Присутствие Pseudomonas aeruginosa в бассейне или ванне является основанием для полной замены содержимого резервуара. Особенность синегнойной палочки – её чрезвычайная устойчивость к нагреванию, дезинфицирующим средствам и антибиотикам.

Staphylococcus aureus – тесно связанная с человеком бактерия, которая в основном образует колонии на коже, половых органах, респираторном и желудочно-кишечном трактах. Как и синегнойная палочка, золотистый стафилококк встречается у здоровых людей, однако может вызвать развитие болезни при ослаблении иммунитета.

В действующих нормативных документах не прописаны конкретные возбудители кишечных инфекций. В эту группу входят микроорганизмы, заражение которыми происходит через жидкие среды (Escherichia, Shigella, Vibrio, Salmonella). Процесс определения этого параметра трудоёмок и требует специальной квалификации микробиолога.

Развитие и удешевление технологий и новых методов приводит, с одной стороны, к расширению контролируемых параметров, с другой, к выбору более конкретных микроорганизмов-показателей. Например, руководство ВОЗ рекомендует использовать в качестве индикатора фекального загрязнения наличие кишечной палочки (Escherіchіa colі), а не ОКБ и ТКБ. В странах ЕС помимо палочки определяют наличие энтерококков – специфичной группы микроорганизмов обитателей кишечника человека. Ниже приведены группы микроорганизмов, которые имеют индикаторное значение при оценке микробиологического качества воды.

Enterococcus spp. – широкая группа микроорганизмов, проживающая в кишечнике человека. Наряду с золотистым стафилококком энтерококки являются причиной внутрибольничных инфекций, вызывают у человека (менингит, эндокардит). Ввиду более высокой устойчивости этих микроорганизмов к засолению и температуре, по сравнению с ТКБ, энтерококки – более надежный индикатор фекального загрязнения морей и солёных озёр. Согласно нормативу ЕС, эта группа не должна обнаруживаться в 250 мл. Согласно законодательству США, при превышении содержания Enterococcus spp. 35 КОЕ / 100 мл вводится запрет на купание людей.

К условно-патогенным дрожжам и микромицетам (плесени) относят большую неоднородную группу грибных организмов. В неё входят Candida albicans и Cryptococcus neoformans, которые вызывают оппортунистические заболевания, в т. ч. грибковые заболевания кожи и молочницу. Другие организмы-микромицеты (Cladosporium cladosporioides, Aspergillus niger) усиливают аллергические реакции, а иногда вызывают их. Особенно опасны плесневые грибы (Penicillium spp., Aspergillus spp., Fusariam spp., Alternaria spp. and Claviceps spp), образующие канцерогенные микотоксины (патулин, афлотоксин). Исследователи из Европейского союза пришли к выводу, что водопроводная вода не является распространителем микотоксинов, однако в стоячих источниках (например, накопительных резервуарах) могут создаться условия для благоприятного развития грибов. В некоторых странах ЕС содержание грибов строго регламентируется, например, в Швеции в питьевой воде их не может быть более 100 КОЕ / 100 мл.

Микроорганизмы, содержащие зелёный пигмент хлорофилл – обитатели богатых питательными элементами стоячих водоемов. Сами микроорганизмы не заражают человека, но синтезируют и выделяют в среду цианотоксины, вызывающие поражение внутренних органов млекопитающих: гепатотоксины (Microcystis, Anabaena, Oscillatoria, Nodularia, Nostoc, Cylindrospermopsis и Umezakia), нейротоксины (Aphanizomenon и Oscilatoria), почечные токсины (Cylindroapermopsis raciborski).

Таким образом, микробиологические показатели качества воды отражают несколько важных показателей:

Общее загрязнение микроорганизмами источника воды (ОМЧ).
Наличие фекального загрязнения и продуктов жизнедеятельности (ОКБ, ТКБ, колифаги, сульфитредукторы, энтерококки).
Возможное наличие энтеровирусов (колифаги).
Наличие потенциально опасных микроорганизмов (золотистый стафилококк, синегнойная палочка, условно-патогенные дрожжи, энтерококки, сульфитредукторы).
Наличие потенциальных продуцентов микотоксинов и цианотоксинов (грибы и цианобактерии).
Наличие патогенных микроорганизмов (Shigella, Vibrio, Salmonella).

источник

УТВЕРЖДАЮ
Заместитель Министра
здравоохранения СССР
Главный государственный
санитарный врач СССР
П.Н.БУРГАСОВ
5 марта 1974 г. N 1150-74

В подготовке инструктивно-методических указаний принимали участие:

Институт общей и коммунальной гигиены им.А.Н.Сысина АМН СССР, Институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР, Московский научно-исследовательский институт гигиены им.Ф.Ф.Эрисмана МЗ РСФСР, Центральный институт усовершенствования врачей, Центральный институт эпидемиологии МЗ СССР, Московский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова, Московская городская санитарно-эпидемиологическая станция.

Современный уровень коммунального благоустройства большинства городов гарантирует эпидемическую безопасность водопроводной воды. Это в значительной степени способствовало снижению общей заболеваемости в стране кишечными инфекциями. Наряду с этим до настоящего времени вода в распространении некоторых кишечных заболеваний, в частности, брюшного тифа, холеры и других является одним из ведущих путей. В последние годы все большее место в инфекционной патологии человека занимают вирусные инфекции, для которых также возможен водный путь распространения (полиомиелит, ЕСНО, Коксаки, эпидемический гепатит).

Передача кишечных инфекций с водой может быть обусловлена недостаточной очисткой или обеззараживанием питьевой воды на некоторых водопроводных станциях, а также широким неорганизованным использованием для хозяйственно-питьевых и других бытовых целей воды открытых водоемов, загрязняемых сточными водами, в особенности сточными водами инфекционных больниц.

В связи с широким развитием большой химии в стране наблюдается значительный рост объема промышленных сточных вод, что приводит к загрязнению воды открытых водоемов и снижению процессов самоочищения в них. Снижение активности антагонистического биоценоза воды и большое распространение антибиотикоустойчивых форм патогенных бактерий семейства кишечных приводит к более длительной циркуляции возбудителей инфекций в воде.

Увеличение степени микробного загрязнения водоемов, являющихся источниками централизованного или неорганизованного питьевого, хозяйственно-бытового водоснабжения, создает потенциальную опасность более широкого распространения кишечных инфекций.

Для своевременного проведения противоэпидемических мероприятий, а также для разработки и выполнения санитарно-гигиенических рекомендаций по неспецифической профилактике кишечных инфекций бактериальной и вирусной природы, передаваемых с водой, возрастает роль и значение микробиологического контроля за качеством воды: питьевой, воды открытых водоемов и сточных вод. С этой целью кроме учета общепринятых бактериологических показателей (общее количество, титр кишечной палочки) в ряде случаев возникает необходимость непосредственного обнаружения в воде возбудителей кишечных инфекций.

Исследование воды на наличие патогенных микроорганизмов рекомендуется проводить:

1. Питьевой воды:

— по эпидемическим показаниям;

— при обнаружении титра кишечной палочки ниже стандарта.

2. Воды открытых водоемов:

— по эпидемическим показаниям;

— при выборе источника централизованного водоснабжения;

— при выборе места для строительства санаториев, домов отдыха, пионерских лагерей, детских оздоровительных учреждений, городских пляжей на берегу рек, озер, прудов.

3. Сточной воды:

— при оценке эффективности работы очистных сооружений городской канализации;

— при оценке эффективности обеззараживания выделений больных в инфекционных больницах;

— при проведении широких обследований сточных вод для обнаружения источников инфекции среди населения канализованного микрорайона города, рабочего поселка и т.п.

При исследовании относительно чистой в микробном отношении питьевой водопроводной воды на наличие патогенных микроорганизмов необходимо концентрировать искомую микрофлору, содержащуюся в ничтожно малом количестве в воде. Обнаружение возбудителей кишечных инфекций в воде открытых водоемов и сточных водах на фоне преобладающей массы сапрофитной микрофлоры наиболее эффективно при концентрировании искомых бактерий в средах накопления, которые угнетают рост сопутствующей микрофлоры. Следовательно, при проведении анализа воды, имеющей различную степень общего микробного загрязнения, используют определенные методы выделения патогенной микрофлоры.

Выделенные из воды в естественных условиях возбудители бактериальных кишечных инфекций могут иметь отклонение от типичных по разным признакам: морфологическим, биохимическим и серологическим, могут обладать пониженной вирулентностью, но способны восстанавливать типичные свойства данного вида бактерий. При оценке качества исследуемой воды необходимо учитывать и атипичные формы патогенных бактерий, представляющие потенциальную эпидемическую опасность.

1. Пробы воды для исследования на присутствие патогенных бактерий семейства кишечных отбирают специально инструктированные лабораторные работники или санитарные врачи и их помощники.

2. Частота отбора проб устанавливается в зависимости от объема конкретно решаемых задач текущего санитарного надзора.

При отборе проб воды по эпидпоказаниям место и время отбора проб, а также кратность бактериологических исследований определяется эпидобстановкой.

3. Пробы воды отбирают в количестве 1-3-х литров, но не менее 500 мл, в стерильные флаконы с притертыми пробками или в бутылки.

Стерилизацию флаконов и бутылок производят сухим жаром в течение 1 часа при 160-170°C. При этом флаконы закрывают притертыми пробками с бумажной прокладкой. Горлышко флаконов поверх притертых пробок закрывают бумажными колпачками и обвязывают шпагатом. Бутылки закрывают ватными пробками и бумажными колпачками и также обвязывают шпагатом.

4. Если отбираемая проба воды содержит или может содержать следы остаточного хлора или хлорамина, то для нейтрализации этих веществ перед отбором пробы во флаконы емкостью 1 литр добавляют 4 мл 1,5% стерильного раствора тиосульфата (Na S O 5H O) (гипосульфит натрия).

5. При отборе проб непосредственно из реки, озера, водохранилища нежелательно отбирать пробу слишком близко к берегу или в отдалении от места водозабора.

Выбор точек для отбора проб производят исходя из местных условий и задач. При отборе проб воды из реки следует предусмотреть, как минимум, две точки: в месте застоя и в месте наиболее быстрого течения. Для отбора глубинных проб необходимы специальные устройства, например, батометры. Удобное приспособление для выемки проб — раскладной шест. Чаще отбор проб из реки, озер, водохранилищ производят путем погружения флакона или бутылки в воду горлышком вниз, при этом флакон или бутыль придерживают за дно. Затем бутыль переворачивают так, чтобы горлышко было направлено несколько вверх, устанавливая горлышко бутылки против течения. Если отбор проб нельзя произвести таким способом, то ко дну бутылки прикрепляют груз, что обеспечивает ее погружение в воду.

Все манипуляции по отбору проб производят осторожно, чтобы не нарушать целостность грунта у берега.

Если из водоисточника отбирается одновременно несколько проб, то в первую очередь необходимо отобрать пробу для бактериологического исследования.

6. При отборе проб сточной жидкости как на различных этапах ее очистки, так и после полного обеззараживания используют металлические черпаки на деревянных или из другого материала ручках либо бутылки, укрепленные винтовым зажимом на металлическом или деревянном стержне.

Целесообразно привлекать для отбора проб сточной жидкости специальных выемщиков из штата лабораторий очистных сооружений.

Владея определенными техническими навыками, выемщики обеспечат быструю и правильную выемку проб.

При выемке проб сточной жидкости должна соблюдаться самая тщательная чистота рук выемщика и всего инвентаря.

Выемщику необходимо иметь мыло, полотенце, денатурированный спирт для обработки рук и поверхности бутылок с отобранными пробами воды.

7. Пробы воды доставляют в лабораторию не позднее 5 часов от момента взятия пробы. При более длительных сроках транспортировки это обстоятельство отмечают в протоколе анализа.

Температура проб воды во время транспортировки должна поддерживаться на уровне возможно близком к исходному. Ватные пробки бутылок необходимо предохранять от смачивания.

Если нет возможности в день отбора пробы начать исследование, то применяют консерванты.

8. В сопроводительный документ и соответственно в лабораторный журнал заносятся следующие данные:

1. Наименование пробы воды.

2. Место нахождения объекта, из которого взята проба.

3. Кем взята проба воды (фамилия, должность).

4. По чьему заданию и с какой целью производится исследование.

5. Дата и час выемки, а также дата и час доставки пробы в лабораторию.

Питьевую воду отбирают в количестве 1-3 литров.

Воду открытых водоемов — в количестве 1 литра.

Сточную жидкость — в количестве 300-500 мл.

Посев воды в среды накопления

Используют не менее двух сред накопления: селенитовую, Кауфмана, магниевую или среду с охмеленным суслом.

Исследуемую воду засевают в первые три среды накопления двойной концентрации, в последнюю: на 100 мл среды — 400 мл воды. Питьевую воду и воду открытых водоемов засевают во флаконы емкостью 500 мл: — 200 мл исследуемой воды в равное количество среды накопления удвоенной концентрации.

Сточную воду засевают 100 мл в равное количество среды накопления удвоенной концентрации, 10 мл сточной жидкости засевают в 100 мл среды обычной концентрации, 1 мл сточной жидкости — в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при 37°C 18-20 часов.

На следующий день из сред накопления производят высев на 2-3 чашки с висмут-сульфит агаром. Чашки с посевами инкубируют при 37°C 18-20 часов.

На среде висмут-сульфит агаре колонии сальмонелл круглые черные с сероватым металлическим ободком вокруг них, зеленые с темным центром и без него, вызывающие потемнение среды под колонией. С каждой чашки снимают по 4-5 типичных для сальмонелл колоний на среду Ресселя.

При отсутствии роста через 24 часа чашки с посевами оставляют в термостате еще на 24 часа и через 48 часов просматривают их снова. Дальнейшее исследование проводится по общепринятой методике исследования на сальмонеллы до определения серотипа.

К роду сальмонелл относят культуры грамотрицательных подвижных палочек, которые:

1. Сбраживают глюкозу и маннит с образованием или без образования газа.

2. Не ферментируют лактозу, сахарозу и не расщепляют мочевину.

4. Обладают четкой серологической характеристикой, определяемой с помощью адсорбированных монорецепторных O- и H-сальмонеллезных агглютинирующих сывороток.

При выделении подобных культур дается положительный ответ.

Для выделения шигелл из воды используется среда накопления с охмеленным суслом. На 100 мл среды (см. пропись в Приложении) берут 400 мл исследуемой воды. Посев подращивают при температуре 37°C в течение 18-20 часов, после чего делают посев с помощью бактериальной петли на плотные элективные питательные среды: среду Левина или среду Плоскирева. Учитывая, что в настоящее время среди шигелл преобладают антибиотикоустойчивые штаммы, рекомендуется для посева шигелл среда Левина с антибиотиком (см. пропись в Приложении). Для высева из среды накопления рекомендуется брать не менее 5 чашек с плотной питательной средой на одну пробу воды. Это повышает возможность выделения шигелл из воды.

Через сутки инкубации при 37°C чашки просматривают и отбирают для дальнейшего исследования все подозрительные колонии: мелкие, прозрачные, бесцветные, круглые или с неровными краями. Отобранные колонии засевают на дифференциальную среду («скошенный столбик» двухсахарного агара с мочевиной). Через сутки инкубации при 37°C отбирают культуры грамотрицательных палочек, которые ферментируют глюкозу, не ферментируют лактозу, не расщепляют мочевину. Затем производится серологическое определение культур до вида, типа, подтипа по общепринятой схеме.

Исследуемую воду фильтруют через мембранные фильтры N 3 в объеме не менее 500 мл (количество фильтров зависит от скорости фильтрации воды). После фильтрации мембранные фильтры укладывают на поверхность питательной среды Эндо, предварительно залитой в чашки Петри (поверхность фильтра, на которой осели бактерии, остается верхней). Посев подращивают три температуре 37°C 18-24 часа.

После учета выросших на мембранных фильтрах колоний кишечных палочек и определения коли-титра производится вторичный посев: мембранные фильтры, на которых имелся рост мелких единичных бесцветных колоний, а также и те, на которых нет видимого бактериального роста, помещают в среды накопления, например, среду с охмеленным суслом или хлормагниевую среду (перед посевом фильтра приготовленную среду с охмеленным суслом разводят стерильной водопроводной водой 1:4). Объем среды обогащения — 50 мл.

Посев помещают в термостат на 18-24 часа при температуре 37°C, после чего производят высевы на плотные дифференциально-диагностические среды: висмут-сульфитный агар, среду Левина с антибиотиком, среду Плоскирева.

Дальнейшее выделение и идентификация бактерий производится по общепринятой методике.

При исследовании воды на наличие патогенных энтеробактерий часто выделяются атипичные формы, которые могут иметь некоторые отклонения в биохимической и серологической активности, однако, сохраняющие вирулентность, т.е. представляющие потенциальную эпидемическую опасность.

Большое количество экспериментальных исследований и изучение атипичных штаммов, выделенных из загрязненных открытых водоемов в естественных условиях, из сточных вод, позволило установить определенные критерии для оценки этих штаммов. Основным доказательством принадлежности атипичного штамма к патогенным бактериям семейства кишечных является способность реверсировать в исходную типичную форму. Восстановление происходит довольно быстро, после 3-4 пересевов на плотные и жидкие питательные среды (желчный бульон, мясо-пептонный агар, двухсахарные дифференциальные среды и др.). Практически это происходит уже в процессе выделения чистой культуры, определения биохимической активности и серологических свойств изучаемого штамма.

При выделении культур, отклоняющихся от типичных, могут быть отмечены разновидности, имеющие типичные биохимические свойства, которые не имеют некоторых антигенов, например, брюшнотифозные палочки могут утрачивать Vi- и H-антигены, или при типичных серологических свойствах давать нехарактерные для данного вида бактерий биохимические реакции. Для дальнейшего исследования необходимо убедиться, что мы имеем дело с чистой культурой, отбирать нежные, мелкие, прозрачные колонии, не разлагающие мочевину, не пептонизирующие и не свертывающие молоко.

Для сальмонелл одним из основных показателей принадлежности к данному роду бактерий является способность лизироваться O-сальмонеллезным фагом. Наиболее частым затруднением в определении вида культуры, подозрительной на принадлежность к шигеллам, является отсутствие агглютинабельности. Такие культуры чаще всего относятся к непатогенным бактериям рода эшерихии — алкалесценс диспар и другим эшерихиям, которые или совсем не разлагают лактозу, или разлагают ее через несколько суток. Чтобы исключить принадлежность изучаемой культуры к кишечным сапрофитам, необходимо более широкое изучение биохимических, серологических свойств выделенных штаммов, а самое главное — способность сохранять вирулентность.

Вирулентность шигелл определяют по кератоконъюнктивальной пробе у морских свинок или кроликов. Вирулентность сальмонелл определяют путем внутрибрюшинного заражения белых мышей, положительным считается результат при значении LD , не превышающим 400-500 млн микробных клеток.

Для тех и других бактерий может быть применен метод определения цитопатического действия на клетки культуры ткани, широко используемый в вирусологии (см. Приложение).

Для обнаружения в воде холерных вибрионов отбирают следующие объемы воды:

а) из источника водоснабжения (места водозабора) — не менее 1 литра;

б) водопроводной воды — не менее 1 литра;

в) сточной воды — не менее 1 литра.

Отбор проб и транспортировка. Пробы воды берут в стерильные бутыли на 1 литр или по 0,5 литра с непромокаемыми пробками. Бутыли с пробами этикетируют и плотно укладывают в металлическую тару (бикс, ведро, кастрюлю и др.) и перевозят на специальном транспорте с сопровождающим. К таре с пробами прилагают сопроводительный документ, в котором указывают количество направленных проб, место и время взятия проб.

От момента взятия пробы до начала исследования должно пройти не более 3-х часов. При плановом обследовании исследование проб воды, доставленных в конце дня, можно проводить на следующий день.

Общие принципы исследования воды:

А. Непосредственный посев на среду накопления.

Б. Посев после концентрации на фильтрах.

А. Непосредственный посев на среду накопления.

После определения pH и в случае необходимости подщелачивания 10% раствором едкого натра до pH 8,0 воду разливают в 2 колбы и к каждой из них добавляют основной раствор пептона в пропорции, необходимой для получения 1% пептонной воды. Посев инкубируют при 37°C 5-6 часов. Если проведение высевов через 6 часов невозможно, к первичным посевам добавляют теллурит калия до окончательного разведения 1:100000 — 1:200000. Инкубируют при 37°C 18 часов. При плановых исследованиях проб, доставленных в конце дня, можно после установления щелочной реакции и добавления основного раствора пептона до 1% концентрации пробы сохранять до утра при комнатной температуре (не выше 18-20°C). В начале следующего дня засевают 2-3 мл поверхностного слоя в 100 мл 1% пептонной воды (1-я среда накопления). Инкубация при 37°C 5-6 часов. Разрешается также при плановом обследовании высев 2 среды накопления на агаровые чашки производить через 12-16 часов.

Б. Посев после концентрации на фильтрах.

Воду фильтруют через мембранные фильтры N 2 или асбестовые фильтры. Фильтры с осадком засевают в среду накопления и на агаровые чашки.

Изучение роста на 1-й среде накопления (на жидких средах холерный вибрион дает гомогенное помутнение и пленку). Пересев с 1-й среды накопления на 2-ю среду накопления и на плотные среды.

А. Изучение роста на 2-й среде накопления. Пересев со 2-й среды накопления на плотные среды.

Б. Изучение роста на плотных средах.

Отбор подозрительных колоний и отсев на полиуглеводную среду (Ресселя, сахарозо-лактозная, Олькеницкого и др.). Изучение наиболее подозрительных колоний (микроскопия мазков, подвижность, ориентировочная реакция агглютинации), пересев на косой агар для выделения чистой культуры и ее идентификации. Идентификацию также можно проводить с молодой бульонной 3-4-часовой культурой.

Последующие исследования проводят по общепринятой методике, определяя серологические, биохимические свойства и лизабельность фагами.

ТЕСТЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ V. CHOLERAE

1. Морфология микробной клетки и тинкториальные

Вибрион подвижный (1 жгутик)

Растет на щелочной среде, колонии гладкие, прозрачные

3. Ферментация углеводородов по Хейбергу

4. Агглютинабельность холерной сывороткой

Агглютинация не менее чем до 1/2 титра

5. Чувствительность к диагностическим бактериофагам «С»

6. Чувствительность к полимиксину (50 ед. в 1 мл среды)

7. Реакция гемагглютинации куриных эритроцитов

8. Реакция Фогес-Проскауэра

9. Гемолиз бараньих эритроцитов

Лабораторная работа по выделению и дифференциации палочек сибирской язвы из любого исследуемого материала должна проводиться в условиях, предупреждающих возможность инфицирования персонала и обсеменения возбудителями объектов внешней среды, в строгом соответствии с «Инструкцией по режиму работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителем чумы, холеры, сапа, миелоидоза, натуральной оспы, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза», утвержденной Министерством здравоохранения СССР 21 июня 1967 г.

Для обнаружения возбудителя сибирской язвы на объектах внешней среды, в частности, в воде, применяют сигнальные и заключительные методы исследования.

К физическим методам концентрирования относятся центрифугирование, фильтрование через мембранные фильтры. Центрифугирование проводят в течение 15 мин при 2000-3000 об./мин. При фильтровании используют мембранные фильтры N 3.

С целью биологического концентрирования используют подращивание B. anthracis на питательных средах и введение их лабораторным животным.

Воду для исследования берут в количестве 1 литра, половину ее (500 мл) равными порциями (пропускают через 4 мембранных фильтра N 3 без предварительного прогревания. Методы обработки мембранных фильтров даны в Приложении.

Для люминесцентно-серологического выявления вегетативных клеток после подращивания два фильтра засевают на чашки с 0,7% МПА путем накладывания мембранного фильтра на питательную среду вверх поверхностью, через которую фильтровали исследуемый материал. С двух мембранных фильтров делают смыв в стерильных чашках Петри, нанося на их поверхность 1 мл физиологического раствора. Смыв используют для посева на среду ГКИ (см. Приложение), введения белым мышам и выявления спор люминесцентно-серологическим методом.

Вторую порцию воды прогревают при 65-70°C 30 минут, затем фильтруют и с ней проводят все манипуляции, описанные ниже.

Сигнальные методы исследования

В качестве сигнальных (экстренных) методов бактериологического исследования направленного материала используются люминесцентно-серологический метод, метод выявления капсулообразования in vitro и метод выявления капсулообразования in vivo.

Эти методы позволяют судить о наличии в исследуемом материале B. anthracis лишь ориентировочно (сигнально) и требуют обязательного дальнейшего исследования с выделением чистой культуры и изучением ее свойств, т.е. проведения окончательной дифференциации палочки сибирской язвы.

Метод выявления капсулообразования in vitro

Для изучения капсулообразования in vitro делают посевы нескольких капель исходной испытуемой взвеси в среду Государственного контрольного института медицинских биологических препаратов им.Тарасевича (ГКИ) и ставят в термостат при 37°C.

Через 30-120 минут начинается капсулообразование in vitro. Следует считать, что через 16-18 часов все или абсолютное большинство B. anthracis, если таковые находятся в исследуемом материале, образуют на среде ГКИ капсулу.

Для наблюдения за капсулообразованием мазки из культур со среды ГКИ после подсыхания и фиксации в течение 15 минут метанолом окрашивают 5-10 минут синькой Леффлера и просматривают в микроскопе (х900). Микробы окрашиваются в синий цвет, а капсула — в розовый.

В случае обнаружения капсульных клеток в препаратах со среды ГКИ дается положительный сигнальный ответ, а полученная культура подлежит дальнейшему исследованию для выделения из нее чистой культуры и изучения ее свойств.

Метод выявления капсулообразования in vivo (ускоренная биологическая проба)

Исходный материал вводят по 0,5 мл внутрибрюшинно 6 белым мышам.

После введения исследуемого материала животным одну пару мышей оставляют под наблюдением на 10 суток как при классической биологической пробе. Остальных мышей забивают (по 2 на срок) через 1 и 2 часа. Забитых мышей вскрывают. Из перитонеального экссудата и крови сердца делают мазки, из селезенки, почек, легких, печени делают мазки-отпечатки, нефиксированные мазки окрашивают по Ребигеру, а фиксированные — лефферовской синькой и микроскопируют на предмет выявления капсульных палочек сибирской язвы.

Обнаружение в мазках типичных капсульных палочек позволяет лаборатории дать положительный сигнальный ответ и продолжить анализ для выделения из органов животных культур и дальнейшего их изучения (см. раздел «Идентификация палочки сибирской язвы в лаборатории»). Если в мазках из экссудата органов забитых мышей не обнаруживаются капсульные палочки, то продолжают наблюдение за контрольной парой. При отсутствии необходимого для данного метода количества мышей заражают только по одной белой мыши на срок.

Люминесцентно-серологический метод может быть использован как для обнаружения спор сибиреязвенного микроба непосредственно в исследуемом материале, так и вегетативных бескапсульных клеток:

а) для выявления спор B. anthracis из исследуемого материала делают мазок на предметном стекле, ближе к краю стекла. Мазок подсушивают и фиксируют в течение 10-15 минут погружением в метанол, налитый в стеклянные стаканчики высотой 5-6 см. После высыхания препараты окрашивают люминесцирующей споровой сибиреязвенной сывороткой;

б) для выявления вегетативных бескапсульных клеток B. anthracis в исходном материале или после подращивания делают препараты способом, описанным в пункте «а».

Препараты окрашивают люминесцирующей адсорбированной сибиреязвенной сывороткой.

Сухую люминесцирующую сыворотку растворяют в указанном на этикетке ампулы объеме дистиллированной воды. Разведенную сыворотку хранят в пробирке с резиновой пробкой или в запаянной ампуле при 4°C.

Перед использованием каждой серии конъюгата рекомендуется опытным путем проверить рабочее разведение люминесцирующей сыворотки, указанное на этикетке ампулы. С этой целью микроскопируют мазки из вакционных сибиреязвенных штаммов, окрашенные в течение 10-15 минут конъюгатом, взятым в разных разведениях (обязательно на 1-2 разведения выше и ниже рабочего разведения, указанного на этикетке).

То максимальное разведение, которое обеспечивает яркое (на ++++ и +++) иммунофлуоресцентное окрашивание микробных клеток, называют красящим титром. В качестве рабочего разведения принимают удвоенный красящий титр. Необходимость опытного определения рабочего разведения обусловлена тем, что оно зависит не только от качества люминесцирующего конъюгата, но и от освещения препарата в люминесцентном микроскопе. Поэтому при работе с различными аппаратами для люминесцентной микроскопии (МЛ-1, МЛ-2, МЛД-1 и т.д.) рабочее разведение люминесцирующей сыворотки может отличаться от указанного в паспорте.

Непосредственно перед окраской препарата люминесцирующую сыворотку разводят забуферным 0,15 М раствором NaCl (pH=7,2-7,4) до рабочего разведения в необходимом для работы объеме. Разведенную до рабочего разведения сыворотку хранить не следует. Забуферный 0,15 М NaCl (pH=7,2-7,4) готовят следующим образом: к 1000 мл 0,15 М NaCl добавляют 10 мл фосфатного буфера, составленного из 90 мл 0,15 М раствора Na HPO (1 г 620 мг на 100 мл дистиллированной воды) и из 10 мл 0,15 М раствора KH PO (2 г 230 мг на 100 мл дистиллированной воды) и проверяют pH.

Фиксированные препараты помещают во влажную камеру (чашки Петри), кюветы, эксикаторы с каплями 0,15 М NaCl или увлажненной фильтровальной бумагой и наносят на них пастеровской пипеткой каплю люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении. Окраску производят в течение времени, указанного в этикетке, при комнатной температуре. Затем мазки два раза тщательно промывают раствором 0,15 М NaCl по 10 минут в стеклянных стаканчиках или под текущей струей из пластмассового баллона и подсушивают на воздухе.

Перед просмотром на препараты наносят каплю раствора, содержащего 1 часть 0,15 М NaCl (pH=7,2-7,4) и 9 частей глицерина и накрывают покровным стеклом. Препараты можно просматривать и без покровных стекол. Мазки микроскопируют в падающем свете люминесцентного микроскопа с системой светофильтров под иммерсионным объективом. При работе с иммерсионным объективом необходимо пользоваться нефлуоресцирующим иммерсионным маслом.

Для получения наиболее яркого свечения бактерий следует тщательно центрировать осветительную систему микроскопов и подбирать соответствующие светофильтры.

Целесообразно сочетать просмотр препаратов одного и того же поля зрения одновременно в люминесцентном микроскопе (освещение сверху) и в фазово-контрастном устройстве (освещение снизу) для определения наличия в препарате клеток бактерий, не окрашенных примененной люминесцирующей сывороткой.

Наблюдение проводят при увеличениях 5×90, 7×90, 10×90. Споры и бактерии, окрашенные люминесцирующей сывороткой, дают яркое свечение периферии клетки, имеющей характерную для исследуемого вида морфологию. Такое свечение называется специфическим в отличие от неспецифического, характеризующегося равномерным свечением всего тела клетки (следует иметь в виду, что в препаратах из органов животных и культуры тканей обычная морфология клеток микроорганизмов может быть изменена).

Для оценки интенсивности свечения используется четырехкрестовая система:

++++ — очень яркая флуоресценция по периферии микробной клетки, четко контрастируемая с темным телом клетки;

+++ — яркая флуоресценция периферии клетки;

++ или + — слабое свечение периферии клетки, не контрастируемое с телом клетки.

Положительным результатом считается люминесценция клеток, оцениваемая на ++++ и +++ при наличии 2-5 специфически светящихся клеток в каждом поле зрения.

в) Если в препаратах, при обработке их люминесцирующими сибиреязвенными сыворотками, обнаружатся ярко светящиеся по периферии микробные клетки (на ++++ и +++), что характерно для спор или вегетативных клеток anthracis, это говорит о подозрениях на наличие в исследуемой пробе B. anthracis и может рассматриваться как ориентировочный сигнальный ответ. Такая проба подлежит дальнейшему исследованию.

Идентификация палочки сибирской язвы в лаборатории

Подозрительные колонии, выделенные на питательных средах, дифференцируют как сибиреязвенные по следующим опорным признакам: специфическая патогенность, капсулообразование, тест жемчужного ожерелья; лизабильность бактериофагом; люминесцентно-серологический метод; и по дополнительным признакам: лецитиназная активность; неподвижность; отсутствие гемолиза.

Специфическая патогенность — определяется проведением биологической пробы на белых мышах и степенью вирулентности выделенных культур.

Биологическая проба на белых мышах: 2-3 белым мышам весом не более 18-20 г вводят внутрибрюшинно или подкожно исследуемую пробу в объеме 0,2 мл. Наблюдение за животными ведут до их гибели. Из селезенки и печени погибших животных делают посевы и тонкие мазки, которые после фиксации окрашивают синькой Леффлера или люминесцирующими капсульными сыворотками. Нахождение в мазках капсульных клеток позволяет сделать заключение о специфической патогенности возбудителя, обнаруженного в исследуемой пробе.

Определение вирулентности выделенных культур. Для этой цели необходимо приготовить споровую культуру на среде из казеинового перевара. Культуру, подлежащую исследованию, засевают на эту среду и на четвертые сутки инкубирования в термостате при 37°C получают в посеве до 95-100% спор. Процесс спорообразования контролируют просмотром мазков, неокрашенных — в фазовом контрасте или окрашенных по Циль-Нильсену. Затем споровая культура смывается с агара и заключается в 50%-ный глицерин или лиофилизируется.

Вирулентность определяется так: берут кроликов весом 2-2,5 кг, вводят им подкожно в область живота в объеме 1 мл три дозы споровой культуры — 100, 1000 и 10000 спор. Предварительно споровая культура разводится 0,15 М NaCl до стандарта мутности ГКИ N 10, который соответствует примерно 100 мл сибиреязвенных спор. Из последующих разведений получают необходимые дозы. Каждая доза вводится 2 кроликам. Всего для определения вирулентности одной культуры требуется 6 кроликов.

Наблюдение за животными длится до 10 суток. Из органов павших животных делают мазки для бактериоскопии и посевы на соответствующие среды для установления специфичности гибели животных.

В ответе лаборатории указывают, что испытуемая культура вирулентна для кроликов в испытанной дозе (или — апатогенна для кроликов).

Капсулообразование устанавливается либо в результате изучения мазков из посевов на среду Государственного контрольного института медицинских биологических препаратов им.Тарасевича или на сывороточный бульон (инкубация при 37°C в течение 16-18 часов), либо в результате исследования мазков из крови и мазков-отпечатков из органов биопробных животных, окрашенных одним из вышеописанных методов для выявления капсул.

Неподвижность B. anthracis определяется при исследовании в висячей капле.

Отсутствие гемолиза определяется при посевах на МПА с добавлением 5-10% дефибринированной крови барана, посевы инкубируются при 35-37°C в течение 18-20 часов, после чего производится учет.

Лецитиназная активность определяется по интенсивности свертывания куриного желтка на жидкой яичной среде Дрожевкиной. Среду готовят путем смешивания в стерильной бутылочке со стеклянными бусами одной части куриного желтка, извлеченного асептически, и двух частей стерильного 0,85% раствора хлористого натрия. Среду разливают по 5 мл в пробирки, засевают петлей испытуемой суточной культуры, инкубируют при 37°C. B. anthracis, как правило, желток не свертывает даже в течение нескольких суток инкубирования, в то время как, например, B. cereus свертывает среду в течение 6-10 часов.

Тест жемчужного ожерелья. Перед постановкой пробы 2% МПА разливают по 10 мл в пробирки. Готовят 3 чашки 2% МПА, наливая в каждую из них агар из одной пробирки; предварительно к агару первой пробирки после его расплавления и охлаждения, добавляют пенициллин из расчета 0,5 ед./мл, к агару второй — 0,05 ед./мл, третья — контрольная. На каждой чашке после застывания агара обратной стороной пробирки делают насечки агара, которые на обратной стороне чашки обозначают номером анализа.

На каждый полученный таким образом кружок агара наносят 1 каплю 3-часовой бульонной культуры исследуемого штамма. На одной чашке может быть поставлено 10-15 проб. Чашки с закрытыми крышками инкубируют при 37°C, через 3 часа просматривают под микроскопом с сильной сухой или иммерсионной системой (в последнем случае каждый кружок агара накрывают покровным стеклом). Рекомендуется использовать фазовоконтрастное устройство.

Ознакомиться с документом вы можете, заказав бесплатную демонстрацию систем «Кодекс» и «Техэксперт».

источник