Название (русское/английское)
Расход среды
Селективные добавки
Стандартный агар для подсчета колоний Американской ассоциации здравоохранения/Standard Plate Count Agar APHA
Стандартная среда, соответствующая составу APHA для использования в исследовании молока,воды, пищи и молочных продуктов
Агар для подсчета колоний из воды (ISO)/Water Plate Count Agar (ISO)
Среда для подсчета способных к восстановлению организмов из воды
Селективная хромогенная среда для E.coli/колиформ/
Brilliance E. coli/coliform Selective Agar
Среда для выделения E. coli и колиформов из пищи, воды и образцов окружающей среды
Лаурил-триптозный бульон/Lauryl Tryptose Broth (Lauryl Sulphate Broth)
Среда для исследования воды и сточных вод, рекомендованная APHA
Агар для легионелл (основа)/LEGIONELLA CYE AGAR BASE
Cелективная среда MWY для легионелл (селективная среда для выделения Legionella Pneumophila из питьевой воды)
Селективная добавка MWY для легионелл, 10 флаконов: SR0118E- флакон на 100 мл среды, SR0118B- флакон на 500 мл среды. Селективная добавка BCYE для легионелл, 10 флаконов: SR0110A- флакон на 100 мл среды SR0110C- флакон на 500 мл среды
Агар M-CP для Clostridium perfringens (основа)/Membrane Clostridium perfringens Medium (m-CP)
Хромогенная среда для быстрой изоляции и предварительной идентификации Clostridium perfringens из водных образцов
SR0188E Селективная добавка к агару M-CP для Clostridium perfringens, 10 флаконов (1 флакон на 500 мл среды)
Лаурил-триптозный бульон с МУГ (модифицированный)/Lauryl Tryptose Broth (Modified) with MUG
Среда для предварительного подсчета E. coli и других колиформ в воде, молочных продуктах и пищевых образцах; с добавлением триптофана
Бульон МакКонки/MacConkey Broth
Дифференциальная среда,содержащая нейтральный красный для выявления колиформных организмов в воде и молоке красный для выявления колиформных организмов в воде и молоке
Минеральная модифицированная среда + глютамат натрия/Minerals Modified Glutamate Medium
Среда для подсчета организмов группы колиформ в воде (поставляется в двойной упаковке)
Бульон азида декстрозный (ROTHE)/Azide Dextrose Broth (Rothe Broth)
Среда для выявления энтерококков в воде, сточных водах и пище
Селективная хромогенная среда для E.coli/колиформ/Brilliance E. coli/coliform Selective Agar
Среда для выделения E.coli и колиформ из пищевых, водных и образцов окружающей среды
Азидный кровяной агар (основа)/Azide Blood Agar Base
Селективная среда для выявления и изоляции стрептококков и стафилококков из сточных вод, фекальных и других образцов
Среда для подсчета гетеротрофных бактерий их водных образцов
EC-бульон с МУГ/EC Broth with MUG
Среда для изоляции и предварительной идентификации E.coli
Лаурил-триптозный бульон с МУГ/Lauril Triptose Broth with MUG
Среда для предварительной идентификации E.coli
Цетримидный агар для Pseudomonas/ Pseudomonas Cetrimide Agar Base
Среда для селективной изоляции и идентификации Pseudomonas aeruginosa из ряда образцов. Состав рекомендован USP, EP и AOAC методами
Агар Эндо (основа) для подсчета колиформ методом мембранной фильтрации/Membrane Endo Agar LES an APHA
Среда для подтверждения колиформ методом мембранной фильтрации
BR0050A Основной фуксин, 10 г
Лаурил-сульфатный бульон/ Membrane Lauryl Sulphate Broth
Среда для подсчета колиформ методом мембранной фильтрации
Бульон МакКонки с бромкрезолпурпуром (формула США)/ MacConkey Broth Purple (US Formulation)
Дифференциальная среда, содержащая бромкрезоловый пурпурный для выявления колиформ
источник
«ОРГАНИЗАЦИЯ ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА САНИТАРНО — МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВОДЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 2.1.4.1057-01» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.07.2001)
Качество питательных сред является одним из важнейших факторов, влияющих на достоверность результата анализа. Жесткая регламентация приготовления питательных сред и выполнения комплекса процедур внутреннего контроля качества является неотъемлемой частью обеспечения достоверности, а также воспроизводимости и повторяемости результатов количественных микробиологических анализов.
На конечный результат качества готовой питательной среды может оказать влияние множество различных моментов. Поэтому контроль качества питательных сред должен осуществляться на всех этапах технологического процесса, начиная от момента закупки среды до непосредственного использования в анализе, и включать следующие этапы:
1. Проверку документации и визуальный контроль питательных сред при их получении.
2. Контроль условий и сроков хранения питательных сред.
3. Контроль питательных сред на этапе приготовления.
4. Контроль биологических свойств питательных сред.
5. Контроль на этапе использования питательных сред.
Данный раздел регламентирует процедуры внутреннего контроля качества питательных сред, которые используются для выполнения текущего производственного и государственного санитарно-эпидемиологического контроля воды по санитарно-микробиологическим индикаторным показателям. Применение питательных сред без подтверждения их качества не допускается. Результаты выполнения процедур контроля качества должны быть документально зафиксированы.
Данный этап контроля позволяет избежать покупки продукции у фирм, не имеющих надлежащих документов, удостоверяющих и гарантирующих ее качество, а также выявить грубые нарушения, возникшие при транспортировании (разгерметизация упаковки, несоответствие внешнего вида обезвоженной среды или отдельных компонентов описанию изготовителя и др.). Контроль осуществляют при каждом поступлении в лабораторию новых сред.
При первом контакте с фирмой, производящей и (или) реализующей питательные среды, необходимо затребовать копии лицензии на право производства и реализации данных питательных сред. Обязательным условием поставки питательных сред является наличие следующих сопроводительных документов:
1. Копии сертификата соответствия на реализуемую среду.
2. Паспорта отдела контроля организации-изготовителя на реализуемую серию препарата.
3. Инструкции по применению.
Среды импортного производства должны иметь сертификаты качества серии ISO 9000.
При получении питательных сред необходимо проверить целостность упаковки (оценивается визуально) и наличие сопроводительной документации (сертификата соответствия, паспорта, инструкции по применению, этикеток на упаковках). Сопроводительная документация должна содержать следующую информацию:
— название среды и ее назначение;
— номер протокола контрольных испытаний;
— описание внешнего вида и консистенции сухой и готовой среды;
— условия и длительность хранения готовой среды.
Обо всех обнаруженных отклонениях необходимо сообщить руководителю лаборатории.
Данный этап контроля позволяет обеспечить правильность и постоянство условий хранения сред, а также своевременное пополнение их запаса.
Контроль осуществляют 1 раз в неделю или чаще.
Сухие питательные среды и реактивы, если не указаны особые условия хранения, необходимо поместить в сухое, защищенное от света место с температурой воздуха 10 — 25 °C.
Материалы, требующие пониженной температуры хранения, необходимо поместить в холодильник с соответствующей степенью охлаждения.
Особое внимание следует уделить сохранению герметичности вскрытых упаковок со средами, т.к. повышение влажности и комкование сухой питательной среды существенно ухудшает ее качество. Если питательная среда упакована в пакет из ламинированной бумаги и весь объем среды не используется за один раз, то после вскрытия пакета оставшуюся часть среды желательно перенести в чистую сухую емкость оранжевого стекла (или другого светозащитного инертного материала) с плотно закрывающейся крышкой.
Готовые питательные среды хранят при температуре (2 — 8) °C. Срок хранения готовой питательной среды определяется изготовителем.
Сухие питательные среды с истекшим сроком годности, но с неизменившимися цветом и консистенцией, подвергают количественным методам контроля питательных сред по биологическим показателям с целью принятия решения о продлении срока годности.
Все приготовленные среды следует промаркировать с указанием названия среды, а также даты приготовления и срока годности. Дату приготовления питательной среды заносят в журнал (Прилож. 8.1).
Контейнеры (флаконы) с завинчивающимися крышками более пригодны для продолжительного хранения готовых жидких и плотных питательных сред, нежели чашки Петри или емкости с ватно-марлевыми пробками.
Температуру воздуха в местах хранения питательных сред проверяют 1 раз в неделю. Результаты проверки заносят в журнал регистрации температур.
Для приготовления питательных сред и растворов, используемых в микробиологическом анализе, допускается применение химических веществ по степени чистоты не ниже ЧДА. Требования к качеству воды для приготовления питательных сред для микробиологических анализов изложены в разделе 7.
При условии, что приобретена продукция надлежащего качества, одним из основных факторов, определяющих качество и дальнейшую пригодность питательной среды, является правильность ее приготовления.
Приготовление сред должно осуществляться со строгим соблюдением рецептуры приготовления и условий стерилизации, определенных изготовителем.
Контроль питательных сред на этапе приготовления включает:
— оценку внешнего вида готовой среды;
— измерение pH готовой среды;
— определение стерильности (отсутствия контаминации) готовой среды;
— постановку качественного контроля биологических свойств среды (раздел 11.4.1).
Контроль питательных сред на этапе приготовления проводят каждую варку.
Оценку внешнего вида питательной среды проводят визуально.
Цвет, прозрачность и консистенция сухой и приготовленной среды должны быть типичны для данного продукта и соответствовать описанию изготовителя.
Некоторыми очевидными ошибками при приготовлении сред являются:
— потемнение среды вследствие перегревания и недостаточного перемешивания;
— неполное растворение порошкообразной среды;
В агаризованных средах осадок может образовываться вследствие продолжительной стерилизации, повторных плавлений твердого агара или длительного содержания расплавленного агара при высокой температуре.
В этих случаях появление осадка свидетельствует о непригодности питательной среды.
Кроме того, агаризованные среды могут образовывать хлопьевидный осадок, если расплавленная среда остается в водяной бане при температуре от 43 до 45 °C более 30 мин., вследствие начинающегося процесса застывания агара. Такой хлопьевидный осадок агара можно рассеять путем повторного нагревания среды до 60 °C.
Значение водородного показателя определяют с помощью pH-метра, для агаризированных сред — бумажной индикаторной системы с шагом измеряемого диапазона не более 0,3 единиц. Определение проводят согласно инструкции по использованию прибора или индикаторной системы.
Величину водородного показателя измеряют у стерилизованной среды, а при работе с плотной средой измеряют у стерилизованной среды после ее отвердения. Результаты регистрируют в журнале (Прилож. 8.1).
Отклонение pH среды за пределы диапазона, указанного в паспорте, приводит к ухудшению ее биологических свойств, вплоть до полной непригодности.
Отклонения водородного показателя или другие проблемы с pH могут быть вызваны:
— использованием щелочного стекла;
— загрязнением емкостей, в которых готовилась среда;
— дистиллированной водой низкого качества.
Определение стерильности (для стерилизуемых сред) и отсутствия контаминации (для нестерилизуемых сред) проводят путем инкубации чашки или пробирки с исследуемой средой в термостате при температуре и в течение времени, определенных для этих сред методическими документами по исследованию воды.
По истечении срока инкубации на (в) исследуемых питательных средах должны отсутствовать визуально определяемые признаки роста микроорганизмов.
Результаты регистрируют в журнале (Прилож. 8.1).
Оценка биологических (ростовых) свойств питательных сред проводится по следующим показателям.
Чувствительность — максимальное разведение тестовой культуры, при котором на всех засеянных чашках (во всех пробирках) обнаруживается рост.
Скорость роста — минимальное время инкубации после посева культур, достаточное для визуального выявления роста (выражается в часах).
Дифференцирующие свойства — оцениваются по выраженности основных отличительных признаков, характеризующих рост тестовых штаммов на данной питательной среде.
Кроме того, для дифференциальных сред необходимо определять ингибирующее действие среды. Ингибирующее действие среды определяется как в отношении основного тестового микроорганизма, так и по отношению к сопутствующим микроорганизмам.
Оценка ингибирующих свойств проводится по двум показателям.
Процент извлекаемости — процентное соотношение среднего значения количества колоний, выросших на исследуемой среде, к среднему значению количества колоний, выросших на контрольной среде.
Показатель ингибиции — степень подавляющего воздействия на постороннюю микрофлору, выражается минимальным разведением, при котором полностью отсутствует рост посторонней флоры.
Основным тестовым микроорганизмом для оценки биологических свойств среды, используемых для текущего санитарно-бактериологического контроля воды, является E.coli.
Дополнительно используются следующие тест-штаммы:
— для выявления дифференцирующих свойств среды — Shigella sonnei «S-form» в качестве вида, не ферментирующего лактозу;
— при определении показателя ингибиции посторонней микрофлоры — Staphylococcus aureus.
Контроль биологических свойств готовых питательных сред включает два этапа: качественный и количественный контроль, каждый из которых имеет свое целевое предназначение.
Задачей качественного контроля является выявление грубых нарушений технологии приготовления, приводящих к выраженному снижению ростовых и (или) дифференцирующих свойств. Качественный контроль проводят после каждой варки среды.
Количественный контроль позволяет выявлять относительные изменения (ухудшение) ростовых свойств из-за ряда причин, возникающих на этапах транспортирования, хранения, приготовления, стерилизации, а также при изменении технологических требований в процессе производства питательных сред, в результате которых они оказываются менее эффективными.
Количественный контроль выполняется:
— при поступлении каждой новой партии среды;
— при необходимости решения вопроса о продлении срока годности среды либо возможности ее дальнейшего использования в случае выявления нарушений условий хранения.
Учитывая, что разные серии питательных сред одного производителя иногда имеют различие по качеству, контролю подлежит каждая серия среды поступившей партии.
Количественный контроль также может служить инструментом выбора более эффективной среды среди продукции, предлагаемой на современном рынке.
В процессе качественного контроля оценивают принципиальную способность основного тестового штамма расти на данной среде, а также наличие характерных дифференцирующих признаков для специфических сред.
Качественный контроль выполняется лабораторией после каждой варки питательной среды.
Накануне исследования тестовую культуру готовят, как указано в п. 10.2.4.
Контроль выполняют путем посева тестового штамма в жидкие, полужидкие или на плотные питательные среды с помощью общепринятых методик. Для плотных сред метод посева должен обеспечивать получение изолированных колоний микроорганизмов (например, метода «штриха»). Пробирки и чашки с посевами инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 24 часов.
Среду считают пригодной, если по истечении срока инкубации тестовый штамм дает хорошо различаемый рост со всеми типичными для него отличительными признаками, которые предполагается выявлять на данной среде.
Этими признаками могут быть: помутнение жидкой или полужидкой среды, изменение цвета, образование газа, отличительная форма, структура, окраска колоний, наличие и диаметр зоны изменения цвета и прозрачности среды вокруг колоний. Результаты качественного контроля заносят в журнал (Прилож. 8.1).
Выполнение количественного контроля должно осуществляться лабораторией, имеющей лицензию на работу с необходимыми патогенными микроорганизмами, аттестованной (аккредитованной) в этой области и располагающей персоналом соответствующей квалификации.
Для исследования следует использовать свежеприготовленные среды одной варки. Исследуемые и контрольные среды готовят согласно инструкции изготовителя.
Среды, предназначенные для прямого поверхностного посева, разливают в чашки Петри слоем не менее 2 мм и предварительно асептически подсушивают одним из следующих способов:
1. Перевернутые чашки Петри с открытыми крышками выдерживают в термостате или сушильном шкафу при температуре 25 — 50 °C до исчезновения капель влаги с поверхности агара. Не пересушивать!
2. Закрытые неперевернутые чашки Петри выдерживают в ламинарном боксе в течение ночи.
3. Чашки Петри с полуоткрытыми крышками помещают в ламинарный бокс на 30 мин.
В качестве неселективной среды при определении ингибирующих и дифференцирующих свойств контролируемой среды используют мясопептонный агар, питательный агар на основе гидролизата кильки, рыбной муки (ГРМ-агар) и их аналоги.
Для исследования необходимо использовать стерильный физиологический раствор, содержащий 0,1% (по массе) пептона. Это сводит до минимума воздействие разбавителя на микроорганизмы. При невозможности приготовления данного разбавителя допускается использование стерильного физиологического раствора без пептона.
За два дня до исследования тестовую культуру микроорганизма пересевают со среды хранения на скошенный питательный агар согласно п. 10.2.4. На следующий день из полученной агаровой культуры с использованием стандарта мутности готовят суспензию
тестового штамма в стерильном разбавителе с концентрацией 10(9) кл/мл и десятикратные серийные разведения (по 8 разведение включительно) согласно п. 9.
Для контроля разбавления из 6 и 7 разведения высевают по 0,1 мл (100 мкл) суспензии прямым поверхностным посевом на чашки с питательным агаром. Из каждого разведения делают по три таких посева. После высева пробирки с разведениями немедленно переносятся в холодильник. Чашки с посевами инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 24 часов.
В день исследования для каждой серии посевов подсчитывают среднее число колоний, выросшее на трех чашках. При правильно выполненном разведении среднее количество колоний, выросших при посеве 0,1 мл суспензии тестового микроорганизма из 6-го разведения, должно составлять около 100 КОЕ. Соотношение полученных средних значений при посеве из 6 и 7 разведений должно быть близко к 10:1.
В случае, если концентрация микроорганизмов в разведениях значительно отклоняется от расчетной и (или) не соблюдена кратность разведения, данный инокулят тестового штамма не пригоден для дальнейшего использования. Подготовку инокулята необходимо повторить.
Для показателей, требующих определения количества внесенных микроорганизмов, рассчитывают посевную дозу. Посевная доза — объем конкретного разведения, содержащий необходимое для посева количество жизнеспособных клеток тестового микроорганизма. Расчет дозы выполняют, основываясь на ранее определенных концентрациях тестового микроорганизма в 6 и 7 разведениях, исходя из требований, что посев на одну чашку не должен превышать 50 — 100 микробных клеток. При правильно выполненном разведении посевная доза составляет 50 — 100 мкл суспензии из 6 разведения.
После расчета посевной дозы определяют необходимое количество повторов посевов (не менее 5) исходя из расчета, что суммарное количество колоний на всех чашках на одной среде должно составлять не менее 200 КОЕ.
Приготовленные суспензии можно использовать, если они были охлаждены сразу же после приготовления и произведения контрольных высевов и не хранились более 24 часов. Перед исследованием инокулят следует тщательно перемешивать, чтобы добиться однородности суспензии микроорганизмов.
Данный метод посева используется при количественном определении показателей ростовых и дифференцирующих свойств жидких и полужидких питательных сред. Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Посевную дозу суспензии асептически помещают при помощи пипетки в пробирку с исследуемой питательной средой и перемешивают. Инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 24 часов.
Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Посевную дозу суспензии асептически помещают при помощи пипетки на поверхность заранее подготовленной питательной среды (п. 11.4.2.1). Стерильным шпателем культуру распределяют по поверхности питательного агара, чтобы добиться равномерного распределения инокулята. После впитывания инокулята чашки переворачивают и инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 24 часов.
При определении показателей чувствительности и скорости роста используют по 0,1 мл из 5, 6, 7 и 8 разведений для посева на плотные питательные среды и по 1,0 мл из 4, 5, 6, 7 — для посева в жидкие среды. Разведения готовят и контролируют, как указано в п. 11.4.2.1.
Посев каждой дозы инокулята выполняют не менее чем на 3 чашки или пробирки в соответствии с пунктом 11.4.2.2. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 24 часов. Визуальный учет скорости роста культуры в каждом взятом в опыт разведении микробной взвеси производят для плотных сред через 12 и 24, а для жидких — через 3, 6 и т.д. часов инкубации.
Чувствительностью среды считается наибольшее разведение исходной суспензии тестового штамма с исходной концентрацией около
9 10 КОЕ/мл, обеспечивающее формирование колоний на всех засеянных чашках или визуально видимый рост во всех пробирках с исследуемой средой.
Чувствительность среды должна соответствовать параметру, указанному изготовителем в паспорте данной среды. Если данный параметр изготовителем не указан, то чувствительность должна составлять не менее чем 0,1 мл суспензии из 6 разведения для плотных и 1 мл суспензии из 7 разведения для жидких питательных сред.
При отсутствии роста в одной пробирке или на одной чашке с посевом разведения, указанного в паспорте как чувствительность, опыт повторяется на удвоенном числе пробирок или чашек. Приемлемым считается наличие роста в 5 посевах оцениваемого разведения из 6. Если при повторном исследовании чувствительность среды не соответствует паспортному значению, то ее бракуют.
Скорость роста контрольной культуры — минимальное время инкубации посевов, за которое при соответствующем разведении обеспечен отчетливый, видимый невооруженным глазом рост культуры во всех пробирках с жидкими питательными средами (помутнение, наличие пленки, изменение цвета среды) или формирование типичных, легко дифференцируемых колоний на чашках с плотной средой.
Скорость роста не должна превышать время инкубации, указанное в нормативных документах для исследований, в которых эта среда используется.
Результат заносят в протокол оценки питательной среды по биологическим показателям (Прилож. 8.2).
Для оценки дифференцирующих свойств сред используют два тестовых штамма, отличающихся по основному дифференцируемому признаку ферментации лактозы E.coli (Lac+ ) и Shigella sonnei (Lac- ).
Разведения тестовых штаммов готовят, как указано в п. 11.4.2.1. Посевная доза должна содержать 50 — 100 микробных клеток на чашку, рассчитанная по контрольному посеву.
Из разведений тестовых штаммов, содержащих исходя из контрольных посевов 500 — 1000 микробных клеток в 1 мл, готовят 3 смеси:
1. По 1 мл каждого штамма E.coli (Lac+ ) и Shigella sonnei (Lac- ).
2. По 1 мл штамма E.coli (Lac+ ) и разбавителя.
3. По 1 мл штамма Shigella sonnei (Lac- ) и разбавителя.
Приготовленные смеси тщательно перемешивают. Из каждой смеси в соответствии с рассчитанной посевной дозой (по 50 — 100 мкл) засевают поверхностным методом не менее чем на 3 чашки с исследуемой средой. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 24 часов.
По окончании инкубации учитывают выраженность дифференциальных признаков при росте колоний тестового микроорганизма
E.coli (Lac+ ), ферментирующего лактозу на исследуемой среде (характерный цвет колоний, среды), и их отсутствие в посевах тестового штамма Shigella sonnei (Lac- ), не обладающего способностью к ферментации лактозы.
Дифференцирующие свойства среды считают удовлетворительными, если она обеспечивает определенный в паспорте перечень признаков и степень их выраженности у тестового штамма, обладающего искомыми свойствами. Результат заносится в протокол оценки питательной среды по биологическим показателям (Прилож. 8.2).
Этот показатель позволяет выявить и оценить наличие и степень ингибирующего влияния исследуемой среды на E.coli по сравнению с контрольной средой. В качестве контрольной используют ранее проведенную неселективную среду.
Определение процента извлекаемости (% всхожести) особенно важно для сред, используемых в методах прямого количественного подсчета (прямой посев исследуемой воды на чашку или фильтр), где наличие даже относительного ингибирующего влияния среды на искомые микроорганизмы будет искажать результат и снижать чувствительность метода.
Готовят инокуляты для посева и осуществляют расчет посевной дозы, как указано в п. 11.4.2.1. Посев на контрольную и исследуемую среду выполняют прямым посевом согласно п. 11.4.2.2.
Чашки с посевами инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 24 часов.
После инкубации подсчитывают количество колоний, выросших на каждой чашке. Общее количество колоний во всех повторах (не менее 5) на контрольной неселективной среде должно быть не менее 200. Вычисляют среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на контрольной и исследуемой средах.
Процент извлекаемости рассчитывают по формуле:
— процент всхожести на исследуемой среде;
— среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на исследуемой среде;
— среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на контрольной среде.
Среда признается приемлемой при условии, что различие между средними значениями количества колоний на контрольной и исследуемой средах недостоверно. При этом, как правило, % извлекаемости (всхожести) составляет не менее 80%.
Расчет достоверности различий средних значений количества колоний, выросших на контрольной и исследуемой средах, приведен в Прилож. 10.
Результат заносится в протокол количественной оценки питательной среды по биологическим показателям (Прилож. 8.2).
В случае получения достоверного различия результатов исследование повторяют, удваивая количество повторов: не менее 10 чашек с общей численностью количества учитываемых колоний на неселективной среде не менее 400.
Для оценки ингибирующих свойств среды Эндо (и ее аналогов) по отношению к микробам-ассоциантам используют тестовый штамм Staphylococcus aureus.
Разведения тестового штамма готовят и контролируют, как указано в п. 11.4.2.1.
Взвесь штамма-ассоцианта из разведений 10(-1) (10(8) микробных клеток в мл) по 100 мкл засевают на 3 чашки Петри с испытуемой и контрольной (неингибиторной) средами. В качестве контрольной среды используется питательный агар. Через 24 — 48 часов инкубации при температуре (37 +/- 1) °C определяют число колоний, сформировавшихся на испытуемой и контрольной средах.
Ингибирующие свойства среды являются удовлетворительными, если в разведении 10(-1) отсутствует рост микроба-ассоцианта при наличии роста в контрольных посевах. Результат заносят в протокол оценки питательной среды (Прилож. 8.2).
Основным методом концентрирования в санитарно-бактериологических исследованиях воды является фильтрование через мембранные фильтры. Введение дополнительного фактора, мембранного фильтра, в систему «микроорганизм — питательная среда» может оказать влияние на показатели роста микроорганизмов и биологические свойства среды.
В настоящее время ведущие зарубежные производители питательных сред выпускают среды, обеспечивающие своим составом оптимальные условия роста микроорганизмов при использовании мембранных фильтров и целенаправленно предназначенные для исследования воды мембранным методом. В отличие от своих аналогов для клинических исследований или прямых посевов воды без концентрирования эти среды имеют индекс m, например: m Endo agar.
В нашей стране подобные среды пока не производятся и в нормативных требованиях к качеству питательных сред такой важный момент, как комплексная оценка системы «микроорганизм — фильтр — среда», не нашел отражения.
Тем не менее, в случаях необходимости сделать выбор между средами, предлагаемыми разными производителями, оценка качества среды в комплексе с используемыми в анализе мембранными фильтрами, наряду с перечисленными в п. п. 11.1 — 11.4.2 исследованиями, будет способствовать повышению объективности получаемых результатов, а в отдельных случаях может стать определяющим фактором в принятии решения.
Однозначно признано, что исследования, выполненные на чистых культурах модельных микроорганизмов, не могут учесть влияния всего многообразия микроорганизмов естественных водоемов. В этой связи, при проведении сравнительной оценки дифференцирующих и ингибирующих свойств различных сред, может оказаться полезным использование природной воды для приближения к натурным условиям.
Однако при выполнении этих исследований необходимо всегда иметь в виду наличие индивидуальных особенностей каждого водоема, а также нестабильность во времени как микробиологических характеристик природных вод, так и уровней химического загрязнения. Эти факты существенно снижают важность полученных результатов и ограничивают их применение конкретным водоемом.
С учетом изложенного описанная методика носит рекомендательный характер.
Процент извлекаемости используемых мембранных фильтров должен составлять не менее 80% на полноценной неселективной среде. Мембранные фильтры должны быть стерильными.
Питательные среды для посева мембранных фильтров не подсушиваются, но на поверхности разлитых в чашки сред не должно быть видимой влаги.
Подготовку инокулята тестовых культур микроорганизма осуществляют, как указано в п. 11.4.2.1. В качестве тестовой культуры используют модельный штамм E.coli M17-02. Посевная доза на фильтр должна составлять от 25 до 100 КОЕ для фильтров диаметром 47 мм и 25 — 60 КОЕ для фильтров диаметром 35 мм.
Расчетное засеваемое общее количество тестовых микроорганизмов должно быть не менее 200, при количестве повторов — не менее 5.
Природная вода используется как естественный источник водных сапрофитов для оценки ингибирующих и дифференцирующих свойств исследуемых сред. За сутки до начала исследований природная вода, предназначенная для подготовки инокулята, должна быть оценена по общепринятым методикам на общее содержание микроорганизмов (ОМЧ) и наличие искомых колиформных микроорганизмов и до начала основных исследований помещена в холодильник.
По результатам выполненных контрольных посевов рассчитывают необходимый объем природной воды. Объем инокулята природной воды должен содержать сотни — тысячи сапрофитных микроорганизмов. Использование обедненных по микробному составу природных вод в данных исследованиях нецелесообразно.
В установленный по содержанию сапрофитных микроорганизмов объем природной воды вносят расчетную посевную дозу тестового микроорганизма (E.coli).
Если природная вода содержит достаточное количество колиформных бактерий для посева требуемого количества на один фильтр, модельные микроорганизмы не используются. При необходимости природная вода может быть разведена в 10 и более раз.
Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Предварительно рассчитанную посевную дозу суспензии вносят в пробирки, содержащие не менее 10 мл разбавителя. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Количество пробирок, содержащих посевную дозу тестового микроорганизма, должно соответствовать количеству предполагаемых посевов методом мембранной фильтрации.
Фильтровальную установку готовят согласно общепринятым процедурам. Контроль стерильности фильтровальной установки проводят, как указано в п. 6.5. Стерильным пинцетом помещают мембранный фильтр на основание держателя фильтра и присоединяют фильтровальную воронку. При отключенном вакууме прибавляют 20 — 30 мл стерильного разбавителя или стерильной дистиллированной воды. Содержимое пробирки с посевной дозой тщательно перемешивают и асептически переносят в воронку с разбавителем, включают вакуум и отфильтровывают.
Дважды, при включенном вакууме, ополаскивают воронку 20 — 30 мл стерильного разбавителя или стерильной дистиллированной воды.
Вакуум отключают, снимают фильтровальную воронку и стерильным пинцетом переносят мембранный фильтр с основания на питательную среду. Между мембранным фильтром и поверхностью агара не должно быть пузырьков воздуха. Чашки с посевами переворачивают и инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 24 часов.
Посев инокулята природной воды осуществляется аналогично описанному выше с коррективами в отношении объема инокулята природной воды, который может быть 10 мл и более. В этом случае вносят соответствующее меньшее количество разбавителя или стерильной дистиллированной воды. Обязательно проводят двойное споласкивание воронки, как указано выше.
На первом этапе осуществляют отбор сред по параметрам, описанным в п. п. 11.1 — 11.3, 11.4.1 — 11.4.2.4.
На втором этапе отобранные среды оценивают по показателю «процент извлекаемости» с использованием двух способов посевов: прямого (по п. 11.4.2.5) и методом мембранных фильтров. Для каждой исследуемой среды и варианта посева должно быть выполнено не менее 5 повторов. Контролями служат прямой посев (контроль N 1) и посев мембранным методом (контроль N 2) на неселективную среду.
При необходимости могут быть проведены параллельные дополнительные исследования с инокулятом природной воды. Инокуляты природной воды с внесенными тестовыми микроорганизмами (или без них) засевают методом мембранных фильтров на исследуемые селективные среды.
Рассчитывается среднее количество колоний для каждой среды, способа посева и контрольных посевов. Общее количество колоний тестового микроорганизма на неселективной среде при посеве прямым методом должно быть не менее 200.
Согласно разделу 12 подтверждают качество используемых в эксперименте мембранных фильтров путем расчета «процента извлекаемости» для мембранных фильтров по средним результатам контрольных посевов (прямого N 1 и мембранного N 2) на неселективный агар.
Далее по п. 11.4.2.5 производят расчет процента извлекаемости и оценку достоверности различий для исследуемых сред. Контрольным результатом при этом служит среднее количество колоний, выросших при прямом посеве на неселективном агаре (контроль N 1).
При посевах природной воды с дополнительным внесением тестовых микроорганизмов в дальнейших расчетах учитывают полученные накануне результаты контрольного посева на наличие колиформ. Далее процент извлекаемости рассчитывается так же, как и в исследованиях с чистыми культурами: в сравнении с результатами прямого посева тестовых микроорганизмов на неселективный агар (контроль N 1).
В случае посевов природной воды без дополнительного внесения тестовых микроорганизмов оценивают достоверность различий результатов, полученных при посевах на исследуемые среды.
При получении недостоверных различий результатов исследований для выбора наиболее оптимальной среды необходимо проанализировать следующие характеристики:
— четкость проявления дифференцирующих признаков для тестового микроорганизма;
— подавление сопутствующей микрофлоры;
— выявление ингибирующего действия микробного населения природной воды на тестовую культуру Е.coli.
В процедуре анализа возможны нарушения использования питательных сред (перегрев, чрезмерная инкубация при высокой температуре и т.д.), приводящие к ухудшению их ростовых свойств. Кроме того, возможно неверное толкование полученного результата вследствие слабой выраженности признака у исследуемого микроорганизма. Контроль на этом этапе позволяет минимизировать подобные проблемы.
Контроль сред на этапе использования включает:
— контроль температурного режима водяных бань, предназначенных для поддержания плотных питательных сред в расплавленном состоянии;
— учет времени нахождения среды в расплавленном состоянии;
— постановку положительного и отрицательного контролей в процессе идентификации микроорганизмов.
Данный вид контроля проводится при каждом использовании питательных сред.
Температура водяной бани должна находиться в пределах (47 +/2) °C.
Питательная среда не должна находиться в расплавленном состоянии более 8 часов. Повторное плавление плотной питательной среды не допускается.
Постановку контролей осуществляют в процессе идентификации микроорганизмов при выполнении подтверждающих тестов.
В качестве тестовой культуры используют штамм Е.coli M17-02. Подготовка инокулята. Накануне исследования тестовую культуру готовят, как указано в п. 10.2.4.
Постановку положительного контроля осуществляют путем внесения одной петли агаровой культуры тестового штамма в пробирку с используемой средой (средами) для идентификации. Отрицательным контролем служит пробирка с аналогичной средой без посева. Обе пробирки маркируют и помещают в термостат вместе с посевами.
По истечении срока инкубации в пробирке с положительным контролем должен наблюдаться хорошо различаемый рост, со всеми типичными для него отличительными признаками, которые предполагается выявлять на данной среде. Цвет индикатора среды должен изменяться на цвет, определяемый в паспорте среды, как положительный результат утилизации данного углевода. В пробирке с отрицательным контролем среда должна находиться без изменений. Результаты положительного и отрицательного контролей заносятся в рабочий журнал основного исследования.
В качественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового штамма Е.coli в виде диффузного помутнения среды не позднее 18 — 24 часов инкубации при (37 +/- 1) °C. В количественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового штамма во всех пробирках при посеве 1,0 мл из разведения 10(-7) не позднее 20 — 24 часов инкубации при (37 +/- 1) °C.
В качественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового штамма Е.coli в виде бесцветных прозрачных круглых колоний в S-форме не позднее 20 — 24 часов инкубации при (37 +/1) °C. В количественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового штамма Е.coli в виде бесцветных прозрачных круглых колоний в S-форме на всех чашках при посеве 100 мкл (0,1 мл) из разведения 10(-6) не позднее 18 — 20 часов инкубации при (37 +/- 1) °C.
Если среду предполагается использовать в качестве контрольной в исследовании по определению показателя ингибиции, то процент всхожести должен составлять не менее 80% по сравнению со средой ранее проверенной партии, а различие между ними должно быть недостоверно.
В качественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового штамма Е.coli в виде красных (малиновых) с металлическим блеском круглых колоний диаметром 2,0 — 3,0 мм, с образованием зоны потемнения среды вокруг колонии («отпечатка») не позднее 20 — 24 часов инкубации при (37 +/- 1) °C.
В количественном контроле среда должна обеспечивать рост типичных колоний Е.coli на всех чашках при посеве 100 мкл (0,1 мл) из разведения 10(-6) не позднее 18 — 20 часов инкубации при (37 +/1) °C.
При посеве смеси тест-штаммов должна наблюдаться четкая дифференциация колоний: в отличие от малиновых колоний Е.coli колонии шигелл более мелкие с окраской от белого до слабо-розового цвета, без отпечатка на среде.
Среда должна подавлять рост Staphylococcus aureus при посеве 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10(-1).
В качественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового штамма в виде диффузного помутнения среды не позднее 18 — 24 часов инкубации при (37 +/- 1) °C. При этом цвет индикатора среды должен изменяться на цвет, определяемый в паспорте среды как положительный результат утилизации данного углевода до кислоты, визуально должно определяться образование газа в виде наполненных и (или) спавшихся пузырьков в толще полужидкой среды или скопления газа в поплавке для жидкой среды.
Количественный контроль для данных сред не проводится.
Данная среда не выпускается отечественной промышленностью в виде обезвоженного полуфабриката, а готовится из составных частей ex temporo, что исключает возможность ее стандартизации. Это приводит к колебаниям качества среды от варки к варке, что зависит от целого ряда факторов.
Поэтому вопрос о контроле данной среды или ее аналогов на уровне производственной лаборатории остается открытым.
Раздел составлен на основе следующих документов:
международного стандарта ISO 9998:1991 (E) «Качество воды — методы оценки и контроля сред, предназначенных для подсчета колоний микроорганизмов, используемых при тестировании качества воды»;
Методических рекомендаций к контролю питательных сред по биологическим показателям. М., 1980;
бактериологического контроля питательных сред. Методические рекомендации в помощь бактериологам санитарно-эпидемических станций и больниц: МЗ РСФСР. Хабаровск, 1979;
ФС 42-3377-97 «Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар)»;
ФС 42-3378-97 «Питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-бульон)»;
ФС 42-3504-97 «Питательная среда для выделения энтеробактерий сухая (агар Эндо)».
источник
Питательные среды классифицируют в зависимости от исходных компонентов, консистенции, целевого назначения, химического состава.
В зависимости от химического состава и исходных компонентов различают следующие типы питательных сред.
Среды неопределенного химического состава. Их подразделяют на: 1) среды животного происхождения (исходные продукты — мясо, рыба, яйца, молоко и т.д.); 2) среды растительного происхождения (исходные продукты — соя, горох, картофель, морковь и т.д.).
Некоторые продукты используют в натуральном виде (картофель, морковь, молоко и т. д.), но чаще животные и растительные ткани подвергают различной обработке (экстрагированию, ферментативному или кислотному гидролизу).
Среды известного химического состава (синтетические). В них входят известные химические соединения (соли, углеводы, аминокислоты, витамины и т. д.) в оптимальном количественном соотношении. Синтетические питательные среды используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных сред, например при получении диагностических аллергенов или при изучении метаболических потребностей микроорганизма в том или ином конкретном химическом соединении.
По консистенции питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие.
Жидкие питательные среды.Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы исходных продуктов.
Полужидкие и плотные питательные среды. Необходимую консистенцию среде придают добавлением различных уплотнителей.
Агар-агар (малайское желе) — полисахарид, продукт переработки некоторых морских водорослей. Плавится при 80. 86 ºС, затвердевает при 40 ºС. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5. 2%, реже 3 %; полужидких — 0,3. 0,7%.
Желатина — экстракт из тканей, содержащих много коллагена (кости, хрящи, сухожилия и т.д.). Желатиновый гель плавится при 25 °С, что делает его неудобным для выращивания микроорганизмов с температурным оптимумом 37. 38 °С. Кроме того, ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину. Обычно в питательные среды вносят 10. 20 % желатины.
По целевому назначению различают общеупотребительные (основные), обогащенные, специальные, элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические питательные среды.
Общеупотребительные (основные) среды. Их применяют для культивирования относительно неприхотливых микроорганизмов.
В качестве исходных компонентов для приготовления основных сред используют наиболее часто мясную воду, перевар Хоттингера, растительные гидролизаты.
Мясная вода: говядину освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. Мясной фарш заливают водопроводной водой в соотношении 1: 2, кипятят 1 ч. После кипячения мясную воду охлаждают, фильтруют через ватно-мар-левый фильтр, затем доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по емкостям, закрывают ватно-мар-левыми пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин.
Перевар Хоттингера готовят из мясных отходов путем их триптического гидролиза. Жир, фасции, сухожилия мелко нарезают, заливают кипящей водой в соотношении 1:2, кипятят, охлаждают до 45 °С и добавляют панкреатин, подщелачивают раствором карбоната натрия до рН 7,8. 8,0, встряхивают и добавляют хлороформ (10 мл/л), плотно закрывают, выдерживают в теплом месте 10 дней, получают продукт гидролиза (перевар).
Мясо-пептонный бульон (МПБ). К 1 л мясной воды добавляют 1 % пептона[1] и 0,5 % хлорида натрия, устанавли-
Рис. 32. Приготовление скошенного агара
вают необходимый рН дробным добавлением 10%-го раствора гидроксида натрия или гидроксида калия. Фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют при 120 «С 15. 20 мин.
Мясо-пептонный агар (МПА): к МПБ добавляют 2. 3 % промытого мелко нарезанного агар-агара, нагревают до расплавления агара, доводят до кипения, в горячем виде проверяют рН, затем, если необходимо, доводят его до нужного значения (7,2. 7,6), фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Профильтрованный горячий агар разливают по пробиркам и колбам, стерилизуют автоклавированием при 1 атм 20. 30 мин. Чтобы получить скошенную поверхность агара, удобную для посева, после стерилизации пробирки с расплавленным МПА оставляют при комнатной температуре до уплотнения в наклонном положении (конец с пробкой приподнят) (рис. 32).
Широко используют культивирование микроорганизмов на плотных питательных средах в чашках Петри. Диаметр стандартной чашки Петри (рис. 33) около 10 см, выпускают чашки меньшего и большего диаметров, а также одноразовые пластиковые. В
стандартные стерильные чашки Петри над пламенем горелки наливают около 20 мл расплавленного и охлажденного до 45. 50 «С питательного агара, чашки помещают на горизонтальную поверхность до застывания агара.
Полужидкий мясо-пептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25 % агара. Кипятят при помешивании до полного расплавления агара, устанавливают рН 7,2. 7,6, фильтруют в горячем виде, стерилизуют в автоклаве.
Мясо-пептонная желатина (МПЖ): к МПБ добавляют 10. 20% измельченной желатины, нагревают до расплавления уплотнителя, устанавливают рН 7,2. 7,4, кипятят, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют дробно в аппарате Коха три дня по 20 мин или однократно в автоклаве при 112°С 15 мин.
Бульон Хоттингера: основной перевар Хоттингера разводят водопроводной водой в соотношении 1 :5 (1:8) до содержания аминного азота 120 мг%, добавляют 0,5% хлорида натрия, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают рН 7,4. 7,6, кипятят 15. 20 мин, фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют при 120 °С 20. 30 мин.
Агар Хоттингера готовят, добавляя к бульону Хоттингера 2 % агар-агара.
Предприятия биологической промышленности выпускают готовые питательные бульон и агар в виде сухого порошка.
Питательный бульон содержит (г/л): триптический гидролизат кильки — 10,05, хлорид натрия — 4,95. Навеску порошка массой 15 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, кипятят 2 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют в автоклаве при 120 ºС 20 мин (рН 7,3).
Питательный агар содержит (г/л): ферментативный гидролизат кормовых дрожжей — 12,0; агар— 12,5; хлорид натрия — 5,5. Навеску порошка массой 36 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, кипятят 3 мин, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют при 120 «С 20 мин (рН 7,3).
Обогащенные среды. Многие виды болезнетворных бактерий плохо растут на общеупотребительных питательных средах, поэтому в основные среды добавляют кровь, сыворотку крови, углеводы и т. д. Такие питательные среды получили название обогащенных.
Сывороточный и кровяной агары: к расплавленному и охлажденному до 45. 50°С стерильному питательному агару добавляют 5. 10% стерильной дефибринирован-ной крови барана (кролика) или сыворотки крови (лошади, крупного рогатого скота, кролика). Для получения дефибринирован-ной крови у барана кровь берут асептично из яремной вены стерильной иглой в стерильный флакон (или колбочку) со стеклянными (фарфоровыми) бусами или шариками, встряхивают вращательными движениями 15. 20 мин, чтобы предотвратить свертывание крови. Фибрин остается на бусах.
Компоненты перемешивают, разливают в чашки Петри, пробирки и оставляют до застывания питательной среды.
Сывороточный и кровяной бульоны готовят аналогичным образом.
Растворы углеводов (глюкоза и др.) стерилизуют текучим паром или фильтрованием и добавляют в количестве 0,5. 1 % к питательной среде.
Специальные среды. Так называют среды, разработанные с учетом специфических ростовых потребностей ряда бактерий. Например, желточная среда Мак-Коя для возбудителя туляремии, среда Терских для культивирования лептоспир и др.
Среда Мак-Коя: чистые куриные яйца обрабатывают спиртом, быстро проводят через пламя горелки. Стерильно вскрывают, желтки отделяют от белков. К 60 частям желтков добавляют 40 частей физиологического раствора (рН 7,0. 7,2). Компоненты перемешивают, разливают в пробирки по 4. 5 мл и помещают в наклонном положении в аппарат для свертывания сыворотки. Стерилизуют в первый день при 75 °С 1 ч, на второй день при 85 °С 30 мин. Для контроля стерильности приготовленные среды выдерживают 2 сут в термостате при 37. 38 °С.
Среда Терских состоит из фосфатной смеси Зеренсе-на и кроличьей сыворотки. Смесь Зеренсена: раствор А: гидрофосфат натрия — 11,876 г, вода дистиллированная — 1000 мл; раствор Б: дигидрофосфат калия — 9,078 г, вода дистиллированная — 1000 мл. К 90 мл раствора А добавляют 10 мл раствора Б и доводят объем дистиллированной водой до 1000 мл. Раствор разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют при 1,5 атм 20 мин. В каждую пробирку добавляют шесть—восемь капель стерильной инактивированной при 56 °С сыворотки кролика.
Элективные среды(лат. electus — избранный). Это питательные
среды для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материалов, содержащих несколько видов микробов. Элективные среды чрезвычайно многообразны по своему составу. В них включают компоненты, обеспечивающие преимущественный рост искомого микроорганизма и
(или) подавляющие в той или иной степени рост сопутствующей
микрофлоры. По консистенции среды данного типа могут быть
плотными и жидкими. Жидкие элективные среды называют средами обогащения или накопления, их применяют, когда ставят
цель увеличить количество искомого микроорганизма в смешанной популяции.
Молочно-солевой агар предназначен для избирательного культивирования стафилококков. К расплавленному МПА с рН 7,2. 7,4, содержащему 5. 7,5 % хлорида натрия, добавляют 10 % стерильного обезжиренного молока, перемешивают и разливают в чашки Петри.
Среда Шустовой предназначена для выделения сальмонелл. Представляет собой МПА (рН 7,4) с добавлением 10 % к объему среды 50%-го водного раствора тиосульфата натрия и 2 % раствора Люголя.
Среда Раппопорт предназначена для культивирования сальмонелл. К МПБ добавляют 1 % глюкозы, 10 % желчи, 1 % индикатора Андрэдэ. Стерилизуют текучим паром.
Среда Мюллера предназначена для культивирования сальмонелл. В колбу с 4,5 г стерильного мела наливают 90 мл МПБ, стерилизуют в автоклаве при 120 «С 30 мин. Затем стерильно добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора тиосульфата натрия (тиосульфат натрия — 50 г, дистиллированная вода — 100 мл), стерилизуют в аппарате Коха 30 мин.
Среда Кауфмана — это среда обогащения для сальмонелл. К 100 мл среды Мюллера добавляют 1 мл водного раствора бриллиантового зеленого, разведенного 1 : 1000, и 5 мл стерильной бычьей желчи. Смесь стерилизуют текучим паром 30 мин.
Казеиново-угольный агар (КУА) с пенициллином используют для культивирования бордетелл. К 1000 мл дистиллированной воды добавляют гидролизат казеина — 20 мл, хлорид натрия — 5 г, хлорид калия — 0,2 г, хлорид кальция — 0,002 г, карбонат натрия — 0,4 г, хлорид магния — 0,025 г, гидрофосфат калия — 0,24 г, растворимый крахмал — 1 г, цистин — 0,01 г, агар —20 г. Компоненты растворяют, устанавливают рН 7,2, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Перед употреблением в расплавленный агар (50 °С) добавляют 3 % дрожжевого экстракта и 0,2 % сухого активированного угля и 0,5 ЕД/мл пенициллина. Компоненты перемешивают и разливают по чашкам Петри.
Дифференциально-диагностические среды. Предназначены для выявления ферментов у микроорганизмов. По консистенции могут быть жидкими, полужидкими, плотными. В состав этих сред входят основная питательная среда, обеспечивающая рост изучаемого микроорганизма, субстрат для обнаружения фермента и индикатор, по изменению цвета которого судят о сдвиге рН среды в результате расщепления субстрата.
К питательным средам такого типа относят среды Гисса, Эндо, Плоскирева, Левина и др.
Среды Гисса используют для изучения ферментативных свойств выделенных культур микроорганизмов. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 1 % пептона, 0,5 г хлорида натрия. Компоненты растворяют, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,0. 7,4, добавляют один из углеводов-субстратов (лактоза, глюкоза и т.д.), агар-агар (0,3. 0,4 %), а затем 1мл индикатора Андрэдэ или 0,1мл 1,6%-го раствора бромтимолового синего. Готовую среду разливают по 3 мл в пробирки, стерилизуют текучим паром три дня подряд по 30 мин или при 112 °С 20 мин.
Выпускают сухие среды Гисса с индикатором BP — смесь водно-голубого с розоловой кислотой (готовые среды — полужидкой консистенции).
Плотные дифференциально-диагностические среды применяют для первичной изоляции возбудителей из материала. В их состав нередко кроме известного субстрата входят вещества, придающие питательной среде селективные свойства.
Среда Эндо содержит лактозу в качестве субстрата и предназначена для дифференциации бактерий, различающихся по способности расщеплять лактозу.
К 1000 мл расплавленного МПА (рН 7,4) температурой 70 °С добавляют 1 г лактозы, предварительно растворенной в небольшом количестве дистиллированной кипяченой воды. В отдельных пробирках готовят: 2. 3 мл спиртового раствора основного фуксина; 10 мл 10%-го водного раствора сульфата натрия.
В стерильную пробирку вносят 1 мл раствора фуксина и добавляют раствор сульфита натрия до обесцвечивания фуксина. Приготовленную смесь вливают в расплавленный агар, перемешивают и разливают по чашкам Петри. Готовая среда бесцветна, при росте на ней микроорганизмов, расщепляющих лактозу, среда закисляется, обесцвеченный фуксин восстанавливается, и колония микроорганизма, например эшерихий, приобретает красный цвет с металлическим оттенком. Среду готовят за сутки до ее использования. Выпускают также сухую среду Эндо. Перед употреблением определенную навеску порошка вносят в дистиллированную воду, кипятят и разливают по чашкам Петри.
Среда Левина аналогична по целевому назначению среде Эндо, но содержит другой индикатор (эозин с метилено-вым синим). К 100 мл расплавленного МПА (рН 7,2. 7,4) добавляют 2 мл 0,5%-го водного раствора метиленового синего, 1,5 мл 2%-го раствора эозина желтого, 2 г лактозы, 0,2 г дигидрофосфата калия. Растворы красителей готовят на дистиллированной воде, стерилизуют текучим паром 60 мин. Лактозу и дигидрофос-фат калия предварительно разводят в небольшом количестве стерильной дистиллированной воды и кипятят. Колонии лактозопо-зитивных бактерий на этой среде окрашены в фиолетово-черный цвет.
Агар Плоскирева предназначен для выделения сальмонелл, содержит лактозу в качестве субстрата и компоненты, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. Среду выпускают в виде порошка, в ее состав кроме питательной агаровой основы входят: желчные соли, цитрат натрия, тиосульфат натрия, фосфат натрия, бриллиантовый зеленый, кальцинированная сода, йод, хлорид натрия, лактоза, нейтральный красный. Навеску порошка растворяют в воде, кипятят и разливают в чашки Петри. Готовая среда прозрачная или розоватая. Колонии сальмонелл бесцветные, эшерихий — брусничного цвета.
Методы культивирования микроорганизмов. Наряду с общими принципами культивирование микроорганизмов различных физиологических групп имеет некоторые особенности Культивирование аэробных и факультативно-анаэробных бактерий. Плотные, жидкие или полужидкие питательные среды, засеянные чистыми культурами микроорганизмов или исследуемым материалом, помещают в термостаты (рис. 34), поддерживающие оптимальную для данного микроорганизма температуру. При температурах, превышающих верхнюю границу нормы, бактерии не только замедляют рост, но и быстро гибнут. При температуре ниже оптимальной скорость роста микроорганизма постепенно замедляется.
У мезофилов температурный оптимум находится в интервале 30. 37 ºС, у психрофилов — 10. 15 ºС, у термофилов — 50. 60 ºС.
Микроорганизмы в процессе культивирования на питательных средах при условии, что в среды не вносят дополнительные вещества, постепенно замедляют и затем прекращают свой рост из-за истощения питательного субстрата, изменения оптимальных значений биофизических показателей (рН, Eh и т.д.). Такое культивирование микроорганизмов называют периодическим. Если при этом жидкую питательную среду в процессе инкубирования посевов не перемешивают, то такой способ культивирования определяют как стационарный. При диагностических бактериологических исследованиях обычно используют именно такой способ культивирования. В биологической промышленности при производстве вакцин и других биопрепаратов, когда необходимо достичь максимального выхода бактериальной массы или экзотоксинов, применяют периодическое культивирование в жидких средах с их интенсивным перемешиванием.
При таких задачах аэробные бактерии культивируют в колбах, бутылях на шюттель-аппаратах с частотой колебания 150. 250 мин-1, что облегчает передачу бактериям кислорода и питательных компонентов.
Рис. 35. Схема ферментера для глубинного культивирования аэробных микроорганизмов.
1 – вход воздуха; 2 – выход воздуха; 3 – отбойники; 4 – мешалка; 5 — барботер
Наиболее эффективное культивирование бактерий в жидких питательных средах с максимальным выходом биопродукта достигают в ферментерах. Ферментеры (реакторы) представляют собой металлические или стеклянные культуральные сосуды емкостью от 500 мл до 1000 л (рис. 35). При культивировании бактерий в ферментерах среду перемешивают специальными мешалками с одновременной подачей необходимого количества стерильного воздуха. Ферментеры конструируют как автономные системы с автоматической регуляцией температуры и рН среды. В ферментерах также осуществляют непрерывное (проточное) культивирование, при котором в отличие от периодической культуры автоматически в среду подаются свежие питательные компоненты со скоростью, равной удалению аналогичного объема выросшей культуры бактерий. Такое непрерывное культивирование в хорошо отрегулированной системе в принципе можно продолжать неограниченно долго.
Культивирование анаэробных бактерий. Облигатные анаэробы — бактерии, у которых энергетический и конструктивный метаболизм происходит без молекулярного кислорода 02. У таких микроорганизмов в процессе дыхания конечными акцепторами
электронов являются окись углерода (IV), ионы сульфата, фумарат и др. Кроме того, молекулярный кислород действует на многие анаэробы губительно. Например, строгие анаэробы погибают при незначительных концентрациях кислорода (бактероиды, фузобак-терии), умеренные анаэробы менее чувствительны (С. perfringens), аэротолерантные анаэробы могут расти в условиях обычной атмосферы (молочнокислые бактерии). Большинство болезнетворных анаэробов относят к строгим или умеренным анаэробам. Для их культивирования используют специальные питательные среды и газовые смеси. Последними наполняют анаэростаты.
Необходимое условие роста облигатных анаэробов — не столько отсутствие молекулярного кислорода, сколько низкий ОКВП питательных сред. Резко восстановительных условий достигают, добавляя в среды редуцирующие (восстанавливающие) вещества и одновременно удаляя из них молекулярный кислород. В качестве редуцирующих веществ в питательные среды добавляют химические соединения, приведенные в таблице 1.
1. Восстанавливающие вещества для культивирования анаэробов
| Восстановитель | Е, мВ | Содержание восстановителя в среде, % |
| Тиогликолят натрия | Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском: источник |