Как берут анализ пцр у собак

Автор: Крылова Дарья Дмитриевна, молекулярный биолог, заведующая отделением ПЦР диагностики независимой ветеринарной лаборатории “Поиск”, г. Санкт-Петербург.

Для начала хотелось бы определиться, в чем же заключается смысл метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с практической точки зрения, с точки зрения ветеринарного врача. Что же должен точно понимать доктор, назначающий анализ методом ПЦР… Я не буду вдаваться ни в какие сугубо профессиональные подробности молекулярных механизмов, задействованных при проведении ПЦР. Хочется только, чтобы ветеринарный врач четко осознавал: метод ПЦР является прямым, и при проведении такого исследования предполагается, что из того клинического материала, который прислан в лабораторию, возможно выделить нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК) предполагаемого возбудителя. Это является главным постулатом. Но, несмотря на этот постулат, я очень часто сталкиваюсь с мнением, которое я назову Мифом 1, о том, что любой возбудитель любого заболевания может быть обнаружен методом ПЦР в крови. Строго говоря, в данном случае кровь фигурирует как некий собирательный образ универсального материала для исследования. Часто от нас хотят, чтобы мы поработали «со всем и на все». Это невозможно, к сожалению. Как же определить, какой возбудитель может быть найден с помощью ПЦР, а какой нет? При отборе материала для исследования методом ПЦР доктор должен в первую очередь представлять себе патогенез заболевания или заболеваний, возбудителей которых он хочет обнаружить. Если прижизненный забор необходимого материала у животного невозможен, то не стоит назначать такую диагностику. В настоящее время в арсенале лабораторий есть множество доступных способов диагностики, например метод иммуноферментного анализа. Этот метод позволяет определить наличие антител к возбудителю, их количество и по определенным критериям с большой долей достоверности – статус заболевания. Для большей ясности можно рассмотреть конкретные примеры. В очередной раз остановимся на коронавирусе кошек и, конкретно, на инфекционном перитоните. В момент мутации вируса, находящегося в кишечнике кошки, он приобретает сродство к моноцитам. Заражая моноцит, вирус попадает в кровоток кошки, это бесспорный факт, но моноцит находится в кровотоке совсем недолго, в норме около 3 дней, а дальше он должен претерпеть свою окончательную дифференцировку в тканевой макрофаг. Поэтому моноцит вместе с коронавирусом уходит из кровотока через стенки сосудов в ткани, где становится макрофагом. Есть данные, что коронавирус еще и стимулирует ускоренную дифференцировку моноцита. Из этого следует, что коронавирус, несомненно, какое-то очень короткое время находится в периферической крови животного, и, конечно же, его можно там обнаружить, но это очень редкая находка, и диагностическая значимость исследования крови на наличие коронавируса методом ПЦР является нулевой, поскольку отрицательный результат такого исследования, к сожалению, не исключает наличия коронавирусной инфекции. Также иногда у доктора есть стремление найти в крови методом ПЦР парвовирус собак и кошек. Могу предположить, что такое желание основано на лейкопении, наблюдающейся при панлейкопении или парвовирусном энтерите. Вероятно, кто-то считает, что эта лейкопения является результатом уничтожения лейкоцитов вирусом непосредственно в кровотоке. Давайте рассуждать логически: парвовирус является ДНК-содержащим вирусом, а для успешного размножения и распространения ДНК-содержащему вирусу необходимо встроиться в геном хозяина, причем в клетки, активно делящиеся, иначе как вирус будет размножаться? Всем известно, что лейкоциты в норме в крови все же не делятся. А делятся их предшественники в костном мозге. Парвовирус поражает костный мозг, и лейкопения возникает в результате уничтожения клеток-предшественников в костном мозге. Также активно делящимися клетками являются клетки ворсин кишечника, где парвовирус успешно реплицируется, и самым хорошим материалом для исследования на парвовирусную инфекцию являются экскременты животного, с помощью которых вирус распространяется во внешней среде. В общем, коронавирус и парвовирус используют кровь только в качестве, условно говоря, транспортной среды для достижения конечной локализации и покидают кровоток достаточно быстро. Есть вирусы, которые вообще не выходят в кровоток. В качестве примеров можно привести калицивирус и герпесвирус кошек. Репликация этих вирусов чаще всего ограничивается лимфоидной тканью рото- и носоглотки. Калицивирусная инфекция может протекать системно, но это достаточно редкие и тяжелые случаи.

Раз уж речь пошла о вирусных инфекциях, хотелось бы отметить, что метод ПЦР очень точен и очень специфичен, но эта специфичность и лабильность генома вирусов, особенно РНК-содержащих, в реальности может привести к тому, что конкретная тест-система для исследования методом ПЦР может обнаруживать лишь какой-то определенный штамм или несколько штаммов конкретного вируса. В качестве примера опять-таки можно рассмотреть калицивирус кошек, который имеет огромное количество сильно отличающихся штаммов, а также постоянно обнаруживаемых новых изолятов. Поэтому, к сожалению, ПЦР-диагностика калицивируса дает много ложноотрицательных результатов.

Есть масса факторов, в силу которых можно получить ложноотрицательный или ложноположительный результат. Ошибиться могут все. И до 70% ошибок происходит в момент пробоотбора. У доктора в момент взятия материала на анализ, как правило, уже имеется мнение, чем болен пациент. И зачастую доктор абсолютно прав. Но если лаборатория выдает отрицательный результат, это не доказывает автоматически ее вину. Существуют универсальные правила забора материала, например, при подозрении на бактериальную инфекцию материал отбирают до введения антибиотиков. Если забор осуществили после двухнедельной антибиотикотерапии, то логично получить отрицательный результат, хотя у животного имелось именно то заболевание, которое предполагал доктор. Есть инфекции, адекватная диагностика которых требует временных и материальных затрат владельца. Например, возбудителя трихомоноза кошек можно не обнаружить в любой порции кала, для подтверждения диагноза требуется исследовать несколько образцов фекалий, собранных с интервалом в 8-12 часов. Часто владелец животного и врач считают это сложным. Да, они правы, но это не проблема лаборатории. При диагностике того же герпесвируса кошек нельзя отбирать материал после проведения флюоресцеинового теста, поскольку краситель, попавший в забранный материал, может заблокировать ПЦР. И это только несколько примеров среди огромного количества факторов, которые должны быть учтены врачом, желающим получить адекватный результат на свой запрос.

В заключение хотелось бы написать, что, к сожалению, у меня часто складывается впечатление некоего противостояния врачей и лаборатории, по крайней мере, в России. Врачи не доверяют лабораториям, лаборатории считают некомпетентными врачей, и т.д. Мне кажется, что такого противостояния быть не должно: лаборатория всегда должна помогать врачу, а для этого доктор должен делиться с ее сотрудниками полной информацией. Я могу точно сказать, что наша лаборатория старается помочь решить любую возникшую проблему, и мы всегда готовы обсудить какие-то непонятные моменты и произошедшие недоразумения.

источник

В лабораторной диагностике ветеринарной клиники «Стелла» доступны: ПЦР-комплексы для выявления ДНК возбудителей, вызывающих инфекции, глистные инвазии и болезни кожи у собак и кошек, а также ПЦР-диагностика по определению пола у птиц и выявлению цирковируса птиц. Кроме этого, диагностика хламидиоза/микоплазмоза/уреаплазмоза теперь проводится путем выделения в культуре клеток, что позволяет более рационально подходить к лечению этих инфекций.

Стоимость каждого комплекса – от 1500 до 2000 рублей, что значительно дешевле ПЦР-диагностики, проводимой по несколько взятым возбудителям. Время исследования – 1-2 суток.

ПЦР-комплекс респираторный для собак №1 (респираторный коронавирус, вирус парагриппа, чума, стрептококк, стафилококк) – комплексный анализ для выявления инфекционных патогенов у собак с симптомами поражения верхних дыхательных путей (кашель, ринит, коньюктивит, лимфаденит, гипертермия). Актуально для щенков, подобранных на улице или взятых из приютов. Первый этап для диагностики «питомникового кашля», так как он может вызываться любым из перечисленных возбудителей.

ПЦР-комплекс респираторный для собак № 2 (аденовироз, бордетеллез, герпесвирус, хламидиоз, микоплазмоз) – диагностический комплекс на выявление патогенов, наиболее часто вызывающих воспаление верхних дыхательных путей и коньюктивы. Является вторым этапом для диагностики «питомникового кашля», при условии получения отрицательного анализа по комплексу № 1.

ПЦР-комплекс для собак № 3 вирусный (парвовирус, коронавирус, ротавирус, чума, боррелиоз) – этот вид исследования предпочтителен для собак, особенно щенков, с симптомами поражения желудочно-кишечного тракта – диарея, рвота, повышенная температура, резкое исхудание, артрит. Парвовирус и коронавирус

ПЦР-комплекс для собак № 4 инфекции, поражающие печень (токсоплазмоз, бабезиоз, инфекционный гепатит, лептоспироз, гемобартонеллез) – анализ проводится собакам, у которых присутствуют признаки поражения печени – анемия, рвота, диарея, желтушность сдизистых оболочек, признаки гепатомегалии на УЗИ.

ПЦР-комплекс для собак № 5 клещевые инфекции (эрлихиоз 1 тип, тейлериоз, бабезиоз, анаплазмоз) – анализ проводится собакам, у которых в анамнезе присутствуют укусы клещей, анемия невыясненной этиологии, гепатит.

ПЦР-комплекс для собак № 6 клещевые инфекции (гепатозооноз, эрлихиоз тип 2, бартонеллез, боррелиоз – болезнь Лайма) – анализ проводится собакам, у которых в анамнезе присутствуют укусы клещей, анемия невыясненной этиологии, артрит (полиартрит), гепатит, а также вторым этапом после комплекса № 5, когда не удается выяснить причину анемии.

ПЦР-комплекс респираторный для кошек №1 (аденовирус, токсоплазмоз, ринотрахеит, хламидиоз, микоплазмоз) – необходим для выявления патогена, вызывающего конъюктивит, ринит (слезотечение, чихание, кашель). Эти инфекции наиболее часто встречаются у кошек, приобретенных в питомниках и подобранных на улице. При выявлении микоплазмы рекомендуется дополнительно сдать анализ на определение чувствительности к антибиотикам.

ПЦР-комплекс урогенитальный для кошек № 2 (уреаплазмоз, токсоплазмоз, хламидиоз, микоплазмоз, цитомегаловирус) – рекомендуется обследовать кошку перед вязкой, а также кота, во избежание внутриутробного инфицирования плодов. Также обследуется кошка, если вязки были неудачными или ветврач диагностирует цистит, пиометру.

ПЦР-комплекс для кошек № 3 вирусный (иммунодефицит, инфекционный перитонит, лейкемия, гемобартонеллез, панлейкопения) – данный вид комплексного обследования желательно проводить породистым кошкам – британцам и шотландцам, аббисинцам, персидским породам. Но не забываем и про домашних кошек! В каком случае? Если наблюдается диарея неясной этиологии, истощение, анемия, гингивит, дерматит, увеличение объема живота. Очень часто встречается одновременно несколько инфекций.

ПЦР-комплекс для кошек № 4 инфекции слизистых оболочек (вирус паппиломы тип 1 и 2, вирус саркомы, стрептококк и стафилококк) – для диагностики берется смыв, если у кошки образовались паппиломы, язвы или опухоли в ротовой полости (если ветврачом исключена калицивирусная инфекция или терминальная стадия почечной недостаточности).

ПЦР-комплекс для кошек № 5 клещевые инфекции (анаплазмоз, тейлериоз, бабезиоз, риккетсиоз) – вопреки мнению, при укусах клещей кошкам, как и собакам, передаются кровепаразиты, которые разрушают эритроциты и вызывают гепатит, нефрит. Очень часто протекают скрыто. Поэтому, если у животного наблюдается анемия, гепатит, желудочно-кишечные расстройства, особенно после укуса клещом, его кровь лучше проверить на кровепаразитов.

ПЦР-комплекс для обнаружения микрофлоры, вызывающей пародонтит (трепонема, актинобациллы, порфирономас гингивалис и другие)– стоматолог может назначить этот вид диагностики, если обнаруживает у животного чрезмерное отложение зубного налета, стоматит, пародонтит, кариес, расшатывание зубов. Выделение возбудителя позволяет правильно назначить лечение и подобрать антибиотики.

ПЦР-комплекс для выявления бактериальной микрофлоры кожи (золотистый стафилококк, стрептококк, кишечная палочка, протей мирабилис) – актуален при дерматитах собак и кошек, хорьков, когда животное длительно страдает и ситуация не позволяет ждать результатов бакпосева.

ПЦР-комплекс для выявления дерматофитов кожи (эпидермофития, трихофития, микроспория, малассезия) – перечисленные грибы являются самыми часто встречающимися патогенами, вызывающими грибковые инфекции кожи (стригущий лишай, атопический дерматит, наружный отит и межпальцевый дерматит). Необходима очень точная дифференциация с помощью ПЦР-диагностики, так как обычный мазок не всегда позволяет это сделать.

ПЦР-комплекс для выявления гельминтов (анкилостомоз, токсокароз, криптоспоридиоз, описторхоз) – очень часто у щенков и котят глистные инвазии протекают скрыто. Животное здорово на вид, хорошо кушает. Яйца гельминтов не всегда выделяются с калом. Поэтому обычный анализ на яйцеглист иногда оказывается ложноотрицательным. В данном случае лучше проводить ПЦР-исследование на наличие гельминтов.

Подробную информацию об исследованиях узнавайте по телефонам: 8 (495) 709-8465, +7-909-930-69-60.

источник

Собаки подвержены многим вирусным заболеваниям и самые распространенные из них – парвовирусный энтерит, коронавирусный энтерит, чума плотоядных, инфекционный аденовироз, парагрипп.

Парвовирусный энтерит – вирусное заболевание, возбудитель которого вызывает острые желудочно-кишечные болезни у собак. Энтерит чаще всего поражает щенков, но могут также болеть и взрослые животные.

Заболевание следует подозревать у щенков, не вакцинированных или не полностью вакцинированных собак с соответствующими клиническими признаками, а также у животных, живущих при скученном содержании. Диагноз на парвовирусный энтерит ставится комплексно с учетом:

• анамнеза (отсутствие вакцинации, нарушение рекомендаций по выполнению и рекомендуемых сроков вакцинации),
• клинической картины (рвота, понос, вялость, анорексия),
• клинического и биохимического анализа крови.

Во время болезни у большинства собак развивается лейкопения (от умеренной до тяжелой), преренальная азотемия, гипоальбуминемия, гипонатриемия, гипокалиемия, гипохлоремия и гипогликемия, увеличение активности ферментов печени. Широко используются фаст-тесты ИХА, диагностическая ценность которых находится под вопросом, так как они могут давать как ложноотрицательные, так и ложноположительные результаты. Самым достоверным методом считается ПЦР-диагностика, которая обнаруживает фрагменты генов возбудителя. Для исследования берутся смывы из прямой кишки. Также есть диагностика ИФА методом, которая обнаруживает антитела к возбудителю, но повышенные титры могут быть также у носителей, переболевших или недавно вакцинированных животных.

Коронавирусный энтерит протекает с длительной диареей, приводящей к быстрой потере тургора кожи. Если парвовирус переносится крайне тяжело и нередко становится причиной гибели организма, то коронавирус обычно проходит легко, а симптомы его менее выражены. Опасность представляет возникающее обезвоживание и нарушение межклеточного обмена (особенно это выражено у щенков). В остальном клиническая картина у инфекций похожа. Она не имеет характерной выраженности, поэтому ПЦР-тест и лабораторное обследование, направленные на изучение смывов из прямой кишки, подтверждают или опровергают предположение специалиста.

Чума плотоядных поражает одновременно или выборочно ЖКТ, дыхательную и нервную систему. Соответственно локализации условно выделяют три ее вида: кишечная, респираторная и нервная. Чаще всего встречается одновременное присутствие нескольких типов. Даже на начальном этапе заметны изменения в конъюнктиве глаз.

Первые признаки чумки включают резкое повышение температуры тела. Владелец наблюдает выделение гноя из носа путем чихания или истечения, вокруг глаз образуется корка. Сразу появляются вялость, многократная рвота и частые позывы на нее. Сразу после окончания инкубационного периода стул может быть нормальной консистенции, но в короткое время развивается диарея вплоть до профузной. Депрессия и отказ от пищи –обычные симптомы.

Чтобы выделить носителя врач берет смывы. ПЦР-исследованию подлежат образцы истечения из глаз, слизистой носа и кишечника.

Аденовирусная инфекция сопровождается тяжелым состоянием, организм длительное время является вирусоносителем. При заражении формой 1 (CAV-1) животное выявляет признаки инфекционного гепатита. Тип 2 поражает дыхательные пути.

Инфекционный гепатит поражает клетки печени. На слизистой оболочке органов желудочно-кишечного тракта возникает воспалительный процесс. Резкое повышение температуры приводит к обезвоживанию. Увеличенная нагрузка на дыхательную систему в сочетании с растущей бактериальной атакой приводит к застойным явлениям. Наблюдаются нарушения в работе ЦНС.

Подтверждение диагноза не всегда возможно из-за перебоев с поставками необходимых для лабораторий реактивов.

Аденовироз респираторный устанавливается после ПЦР-исследования пробы с гортани.

источник

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной диагностики, ставший для многих инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Высокая чувствительность и специфичность метода позволяют гарантированно обнаруживать единичные возбудители в биологическом материале на основе их генетической информации. Аналитическая чувствительность ПЦР для большинства вирусов и бактерий составляет 1000 микроорганизмов в 1 мл пробы. Специфичность ПЦР для вирусных, хламидийных, микоплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР был разработан сравнительно недавно, но к настоящему времени успел занять передовые позиции как в медицинской, так и в ветеринарной лабораторной диагностике инфекционных и инвазионных заболеваний. Основные принципы ПЦР открыл в 1983 году американский химик Кэри Б. Мюллис, за что и был удостоен Нобелевской премии.

ПЦР-анализ состоит из нескольких этапов. Первый этап — пробоподготовка — заключается в обработке исследуемого материала (приготовление суспензии, центрифугирование). На втором этапе проводится выделение наследственного материала — ДНК или РНК — из клеток. При этом после лизиса клеток и разрушения комплекса «ДНК-белок» производится осаждение ДНК или РНК на сорбенте с последующим переходом их в элюирующий буфер. На третьем этапе проводится амплификация, то есть умножение количества специфических участков ДНК. Для этого используются тест-системы, в состав которых входят праймеры — олигонуклеотиды, которые являются специфическими для каждого возбудителя. К разлитой в микропробирки ПЦР-смеси добавляют образцы и контроли, которые помещают в амплификатор или термоциклер — программируемый термостат с высокой скоростью и точностью задаваемой температуры. Процесс амплификации заключает в себе три стадии: денатурация, отжиг и элонгация. При определении в клинических образцах РНК-содержащих вирусов амплификации предшествует стадия обратной транскрипции, при которой РНК переводят в форму ДНК с использованием фермента обратной транскриптазы, или ревертазы. Четвертый этап ПЦР-диагностики заключается в проведении электрофоретической детекции продуктов ПЦР — ампликонов. При этом продукты ПЦР помещают в лунки агарозного геля и подвергают действию постоянного электрического тока, в результате чего отрицательно заряженная молекула ДНК движется к положительному электроду. В состав геля входит бромид этидия, который, образуя устойчивый комплекс с ДНК, делает эти полосы хорошо заметными при просмотре под ультрафиолетовым облучением (рис. 1).

Следует отметить, что для получения достоверного результата ПЦР-анализа необходимым условием является соблюдение правил отбора, хранения и транспортировки клинического материала. Несмотря на то, что ПЦР является очень чувствительным методом, желательно наличие определенного количества возбудителя в пробе.

Взятие материала для ПЦР-исследования следует проводить в одноразовых неталькованных перчатках (так как тальк угнетает ПЦР). При взятии соскобов и смывов следует пользоваться одноразовыми стерильными зондами с повышенной адсорбцией (имеющими на конце щеточку), так как они отбирают оптимальное количество материала.

Соскобы и смывы со слизистых оболочек носа, ротовой полости, влагалища, конъюнктивы отбирают в одноразовые пластиковые микропробирки — эппендорфы — объемом 1,5 мл, в которые разлито по 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Желательно не использовать зонды с ватными наконечниками. Следует также избегать отламывания кончика зонда в пробирку с физиологическим раствором, так как это затрудняет дальнейшую обработку и повышает риск перекрестной контаминации проб. Для получения необходимого количества материала достаточно вращать зонд в пробирке в течение 1-2 минут, избегая разбрызгивания жидкости. Проба должна быть мутной на вид, а при отстаивании в ней должен образовываться небольшой осадок.

Забор крови проводят одноразовой иглой в одноразовый шприц или в стеклянную пробирку без антикоагулянта. При заборе в шприц, кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую стеклянную пробирку. Возможно использование вакуумных систем («Vacuette») для забора крови. Для исследования можно предоставить сыворотку крови: пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 минут до полного образования сгустка, затем центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 10 минут и переносят в количестве не менее 1 мл в стерильные эппендорфы объемом 1,5 мл.

Сперму отбирают в стерильные одноразовые пробирки или флаконы.

Моча. Отбирают первую порцию утренней мочи в количестве не менее 20-40 мл в стерильный сухой флакон или пробирку.

Фекалии. Отбирают пробы массой 1-3 грамма из предварительно продезинфицированного и вымытого лотка, одноразовыми лопаточками переносят в стерильный флакон.

Кусочки пораженных органов от павших животных отбирают в стерильные одноразовые контейнеры или в чистые стеклянные или пластиковые емкости.

Следует строго соблюдать температурные режимы хранения и транспортирования отобранного материала. Транспортирование осуществляют в термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом. При хранении материала более суток его необходимо заморозить при Т минус 20°С.

Наиболее часто встречающимися заболеваниями у кошек и собак являются конъюнктивит, ринотрахеит, а также энтерит. Для того чтобы выяснить этиологию заболевания, требуется провести качественную лабораторную диагностику.

Причиной коньюнктивитов или инфекций верхнего респираторного тракта у кошек может быть инфицирование следующими микроорганизмами: герпесвирус типа 1 (FHV1), калицивирус кошек, Chlamediapcittaci. Mycoplasma felis, Bordetella bronchiseptica, Feline reovirus, Staphylococ-cuc aureus, Brohaemolytic streptococcic и Salmonella tephimurium.

Наиболее частой причиной, по данным различных авторов и методов исследования, являются герпес-вирус типа FHY1 (от 10% до 34%) и калицивирус кошек (от 20% до 53%). Chlamydia pcittaci (от 10% до 35%).

Герпесвирусная инфекция, ассоциирована абортами, высокой смертностью новорожденных (инфицирование почти 60% случаев) с признаками интерстициальной пневмонии.
Калицивирус — тяжело протекает у котят, в то же время 25-80% переболевших взрослых животных становятся носителями и являются источником заражения, передавая вирус через слюну.

Панлейкопения — контагиозное вирусное заболевание кошек, характеризующееся резким падением уровня лейкоцитов, гастроэнтеритом, ринитами с конъюнктивитами, высокой смертностью (30-90 % заболевших котят).

Настоящим бичом для питомников является инфекционный перитонит кошек — тяжелое заболевание, возбудителем которого является РНК-содержащий высокопатогенный вирус. Вирус реплицируется в миндалинах и энтероцитах тонкого кишечника, рассеиваясь по организму через макрофаги и моноциты. Коронавирусы с низкой вирулентностью вызывают энтериты средней тяжести, чаще всего у котят после отъема от матери. Высоковирулентный коронавирус может привести к развитию сухого или выпотного перитонита. Перитонит часто сопровождается почечной недостаточностью, печеночными и неврологическими симптомами.

При инфицировании аденовирусами обоих типов и вирусом чумы плотоядных у собак проявляется общий комплекс симптомов: лихорадка, конъюнктивиты и ринотрахеиты, расстройство желудочно-кишечного тракта, поражение нервной системы.

При чуме плотоядных клинические признаки могут включать серозно-слизистые назальные и конъюнктивальные выделения, кашель, одышку, пневмонию, рвоту и понос, а также лихорадку и гиперкератоз.

Аденовирус плотоядных. Возбудитель — ДНК-содержащий аденовирус плотоядных первого типа (вызывает инфекционный гепатит плотоядных) и второго типа (вызывает аденовироз собак). Наблюдаются лихорадка, апатия, анорексия, жажда, рвота и понос, болезненность брюшной стенки при пальпации. Иногда развиваются конъюнктивит, кератит, светобоязнь. Могут быть точечные кровоизлияния на слизистой оболочке и коже. Редко наблюдаются неврологические нарушения.

Все перечисленные заболевания имеют высокий индекс контагиозности и ассоциированы с высокой смертностью среди щенков, от парвовирусного энтерита погибает 10-50% заболевших щенков, при инфицировании не вакцинированных щенков вирусом чумы плотоядных смертность доходит до 100%.

Токсоплазмоз. Возбудитель — простейшее Toxoplasma gondii. Размножение возбудителя происходит у кошек на стенках кишечника. С калом они выделяют во внешнюю среду ооцисты.

Промежуточными хозяевами могут быть кошка, собака, человек. У кошек развитие паразита в кишечнике обычно проходит бессимптомно, изредка вызывая «легкий» понос.

Тканевые цисты могут вызывать анорексию, угнетение, кератиты, желтуху, рвоту, понос и неврологические симптомы в зависимости от пораженных органов. У собак клинические симптомы зависят от пораженных органов: могут наблюдаться неврологические нарушения (тремор, атаксия, паралич) или токсоплазмозный миозит (нарушение походки, атрофия мышц, ригидность), а также миокардит и гепатит.

Хламидиоз и орнитоз. Возбудители у кошек — Chlamydophila felts, у собак — Chlamydophila abortus, Ch. pecorum, у тех и у других заболевание может вызывать Ch. psittaci. У птиц — Ch. psittaci.
У кошек заболевание проявляется в основном в форме гнойных и негнойных конъюнктивитов и кератитов, также могут наблюдаться ринит, пневмония, вагинит, аборты и бесплодие. У котят встречается неонатальныи хламидиозный конъюнктивит. У собак симптомы разнообразны и проявляются воспалительными заболеваниями конъюнктивы, половых органов, гастритами, артритами, абортами и бесплодием. Есть данные о роли хламидий в патогенезе атеросклероза у собак.

Микоплазмоз. Возбудители — микроорганизмы рода Mycoplasma. Протекает с признаками бронхопневмонии, кератоконъюктевитов и кератитов.

Вирусный иммунодефицит кошек. Иммунодефицит кошек — тяжелое заболевание, вызываемое вирусом из семейства Retrovoridae, рода Lentivirus. Вирус поражает иммунную и нервную системы. Обладает тропизмом к Т-лимфоцитам. В результате иммунодепрессии организм становится беззащитным против бактерий, грибов, вирусов и погибает от вторичной инфекции.
Клинические признаки развиваются медленно, и заболевание чаще регистрируется среди кошек 6-10 лет.

Встречаются у домашних животных и такие заболевания как: лептоспироз собак, листериоз кошек и собак, иерсиниоз щенков, бруцеллез, ротовирусный энтерит, бешенство.

Правильность постановки ПЦР-анализа и качественное выделение инфекции зависит, в первую очередь, от правильности взятия материала, во-вторых, от соблюдения температурного режима хранения и транспортирования проб. Поступившая в лабораторию проба регистрируется, проходит все стадии ПЦР, подвергается электрофоретической детекции с последующей выдачей конечного результата.

Таким образом, высокая чувствительность и специфичность ПЦР-метода позволяет гарантированно обнаруживать единичных возбудителей в биологическом материале за короткий промежуток времени, что позволяет поставить точный диагноз, назначить адекватное лечение и разработать профилактические мероприятия.

И.М. Донник, член-корреспондент РАСХН, д.б.н., профессор, Н.А. Пелевина, м.н.с, О.Г. Бодрова, м.н.с,
ГНУ Уральский государственный научно-исследовательский ветеринарный нститут РАСХН

Журнал «Ветеринарная клиника», июль, 2007

источник

Парвовирусная инфекция собак — вызывается вирусом из семейства Parvoviridae. Это ДНК – содержащий вирус, родственный с вирусом панлейкопении кошек, но поражает только представителей семейства псовых и енотовых.

Парвовирус очень устойчив в окружающей среде, (в каловых массах может сохраняться более 5 месяцев), устойчив к большинству дезинфектантов, но погибает в формалине, гидроокиси натра и при хлорировании.

Отличается очень высокой контагиозностью. Основным источником распространения болезни служат фекалии больных и переболевших собак. Заражение происходит через пищу, предметы ухода, загрязненные калом, а также вирусы, находящиеся на шерсти и лапах выздоравливающих собак.

Инфицирование происходит через пищеварительный тракт. После проглатывания вирус размножается в лимфоидных клетках носоглотки, пейеровых бляшках кишечника. С кровью попадает в другие лимфоидные ткани, костный мозг, лёгкие, печень и почки. Размножение вируса происходит в клетках с высоким уровнем деления, поэтому он поражает в основном клетки крипт кишечника, ткани лимфопоэза, незрелые эритроциты и лейкоциты, а у щенков младше 4 недель — сердечные миоциты.

Выделение вируса с калом начинается через 3-5 дней после начала болезни и длится от 12 до 25 дней. Значительную роль играет выделение вируса собаками с субклиническим течением заболевания. Инкубационный период составляет 4-7 дней. Болеют собаки всех возрастов, но наиболее чувствительны щенки, а у собак старшего возраста заболевание обычно проявляется в субклинической форме. Клинические симптомы включают повышение температуры, рвоту, анорексию, понос, что приводи к обезвоживанию и снижению возможности нормально усваивать пищу. Сердечная (миокардиальная) форма болезни встречается редко у щенков в возрасте от 8 недель до 2 мес., которые не имеют материнских антител. У выздоровевших животных иммунитет может сохраняться в течение всей жизни. Для создания иммунитета против парвовирусного энтерита собак, применяют вакцину против парвовирусных инфекций плотоядных.

Предварительный диагноз ставится на основании анамнеза, характерных клинических симптомов, результатов общего анализа крови (выраженная лейкопения). Окончательный диагноз устанавливается только после непосредственного нахождения вируса в кале или смывах с прямой кишки. Для выявления парвовируса собак используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на обнаружении ДНК или РНК возбудителя, а также серологические тесты.

Материал для исследований должен отбираться от животных не ранее, чем через 21 день после иммунизации их живыми вакцинами. Для исследования используют фекалии и мазки со слизистой прямой кишки. Кал собирается в чистую пластиковую посуду и доставляется в лабораторию.

Мазки со слизистой прямой кишки берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл стерильного физиологического раствора. Конец зонда отрезают, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают. Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий день, сохраняя при комнатной температуре до 30 мин, при температуре от 2 до 8 °С – до 12 ч. Допускается хранение материала при температуре не выше минус 16 °С в течение 30 дней. Повторное замораживание образцов не допускается.

Парвовирус собак обнаружен:

— При наличии клинических симптомов говорит о заболевании;

— При диагностике методом ПЦР возможно появление ложноположительных результатов, связанных с тем, что метод, обладая высокой чувствительностью, может реагировать на вакцинный штамм, поэтому необходимо, чтобы после вакцинации прошло не менее 3-х недель;

— После лечения и исчезновения клинических признаков, некоторое время вирус может обнаруживаться в организме, до тех пор, пока не произойдет его полная элиминация;

— Может быть, при бессимптомном вирусоносительстве.

Парвовирус собак не обнаружен

— Отсутствие парвовируса у животного;

— Наличие другого заболевания, которое протекает с похожими клиническими признаками;

— В случае бессимптомного вирусоносительства не всегда удается обнаружить вирус, так выделение вируса происходит нерегулярно.

Светлакова Е.С
Ветеринарный врач-лаборант
лаборатории «BIOVETLAB»

источник

1. Хламидиоз животных (семейство Chlamydiaceae)

Хламидиоз (Chlamydiosis) — это большая группа болезней, объединенных этиологически, но в большинстве своем различающихся по характеру течения инфекционного процесса и формам его клинического проявления. Хламидиозы характеризуются абортами маточного поголовья (коровы, овцы, козы, свиньи, лошади), рождением нежизнеспособного или слабого молодняка с симптомами пневмонии, полиартритов, энтеритов, энцефаломиелитов и конъюнктивитов. Хламидиозы относятся к зооантропонозам с выраженной природной очаговостью. Хламидии биологически родственные микроорганизмы, характеризуются «группоспецифическим» родством, в отличие от других представителей микромира, что и определяет их таксономическое положение в системе микроорганизмов на уровне самостоятельного рода Chlamydiales. Они являются грамотрицательными облигатными внутриклеточными паразитами, обладающими особым циклом развития. С вирусами их сходство — в облигатном внутриклеточном паразитировании, т.е. они размножаются только внутри клеток макроорганизма. Выделенные хламидии от разных видов животных и птиц отличаются между собой по патогенности и антигенным свойствам. К хламидиям (семейства Chlamydiacеae) чувствительны все виды с/х животных и птиц.
Показания к назначению: для диагностики хламидиоза животных и птиц.

Биологический материал для анализа: для исследования используют: соскобы слизистых оболочек (конъюнктивы, урогенитального тракта, а у птиц — клоаки), помет птиц, паренхиматозные органы павших или вынужденно убитых животных и птиц, кусочки плодовых оболочек, паренхиматозные органы и перевязанный с двух сторон сычуг аборт-плодов, сперму замороженную (или пробы эякулята), мочу от производителей, подозрительных по заболеванию.

2. Чума плотоядных (Canine Distemper virus)

Чума плотоядных – высококонтагиозная болезнь, проявляющаяся лихорадкой, воспалением слизистых оболочек глаз, дыхательных путей, кожной экзантемой и тяжелым поражением нервной системы. Заболевание регистрируется в любое время года, но весной и осенью протекает преимущественно в виде эпизоотий. Летальность колеблется от 50 до 80%. Чуму плотоядных вызывает РНК-содержащий вирус из семейства Paramyxoviridae, имеющий близкое родство с вирусом кори человека и вирусом чумы крупного и мелкого рогатого скота. Возбудитель относительно устойчив к действию внешних факторов. В выделениях больных животных, во внешней среде при температуре 4°С вирус сохраняется 7-11 дней, а при 100°С погибает мгновенно.

Чума плотоядных до сих пор признается трудноизлечимым заболеванием. Это связано с тем, что болезнь сопровождается поражением центральной нервной системы, при котором до настоящего времени не разработана эффективная терапия, и вызывается вирусом, на который сложно воздействовать из-за особенностей его цикла репродукции. К тому же следует дифференцировать другие заболевания, характеризующиеся сходными клиническими признаками, – парвовирусный энтерит и др. В связи с этим роль ранней диагностики чумы собак, до проникновения вируса через гематоэнцефалический барьер, является наиболее важной для владельцев животных и ветеринарных специалистов, оказывающих помощь больным.

Метод ПЦР позволяет достаточно быстро и точно выявлять РНК вирус чумы плотоядных (Canine Distemper virus). При соблюдении всех мер профилактики контаминации проб требуется всего 3-8 часов от взятия клинических проб до получения надежного диагноза.

Показания к назначению: диагностика чумы плотоядных.

Биологический материал для анализа: мазки или смывы (в малом объеме – не более 300 мкл жидкости) конъюнктивы глаз, мазки со слизистой носа, мазки со слизистой прямой кишки, цельная кровь, плазма крови, сыворотка крови, фекалии животных.

3. Ринотрахеит кошек (Feline herpes virus)

Инфекционный ринотрахеит кошек — остропротекающая вирусная инфекционная болезнь, сопровождающаяся поражением глаз и органов дыхания.

Возбудитель — ДНК содержащий вирус семейства Herpesviridae. Заболеваемость составляет 50%, смертность 5-20%. Вирус ИРТ кошек является видоспецифическим заболеванием, которое не опасно для других видов домашних животных и человека. Зараженные и переболевшие кошки являются источником возбудителя инфекции. Даже после полного выздоровления, кошки становятся переносчиками ринотрахеита еще на 8-9 месяцев. Заражение осуществляется через выделения из носа, глаз и половых органов. Передача вируса так же происходит через воздух, предметы ухода, насекомых, корма. Аэрогенный способ заражение самый распространенный в естественной среде.

Показания к назначению: ринотрахеит кошек

Биологический материал для анализа: смывы с конъюнктивы глаз и поврежденной слизистой носоглотки, а также с изъязвлений слизистой ротовой полости.

4. Вирус кальцивироза кошек (Feline calicivirus)

Возбудитель калицивироза — инфекционного заболевания кошек, проявляющегося повышением температуры, конъюнктивитом, изъязвлением слизистых ротовой и носовой полости, хромотой. Симптомы — возникновение язв в ротовой полости, слюнотечение, общее недомогание, гипертермия, иногда конъюнктивит, чихание, отказ от еды, одышка. Большинство кошек после выздоровления выделяют вирус в течение 75 дней, а некоторые — в течение всей жизни.

Показания к назначению: 1) Диагностика калицивироза кошек; 2) Установление калицивирусной этиологии: артриты; заболевания дыхательной системы; заболевания глаз; язв ротовой полости 3) Оценка эффективности лечения.

Биологический материал для анализа: соскобы из язв ротовой полости; смывы со слизистой конъюнктивы глаз; смывы со слизистой носа и ротоглотки.

5. Коронавирус кошек и собак (Canine Coronavirus, Feline Coronavirus)

Возбудителем коронавирусной инфекции у собак является Canine coronavirus, вызывающий острый коронавирусный энтерит. Заболевание передается при непосредственном контакте с носителем вируса (через слюну и фекалии). Данной инфекции подвержены собаки любого возраста, однако чаще всего поражаются щенки и ослабленные животные, которые уже перенесли другую болезнь, например, парвовирусную инфекцию. Основные симптомы заболевания — рвота и диарея, иногда с примесью крови, обезвоживание организма, потеря в весе, апатия. Через 3-4 недели после выздоровления может развиться повторное заболевание. При проведении диагностики коронавирусный энтерит собак необходимо дифференцировать от парвовирусного энтерита, аденовирусной инфекции кишечного типа и чумы плотоядных.
Коронавирусы, поражающие кошек, представлены двумя биотипами: FECV, или коронавирус энтерита кошек, и FIPV — вирус инфекционного перитонита кошек (2, 3). Носителями FECV является 16-50% домашних кошек, у которых вирус локализуется в тонком кишечнике, не вызывая заболевания или становясь причиной легкой диареи. В то же время у 5-12% носителей может наблюдаться мутация условно-патогенной кишечной формы FECV в патогенную (FIPV), что приводит к развитию болезни.

Показания к назначению: 1) Диагностика коронавирусного энтерита собак и кошек; 2) Неясная клиническая картина; 3) Контроль эффективности терапии; 4) Профилактические скрининговые исследования (для исключения вероятности бессимптомного течения инфекции).

Биологический материал для анализа: плазма крови, асцитическая жидкость и фекалии

6. Аденовирус плотоядных (Canine adenovirus I, II)

Canine adenovirus I вызывает гепатит плотоядных. Поражаемые ткани – преимущественно паренхиматозные органы (особенно печень), глаза и эндотелий.
Попадание вируса ороназальным путем ведет к локализации вируса в миндалинах и виремии в течение 4-8 дней, слюна и фекалии становятся заразными в период начальной виремии. При адекватной выработки антител, вирус удаляется через 10-14 дней из большинства органов, устойчиво остается в почечных канальцах, откуда может выделяться с мочой в течение 6-9 мес. Хронический гепатит – может развиться только при частичном ответе нейтрализующих антител. Цитотоксическое повреждение глаза – формирование переднего увеита и классического признака «голубого глаза».

Canine adenovirus II вызывает аденовироз собак (инфекционный ларинготрахеит) Основные симптомы – это кашель и выделения из носа. Кашель часто усиливается от питья, еды и выхода на свежий воздух. Характерным кашлем при аденовирозе является кашель до рвоты или отрыжки. При этом увеличиваются лимфатические узлы, и часто повышается температура. Возможны конъюнктивиты. Кроме того, имеют место различные диспептические явления: понос (часто с кровью), иногда рвота. Собака угнетена, аппетит снижен. В каловых массах остатки непереваренного корма. Температура субфебрильная или нормальная.

Показания к назначению: 1) Диагностика гепатита плотоядных, аденовироза собак. 2) Подозрения на аденовирусную этиологию гепатита, поражения глаз, ларинготрахеита, увеличения лимфатических узлов, диспептических явлений. 3) Скрининговые исследования.

Биологический материал для анализа: смывы с конъюнктивы (в первую неделю после появления конъюнктивита), выделения из носа (в первую неделю после их появления), фекалии (при наличии расстройства ЖКТ) и сыворотка крови (при подозрении на гепатит собак)

7. Микоплазмоз плотоядных (Mycoplasma)

Возбудители микоплазмоза относятся к классу Mollicutes и являются грамотрицательными очень мелкими (0,2 – 0,3 мкм) организмами, характеризующимися отсутствием жесткой клеточной стенки. Заражение микоплазмами происходит воздушно-капельным путем, контактным путем через предметы обихода, половым и натальным путем во время прохождения плода через родовые пути. Микоплазмоз встречается как у животных при групповом содержании (питомники), так и при одиночном содержании. Наиболее часто болеют молодые животные или животные с ослабленной иммунной системой. Микоплазмоз у животных часто сопровождается вторичной бактериальной инфекцией. Заболевание часто переходит в хроническую форму. Микоплазмоз проявляется одно- или двухсторонними конъюнктивитами с серозными, а затем и слизисто-гнойными выделениями, ринитами, пневмониями, артритами, кожными абсцессами. Могут наблюдаться циститы, вагиниты, уретриты, нарушения желудочно-кишечного тракта. Микоплазмы могут быть причиной бесплодия и абортов у самок, рождения нежизнеспособного молодняка.

Показания к назначению: 1) Диагностика микоплазмоза плотоядных.

Биологический материал для анализа: назальные, конъюнктивальные смывы, истечения, синовиальная жидкость суставов, желток, аллантоисную жидкость эмбрионов, паренхиматозные органы, трахею, воздухоносные мешки павшей птицы, цельную кровь, сыворотки (лечебные), культуры клеток (оптимальная концентрация 10 6 клеток в мл), сперма в объеме не менее 2 мл.

8. Вирус иммунодефицита кошек (Provirus)

Вирус иммунодефицита кошек — ретровирус, для которого свойственна тропность к клеткам лимфоидной ткани. При заражении кошки вызывает синдром иммунодефицита.

Распространяется в кошачьей популяции парентеральным путем, обычно через рану, редко — трансплацентарно или в процессе родов. Могут поражаться нервные клетки, мегакариоциты и мононуклеарные клетки костного мозга. Если к поражению, вызванного вирусом иммунодефицита присоединяется вирус лейкоза кошек, то это приводит к поражению почек, головного мозга, печени и других тканей. Заболеваемость повышается с возрастом, наиболее часто выявляется в 5 лет. Коты более подвержены риску заражения. Активному распространению инфекции способствует вольный образ жизни кошки и контакты с другими бродячими животными. Первыми признаками инфекции могут быть рецидивирующие болезни верхних дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта. Затем развиваются умеренная или выраженная лимфаденопатия, лимфосаркома или другие новообразования. На фоне иммунодефицита у 25-50% животных возникают гингивит, стоматит, периодонтоз; в 30% случаев — ринит, конъюнктивит, кератит; в 10-20% случаев — персистирующая диарея, вызванная инфекцией (бактериальной, вирусной, грибковой или паразитарной) или обусловленная прямым воздействием вируса на эпителий кишечника. Активизируется хроническая бактериальная или микотическая инфекция, наблюдаются поражения глаз по типу переднего увеита, хориоретинита, глаукомы; неврологические расстройства (периферическая нейропатия). Лихорадка и слабость наиболее выражены на поздних стадиях болезни и возможно обусловлены высоким уровнем фактора некроза опухоли.

Показания к назначению: 1) Диагностика вируса иммунодефицита кошек

Биологический материал для анализа: цельная кровь.

9. Парвовирусный энтерит собак и панлейкопения кошек (Canineparvovirus, Felinepanleukopeniavirus, Minkenteritisvirus)

Высококонтагиозная вирусная болезнь собак, характеризующаяся в основном острым геморрагическим энтеритом, обезвоживанием организма, лейкопенией и миокардитом. ДНК-содержащий вирус, относится к семейству Parvoviridae роду Parvovirus. Существует две разновидности парвовируса собак (ПВС): ПВС-1 и ПВС-2. Наиболее опасен патогенный ПВС-2, который обусловливает острые парвовирусные энтериты у собак. Заражение происходит в основном фекально-оральным способом через инфицированные ПВС корма и воду, а также контактным — при обнюхивании и облизывании непосредственно больных животных или инфицированных ими объектов внешней среды. Инкубационный период при парвовирусном энтерите составляет обычно от 4 до 10 дней, а у 1-2 месячных щенков — 1-3 дня. Заболеванию подвержены собаки любого возраста, но наиболее восприимчивы к болезни щенки в возрасте от 2 до 16 недель. Это объясняется тем, что возбудитель ПВС-2 особенно быстро размножается в клетках с высоким уровнем митоза (основная форма клеточного деления), а у щенят в возрасте до 4 недель активно делятся клетки миокарда, позднее — клетки лимфоидной ткани, костного мозга и эпителия кишечных крипт. Наиболее часто болезнь наблюдают у щенков, полученных от невакцинированных сук. В зависимости от степени выраженности клинических признаков условно разделяют три основные формы болезни: сердечную, кишечную и смешанную.

Показания к назначению: диагностика и выявление ДНК парвовирусов (Canineparvovirus, Felinepanleukopeniavirus, Minkenteritisvirus), вызывающих парвовирусный энтерит собак и норок и панлейкопению кошек

Биологический материал для анализа: в мазках со слизистой прямой кишки и фекалии.

источник

Бактериальные и вирусные заболевания — одни из наиболее часто встречающихся заболеваний домашних животных. Это, например, пироплазмоз, лептоспироз, гепатит, чумка, герпесвирус, калицивироз, хламидиоз и др.

До настоящего времени диагностика таких заболеваний вызывала затруднения, поскольку существующие виды анализов из-за их малой доступности не нашли широкого применения в ветеринарии. Зачастую работа по диагностике и лечению вирусных и бактериальных инфекций строится на основании одних лишь симптомов заболевания и личного опыта врача. При этом нужно учитывать, что часто различные вирусы и бактерии могу вызывать одинаковые симптомы заболевания. Разумеется, рассчитывать на высокую эффективность лечения при таких условиях невозможно. Но с появлением нового диагностического инструмента — анализа ПЦР — ситуация существенно изменилась! Теперь на основании данного анализа ветврач может точно определить заболевание и назначить эффективное лечение или скорректировать уже проводимое.

С октября 2016 г. ПЦР-диагностика вирусных и бактериальных заболеваний проводится и в лабораториях клиник «Доктор Вет»!

ПЦР (полимеразная цепная реакция) — высокоточный метод диагностики многих инфекций, который основывается на исследовании генетического материала животных (ДНК и РНК). Это один из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

ДОСТОИНСТВА МЕТОДА

Универсальность. ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы.

Специфичность. При поиске определяется вид конкретного возбудителя. Кроме того в одном биологическом материале, возможен поиск нескольких возбудителей без ущерба для качества полученных данных.

Чувствительность. Результат будет получен даже при минимальном содержании возбудителя в материале, например, на начальной стадии заболевания или если заболевание не вылечено окончательно. А лечение болезни на раннем этапе значительно повышает эффективность и скорость выздоровления пациента, предотвращает риски осложнений.

Оперативность. Результат анализа готов уже через сутки.

К недостаткам метода можно отнести лишь осторожность, с которой врач должен относиться к интерпретации результатов. Так, не всегда положительный ответ ПЦР означает наличие заболевания. После проведения лечения контроль необходим через время, а не сразу, так как погибший и уже не опасный возбудитель будет еще некоторое время «разбираться на запчасти» защитной системой организма и «показываться» в анализе. Отрицательный же результат ПЦР при наличии явной клинической картины может означать, что материал для исследования был взят не правильно.

Так как все инфекции собак и кошек можно разделить на несколько групп: системные, кровопаразитарные, офтальмологические, респираторные, дерматофитозные, половые, желудочно-кишечные, то и забор материала должен проводиться с соответствующих мест. Материалом для исследования может служить: кровь, слюна, мокрота, фекалии, соскобы и суспензии клещей.

Несмотря на вышеуказанные трудности ПЦР остается наиболее доступным и совершенным на сегодняшний день приемом диагностики.

КАКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ОПРЕДЕЛЯЮТСЯ МЕТОДОМ ПЦР?

В клиниках «Доктор Вет» проводят исследования методом ПЦР на выявление следующих инфекций.

1. Герпесвирусная инфекция — приводит к абортам, высокой смертности новорожденных (инфицирование почти в 60% случаев).
2. Калицивирус — тяжело протекает у котят, в то же время 25-80% переболевших взрослых животных становятся носителями и являются источником заражения, передавая вирус через слюну.
3. Панлейкопения — вирусное заболевание кошек, характеризующееся резким падением уровня лейкоцитов, гастроэнтеритом, ринитами с конъюнктивитами, высокой смертностью (30-90 %) заболевших котят.
4. 4. Короновирусная инфекция — тяжелое заболевание, возбудителем которого является РНК-содержащий высокопатогенный вирус.
5. Иммунодефицит кошек и лейкемия кошек — вирус поражает иммунную и нервную системы.
6. Аденовирус и чума плотоядных у собак проявляется комплексом симптомов: лихорадка, конъюнктивиты и ринотрахеиты, расстройство желудочно-кишечного тракта, поражение нервной системы.
7. Токсоплазмоз — промежуточными хозяевами могут быть кошка, собака, человек. Клинические симптомы зависят от пораженных органов: могут наблюдаться неврологические нарушения (тремор, паралич) или нарушения походки, атрофия мышц, а также миокардит и гепатит.
8. Хламидиоз — у кошек заболевание проявляется в основном в форме гнойных и негнойных конъюнктивитов и кератитов, также могут наблюдаться ринит, пневмония, вагинит, аборты и бесплодие. У котят встречается конъюнктивит. У собак симптомы разнообразны и проявляются воспалительными заболеваниями конъюнктивы, половых органов, гастритами, артритами, абортами и бесплодием. Есть данные о роли хламидий в развитии атеросклероза у собак.
9. Микоплазмоз — протекает с признаками бронхопневмонии, кератоконъюктевитов и кератитов.
10. Пироплазмоз, анаплазмоз, боррелиоз — заболевания, переносимые клещами.

Все перечисленные заболевания очень коварны, так как легко и быстро передаются от больных животных здоровым (а также людям) и имеют высокий показатель смертности при отсутствии должного лечения.

ПЦР-метод позволяет гарантированно обнаруживать даже единичных возбудителей в биологическом материале за короткий промежуток времени, благодаря чему врач может поставить точный диагноз, назначить адекватное лечение и разработать профилактические мероприятия.

источник

Инфекционная патология в ветери­нарии охватывает широкий круг бо­лезней, различных как по характе­ру течения (острые, хронические, латентные), степени распростране­ния (от спорадических случаев до эпизоотии), так и по сложности их диагностики. Важное, а при некото­рых болезнях решающее значение имеют серологические исследова­ния, направленные на выявление антител, вырабатываемых организ­мом животного в ответ на внедре­ние инфекционного агента или вак­цины. Несмотря на ряд достоинств, методы, основанные на этом прин­ципе, обладают недостаточной чувствительностью и специфич­ностью. Существенный прорыв был сделан в последние годы, когда для диагностических целей привлекли методы генной инженерии и био­технологии. Для диагностики ин­фекционных заболеваний наиболь­шее применение нашёл способ амплификации (умножения) нукле­иновых кислот: полимеразная цеп­ная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция, NASBA -метод и др. Актив­ное развитие и внедрение метода ПЦР в диагностическую практику позволило продемонстрировать ос­новные достоинства и эффектив­ность этой реакции, обнаружить не­достатки и выработать подходы для их преодоления.

ПЦР в лабораторной диагностике инфекций характеризуется быстро­той, непревзойдённой чувствитель­ностью и высокой специфич­ностью, что позволяет обнаружи­вать микроорганизмы, присутству­ющие в очень низких концентраци­ях (1-10 возбудителей в пробе). При этом ДНК инфекционных аген­тов может быть достаточно эффек­тивно экстрагирована из любой биологической жидкости или тка­ни, а также из проб объектов окру­жающей среды (почвы, воды и т.д.) и продуктов питания. Полимераз­ная цепная реакция эффективна при обнаружении бактериальных, грибковых, паразитарных и вирус­ных патогенов.

Одним словом, это метод, осно­ванный на принципе амплифика­ции, — изолированного умножения гена или его определённого фраг­мента. Амплификация — один из способов выживания микроорга­низмов и клеток животных в усло­виях действия противоопухолевых и противобактериальных препара­тов. ПЦР позволяет проводить ана­логичный процесс in vitro , то есть в пробирке.

Основные положения амплифи­кации ДНК in vitro были обосно­ваны сотрудником корпорации « Cetus » (США) Кэрри Маллисом в 1983 году. Через 10 лет за эту раз­работку он был удостоен Нобелев­ской премии по химии.

Метод базируется на достройке ферментом (термостабильная ДНК-полимераза) олигонуклеотидных затравок (праймеров), присоеди­нённых к денатурированной низкокопийной ДНК-матрице. Праймеры определяют специфичность реак­ции и величину фрагмента. Про­цесс амплификации включает мно­гократное повторение определён­ных циклов, как правило, 30-40. Каждый состоит из трёх основных стадий: денатурации ДНК, отжига (присоединения) и достройки прай­меров.

На первой стадии двухцепочечная ДНК-матрица денатурируется при 94° С с образованием одноцепочечных ДНК. На второй темпе­ратура понижается до 55-65° С и происходит присоединение прай­меров к каждой из двух одноцепо-чечных ДНК. На третьей фермент (термостабильная ДНК-полимераза) при температуре 72° С достраивает оба праймера в направлении от 3-го к 5-му концу, в результате чего образуется двуцепочечная ДНК.

После первого цикла создаются длинные фрагменты, так как поли­мераза достраивает праймеры, ис­пользуя в качестве матрицы весь ге­ном. В следующих циклах праймеры отжигаются с вновь синтезиро­ванными молекулами ДНК. Полиме­раза останавливается, доходя до конца этих молекул, то есть до прай­меров, использованных в предыду­щем цикле. После каждого цикла число молекул матрицы удваивает­ся, в результате происходит экспо­ненциальная амплификация фраг­мента ДНК-матрицы. Это позволяет за 25-40 циклов накопить ПЦР-продукт в достаточном количестве для визуальной детекции после электрофоретического разделения и ок­рашивания бромистым этидием.

Основные компоненты ПЦР

1. Два синтетических олигонукле­отидных праймера (длиной пример­но по 18-25 нуклеотидов). Каждый из них комплементарен одной из цепей двуцепочной матрицы, огра­ничивающей начало и конец амплифицируемого участка. Специфич­ность реакции в основном опреде­ляется температурой отжига прай­меров, при которой происходит их комплементарное взаимодействие с ДНК-матрицей. Температура зави­сит от длины праймера и содержа­ния G — C пар (С — гуанин, С — цитозин). Как правило, она варьируется в диапазоне 50-64° С. Дизайн прай­меров осуществляется с использо­ванием специальных компьютер­ных программ и автоматических ДНК-синтезаторов.

2. Термостабильная ДНК-полиме­раза— фермент, который катализи­рует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длитель­ное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термо­филов — Thermus aquaticus ( Taq -полимераза), Pyrococcus furiosus ( Pfu -полимераза), Pyrococcus woe — sei ( Pwo -полимераза) и другие.

3. Дезоксинуклеотидтрифосфаты ( dATP , dGTP , dCTP , dTTP ).

4. Ионы Mg 2+, необходимые для активации полимеразы.

5. Буфер, создающий оптималь­ные условия для функционирования фермента. Как правило, ис­пользуется Трис- HCI буфер, кото­рый удерживает рН реакционной среды в пределах 7,8. Для стабили­зации фермента в среду добавляют желатин или бычий сывороточный альбумин, неионные детергенты (Твин-20, Тритон Х-100 и др.).

Наработка ампликонов заданной длины начинается с 3 до 25 циклов и носит экспоненциальный харак­тер. В силу истощения дезоксинуклеотидтрифосфатов, праймеров, инактиваций Taq -полимеразы, воз­растания конкуренции ампликонов в ферменте, начиная с 40-45 цик­лов реакция выходит на плато. От­сюда, как правило, при постановке реакции число циклов не превыша­ет 30-35.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем перио­дическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1° С. Обычно в нём можно задавать сложные программы, в том числе возможность «горячего стар­та» ( Touchdown ПЦР) и последующее хранение амплифицированных мо­лекул при 4° С. Для реакции в ре­альном времени выпускают прибо­ры, оборудованные флуоресцент­ным детектором. Из поставляемых зарубежными фирмами наиболее популярны амплификаторы фирм «Перкин-Эльмер», «Эппендорф» и «Хайбенд».

В настоящее время разработаны отечественные приборы: «Цикло-темп», «Медимакс», «Термоцик», «Амр ly 4 L » и др.

Проведение полимеразной цепной реакции

Она состоит из трёх основных процедур: пробоподготовки, кото­рая в основном сводится к выделе­нию ДНК или РНК, постановки ПЦР и детекции амплифицированного продукта.

Выделение нуклеиновых кис­лот (ДНК, РНК). Исследуемым ма­териалом для ПЦР могут служить лю­бые, даже гистологические препара­ты. Определение можно проводить, используя как клинический и патологоанатомический материал, так и пробы с объектов внешней среды.

В зависимости от вида определяе­мого возбудителя и клинической пробы применяют различные спо­собы выделения ДНК (РНК). В неко­торых случаях обработка заключа­ется в добавлении лизирующего агента, содержащего раствор гуа-нидинтиоционата, с последующей сорбцией ДНК (РНК), многократной отмывки и элюции, очищенной нук­леиновой кислоты.

В других случаях необходима депротеинизация фенолом/хлоро­формом с последующим осажде­нием ДНК (РНК) этанолом или изопропанолом. В последние годы ряд отечественных фирм («Литех», «ДНК-технология», «Диалат» и др.) производят наборы для экстракции ДНК и РНК из различных клиничес­ких образцов.

Постановка ПЦР. В пробирку ти­па « Eppendorf » объёмом 0,2 или 0,5 мл добавляют определённое коли­чество реакционной смеси, состоя­щей из воды, ПЦР-буфера, раствора дизоксинуклеотидтрифосфатов, раствора праймеров и Taq -полиме­разы. Затем вводят одну каплю ми­нерального масла с высокой точкой кипения, например вазелинового, для предотвращения испарения реакционной смеси в процессе амплификации. Если использовать амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы мо­жет увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидро­лиз пирофосфата, побочного про­дукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата.

Обработанную клиническую про­бу вносят под масло в объёме 5-10 мкл. Амплификация проводится в программируемом термостате (амп­лификаторе) в автоматическом ре­жиме по программе, соответствую­щей виду определяемой инфек­ции. Как правило, необходимо 1,5-3 часа в зависимости от задан­ной программы.

При постановке реакции прово­дится соответствующий контроль: положительный — препарата ДНК исследуемого возбудителя; отрица­тельный — деионизированной во­ды. Последний необходим для про­верки реакционной смеси на нали­чие контаминации продуктами амп­лификации (ампликонами).

В одной реакции амплификации возможно определение нескольких инфекций ( Multiplex PCR ). С этой целью в реакционную смесь добав­ляют несколько пар праймеров, од­нако при этом уменьшается количе­ство воды. Учитывая, что чувстви­тельность реакции снижается про­порционально разбавлению, реко­мендуется одновременно опреде­лять не более 3 инфекций.

Для определения РНК-содержащих вирусов в составе реакцион­ной смеси дополнительно вносят обратную транскриптазу и ингиби­тор рибонуклеаз ( RT — PCR ).

Эффективность ПЦР зависит от многих факторов, в частности от ко­личества ДНК-матрицы, качества Taq -полимеразы и дезоксинуклеотидтрифосфатов, специфичности праймеров, концентрации Мд2+ и программы амплификации. Для по­лучения максимального эффекта проводят оптимизацию реакции. В таблице приведены пределы вариа­ции её основных параметров.

Чувствительность ПЦР существен­но зависит от температуры отжига праймеров. При заниженной повы­шается вероятность амплификации неспецифических фрагментов, при повышенной снижается выход амп­лифицированного продукта, так как праймеры слабо взаимодей­ствуют с ДНК-матрицей.

Количество Taq -полиме­разы в пробирке

Концентрация каждого праймера

В настоящее время разработан ряд подходов, повышающих специ­фичность реакций. Часто с этой целью применяется так называемая « Nested PCR » (гнездовая ПЦР). Принцип данного метода заключа­ется в использовании двух пар праймеров, одна из которых способна амплифицировать внутрен­ний участок ампликона, полученно­го после первого раунда, с внеш­ней парой праймеров. Применение гнездовой ПЦР имеет преимущест­ва: высокая чувствительность мето­дики; отсутствие необходимости ис­пользовать другие методы. К недос­таткам относят перенос продуктов реакции из одной пробирки в дру­гую, что существенно снижает кон­центрацию ингибиторов, а также приводит к появлению большого количества ложноположительных результатов вследствие перекрёст­ной контаминации проб продукта­ми амплификации.

В последние годы для повышения чувствительности и специфичности реакции используется «горячий старт». Суть его заключается в том, что прежде чем добавлять Taq — no -лимеразу, реакционная смесь про­гревается предварительно до 95° С. Это исключает возможность образо­вания неспецифических фрагмен­тов вследствие неспецифического отжига праймеров при температуре ниже оптимальной.

Механизм простой полимеразной цепной реакции непригоден для идентификации рибонуклеи­новых кислот (РНК), так как Taq — no -лимераза неспособна катализиро­вать синтез ДНК на матрице РНК. Вместе с тем хорошо известно, что геномы многих вирусов состоят из молекул рибонуклеиновых кис­лот (РНК), и вследствие этого акту­альна идентификация РНК-виру­сов. Практически это решается с помощью нескольких приёмов, в частности использования дополни­тельного фермента — РНК-зависи­мой ДНК-полимеразы — обратной транскриптазы ( RT — reverse tran ­ scriptase ). Реакция, катализируе­мая этим ферментом, приводит к образованию однонитевых фраг­ментов ДНК, используемых в даль­нейшем в амплификации с по­мощью Taq -полимеразы.

Как было отмечено выше, Taq -п o лимераза неспособна катализиро­вать процесс обратной транскрип­ции, то есть синтез однонитевой ДНК на РНК-матрице. В 1991 году Маерсом и Гельфандом охарактеризован фермент ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, выделенной из другого экстремального термофила Thermus thermophilus ( Tth -полиме-раза), который в присутствии ионов магния и хелаторов ионов марган­ца позволял ферменту катализиро­вать обычную ДНК-зависимую ДНК-полимеразную реакцию. Этот фер­мент мог быть использован для од­новременного синтеза комплимен­тарных однонитевых фрагментов ДНК и амплификации.

Регистрация результатов. В большинстве случаев амплифицированный фрагмент ДНК или кДНК выявляют методом электрофореза в 1,5-2% геля агарозы в присут­ствии бромистого этидия, который образует с фрагментами ДНК устой­чивый комплекс. При облучении ге­ля ультрафиолетом длиной волны 290-330 нм амплифицированные фрагменты ДНК проявляются в ви­де светящихся полос.

Специфичность полосы опреде­ляется её положением по отноше­нию к ДНК-маркерам и положи­тельному контролю.

Специфичность амплифицированного фрагмента также может быть подтверждена рестрикционным анализом или гибридизацией со специфическим меченым флуо­ресцентным или радиоактивным зондом.

Другие методы детекции основа­ны на идентификации меченых компонентов реакции. В частности, в отдельных тест-системах (фирмы «Хофманн Ля Рош») используются праймеры, меченные биотином. В процессе детекции амликон, ме­ченный биотином, гибридизуется со специфическим ДНК-зондом, иммобилизованным на микроп­ланшете. На следующей стадии биотин связывается с конъюгатом авидин-пероксидаза хрена. Актив­ность фермента, входящего в комп­лекс ампликон-биотин-авидин-пероксидаза хрена, выявляют приё­мом, используемым при стандарт­ном иммуноферментном анализе. Интенсивность окраски определя­ют на планшетном фотометре при 450 нм. Данный подход позволяет проводить объективную оценку результатов реакции в виде показате­лей оптической плотности и, следо­вательно, количественно опреде­лять концентрацию ДНК или РНК в пробе.

Существуют и другие варианты де­текции ПЦР-продукта. Успешно ис­пользуются зонды, меченные дитоксигенином или флуоресцеином. Для выявления комплекса ампликон-дитоксигенин (флуоресцеин) применяют меченные пероксидазой хрена моноклональные антитела к дитоксигенину или флуоресцеину.

W . D . Harrman , M . Wall (1995 г.) предложили для количественной оценки продуктов реакции исполь­зовать миниатюрную видеокамеру, передающую информацию с гельэлектрофореграммы на экран мо­нитора, что позволяет сравнить ин­тенсивность окраски ДНК-стандарта и амплифицированного фрагмента.

Полимеразная цепная реакция — высокочувствительный специфич­ный метод. К сожалению, он не исключает возможной контамина­ции.

Попадание в реакционную про­бирку следовых количеств ДНК или кДНК возбудителя (специфических продуктов амплификации; ДНК-стандарта, используемого в качест­ве положительного контроля; ДНК или кДНК возбудителя клиническо­го образца) приводит к амплифика­ции в процессе реакции специфи­ческого фрагмента ДНК и, как след­ствие, к появлению ложноположи­тельных результатов.

Опасность представляют в основ­ном два вида контаминации: пере­крёстная — от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или разбрызгивания ре­акционной смеси), что приводит к появлению спорадических ложноположительных результатов; и про­дуктами амплификации (ампликоны), которые являются также при­чиной получения ложноположи­тельных результатов. В процессе проведения ПЦР ампликоны накап­ливаются в больших количествах и являются классическими матрица­ми для реамплификации.

Различают и контаминацию сле­довыми ампликонами посуды, автоматических пипеток и лаборатор­ного оборудования, поверхности лабораторных столов.

На основании опыта ПЦР-лабораторий к настоящему времени сфор­мулированы основные принципы организации диагностики, исключающие возможность контаминации и получения ложноположительных результатов.

Необходимо разделить различные стадии проведения анализа, размещая их в отдельных помещениях: для выделения ДНК или РНК; для проведения детекции продуктов амплификации.

Клинические образцы необходимо помещать только в одноразовые стерильные пластиковые пробирки. Работа должна производиться в лабораторной одежде, сменяемой при переходе из одного помеще­ния в другое. Желательно, чтобы на каждом этапе проведения реакции работали другие сотрудники.

На различных стадиях анализа следует иметь отдельные наборы полуавтоматических пипеток.

Использовать только одноразо­вые материалы, наконечники для микропипеток, пробирки, перчатки и т.д. Желательно применять нако­нечники с аэрозольным фильтром, предохраняющим попадание мик­рокапель раствора в пипетку. Пос­ле работы пробирки и наконечники должны сбрасываться в дезинфи­цирующий раствор (1Н соляной кислоты, 10% гипохлорида натрия, 10% хлорной извести).

Облучение рабочих поверхностей проводят в течение 1 часа до нача­ла и после опыта (излучение до 260 нм).

Неуклонно выполняя эти требова­ния и применяя при постановке ПЦР отрицательный контроль нук­леиновых кислот, буферного раст­вора, праймеров, можно практи­чески исключить ложноположительные результаты.

Кроме организационных мер, в настоящее время успешно приме­няют метод ферментативного пре­дупреждения контаминации. Суть его заключается в том, что вместо одного из 4 дНТФ, а именно вместо дТТФ (дезокситимидин-трифосфат) вводится аналог дУТФ (дезоксиуридин-трифосфат), который включив­шись в амплификон вместо дТТФ, делает этот амплификон чувстви­тельным к ферменту урацил-гликозилазе, которая также вводится в амплификационную смесь. Некото­рые коммерческие ПЦР-тест-систеы содержат эти компоненты и по­этому гарантируют отсутствие ложноположительных результатов от контаминации. Подобную систему защиты имеют ряд тест-систем, вы­пускаемых зарубежными фирма­ми, в частности фирмой «Хофманн Ля Рош».

В качестве химического способа для предупреждения ложноположительных результатов от контами­нации амплификонами используют псорален-соединение, легко пов­реждающее их ультрафиолетовыми лучами.

Для контроля ингибирования ПЦР продуктами, содержащимися в клинической пробе, вводят внут­ренний контроль: в состав ПЦР-смеси вносят ДНК-матрицу, которая амплифицируется одновременно с ДНК клинической пробы в одной и той же пробирке.

Амплифицированная ДНК-матри­ца контроля свидетельствует об от­сутствии ингибирования реакции. В России подобные наборы поставля­ет фирмы «Литех» (Москва), за ру­бежом — «Хофманн Ля Рош».

Достоинства и преимущества ПЦР-диагностики инфекцион­ных заболеваний

Метод прямой и позволяет дос­тичь предельно возможной чувстви­тельности: от одного до нескольких возбудителей в пробе. Специфич­ность метода составляет 99-100 процентов. Для ПЦР-анализа приго­ден любой материал, в том числе и гистологические препараты. Коли­чество исследуемого материала, как правило, составляет несколько десятков микролитов. Высокая чувствительность метода позволяет контролировать эффективность проводимого лечения. ПЦР успеш­но используется при диагностике труднокультивируемых и некультивируемых возбудителей, а также хронических, латентных и персистентных форм инфекции. Длитель­ность анализа не превышает 5-6 часов.

Но наряду с достоинствами име­ется определённый недостаток, ко­торый можно охарактеризовать как технологический. Подразумеваются повышенные требования к оснаще­нию лаборатории, качеству тест-на­боров и строжайшее соблюдение регламента исследования во избе­жание получения ложных результа­тов. Решение проблемы качества анализов возможно при соответ­ствующей квалификации персона­ла и обязательной сертификации лаборатории.

Разработка методик и испытание приборов и оборудования — один из этапов большой работы по внед­рению ПЦР-методов в практику ди­агностических лабораторий. В связи с возрастающим интересом к ПЦР-диагностике внедрение её методов в систему государственной ветери­нарной службы — дело сегодняш­него дня. Необходимо отметить, что перспективными направлениями являются определение антибиотикорезистентности клинических штаммов возбудителей, возмож­ность количественного учёта ре­зультатов для контроля динамики инфекционного процесса, правиль­ного выбора тактики лечения и оценки эффективности применяе­мых лекарственных средств.

К настоящему времени ветери­нарными специалистами уже раз­работаны тест-системы для диагнос­тики методом ПЦР таких заболева­ний, как туберкулёз, сибирская яз­ва, лейкоз, чума крупного рогатого скота, бешенство, ящур, бруцеллез, кампилобактериоз, листериоз, хламидиоз животных, классическая чу­ма свиней, респираторно-репродуктивный синдром свиней, парвовирусная инфекция свиней, энцефаломиокардит свиней, сальмонеллёз, стафилококкоз, микоплазмоз, болезнь Марека, реовирусная инфекция, болезнь Гамборо, ин­фекционный бронхит птиц, ньюкаслская болезнь; чума плотоядных, вирусный энтерит норок, вирусный гепатит утят и др.

Диагностика частной патоло­гии методом ПЦР. В данном раз­деле рассмотрены только некото­рые виды патологии, при которых этот метод играет важную роль. Следует отметить, что данная диаг­ностика — один из способов и не может полностью заменить приме­няемый в настоящее время комп­лекс диагностических исследова­ний.

Среди методов лабораторной ди­агностики гриппа птиц наиболее эффективным считается метод полимеразной цепной реакции. Исполь­зуя праймеры к НА, NA и М-генам различных субтипов вируса гриппа, Zhang W . и Evans D . N . (1991 г.) впер­вые продемонстрировали возмож­ность детекции вирусов. Однако ис­следования были выполнены на музейных штаммах.

Главными преимуществами ПЦР в сравнении с методами культурального подхода являются его более высокая чувствительность, быстрота и безопасность для пер­сонала. При сравнении с сероло­гическими методами ПЦР сущест­венно выигрывает, поскольку поз­воляет выявлять вирусы гриппа на самых ранних стадиях, задолго до появления антител.

Кроме явных диагностических преимуществ, его дополняют мето­дом секвенирования ДНК, и тогда он является универсальным молекулярно-генетическим подходом к определению большинства биоло­гических свойств вирусов грип­па птиц, позволяющим выявлять родство циркулирующих штаммов, предсказывать его опасность для человека и эффективность проти­вовирусной терапии.

Хламидиозная инфекция ши­роко распространена практически среди всех видов млекопитающих и наносит существенный экономи­ческий ущерб различным отраслям животноводства, вызывая гибель животных, патологию их воспроиз­водительных органов, аборты, рож­дение мёртвого или нежизнеспо­собного приплода.

Больные животные часто стано­вятся источником инфекции работ­ников хозяйств, что приводит к возникновению эпидемических вспы­шек. Распространённость возбуди­телей хламидиозов в природе сре­ди диких животных и особенно птиц представляет постоянную уг­розу спорадических заболеваний для людей, профессионально не занятых в сельском хозяйстве.

Длительное время общепризнан­ным эталоном для прямых мето­дов выявления хламидий считает­ся выделение возбудителя в куль­туре клеток. Однако метод имеет недостатки, существенно затруд­няющие его широкое использова­ние в практической ветеринарии. Прежде всего высокий риск инфи­цирования персонала, а следова­тельно, необходимость проведе­ния работ по выделению возбуди­теля в специальной режимной ла­боратории.

Кроме того, культуральный метод трудоёмок и занимает много време­ни. Несмотря на то, что для высева патогена подходит практически лю­бой материал от инфицированного животного, успех исследования во многом зависит от скорости транс­портировки проб в лабораторию и соблюдения условий доставки об­разцов (специальные транспортные среды, охлаждение, добавление антибиотиков, предварительная очистка материала от токсичных ве­ществ и т.д.).

С учётом этих недостатков были разработаны альтернативные тесты, такие, как определение антиге­на методами иммуноферментного анализа (ИФА), прямой иммунофлуоресценции (МФА), а также экспресс-методами.

Вместе с тем для ИФА-детекции антигенов так же, как и для культурального метода, характерны низ­кая чувствительность и специфич­ность. Учитывая, что при проведе­нии метода иммунофлуоресценции для достоверного выявления хла­мидий необходимо обнаружить оп­ределённое число элементарных телец во всём исследуемом образ­це, чувствительность анализа зави­сит от опыта работы лаборанта.

В настоящее время одним из наи­более перспективных следует счи­тать метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для диагностики хламидиозов человека и животных он был впервые применён в 1989 году. Это быстрый и надёжный ди­агноз, своевременная эффективная терапия и научно обоснованная профилактика. Дополнительная ин­формация о разновидности возбу­дителя, легко получаемая методом ПЦР, позволит проводить эпидеми­ологический контроль и предотвра­щать распространение опасных штаммов хламидий.

Сегодня основным массовым и доступным в ветеринарной практи­ке методом прижизненной диаг­ностики туберкулёза является внутрикожная туберкулиновая про­ба с применением ППД-туберкулина для млекопитающих. Однако данный тест имеет известные недос­татки: длительный срок выявления заболевания; возбудитель туберку­лёза при посеве патолого-анатомического материала растёт медлен­но; колонии микобактерий туберку­лёза бычьего вида появляются толь­ко через 20-60 дней, а птичьего — через 15-30 дней посева. При адап­тации к питательной среде скорость роста может возрастать.

При диагностике туберкулёза ПЦР-метод применяют в случае по­лучения положительных результа­тов при проведении плановых ал­лергических исследований в благо­получных по туберкулёзу хозяй­ствах. Кровь всех животных анали­зируют при введении туберкулина. Также полимеразную цепную реак­цию целесообразно применять при изучении патматериала от убитых животных для диагностики и иден­тификации культур М. Bovis и М. Tuberculosis с другими видами ми­кобактерий.

В заключение следует отметить, результаты ПЦР-анализа, как и дру­гие диагностические тесты in vitro , необходимо рассматривать с учё­том данных, полученных традици­онными методами.

Для рационального использова­ния ПЦР в клинической практике нужно определить её место, учиты­вая специфику поставленных задач и экономическое обоснование для решения тех или иных проблем.

Статья былп опубликована в журнале «Птицеводство», 2009 г.

источник