б)воду плавательных бассейнов;
д) воду очищенную для приготовления лекарств;
е) воду для приготовления стерильных растворов (инъекций, глазных капель).
а) общее микробное число (ОМЧ) – количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных бактерий в 1 мл воды (КОЕ/мл).
б) общие колиформные бактерии (ОКБ).
в) термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) .
г) коли-фаги – по эпидемическим показаниям.
д) споры сульфитредуцирующих клостридий – для оценки технологий обработки воды.
е) патогенные микроорганизмы – по эпидемическим показаниям.
ОМЧ воды определяют у всех видов воды. Для определения микробного числа водопроводной воды ее берут из уличных водозаборов или кранов внутренних водопроводов. Краны обжигают, полностью открывают и 10 минут спускают воду, а затем отбирают не менее 500 мл воды с соблюдением требований асептики. Затем производят посев воды глубинным методом Коха: по 1 мл воды вносят в стерильные чашки Петри, после чего добавляют 12-15 мл расплавленного и остуженного до 45 °C МПА, быстро и тщательно перемешивают, а после застывания помещают чашки в перевёрнутом виде в термостат. Инкубируют при 37°С 24 часа, а затем при комнатной температуре еще 24 часа. Посев осуществляет не менее, чем в 2 чашки Петри. Подсчитывают число выросших колоний на 2-х чашках и рассчитывают среднее арифметическое значение. Для выявления плесневых и дрожжевых грибов воду засевают по 0,5 мл на среду Сабуро и инкубируют при комнатной температуре 3-4 суток Подсчитывают число выросших колоний и также рассчитывают среднее арифметическое. Результат (ОМЧ) вычисляют путем суммирования среднего арифметического бактерий, дрожжевых и плесневых грибов и выражают в КОЕ/мл. КОЕ – колониеобразующие единицы. Учитывают только те чашки, где выросло не более 300 колоний. Если более 300 – делают 10-ти кратные разведения (1:10,1:100 и т.д.). При расчете умножают на степень разведения.
Дистиллированную воду, используемую для приготовления инъекционных растворов, отбирают в стерильные флаконы по 15-20 мл из ёмкостей, в которых проводится стерилизация. Посев производят так же, как и для водопроводной воды. Речную воду и воду других открытых водоёмов и бассейнов берут в объеме 100 мл.
Определение колиформных бактерий также проводят в воде всех видов. Общие колиформные бактерии (ОКБ) – это грам «-» аспорогенные палочки , не обладающие оксидазной активностью и сбраживающие лактозу (глюкозу) с образованием кислоты и газа при37°С в течение 24-48 часов. Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) – обладают теми же характеристиками, но дополнительно сбраживают лактозу с образованием кислоты и газа при 44,5°С через 24 часа. ТКБ быстро отмирают во внешней среде, поэтому их обнаружение свидетельствует о свежем фекальном загрязнении воды.
Определение колиформных бактерий в питьевой воде и воде очищенной проводят методом мембранных фильтров. Исследуемую воду (3 пробы по 100 мл) пропускают через 3 бактериальных фильтра из нитроцеллюлозы, которые помещают на среду Эндо и инкубируют при 37°С 24 часа. Подсчитывают число красных с металлическим блеском колоний. Проводят идентификациюколиформных бактерий: окраска по Граму (грам «-» палочки), оксидазный тест (оксидазо «-»), тест ферментации лактозы или глюкозы (до кислоты и газа). ТКБ дополнительно сбраживают лактозу при 44,5°Счерез 24 час.
При отсутствии колоний на всех 3-х фильтрах делают заключение : «не обнаружено КОЕ ОКБ (ТКБ) в 100 мл». При идентификации колоний результат выражают в КОЕ в 100 мл воды.
Расчет проводят по формуле:
Х = а х 100/300, где
• V- профильтрованный объем воды;
• Например, при посеве 3 фильтров по 100 мл:
• на одном фильтре — 2 колонии,
• на остальных 2-х фильтрах — нет роста.
• 
Число общих или термотолерантных колиформных бактерий будет:
Требования к микробиологической чистоте воды приведены в таблице. 
источник
— А.Е.Приходько, ЗАО «НПК Медиана-Фильтр»
— О.В.Гунар, Институт контроля лекарственных средств ФГУ НЦ ЭСМП
Вода очищенная — это вода, используемая фармацевтическими предприятиями, больничными и межбольничными аптеками для производства и/или изготовления лекарственных средств, растворения или разведения субстанций, а также в других целях при получении нестерильных лекарственных препаратов.
Вопросы микробиологического качества воды в настоящее время обозначены достаточно остро. Это связано прежде всего с несовершенством методической базы, а также отсутствием современного оборудования предварительной подготовки, получения, хранения и распределения воды на производстве и в аптеках, отвечающего всем требованиям.
Основными потенциальными источниками микроорганизмов в воде для фармацевтических целей на фармацевтическом предприятии или в аптеке являются источник воды и используемое оборудование. Присутствующие в исходной питьевой воде микроорганизмы могут адсорбироваться и задерживаться фильтрами с активированным углем, многослойными фильтрами, ионообменными смолами, мембранными элементами, микро- и ультрафильтрами, инициируя образование биопленок. Системы вентиляции (отсутствие защиты и/или неисправность фильтров), обратный ток воды из систем канализации, воздушные зазоры сливных устройств так же могут служить источником микроорганизмов. Часто причиной микробной контаминации является замена фильтрующих сред (активированного угля, ионообменных смол и др.) Микроорганизмы могут «прикрепляться» к взвешенным в воде частицам, например, угольной пыли, и становиться причиной контаминации следующего далее оборудования водоподготовки.
Другим источником бактериального загрязнения является система хранения и распределения ВО и ВДИ, При неправильно спроектированной системе и отсутствии периодической санитарной обработки трубопроводов и накопительных емкостей может происходить рост на внутренних поверхностях труб, вентилей, соединительных элементов, в застойных зонах. Это становится причиной образования биопленок, являющихся постоянным источником микробиологического загрязнения. Микроорганизмы в биопленках защищены от воздействия многих биоцидных агентов. Сорванные с места первичного образования и перенесенные в другое место биопленки становятся источниками микроорганизмов далее по ходу движения воды.
Основными бактериальными показателями загрязнения воды являются: сапрофитные бактерии, указывающие на поступление в воду легко разлагающихся органических веществ; бактерии – обитатели кишечника человека и теплокровных животных, указывающие на загрязнение воды фекальными и хозяйственно-бытовыми отбросами.
Оценка общего числа микроорганизмов позволяет определить численность разнообразных групп микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре, оценить уровень микробного загрязнения воды. Данный показатель весьма чувствителен к увеличению в воде легкоусвояемых органических веществ, поэтому динамика возрастания сапрофитной микрофлоры, особенно по сравнению с ее численностью в поступающей воде, характеризует санитарное состояние отдельных стадий водоподготовки.
Общее микробное число является косвенным показателем, так как характеризует общее содержание микроорганизмов в воде без их качественной характеристики.
Размножение сапрофитной микрофлоры в системе предварительной подготовки воды для фармацевтических целей может явиться причиной вторичного загрязнения воды. При этом накопление биомассы создает дополнительные условия для размножения индикаторных, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов.
Особое значение данный показатель приобретает при ежедневном контроле качества воды в одной и той же точке. Внезапное возрастание общего микробного числа (даже в пределах нормы) является сигналом для поиска причины загрязнения.
В основе микробиологического контроля воды очищенной лежат методы мембранной фильтрации и прямого посева. В 1 мл воды очищенной (ангро) допускается не более 100 аэробных бактерий. В 100 мл не допускается наличие E.coli и P.aeruginosa.
Отбор проб. Для достоверности результатов пробу воды целесообразно отбирать непосредственно из пробоотборного крана (пробоотборника) без полимерных (силиконовых и пр.) шлангов и насадок. Первоначально место отбора (кран или место подсоединения шланга) с помощью распылителя обрабатывают 70% этиловым спиртом, в некоторых случаях (пробоотборник из нержавеющей стали) используют фламбирование с помощью спиртовки. Сливают воду до 10 л воды при полностью открытом кране. Затем отбирают пробу для микробиологического испытания в стерильную емкость в количестве не менее 1л. Воду испытывают на наличие колиформных бактерий, синегнойной палочки, определяют общее число аэробных бактерий.
Микробиологический анализ. Для определения общего числа аэробных бактерий образец тестируемой воды тщательно перемешивают и вносят по 1мл в две стерильные чашки Петри. В каждую добавляют по 8-10 мл расплавленной и охлажденной до 45 о С среды №1 (Государственная Фармакопея XI изд., вып.2). Содержимое чашек быстро перемешивают и оставляют до застывания. После застывания чашки переворачивают и инкубируют в течение 24ч при температуре (32,5 +2,5) о С. Подсчитывают все выросшие колонии. Результат выражают средним числом КОЕ в 1 мл исследуемой пробы воды.
Для определения колиформных бактерий проводят мембранную фильтрацию, используя стерильные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм. Для получения достоверных результатов проводят 3-х кратную мембранную фильтрацию по 100 мл воды. После чего фильтры переносят на заранее разлитый по чашкам Петри агар Эндо (среда № 4). Если анализируемая вода стабильно соответствует нормативам, допустима фильтрация 300 мл воды через один фильтр. Для положительного контроля среды используют посев тест-микроорганизма Escherichia coli АТСС 25922 на агар Эндо. Чашки Петри с фильтрами инкубируют в течение 24ч при температуре (32,5 +2,5) о С.
Результат считается отрицательным, если на фильтрах не выросли колонии или колонии имеют нетипичный вид (неровные края, шероховатая поверхность). Если отмечается рост колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском, с красным центром, выпуклых, блестящих, подсчитывают число колоний каждого типа и проводят идентификацию. Для этого каждую колонию микроскопируют и при выявлении грамотрицательных палочек отсевают на скошенную среду № 1 для получения чистой культуры. В качестве подтверждающих тестов используют оксидазный тест, образование кислоты и газа при ферментации глюкозы (среда № 6) , редукцию нитратов в нитриты с использованием реактива Грисса (среда № 7).
Таким образом, полученные грамотрицательные палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, ферментирующие глюкозу и редуцирующие нитраты, относятся к общим колиформным бактериям и их наличие в питьевой воде недопустимо.
Особое внимание следует уделить синегнойной палочке (Pseudomonas aeruginosa). Для ее достоверного выделения проводят 3-х кратную мембранную фильтрацию по 100 мл очищенной воды, после чего фильтры переносят на заранее разлитую в чашки Петри среду №9 (цетримидный агар). Если анализируемая вода стабильно соответствует нормативам, то допустима фильтрация 300 мл воды через один фильтр. Для положительного контроля среды используют посев тест-микроорганизмов P. aeruginosa АТСС 9027 на среду №9 (цетримидный агар). Чашки Петри с фильтрами инкубируют в течение 72 ч при температуре (32,5 +2,5) о С.
Результат считается отрицательным, если на фильтрах вообще не выросли колонии или колонии имеют нетипичный вид. Если отмечается рост зеленоватых, голубо-зеленых, флюоресцирующих колоний, их идентифицируют. В качестве подтверждающих тестов используют окраску по Граму, цитохромоксидазную реакцию и рост при
Выделенные микроорганизмы относятся к P. aeruginosa при наличии сине-зеленого пигмента–пиоционина, грамотрицательной окраске, положительной цитохромоксидазной реакции и росте на питательной среде при 42 о С в течение 48-72ч.
В связи с высокой значимостью показателя «Микробиологическая чистота» для оценки качества воды для фармацевтических целей, нами были проведены комплексные исследования образцов воды очищенной, полученной в одной из больничных аптек г. Москвы. Образцы воды были отобраны как непосредственно после финишной стадии очистки, так и в системе ее хранения и распределения.
Выполненные нами исследования показали неутешительные результаты, представленные на фотографиях. Во всех образцах были обнаружены аэробные бактерии, дрожжевые и плесневые грибы, кишечные бактерии после мембранной фильтрации образцов (см. фото).
Мембраны на соответствующих питательных средах инкубировали в течение 3-4 суток при температуре (32,5 +2,5) о С (для учета бактерий) и (22,5 +2,5) о С (для учета грибов).
При подготовке и проведении микробиологических исследований необходимо помнить, что на качество результатов во время анализов воды могут существенно влиять следующие факторы:
· квалификация персонала, выполняющего отбор проб, посев образцов па питательные среды, учет и интерпретацию результатов;
· сроки хранения отобранных проб воды;
· условия проведения испытания (температура и время инкубации посевов);
· правильный учет и интерпретация результатов;
· валидация процессов мембранной фильтрации и прямого посева;
· использование качественных питательных сред.
Таким образом, был сделан неутешительный вывод о том, какую же воду наши аптеки (и, к сожалению, предприятия тоже) используют для изготовления и/или производства лекарственных средств, и какие лекарственные препараты принимают пациенты стационаров, да и мы с Вами. А что говорить о регионах Российской Федерации, если даже в г. Москве наши медицинские учреждения не в состоянии обеспечить надлежащего качества воды для фармацевтических целей и «вооружиться» современным технологическим оборудованием.
Все-таки, что же нужно, чтобы микробиологическая чистота не вызывала никаких сомнений? В первую очередь, необходимо внедрять и использовать современное технологическое оборудование и техническое обеспечение; правильно выбрать технологическую схему предварительной подготовки, получения, хранения и распределения воды для фармацевтических целей в соответствии с потребностями предприятия или аптеки. Для этого и существуют узкопрофильные компании такие, например, как ЗАО «НПК Медиана-Фильтр», имеющие практический и теоретический опыт и обладающие штатом высококвалифицированных и профессиональных специалистов, т.е. необходимо «отдать все в руки профессионалов».
И безусловно, необходимо реанимировать и воссоздать нормативную базу, внедрить государственную программу контроля качества воды в аптечных и фармацевтических учреждениях на местах, а также периодического контроля и мониторинга воды уполномоченными независимыми организациями.
источник
Цель занятия. Ознакомить студентовс микрофлорой воды, источниками ее загрязнения патогенной микрофлорой. Студенты должны овладеть различными методами бактериологического исследования воды: определения количества МАФАнМ, коли-титра и коли-индекса воды.
Материальное оснащение. Пробы речной воды и стерильные пробирки для взятия водопроводной воды; чашки Петри, расплавленный МПА в пробирках столбиком, стерильные пипетки на 1 мл, стерильный физраствор по 9 мл, спирт для факела, пинцет, вата.
Для демонстрации – прибор Зейтца, водоструйный вакуумный насос, кипяченые мембранные фильтры №3 в стакане с дистиллированной водой, среда Эндо в чашках Петри; глюкозо-пептонная среда (ГПС) с индикатором и поплавками, разлитая по колбам и пробиркам.
Для демонстрации – 3 колбы и 6 пробирок с ГПС с готовыми посевами воды для определения коли-титра воды методом бродильных проб. Только в первой колбе с посевом 100 мл исследуемой воды должно быть помутнение, изменение цвета индикатора (красный цвет индикатора меняется на желтый) и наличие пузырьков газа в поплавках. Агар Эндо в чашках Петри с 4 мембранными фильтрами после фильтрации воды и наличием красных колоний на поверхности белого фильтра.
Вода является естественной средой обитания многих микроорганизмов. Особую опасность для здоровья человека и животных представляют патогенные бактерии, которые могут быть в воде.
Источниками загрязнения воды патогенными микроорганизмами являются выделения больных животных и людей, трупы животных, сточные воды, особенно предприятий, перерабатывающих сырье животного происхождения и др. Длительность выживания патогенных микробов в воде зависит от их вида, условий окружающей среды и может составлять от нескольких часов до нескольких лет. Так, возбудитель сибирской язвы может сохраняться в воде до 3 лет, возбудитель туберкулеза до 1 года, а бруцеллы — до 100 дней. Имеется группа болезней, для которых характерен водный путь распространения (паратифы, лептоспирозы).
Таким образом, вода может стать источником распространения инфекционных болезней и возникновения эпидемий и эпизоотий.
Для санитарно-микробиологической оценки воды проводят следующие исследования:
1.Определение количества МАФАнМ в 1 мл воды;
2. Определение коли-титра (КТ) и коли-индекса (КИ);
3. Обнаружение в воде патогенных микроорганизмов по эпидпоказаниям.
При санитарно-микробиологических исследованиях пробы воды забирают в объеме не менее 0,5 л. Из открытых водоемов пробу воды отбирают батометром. Батометр – стерильная емкость с пробкой, в металлическом каркасе и свинцовым грузилом. На нужной глубине пробку открывают, подтягивая ее за веревочку. Воду из рек, озер отбирают с глубины 10-15 см от поверхности, а при небольшой глубине на расстоянии 10-15 см от дна.
Для отбора проб водопроводной воды из крана используют стерильные колбы на 0,5 л с ватной пробкой. Кран предварительно стерилизуют обжиганием, горящим спиртовым тампоном, затем в течение 10 мин спускают воду. Пробы воды исследуют тотчас же или не позднее 2 ч с момента взятия. Если это невозможно, то хранят не более 6 ч при 1-5 0 С.
Определение количества МАФАнМ в водопроводной воде. В чашку Петри с соблюдением правил асептики вносят 1 мл водопроводной воды без разведения, заливают 15 мл расплавленного и охлажденного до 45 0 С МПА. Посевы инкубируют в термостате при 30 0 С 72 ч. Количество бактерий в 1мл воды определяют по количеству выросших колоний.
Для определения количества МАФАнМ в воде открытых водоемов исследуемую воду в зависимости от предполагаемого загрязнения предварительно разводят стерильной водой от 1:10 -1 до 1:10 -4 , из двух последних разведений по 1 мл вносят в стерильные чашки (не менее 2 чашек на каждое разведение) и заливают 15 мл расплавленного и охлажденного до 46 0 С МПА. Посевы помещают в термостат при 30 0 С на 72 ч, подсчитывают количество колоний, умножают на степень разведения и определяют количество бактерий в 1 мл воды открытых водоемов.
Определение коли-титра (КТ) и коли-индекса (КИ) воды.
Коли-титром называют наименьший объем воды, в котором обнаружена одна кишечная палочка.
Коли-индекс показывает число кишечных палочек в 1000 мл воды.
Кишечная палочка является постоянным обитателем кишечника человека и животных, следовательно, ее присутствие в питьевой воде является индикатором фекального загрязнения. Чем выше концентрация бактерий группы кишечной палочки, тем вероятнее присутствие таких бактерий, как сальмонеллы, возбудители дизентерии и холеры. Показатели КТ и КИ указывают на санитарное состояние воды, ее пригодность в качестве питьевой. КТ и КИ определяют двумя методами:
2.Метод мембранных фильтров.
Этот метод основан на ферментативной активности бактерий группы кишечной палочки (БГКП), которая выражается в способности расщеплять при помощи ферментов лактозу или глюкозу до кислоты и газа. Исследуемая вода засевается в различных объемах в среду накопления — глюкозо-пептонную среду (ГПС) с индикатором и поплавками. При наличии кишечной палочки появляется помутнение, меняется цвет индикатора, и появляются пузырьки газа в поплавках. Из забродивших посевов делают пересев на дифференциально-диагностические среды.
Методика: засевают водопроводную воду в объеме 333 мл, разделенной на 9 порций (три объема по 100 мл, три – по 10 мл и три — по 1 мл). При этом вода в объемах по 100 мл засевается в три колбы с 10 мл концентрированной ГПС, 10 мл — в три пробирки с 1 мл концентрированной среды, а 1 мл воды вносят – в пробирки с 10 мл среды с нормальной концентрацией. Посевы инкубируют в термостате 24 часа при 37 0 С. При отсутствии БГКП в исследуемой воде, изменение цвета индикатора и образование газа не происходит
Рост кишечной палочки сопровождается помутнением среды, изменением цвета индикатора (красный цвет переходит в желтый) и появлением газа в поплавках. Из колбы и пробирок с признаками роста проводят пересев на агар Эндо штрихом по секторам. Посевы инкубируют при 37 0 С 24 часа. При отсутствии роста на агаре Эндо или при наличии колоний, не характерных для БГКП, дается отрицательный ответ.
Из колоний, характерных для бактерий БГКП (ярко-красных с металлическим оттенком, розовых), готовят мазки, их окрашивают по Граму, микроскопируют. Дополнительно изучают культуру по оксидазному тесту. Для этого на фильтровальную бумагу пропитанную раствором альфа-нафтола-диэтил-n-фенилендиамина наносят штрихом 2-3 колонии снятые с агара Эндо.
Для кишечной палочки характерно: наличие грамотрицательных палочек в мазке и отсутствие изменений в окраске фильтровальной бумаги на оксидазный тест. Следовательно, наличие грамотрицательных палочек и отрицательный оксидазный тест подтверждает наличие кишечной палочки в исследуемой воде.
Для подтверждения свежего фекального загрязнения исследуемой воды посевы выращивают при 43 0 С для дифференциации от кишечных палочек хладнокровных, не растущих при такой высокой температуре. Требования к санитарному состоянию воды приведены в таблице 3.
Микробиологические нормативы санитарного состояния воды
| Объект контроля | МАФАнМ, КОЕ, не более | Коли- титр, не менее | Коли- индекс, не более | Периодичность контроля |
| Вода водопров-я | 100 в 1 мл | 1 раз в месяц | ||
| Вода открытых водоемов | 1000 в мл | — |
Из таблицы видно, что для питьевой воды установлены следующие нормативы бактериологических показателей:
— общее микробное число – не более 100 в 1 мл;
— коли-индекс не должен превышать 3 кишечных палочек в 1000 мл.
Вода открытых водоемов считается доброкачественной, если общее микробное число – не более 1000 в 1 мл, коли-титр – не менее 111, коли-индекс – не более 9.
Метод мембранных фильтров
Для исследования воды применяется мембранный фильтр №3 из нитроцеллюлозы, с диаметром пор 0,7 мкм, который задерживает на своей поверхности БГКП. Перед использованием мембранные фильтры кипятят 10-15 мин в дистиллированной воде. Фильтр, с соблюдением правил асептики, матовой поверхностью вверх накладывают на сетку фильтрационного прибора Зейтца. В воронку прибора наливают исследуемую воду и в приемной колбе Бунзена создают вакуум при помощи водоструйного насоса. Исследуемую воду фильтруют через мембранный фильтр, а бактерии, находившиеся в ней, остаются на поверхности. После фильтрации мембранный фильтр матовой стороной вверх переносят на поверхность агара Эндо в чашках Петри. Чашки ставят в термостат при 37 0 С на 18-24 ч.
Через поры мембранного фильтра происходит диффузия питательных компонентов среды Эндо, вследствие этого оставшиеся на поверхности БГКП размножаются на поверхности фильтра и образуют типичные колонии — красные с металлическим оттенком. По числу выросших колоний определяют количество кишечных палочек в 1000 мл воды и тем самым устанавливают коли-индекс.
Водопроводную воду исследуют в объеме 333 мл, которую дробно и последовательно пропускают через четыре фильтра в объемах — 200, 100, 30 и 3 мл воды.
Наличие в воде патогенных бактерий устанавливают путем посева на дифференциально-диагностические и селективные питательные среды с последующей их идентификацией методами, принятыми в микробиологии.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: Да какие ж вы математики, если запаролиться нормально не можете. 8396 — 
| 7314 — 
или читать все.
195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.
Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно
источник
Микроорганизмы – мельчайшие, главным образом одноклеточные существа, широко распространенные в природе. Они обнаруживаются во всех средах (воздухе, почве, воде), в организме человека и животных, в растениях.
Качественное разнообразие и количество микроорганизмов зависят в первую очередь от питательных соединений. Однако немаловажное значение имеют также влажность, температурный режим, аэрация, действие солнечных лучей и прочие факторы.
Методы санитарно-микробиологического исследования природных сред позволяют выявить наличие патогенных микроорганизмов, определить их количество и, в соответствии с полученными результатами, выработать меры по устранению или предупреждению инфекционных заболеваний. Кроме того, количественный учет необходим для моделирования экосистем и разработке принципов управления естественными процессами. Рассмотрим далее, какими бывают методы микробиологического исследования .
Она рассматривается учеными как один из возможных путей передачи инфекционных патологий. С выделениями больных людей или животных в почву проникают патогенные микроорганизмы. Некоторые из них, в частности, споровые, способны сохраняться в грунте продолжительное время (иногда несколько десятков лет). В почву попадают возбудители таких опасных инфекций, как столбняк, сибирская язва, ботулизм и пр. Методы санитарно-микробиологического исследования почвы позволяют определить «микробное число» (кол-во микроорганизмов в грамме грунта), а также коли-индекс (количество кишечных палочек).
К методам микробиологического исследования почвы следует в первую очередь отнести прямое микроскопирование и посев на плотную питательную среду. Популяции микроорганизмов и их группы, населяющие грунт, различаются по таксономическому положению и экологическим функциям. В науке они объединены под общим термином «почвенная биота». Грунт – среда обитания огромного числа микроорганизмов. В грамме почвы присутствует от 1 до 10 млрд их клеток. В этой среде активно протекает разложение органических веществ при участии разнообразных сапрофитных микроорганизмов.
Анализ среды начинается с отбора образцов. Для этого используют предварительно очищенный и протертый спиртом нож (можно использовать лопату). После этого осуществляется подготовка образца. Следующий этап – подсчет клеток на окрашенных мазках. Рассмотрим каждую стадию в отдельности.
При анализе пахотной почвы, как правило, пробы берут с глубины всего слоя. Сначала удаляется 2-3 см сверху грунта, так как в нем может присутствовать посторонняя микрофлора. После этого с изучаемого участка грунта берут монолиты. Длина каждого из них должна соответствовать толщине слоя, из которого нужно взять образец.
На участке в 100-200 кв. м отбирается 7-10 проб. Вес каждой – порядка 0.5 кг. Пробы необходимо тщательно перемешать в мешке. После этого берут средний образец, весом приблизительно 1 кг. Его следует поместить в пергаментный (стерильный) пакет, вложенный в тканевый мешок. До непосредственного анализа образец хранится в холодильнике.
Перемешанная почва высыпается на сухое стекло. Предварительно его необходимо протереть спиртом и обжечь над горелкой. При помощи шпателя почва тщательно перемешивается и раскладывается ровным слоем. В обязательном порядке необходимо удалить корешки, прочие посторонние элементы. Для этого используется пинцет. Перед работой пинцет и шпатель прокаливают над горелкой и остужают.
Из различных участков почвы, распределенной по стеклу, отбираются небольшие порции. Их взвешивают в фарфоровой чашке на технических весах. Обязательным этапом микроскопического метода микробиологического исследования является специальная обработка образца. Заранее необходимо подготовить 2 стерильные колбы. Их емкость не должна превышать 250 мл. В одну из колб наливают 100 мл водопроводной воды. Из нее берут 0.4-0.8 мл жидкости и увлажняют навеску почвы до пастообразного состояния. Смесь необходимо растереть пальцем или резиновым пестиком в течение 5 мин.
Водой из первой колбы почвенную массу переносят в пустую колбу. Далее ее снова растирают. После этого масса переносится в колбу возле пламени горелки. Емкость с почвенной суспензией встряхивают на качалке на протяжении 5 мин. После этого ее оставляют отстаиваться около 30 с. Это необходимо для того, чтобы крупные частицы осели. Через полминуты массу используют для приготовления препарата.
Прямое микроскопическое изучение грунта осуществляется по методу микробиологического исследования , разработанному Виноградским. В определенном объеме приготовленной суспензии подсчитывается число клеток микроорганизмов. Изучение фиксированных мазков позволяет сохранять препараты в течение длительного срока и выполнять подсчеты в любое удобное время.
Приготовление препарата осуществляется следующим образом. Определенный объем суспензии (как правило, 0.02-0.05 мл) наносится с помощью микропипетки на предметное стекло. К нему добавляют каплю раствора агар-агара (смеси полисахаридов агаропектина и агарозы, извлеченных из бурых и красных водорослей Черного моря), быстро перемешивают и распределяют на площади 4-6 кв. см. Мазок высушивается на воздухе и фиксируется 20-30 мин. спиртом (96 %). Далее препарат увлажняют дистиллированной водой, помещают в р-р карболового эритрозина на 20-30 мин.
После окрашивания его промывают и высушивают на воздухе. Подсчет клеток осуществляется с иммерсионным объективом.
Микроскопические методы микробиологического исследования позволяют выявить большое количество микроорганизмов. Но, несмотря на это, метод посева считается наиболее распространенным в практике. Суть его состоит в высеве объема препарата (почвенной суспензии) в чашке Петри на плотную среду.
Этот метод микробиологического исследования позволяет учитывать не только количество, но и групповой, а в ряде случаев и видовой состав микроскопической флоры. Подсчет числа колоний производится, как правило, со дна чашки Петри в проходящем свете. На подсчитанном участке ставится точка маркером либо чернилами.
Микрофлора водного объекта, как правило, отражает микробный состав почвы около него. В этой связи методы санитарно-микробиологического исследования воды и почвы имеют особое практическое значение при изучении состояния конкретной экосистемы. В пресных водоемах содержатся, как правило, кокки, палочковидные бактерии.
Анаэробы в воде обнаруживаются в малом количестве. Как правило, они размножаются на дне водоемов, в иле, принимая участие в процессах очищения. Микрофлора океанов и морей представлена преимущественно солелюбивыми (галофильными) бактериями.
В воде артезианских скважин микроорганизмов практически нет. Это обуславливается фильтрующей способностью почвенного слоя.
Общепринятыми методами микробиологического исследования воды считаются определение микробного числа и коли-титра либо коли-индекса. Первый показатель характеризует количество бактерий в 1 мл жидкости. Коли-индекс представляет собой количество кишечных палочек, присутствующих в литре воды, а коли-титр – минимальное количество или максимальное разведение жидкости, в котором их еще можно обнаружить.
Этот метод санитарно микробиологического исследования воды состоит в следующем. В 1 мл воды определяют количество факультативных анаэробов и мезофильных (промежуточных) аэробов, способных на мясопептонном агаре (основной питательной среде) при 37 град. на протяжении суток формировать колонии, видимые при увеличении в 2-5 р. или невооруженным глазом.
Ключевой стадией рассматриваемого метода микробиологического исследования воды является посев. Из каждой пробы делается посев не менее 2-х разных объемов. При анализе водопроводной воды в каждую чашку вносят по 1-0.1 мл чистой жидкости и по 0.01-0.001 мл загрязненной. Для посева 0.1 мл или меньшего объема жидкость разводится дистиллированной (стерильной) водой. Последовательно готовят десятикратные разведения. По 1 мл от каждого из них вносят в две чашки Петри.
Разведения заливаются питательным агаром. Его необходимо предварительно растопить и остудить до 45 град. После активного перемешивания среду оставляют на горизонтальной поверхности для застывания. При 37 град. посевы выращивают на протяжении суток. Рассматриваемый метод микробиологического исследования воды позволяет учитывать результаты на тех чашках, где количество колоний находится в пределах от 30 до 300.
Он считается транзитной средой для микроорганизмов. Основными методами микробиологического исследования воздуха являются седиментация (оседание) и аспирация.
Микрофлора воздушной среды условно разделяется на переменную и постоянную. К первой относятся дрожжи, пигментообразующие кокки, спороносные бациллы, палочки и прочие микроорганизмы, устойчивые к высыханию, воздействию света. Представители переменной микрофлоры, проникая в воздух из привычной для них среды обитания, недолго сохраняют свою жизнеспособность.
В воздухе крупных мегаполисов микроорганизмов намного больше, чем в воздушной среде сельской местности. Над морями, лесами бактерий очень мало. Очищению воздуха способствуют осадки: снег и дождь. В закрытых помещениях микробов намного больше, чем на открытых пространствах. Их количество повышается в зимний период при отсутствии регулярного проветривания.
Этот метод микробиологического исследования в микробиологии считается простейшим. Он основывается на оседании капель и частиц на поверхности агара в открытой чашке Петри под действием силы тяжести. Метод седиментации не позволяет точно определить число бактерий в воздухе. Дело в том, что на открытой чашке уловить мелкие фракции пылевых частиц и бактериальных капель довольно сложно. На поверхности задерживаются преимущественно крупные частицы.
Этот метод не используется при анализе атмосферного воздуха. Этой среде свойственны большие колебания скорости движения воздушных потоков. Седиментация, однако, может использоваться при отсутствии более совершенных приборов или источника электроэнергии.
Определение микробного числа осуществляется по методу Омелянского. В соответствии с ним, за 5 минут на поверхности агара площадью 100 кв. см оседает такое число бактерий, которое присутствует в 10 л воздуха.
Бактериологический анализ занимает важнейшее место в комплексе клинико-лабораторных мероприятий, направленных на диагностику, профилактику и лечение разнообразных инфекционных заболеваний. Однако исследованием окружающей среды они не ограничиваются.
Особое значение имеет бактериологический анализ биологического материала в лечебных учреждениях. К исследованиям, проводимым в медучреждениях, предъявляются повышенные требования. Целью Приказа «Об унификации микробиологических методов исследования» является совершенствование бактериологического анализа, повышение качества и эффективности микробиологической диагностики.
Оно является ключевым методом анализа при диагностике инфекций, передающихся половым путем, и оппортунистических заболеваний (вызываемых условно-патогенными бактериями).
Микроскопический анализ позволяет оценить качественный и количественный состав микрофлоры, проверить правильность взятия пробы. К примеру, наличие вагинального эпителия в мазке, взятом из цервикального канала, указывает на нарушение правил отбора биологической пробы.
Стоит сказать, что микробиологическое обследование в данном случае вообще сопровождается определенными проблемами. Они связаны с тем, что в нижних отделах полового тракта в норме присутствует разнообразная микрофлора, изменяющаяся в различные возрастные периоды. Для повышения эффективности исследования и были разработаны унифицированные правила.
Она осуществляется методами выявления РНК и ДНК-возбудителей. Они базируются преимущественно на определении нуклеотидных последовательностей в патологическом материале. Для этого используются молекулярные зонды. Они представляют собой искусственно полученные нуклеиновые кислоты, комплементарные (дополняющие) вирусным кислотам, меченные радиоактивной меткой или биотином.
Особенность метода состоит в многократном копировании конкретного фрагмента ДНК, включающего в себя несколько сотен (или десятков) нуклеотидных пар. Механизм репликации (копирования) заключается в том, что достраивание может начаться исключительно в определенных блоках. Для их создания используются праймеры (затравки). Они представляют собой синтезированные олигонуклеотиды.
ПЦР-диагностика (полимеразная цепная реакция) проста в исполнении. Этот метод позволяет быстро получить результат при использовании небольшого объема патологического материала. С помощью ПЦР-диагностики выявляются острые, хронические и латентные (скрытые) инфекции.
При чувствительности этот метод считается более предпочтительным. Однако в настоящее время тест-системы недостаточно надежны, поэтому ПЦР-диагностика не может полностью заменить традиционные методики.
источник
Вода очищенная должна подвергаться химическому и бактериологическому контролю. Ежедневно (из каждого баллона, а при подаче воды по трубопроводу — на каждом рабочем месте ) — анализу на отсутствие хлоридов, сульфатов, солей кальция и др. Ежеквартально — полному химическому анализу. Два раза в квартал направляется в местную санитарно — бактериологическую лабораторию для бактериологического исследования.
Воду очищенную сохраняют в асептических условиях не более 3 суток в закрытых емкостях, изготовленных из материалов, которые не меняют свойств воды и защищают ее от механических включений и микробиологических загрязнений.
Большое значение для качества воды имеет способ ее сбора и хранения. Получаемая вода для инъекций собирается в чистые простерилизованные или обработанные паром сборники промышленного производства . Необходимые санитарно — гигиенические условия хранения воды для инъекций обеспечивают отечественные сборники.
Выбор сборника типа СИ для аптек зависит от объема работы и затраты очищенной воды. Сборники должны иметь четкую надпись: «Вода для инъекций». Если используется одновременно несколько сборников, они нумеруются.
В порядке исключения вода для инъекций может хранится в стерильных сборниках, которые плотно закрываются пробками с двумя отверстиями: одно — для трубки, по которой поступает вода, другой — для стеклянной трубки, в которую вставляется тампон из стерильной ваты для фильтрования воздуха. Приемник с меток защиты от пыли должен быть обязан закрыт в герметичный стеклянный бокс. Необходимо тщательно следить за чистотой баллонов и соединительных трубок, по которым поступает вода в сборник.
Обычные стеклянные бутылки с корковыми или притертыми пробками непригодны для хранения воды для инъекций.
Воду для инъекций используют свежеприготовленной или хранят при температуре от 5 до 10 С. При подготовке запаса воды для инъекций ее необходимо стерилизовать сразу же после пергонки в плотно закрытых сосудах 120 С в течении 20 минут или при 100 С в течение 30 минут, или подогревать в сборнике до температуры 80-95 С в процессе перегонки, сбора и затем хранить в септических условиях не более 24 часов.
Проверка качества воды для инъекций. В аптеках качество воды для инъекций проверяется химическими методами ежедневно с каждого баллона согласно требованиям ДФ на отсутствие хлоридов, сульфатов, солей кальция, возобновляемых веществ, аммиака и угольного ангидрида. Ежеквартально вода направляется в контрольно — аналитическую лабораторию для полного химического анализа. В этом случае, помимо вышеупомянутых анализов, в воде определяют рН, кислотность или щелочность, наличие сухого остаткаЮ нитратов, нитритов, тяжелых металлов.
Бактериологический контроль проводиться не реже 2 раз в квартал. В 1 мл очищенной воды, используемой для перегонки, предельно допустимое содержание микроорганизмов не должно превышать 10 -15 колоний.
Ежеквартально вода для инъекций контролируется на пирогенность, так как исследования на восстанавливающие вещества с калия перманганатом не может указывать на отсутствие пирогенных веществ.
Вода проверяется на отсутствие видимых механических включений.
Методы получения воды очищенной и воды для инъекций. Стадии технологического процесса получения воды.
Вода очищенная может быть получена дистилляцией, ионным обменом , электролизом, обратным осмосом. Вода — бесцветная , прлзрачная, без запаха и вкуса; рН может колебаться в пределах 5,0 — 7,0 ; не должна содержать восстанавливающих веществ, нитратов, нитритов, хлоридов, сульфатов, следов аммиака и других примесей.
Из методов получения воды очищенной распространенным является метод дистилляции (перегонки).
Перегонка воды должна проводиться в специально оборудованном для этого помещении. Стены помещения должны быть окрашены маслянной краской или выложены облицовочной плиткой и содержаться в абсолютной чистоте. В этих помещениях запрещается делать другие посторонние работы — мыть грязную посуду, стирать белье, хранить посторонние предметы. В порядке исключения может быть разрешена только стерилизация растворов лекарственных веществ.
Механические примеси обычно отделяют отстаиванием с последующим сливом воды из осадка или фильтрованием. Для этого используют фильтры, выполненные в виде емкости цилиндрической формы, заполненные антрацитом или кварцевым песком. Емкости имеют крышку и дно, Оснащенное устройством для ввода, вывода и распределения воды внутри фильтра. Фильтры могут быть однослойные или двухслойные. Высота загрузки колеблется в зависимости от количества взвешенных частиц и желаемого промывочного эффекта.
Нежелательно присутствие в воде солей кальция и магния, которые придают ей временную и постоянную жесткость, вследствие чего при дистилляции воды на стенках испарителя образуется накипь. Кроме того, при перегонке жесткой воды быстро выходят из строя нагревательные элементы дистиллятора. Временную жесткость обусловливает наличие кальция и магния гидрокарбонатов. От них можно избавиться кипячением воды. При этом гидрокарбонаты переходят в карбонаты и выпадают в осадок, который отфильтровывают. Но в этом случае вода насыщается углерода оксидом, медленно удаляется при кипячении, тем самым снижается рН воды очищенной. Поэтому для устранения временной жесткости целесообразно применять кальция гидроксил.
Постоянная жесткость воды обусловлена присутствием кальция и магния хлоридов, сульфатов и других солей. ее устраняют обработкой воды натрия карбонатом.
Доступен для каждой аптеки известково-содовый способ смягчения воды. Суть его в том, что в воду добавляют одновременно раствор кальция гидроксила и раствор натрия карбоната. Под действием кальция гидроксила устраняется временная (карбонатная) жесткость, поскольку кальция и магния гидрокарбонаты переходят в карбонаты и выпадают в осадок.
Под действием натрия карбоната выпадают соли постоянной (некарбонатных) твердости: сульфаты, хлориды и другие соли кальция и магния. Кальция гидроксил связывает также углерода диоксид, находящегося в воде.
Коагуляция коллоидных примесей. Коллоидную муть можно удалить только после предварительного укрупнения взвешенных частиц. Для разрушения коллоидной системы необходимо нейтрализовать электрический заряд частиц. Лишенные заряда частицы под действием сил взаимного притяжения соединяются-коагулируют. Укрупненные частицы имеют такую массу, при которой они теряют свою кинетическую устойчивость и выпадают в осадок. Нейтрализация заряда коллоидных частиц достигается добавлением в воду другого вещества также коллоидного характера, но частицы которой несут противоположный заряд.
Соединения кремниевой кислоты, находящиеся в воде, в коллоидно-дисперсном состоянии несут отрицательные заряды, поэтому для их коагуляции пригодны только вещества, заряженные в воде положительно. Как такое вещество чаще всего применяют алюминия сульфат или алюмокалиевые галуны. Обработку воды перед дистилляцией стоит делать в отдельных емкостях, чтобы избежать загрязнения аквадистилляторов.
Водопроводная вода, подготовленная таким образом, все же содержит достаточное количество солей, которые при дистилляции оседают на стенках испарителя и электронагревательных элементов, что значительно снижает производительность дистиллятора и нередко выводит из строя электронагреватели.
Метод магнитной обработки воды заключается в пропускании ее через зазоры, образованные в корпусе специального устройства между подвижными и неподвижными магнитами. В результате воздействия на воду магнитного поля изменяются условия кристаллизации солей при дистилляции. Вместо плотного осадка на стенках дистилляторов образуются рыхлые шламы, а в толще воды — суспендированных. При использовании устройства обязательное ежедневное сброса воды из аппарата для удаления шлама. Предложен электрохимический диализный аппарат с применением полупроницаемых мембран, а также ионообменная установка для получения обессоленной воды с использованием гранулированных ионитов и ионообменного целлюлозного волокна.
Общий принцип получения воды дистиллированной заключается в том, что питьевую воду, которая прошла водоподготовку, помещают в аквадистиллятор, состоящий из следующих основных частей: испарителя, пароотводной части (шлема и соединительных трубок), конденсатора (холодильника) и сборника. Для контроля уровня воды в камере испарения оборудовано водомерное стекло. Испаритель с водой нагревают до кипения. Пары воды поступают в конденсатор, где они скраплливаются и в виде дистиллята поступают в сборник. Все нелетучие примеси, находящиеся в исходной воде, остаются в аквадистилляторы.
источник
Содержимое (Table of Contents)
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Вода очищенная ФС.2.2.0020.15
Вода очищенная Взамен ГФ Х, ст. 73;
Aqua purificata взамен ФС 42-2619-97
Настоящая фармакопейная статья распространяется на нефасованную воду очищенную, получаемую из воды питьевой методами дистилляции, ионного обмена, обратного осмоса, комбинацией этих методов или другим способом, и предназначенную для производства или изготовления лекарственных средств, получения воды для инъекций, а также для проведения испытаний лекарственных средств.
Для приготовления лекарственных средств, изготовляемых в асептических условиях, воду очищенную необходимо подвергать стерилизации.
Вода очищенная не должна содержать антимикробных консервантов или других добавок.
Бесцветная прозрачная жидкость без запаха.
От 5,0 до 7,0 (ОФС «Ионометрия», метод 3). К 100 мл воды очищенной прибавляют 0,3 мл насыщенного раствора калия хлорида.
К 20 мл воды очищенной прибавляют 0,05 мл 0,1 % раствора фенолового красного. При появлении желтого окрашивания оно должно измениться на красное при прибавлении не более 0,1 мл 0,01 М раствора натрия гидроксида. При появлении красного окрашивания оно должно измениться на желтое при прибавлении не более 0,15 мл 0,01 М раствора хлористоводородной кислоты.
Определение проводят в соответствии с требованиями ОФС «Электропроводность» с помощью оборудования – кондуктометров, внесенных в Государственный реестр средств измерений.
Оборудование
− электроды из подходящего материала, такого как нержавеющая сталь;
− константа ячейки обычно устанавливается поставщиком и впоследствии проверяется через соответствующие интервалы времени с использованием сертифицированного стандартного раствора с электропроводностью менее 1500 мкСм/см или путем сравнения с ячейкой, имеющей аттестованную константу ячейки. Константа ячейки считается подтвержденной, если найденное значение находится в пределах 2 % от значения, указанного в сертификате; в противном случае должна быть проведена повторная калибровка.
Кондуктометр. Точность измерения должна быть не менее 0,1 мкСм/см в низшем диапазоне.
Калибровка системы (ячейки электропроводности и кондуктометра). Калибровка должна проводиться с использованием одного или более соответствующих стандартных растворов (ОФС «Электропроводность»). Допустимое отклонение должно составлять не более 3 % от измеренного значения электропроводности.
Калибровка кондуктометра. Калибровку кондуктометра проводят с использованием сопротивлений высокой точности или эквивалентным прибором после отсоединения ячейки электропроводности для всех интервалов, использующихся для измерения электропроводности и калибровки ячейки, с погрешностью не более 0,1 % от сертифицированной величины.
В случае невозможности отсоединения ячейки электропроводности, вмонтированной в производственную линию, калибровка может быть проведена относительно предварительно калиброванной ячейки электропроводности, помещенной в поток воды рядом с калибруемой ячейкой.
Измеряют электропроводность без температурной компенсации с одновременной регистрацией температуры. Измерение электропроводности с помощью кондуктометров с температурной компенсацией возможно только после соответствующей валидации.
В табл. 1 находят ближайшее значение температуры, меньше измеренного. Соответствующая величина электропроводности является предельно допустимой.
Вода очищенная соответствует требованиям, если измеренное значение электропроводности не превышает найденного по табл.1 предельно допустимого значения.
Таблица 1 – Предельно допустимые значения электропроводности воды очищенной в зависимости от температуры
мкСм/см
Для значений температур, не представленных в табл. 1, рассчитывают предельно допустимое значение электропроводности путем интерполяции ближайших к полученному верхнему и нижнему значениям, приведенным в табл. 1.
Не более 0,001 %. 100 мл воды очищенной выпаривают досуха и сушат при температуре от 100 до 105 ºС до постоянной массы.
100 мл воды очищенной доводят до кипения, прибавляют 0,1 мл 0,02 М раствора калия перманганата и 2 мл серной кислоты разведенной 16 %, кипятят 10 мин; розовое окрашивание должно сохраниться.
При взбалтывании воды очищенной с равным объемом раствора кальция гидроксида (известковой воды) в наполненном доверху и хорошо закрытом сосуде не должно быть помутнения в течение 1 ч.
К 5 мл воды очищенной осторожно прибавляют 1 мл свежеприготовленного раствора дифениламина; не должно появляться голубое окрашивание.
Не более 0,00002 % (ОФС «Аммоний»). Определение проводят с использованием эталонного раствора, содержащего 1 мл стандартного раствора аммоний-иона (2 мкг/мл) и 9 мл воды, свободной от аммиака. Для определения отбирают 10 мл испытуемой пробы.
Примечание. Стандартный раствор аммоний-иона (2 мкг/мл) готовят разбавлением стандартного раствора аммоний-иона (200 мкг/мл) водой, свободной от аммиака.
К 10 мл воды очищенной прибавляют 0,5 мл азотной кислоты, 0,5 мл 2 % раствора серебра нитрата, перемешивают и оставляют на 5 мин. Не должно быть опалесценции.
К 10 мл воды очищенной прибавляют 0,5 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3 % и 1 мл 5 % раствора бария хлорида, перемешивают и оставляют на 10 мин. Не должно быть помутнения.
К 100 мл воды очищенной прибавляют 2 мл буферного раствора аммония хлорида, рН 10,0 50 мг индикаторной смеси протравного черного 11 и 0,5 мл 0,01 М раствора натрия эдетата; должно наблюдаться чисто синее окрашивание раствора (без фиолетового оттенка).
Не более 0,000001 % (ОФС «Алюминий», метод 1). Испытание проводят для воды очищенной, предназначенной для использования в производстве растворов для диализа.
Испытуемый раствор. К 400 мл воды очищенной прибавляют 10 мл ацетатного буферного раствора, рН 6,0 и 100 мл воды дистиллированной, перемешивают.
Эталонный раствор. К 2 мл стандартного раствора алюминий-иона
(2 мкг/мл) прибавляют 10 мл ацетатного буферного раствора, рН 6,0 и 98 мл воды дистиллированной, перемешивают.
Контрольный раствор. К 10 мл ацетатного буферного раствора, рН 6,0 прибавляют 100 мл воды дистиллированной и перемешивают.
Определение проводят одним из приведенных методов.
Метод 1. В пробирку диаметром около 1,5 см помещают 10 мл испытуемой воды очищенной, прибавляют 1 мл уксусной кислоты разведенной 30 %, 2 капли 2 % раствора натрия сульфида и перемешивают. Через 1 мин производят наблюдение за изменением окраски раствора по оси пробирки, помещенной на белую поверхность. Не должно быть окрашивания.
Метод 2. 120 мл воды очищенной упаривают до объёма 20 мл. Оставшеаяся после упаривания вода в объеме 10 мл должна выдерживать испытание на тяжёлые металлы (ОФС «Тяжелые металлы») с использованием эталонного раствора, содержащего 1 мл стандартного раствора свинец-иона (5мкг/мл) и 9 мл испытуемой воды очищенной.
Примечание. Стандартный раствор свинец-иона (5мкг/мл) готовят разбавлением стандартного раствора свинец-иона (100мкг/мл) испытуемой водой очищенной.
Общее число аэробных микроорганизмов (бактерий и грибов) не более 100 КОЕ в 1 мл. Не допускается наличие Еscherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa в 100 мл.
Для анализа микробиологической чистоты воды очищенной отбирают образец в объеме не менее 1000 мл.
Исследование проводят методом мембранной фильтрации в асептических условиях в соответствии с методами ОФС «Микробиологическая чистота», п.12.
Испытание проводят для воды очищенной, предназначенной для использования в производстве растворов для диализа.
Вода очищенная хранится и распределяется в условиях, предотвращающих рост микроорганизмов и исключающих возможность любой другой контаминации.
Хранение воды очищенной осуществляют в специальных сборниках, оно не должно превышать 3 сут.
источник
Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды
Методические указания
МУК 4.2.1018-01
1. Разработаны НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН (Недачин А. Е., Доскина Т. В., Дмитриева Р. А., Тишкова Н. Ю., Сидоренко С. Г.), Федеральным научным центром гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана Минздрава России (Трухина Г. М., Мойсеенко Н. Н., Сарафанюк Е. В.), Аналитическим центром контроля качества воды «Роса» (Кашкарова Г. П.), Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Кривопалова Н. С., Сорокина Р. С.), Центром госсанэпиднадзора в г. Москве (Салова Н. Я., Малышева З. Г., Кожевникова Н. А.), Центром госсанэпиднадзора в Московской области (Козлова А. Т.), Московским НИИ генетики (Бовыкина Н. М.), НИИ коммунального водоснабжения и очистки воды (Русанова Н. А.), Российской медицинской академией последипломного образования (Власова И. В.), Российским государственным медицинским университетом (Пивоваров Ю. П.).
2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации 9 февраля 2001 г.
3. С момента ввода данных методических указаний считаются утратившими силу методические указания МУК 4.2.671-97 «Методы санитарно-микробиологического анализа питьевой воды» и Информационно-методическое письмо Департамента государственного санитарно-эпидемиологического надзора Министерства здравоохранения Российской Федерации № 1100/1670-98-111 «О дополнительных мерах по осуществлению контроля качества питьевой воды по микробиологическим и паразитологическим показателям».
3. Отбор, хранение и транспортирование проб . 2
3.1. Общие требования к отбору проб . 2
3.2. Хранение и транспортирование проб . 3
4. Оборудование, расходные материалы, реактивы, питательные среды .. 3
4.2. Расходные материалы .. 4
4.3. Химические реактивы .. 4
4.5. Тест-культуры микроорганизмов . 6
5. Приготовление питательных сред и реактивов . 6
5.4. Фуксин-сульфитная среда Эндо . 7
5.5. Лактозо-пептонная среда . 7
5.6. Питательные среды для подтверждения способности ферментировать лактозу до кислоты и газа . 7
5.7. Реактивы для оксидазного теста . 8
5.8. Железо-сульфитный агар . 8
5.9. Реактивы для окраски препаратов по Граму . 8
6. Подготовка к анализу . 9
6.1. Подготовка посуды и материалов . 9
6.2. Подготовка проб воды .. 9
7. Методика работы при использовании мембранных фильтров . 9
7.1. Подготовка мембранных фильтров . 9
7.2. Подготовка фильтровального аппарата . 9
8.1. Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре . 10
8.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации (основной метод) 10
8.3. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом .. 13
8.4. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий . 15
8.5. Определение колифагов . 16
Главный государственный санитарный врач
Российской Федерации — Первый заместитель
Министра здравоохранения Российской Федерации
Дата введения: 1 июля 2001 г.
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды
Методические указания
МУК 4.2.1018-01
1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы санитарно-микробиологического контроля качества питьевой воды в отношении ее эпидемической безопасности по показателям СанПиН 2.1.4.559-96 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».
1.2. Методические указания предназначены для лабораторий организаций, предприятий и иных хозяйственных субъектов, осуществляющих производственный контроль, а также органов санитарно-эпидемиологической службы, обеспечивающих государственный и ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор за качеством питьевой воды централизованных систем питьевого водоснабжения.
2.1. Санитарные правила и нормы. «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества». СанПиН 2.1.4.559-96.
2.2. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами». СП 1.2.731-99.
2.3. ГОСТ 18963-73. Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа.
3.1.1. Отбор проб производит специалист после прохождения инструктажа по технике выполнения отбора проб для микробиологического анализа.
3.1.2. Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов.
3.1.3. Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги). Многоразовая посуда, в т.ч. пробки, должна выдерживать стерилизацию сухим жаром или автоклавированием.
3.1.4. При отборе проб в одной и той же точке для различных целей первыми отбирают пробы для бактериологических исследований. Если отбирают воду после обеззараживания химическими реагентами, то для нейтрализации остаточного количества дезинфектанта в емкость, предназначенную для отбора проб, вносят до стерилизации натрий серноватисто-кислый в виде кристаллов из расчета 10 мг на 500 мл воды.
3.1.5. Пробу отбирают в стерильные емкости. Емкость открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду запрещается.
3.1.6. При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана производят после предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 мин при полностью открытом кране. При отборе пробы напор воды может быть уменьшен. Пробу отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок. Если через пробоотборный кран происходит постоянный излив воды, отбор проб производят без предварительного обжига, не изменяя напора воды и существующей конструкции (при наличии силиконовых или резиновых шлангов).
При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировании.
После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком.
3.1.7. Отобранную пробу маркируют и сопровождают документом отбора проб воды с указанием места, даты, времени забора, фамилии специалиста, отбиравшего пробу, и другой информации.
3.2.1. Доставку проб питьевой воды осуществляют в контейнерах-холодильниках при температуре (4 — 10) °С. В холодный период года контейнеры должны быть снабжены термоизолирующими прокладками, обеспечивающими предохранение проб от промерзания. При соблюдении указанных условий срок начала исследований от момента отбора проб не должен превышать 6 ч.
Если пробы нельзя охладить, их анализ следует провести в течение 2 ч после забора.
Если не может быть соблюдено время доставки пробы и температура хранения, анализ пробы проводить не следует.
Пробы питьевой воды должны доставляться в отдельных продезинфицированных контейнерах.
Термостат для температурного режима (37 ± 1) °С
Термостат для температурного режима (44 ± 1) °С
Термостат или водяная баня для температурного режима (44 ± 0,5) °С
Водяная баня для температурного режима (75 ± 5) °С
Водяная баня или термостат для температурного режима (45 — 49) °С (для питательных сред)
Прибор для мембранной фильтрации под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм и устройство для создания разрежения (0,5 — 1,0) атм
Весы лабораторные общего назначения 4 кл. точности, с пределом взвешивания до 1000 г
Максимальный термометр ртутный с диапазоном измерения от 20 до 200 °С с ценой деления шкалы 1 °С
Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С с ценой деления шкалы 0,5 °С
рН-метр, обеспечивающий измерение с погрешностью до 0,01
Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды не ниже
Стерилизатор суховоздушный для температурного режима (180 ± 5) °С
Холодильник бытовой электрический
Вытяжной шкаф для работы с хлороформом при проведении анализа на колифаги
Нагревательный прибор для варки питательных сред либо магнитные мешалки с подогревом до 300 °С
Прибор для счета колоний бактерий
Лупа с двукратным увеличением
Дозаторы для разлива питательных сред
Оптический стандарт мутности на 10 ед.
Горелки газовые или спиртовки
Пинцеты для работы с мембранными фильтрами
Мембранные фильтры для микробиологических целей с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм и другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации, имеющие сертификат качества
Индикаторы бумажные для определения рН в диапазоне 6 — 8 с интервалом определения 0,2 — 0,3
Фольга алюминиевая, колпачки силиконовые, металлические
Пипетки, вместимостью 1,5, 10 мл с ценой деления 0,1 мл многоразового или одноразового использования)
Пробирки (многоразового или одноразового использования)
Цилиндры, вместимостью 100, 250, 500 мл или мензурки, вместимостью 250, 500, 1000 мл
Чашки бактериологические (Петри)
Пробки (силиконовые, резиновые и другие, выдерживающие стерилизацию сухим жаром или автоклавированием)
Бумага фильтровальная лабораторная
Вата хлопковая медицинская гигроскопическая
Карандаши или фломастеры по стеклу
Все химические реактивы должны соответствовать квалификации не ниже ч. д. а.
Железо серно-кислое закисное (7-водное)
Натрий серноватисто-кислый (тиосульфат натрия) 5-водный
Спирт этиловый ректификованный медицинский
Спирт этиловый технический
Натрий сернисто-кислый (сульфит натрия)
Фенилендиаминовые соединения* (тетраметил-п-фенилендиамин гидрохлорид, диметил-п-фенилендиамин соляно-кислый)
Генциан фиолетовый кристаллический
* Вещества обладают канцерогенным и мутагенным действием, работа с ними требует соблюдения мер предосторожности.
Сухой препарат с индикатором ВР и лактозой или среда Гисса с лактозой
Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей
Системы индикаторные бумажные (СИБ)
Допускаются к использованию коммерческие питательные среды, диагностические препараты и системы идентификации производства зарубежных фирм, предназначенные для целей описываемых методов. Питательные среды и биологические препараты зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ISO 9000 или EN 29 000.
При использовании следует руководствоваться рекомендациями фирмы-производителя.
Все обезвоженные коммерческие питательные среды и препараты отечественного производства должны иметь сертификат соответствия.
4.5.1. Контрольный колифаг М82, штамм ВКПМ-3254 Е. coli К12 F + Str r получают в ГНИИ Генетика — Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ — Россия, 113545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1).
4.5.2. Штамм Е. coli М17-02 и один из штаммов: Pseudomonas aeruginosa или Pseudomonas fluorescens получают в Государственном Национальном Органе контроля медицинских и биологических препаратов им. Л. А. Тарасовича Минздрава России (Россия, 121002, г. Москва, ул. Сивцев-Вражек, д. 41).
В производственных лабораториях, расположенных на территории водопроводных станции, следует использовать штамм Pseudomonas fluorescens .
Предпочтительно использование стандартизованных сухих питательных сред промышленного производства.
При использовании промышленных сухих питательных сред их приготавливают в соответствии с указаниями изготовителя на этикетке.
В этом случае следует соблюдать способ применения и срок хранения питательных сред, указанные на упаковках.
Сухие питательные среды хранят в сухих помещениях, в темноте, при комнатной температуре. Открытые упаковки тщательно закупоривают. Среды с измененным внешним видом (уплотненные, с комками), а также с истекшим сроком годности не используют.
Для приготовления растворов, реактивов и питательных сред применяют воду дистиллированную по ГОСТу 6709-72.
Питательные среды готовят в посуде из инертного материала.
Учитывая возможное изменение рН питательных сред после кипячения и стерилизации, окончательный контроль рН проводят в готовой среде при температуре 25 °С с использованием индикаторной бумаги.
После стерилизации питательные среды оставляют для охлаждения при комнатной температуре. При необходимости розлива в чашки Петри среды охлаждают до температуры (50 — 60) °С.
Температура сред, хранящихся в холодильнике, перед посевом должна быть доведена до комнатной.
5.2.1. Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.
5.2.2. Питательный бульон (десятикратный) для колифагов готовят путем увеличения в 10 раз навески сухого препарата, указанной на этикетке.
5.3.1. Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.
5.3.2. Питательный агар для определения колифагов прямым методом готовят, увеличивая навеску сухого препарата в 2 раза от прописи.
5.3.3. Питательный агар запрещается выдерживать в расплавленном состоянии более 8 ч. Оставшийся неиспользованным агар повторному расплавлению не подлежит.
5.3.4. Полужидкий питательный агар готовят следующим образом: сухой питательный бульон (15 г) и агар микробиологический (3 г) растворить при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды. Довести рН до 7,0 — 7,2, разлить в пробирки и стерилизовать автоклавированием при 121 °С в течение 15 мин.
5.3.5. Питательный агар со стрептомицином готовят из расчета содержания 100 мкг стрептомицина на 1 мл питательного агара, приготовленного по стандартной прописи. Стерильно на стерильной дистиллированной воде готовят раствор стрептомицина в концентрации 10 мг на 1 мл. В готовый питательный агар, отмеренный по объему и остуженный до температуры (45 — 49) °С, вносят приготовленный стерильный раствор стрептомицина из расчета 0,1 мл на 10 мл питательного агара. Разливают в пробирки для приготовления скошенного агара. Повторное расплавление питательной среды со стрептомицином запрещается.
Готовят из сухого препарата по способу, указанному на этикетке. Если на поверхности среды заметны следы влаги, чашки перед посевом необходимо подсушить. Срок хранения чашек со средой не более 2 — 3 суток в темноте, если производителем не оговорены другие сроки.
5.4.2. Повышение дифференцирующих свойств среды
Для повышения дифференцирующих свойств среды в готовую и охлажденную до (60 — 70) °С среду перед разливкой в чашки допускается прибавлять на 100 мл среды 0,2 мл 5 %-ного спиртового раствора основного фуксина. Срок хранения раствора фуксина — не более 1 мес.
5.4.3. Модификация среды с добавлением розоловой кислоты
В случаях, когда мембранные фильтры зарастают микрофлорой, не относящейся к бактериям кишечной группы, помимо фуксина, допускается добавление на 100 мл среды Эндо 0,2 мл 5 %-ного спиртового раствора розоловой кислоты. Срок хранения раствора розоловой кислоты — не более 1 мес.
Модификацию среды Эндо с добавлением розоловой кислоты используют только при работе методом мембранной фильтрации.
10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г лактозы растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды. После растворения ингредиентов устанавливают рН 7,4 — 7,6, разливают по 10 мл в пробирки, стерилизуют при (112 ± 2) °С 12 мин.
Для приготовления концентрированной лактозо-пептонной среды все ингредиенты, кроме воды, увеличивают в 10 раз, разливают по 1 мл в пробирки и по 10 мл во флаконы.
5.6.1. Полужидкая среда с лактозой из сухого препарата
Готовят по способу, указанному на этикетке.
Срок хранения — не более 2 недель при комнатной температуре.
Посев производят уколом до дна пробирки. При образовании кислоты цвет питательной среды изменяется в соответствии с использованным индикатором. При газообразовании газ скапливается или по уколу, или на поверхности, или в толще среды появляются разрывы. При инкубации посевов более 5 ч газ может улетучиться. В таких случаях на присутствие газа указывают оставшиеся в толще среды «карманы» — потемнения среды на месте бывшего пузырька газа.
5.6.2. Полужидкая среда с лактозой
Готовят при отсутствии сухого препарата.
В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, (4 — 5) г агар-агара, доводят до кипения, устанавливают рН 7,2 — 7,4, добавляют 1 мл 1,6 %-ного спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при (120 ± 2) °С 20 мин. В расплавленную среду вносят 5 г лактозы, нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки на высоту (3 — 5) см и стерилизуют при (112 ± 2) °С 12 мин. Срок хранения — не более 2 недель при комнатной температуре.
Правильно приготовленная среда зеленого цвета с синеватым оттенком (цвет бутылочного стекла). При Образовании кислоты цвет среды изменяется на желтый.
5.6.3. Лактозо-пептонная среда
Готовят по п. 5.5 с добавлением 1 мл 1,6 %-ного спиртового раствора бромтимолового синего на 1 л и разливают по (3 — 5) мл в пробирки с поплавком.
Готовят по прописи завода-изготовителя.
1 %-ный водный раствор тетраметил-п-фенилендиамина гидрохлорид. Готовят перед употреблением.
Реактив № 1. 1 %-ный спиртовой раствор α-нафтола.
Реактив № 2. 1 %-ный водный раствор фенкпендиаминового соединения.
Растворы сохраняют в темных флаконах с притертыми пробками:
1 — до одного месяца, 2 — до одной недели. Перед употреблением к трем частям первого раствора добавляют семь частей второго раствора.
Могут быть использованы коммерческие тест-системы для постановки оксидазного теста (СИБ-оксидаза или аналоги).
Перед работой с каждой серией проб реактивы или тест-системы на оксидазу следует испытывать с тест-культурами микроорганизмов, дающих положительную ( Ps . aeruginosa , Ps . fluorescens ) и отрицательную оксидазную реакцию (E. coli).
В 1000 мл стерильного расплавленного питательного агара (по п. 5.4) добавляют 10 г глюкозы, нагревают до растворения, разливают мерно во флаконы, автоклавируют при (112 ± 2) °С 12 мин (основная среда).
20 %-ный раствор сульфита натрия ( Na 2 SO 3 ) и 8 %-ный раствор железа серно-кислого закисного ( FeSO 4 ) или железа хлористого ( FeCl 2 ) готовят непосредственно перед употреблением в стерильной посуде на стерильной дистиллированной воде. Раствор сульфита натрия нагревают до полного растворения. Перед выполнением анализа в 100 мл расплавленной основной среды вносят 5 мл 20 %-ного раствора сульфита натрия, перемешивают, затем вносят 1 мл 8 %-ного раствора сернокислого железа, перемешивают и стерильно разливают в пробирки высоким столбиком (12 — 15) см для работы методом мембранной фильтрации или во флаконы для работы методом прямого посева.
5.9.1. Карболовый раствор генциана фиолетового готовят следующим образом: 1 г генциана фиолетового, 10 мл ректификованного этилового спирта, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 мл дистиллированной воды.
5.9.2. Раствор Люголя готовят следующим образом: 1 г йода, 2 г йодистого калия растворяют в 300 мл дистиллированной воды. Хранить во флаконе из темного стекла.
5.9.3. Фуксин Циля готовят следующим образом: 1 г основного фуксина, 10 мл спирта этилового ректификованного, 54 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 мл дистиллированной воды.
Лабораторную посуду моют, ополаскивают сначала водопроводной, затем дистиллированной водой и высушивают.
Пробирки, колбы, бутылки, флаконы закрывают силиконовыми или ватно-марлевыми пробками и колпачками (силиконовые, металлические, из фольги или плотной бумаги).
Пипетки со вставленными тампонами из ваты укладывают в металлические пеналы или заворачивают в бумагу.
Чашки Петри укладывают в металлические пеналы или заворачивают в бумагу. Бумага, используемая для обертывания лабораторной посуды, не должна разрушаться при стерилизации.
Подготовленную посуду стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 160 °С в течение 2 ч или 180 °С 1 ч, считая с момента достижения указанной температуры. Стерильную посуду вынимают из стерилизационного шкафа после его охлаждения ниже 60 °С. Срок хранения стерильной посуды — не более 10 дней.
Материалы и лабораторную посуду, разрушающиеся при температуре (160 — 180) °С (резина и т.п.), следует стерилизовать в паровом стерилизаторе при температуре (121 ± 2) °С 20 мин.
Новые резиновые пробки кипятят в 2 %-ном растворе натрия двууглекислого 30 мин и 5 раз промывают водопроводной водой (кипячение и промывание повторяют дважды). Затем пробки кипятят в дистиллированной воде 30 мин, высушивают, заворачивают в бумагу или фольгу и стерилизуют в паровом стерилизаторе. Резиновые пробки, использованные ранее, обеззараживают, кипятят 30 мин в водопроводной воде с нейтральным моющим средством, промывают в водопроводной воде, высушивают, монтируют и стерилизуют.
После выполнения анализа все использованные чашки, пробирки и пипетки обеззараживают в автоклаве при (126 ± 2) °С в течение 60 мин, в исключительных случаях допускается обеззараживание кипячением в 2 %-ном растворе пищевой соды или 0,5 %-ном моющего средства в течение 60 мин с момента закипания (в закрытой емкости с полным погружением в раствор).
Перед посевом пробу тщательно перемешивают и фламбируют горящим тампоном край емкости. Используемые пробирки и чашки маркируют.
Перед каждым отбором новой порции воды для анализа пробу перемешивают стерильной пипеткой.
Мембранные фильтры должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями изготовителя.
Воронку и столик фильтровального аппарата обтирают марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом ректификованным, и фламбируют. После охлаждения на столик фильтровального аппарата кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его воронкой.
В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем воды, затем создают вакуум.
При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без обеззараживания сначала меньшие, а затем большие объемы воды, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы прибор обеззараживают.
Следует начинать с фильтрования проб обеззараженной воды или тех проб, которые предположительно не загрязнены, а затем фильтровать загрязненные пробы.
При фильтровании 1 мл исследуемой воды следует в воронку налить предварительно не менее 10 мл стерильной воды, а затем внести анализируемую воду.
После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду, разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.
Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы и даты посева. На одну чашку можно поместить 3 — 4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.
8.1.1. Определение понятия показателя
Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24 ч, видимые с увеличением в 2 раза.
Из каждой пробы делают посев не менее двух объемов по 1 мл.
После тщательного перемешивания пробы воды вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. После внесения воды в каждую чашку вливают (8 — 12) мл (на чашку диаметром 90 — 100 мм) расплавленного и остуженного до (45 — 49) °С питательного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержится. Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашки оставляют до застывания агара.
Расплавленный агар на период проведения анализа помещают в водяную баню или термостат, поддерживающие температуру (45 — 49) °С.
После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 2) ч.
Подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300 изолированных колоний.
Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды.
Если на одной из 2 чашек подсчет невозможен, результат выдают на основании учета колоний на одной чашке. Если на двух чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не распространяющийся на всю поверхность чашки, или выросло более 300 колоний и анализ нельзя повторить, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают «число КОЕ/мл — ориентировочно».
Если подсчет колоний на чашках невозможен, то в протоколе отмечают «сплошной рост».
8.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации (основной метод)
8.2.1. Определение понятия показателя
Общие колиформные бактерии (ОКБ) — грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (37 + 1) °С в течение (24 — 48) ч.
Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч.
Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.
8.2.3.1. Порядок исследования
При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 мл.
При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 мл воды через один фильтр.
При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличение количества фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например, 10, 40, 100, 150 мл воды).
Отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры с соблюдением требований, изложенных в п. 7.
Фильтры помещают на среду Эндо, приготовленную по п. 5.4. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 2) ч.
Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 мл исследуемой воды. Анализ заканчивают через 24 ч.
Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.
Для подтверждения наличия ОКБ исследуют:
· все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний;
· не менее 3 — 4 колоний каждого типа.
Для подтверждения наличия ТКБ исследуют все типичные колонии, но не более 10.
Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на:
· наличие оксидазной активности;
· принадлежность к Граму (микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена);
· ферментацию лактозы до кислоты и газа.
8 2.3 2. Постановка оксидазного теста
Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и смачивают 2 — 3 каплями реактива для оксидазного теста по п. 5.7. Готовые бумажные системы смачивают дистиллированной водой. Часть изолированной колонии стеклянной палочкой или платиновой петлей (металлическая петля из нихрома может дать ложноположительную реакцию) наносят штрихом на подготовленную фильтровальную бумагу. Реакция считается положительной, если в течение 1 мин появляется фиолетово-коричневое ( п. 5.7.1 вариант 1) или синее ( п. 5.7.2 вариант 2 и СИБ-оксидаза) окрашивание штриха. При отрицательной реакции цвет в месте нанесения культуры не меняется. При положительном результате эту колонию из дальнейшего исследования исключают.
Если при исследовании колоний, окрашенных в темно-красный цвет, получают недостаточно четкий результат, необходимо пересеять культуру со среды Эндо на питательный агар. После инкубации тест повторяют.
8.2.3.3. Определение принадлежности к Граму
Из оксидазоотрицательной колонии делается мазок, окрашивается по Граму и микроскопируется.
На обезжиренное спиртом предметное стекло наносят петлей 1 каплю дистиллированной воды, вносят небольшое количество культуры из анализируемой колонии и распределяют по поверхности стекла. Мазок высушивают при комнатной температуре и фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки. На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генциана фиолетового на (0,5 — 1) мин, снимают бумагу, наливают раствор Люголя на (0,5 — 1) мин, сливают раствор Люголя и стекло промывают в этиловом спирте в течение (0,5 — 1) мин, пока не перестанет отходить краситель. Затем стекло тщательно промывают водой и докрашивают в течение (1 — 2) мин фуксином Циля, разведенным 1:10 дистиллированной водой. После промывания и просушивания препарата мазок микроскопируют.
Приготовление реактивов для окраски по Граму изложено в п. 5.9.
Грамотрицательные микроорганизмы имеют розовую окраску, грамположительные окрашиваются в синий цвет. Колиформные бактерии являются грамотрицательными палочками.
Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена, не требующим использования оптики.
Тест Грегерсена: в капле 3 %-ного водного раствора КОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры или колонии к грамотрицательному виду. У грамположительных бактерий слизистые нити не образуются — реакция отрицательная.
8.2.3.4. Определение ферментации лактозы
Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной изолированной колонии засевают параллельно в две пробирки с лактозной средой ( п. 5.6):
· для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 48 ч;
· для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно прогретую до температуры (43 — 44) °С, и инкубируют при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч.
Первичный учет образования кислоты и газа на подтверждающих полужидких средах и СИБ ( п. 5.6) возможен через (4 — 6) ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ. При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки с посевами для окончательного учета ТКБ оставляют до 24 ч. Пробирки с посевами для подтверждения наличия ОКБ после просмотра через 24 ч и получения отрицательного результата оставляют для окончательного учета до 48 ч.
Если колония, подлежащая исследованию, незначительных размеров, ее пересевают на скошенный питательный агар и после инкубации в течение (18 — 24) ч выполняют все необходимые подтверждающие тесты.
8.2.3.5. Постановка подтверждающих тестов при наложении колоний или сплошном росте
Если на части или на всей поверхности фильтра наблюдается наложение колоний или сплошной рост, выполняют оксидазный тест путем помещения мембранного фильтра на кружок фильтровальной бумаги большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом, или на диск СИБ-оксидаза, смоченный дистиллированной водой. При появлении первых признаков реакции, но не более чем через 5 мин, мембранный фильтр переносят обратно на среду Эндо. После четкого проявления реакции определяют результат. При появлении фиолетово-коричневого или синего окрашивания (в зависимости от примененного реактива) оксидазный тест считают положительным.
Если на фильтрах все колонии оксидазоположительные, они не учитываются и выдают ответ об отсутствии ОКБ и ТКБ и завершают анализ.
При отрицательной оксидазной реакции проводят рассев до получения изолированных колоний и подтверждают их принадлежность к ОКБ и ТКБ по п. п. 8.2.3.3 — 8.2.3.4 (анализ качественный).
8.2.4.1. Грамотрицательные колонии учитываются как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 37 °С с образованием кислоты и газа.
Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44 °С с образованием кислоты и газа.
8.2.4.2. При отсутствии общих и термотолерантных колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают «не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 мл» и «не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 мл».
8.2.4.3. В случае идентификации всех выросших подозрительных колоний число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 мл воды.
Вычисление проводят по формуле:
, где
Х — число колоний в 100 мл;
V — профильтрованный объем воды через фильтры, на которых велся учет;
а — число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.
1. При посеве 3 фильтров по 100 мл выросло две колонии в 100 мл, на остальных двух фильтрах нет роста. Число общих или термотолерантных колиформных бактерий будет:
КОЕ ОКБ (ТКБ) в 100 мл
2. При посеве 10, 40, 100 и 150 мл на фильтрах с профильтрованным объемом 40 мл выросло 4 изолированные колонии, с профильтрованным объемом 100 — 3 ОКБ. Фильтры с объемами 10 мл и 150 мл заросли и учету не подлежат. Суммируют общее число колоний ОКБ (ТКБ) на тех фильтрах, где получены изолированные колонии, и пересчитывают на объем 100 мл.
КОЕ в 100 мл
8.2.4.4. Если при выборочной проверке колоний одного типа получены неодинаковые результаты, то вычисляют числа ОКБ или ТКБ среди колоний этого типа по формуле:
, где
Х — число подтвержденных бактерий одного типа;
а — общее число колоний этого типа;
b — число проверенных из них;
с — число колоний с положительным результатом.
Полученные результаты учета по каждому типу колоний суммируют и далее подсчитывают по п. 8.2.4.3 — 8.2.4.4.
8.2.4.5. Окончательный результат выдают: количество КОЕ ОКБ в 100 мл, из них количество КОЕ ТКБ в 100 мл.
Ориентировочный результат может быть выдан при обнаружении типичных колиформных колоний на среде Эндо, образованных грамотрицательными оксидазоотрицательными бактериями. Окончательный ответ подтверждается по результатам ферментации лактозы.
8.2.4.6. При наложении колоний или сплошном росте на всех фильтрах ( п. 8.2.3.5) в случае подтверждения принадлежности к ОКБ и ТКБ выдается качественный результат «обнаружено ОКБ в 100 мл».
Если все колонии на фильтре оксидазоположительные или не подтвердилась их принадлежность к ОКБ и ТКБ, анализ завершается, в протоколе отмечают «зарост фильтров».
В обоих случаях анализ повторяют.
8.3.1. Определение понятия показателя
Определение понятия показателей ОКБ и ТКБ по п. 8.2.1.
Титрационный метод может быть использован:
· при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации;
· при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;
· в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.
Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.
При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий санэпиднадзор, производственный контроль) засевают 3 объема по 100 мл.
При исследованиях воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят посев: 3 объемов по 100 мл, 3 объемов по 10 мл, 3 объемов по 1 мл.
Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозо-пептонную среду, приготовленную по п. 5.5. Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации.
Посевы инкубируют при (37 ± 1) °С в течение 48 ч. Не ранее 24 час инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо ( п. 5.4.1) для получения изолированных колоний.
Емкости без наличия роста и образования газа оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными и дальнейшему исследованию они не подлежат. Из емкостей, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают высев на сектора среды Эндо.
Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 — 20) ч.
При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий: темно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде, дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме пробы.
Наличие ОКБ требуется подтвердить:
· если в среде накопления отмечено только помутнение;
· если принадлежность к лактозоположительным колониям вызывает сомнение у исследователя.
· проверяют наличие отпечатка на среде Эндо после снятия петлей подозрительной колонии;
· выполняют оксидазный тест по п. 8.2.3.2;
· подтверждают принадлежность к Граму по п. 8.2.3.3;
· подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных 1 — 2 колоний каждого типа с каждого сектора на среду с лактозой по п. 5.6 с последующей инкубацией посевов при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 — 48) ч.
При отсутствии изолированных колоний проводят рассев на среду Эндо общепринятыми бактериологическими методами.
Отрицательный ответ дают, если:
· в среде накопления нет признаков роста;
· на секторах среды Эндо нет роста;
· на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные с неровными краями, расплывчатые и т.п.);
· все колонии оказались оксидазоположительными;
· все колонии оказались грамположительными;
· если в подтверждающем тесте на среде с углеводом не отмечено газообразования.
Для определения термотолерантных колиформных бактерий работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии. Делают посев 2 — 3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред, приготовленных по п. 5.6.
Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °С. Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через (4 — 6) ч.
При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °С дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.
Допустимо для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ производить высев 1 мл из объемов среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование в пробирке с лактозо-пептонной средой с поплавком по п. 5.6 и прогретой предварительно до температуры 44 °С. Посевы выдерживают в термостате при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.
При исследовании 3 объемов по 100 мл результаты оцениваются качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из 3 объемов, делается запись в протоколе «обнаружены в 100 мл».
При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по табл. 1.1 приложения 1.
Результат сообщают без доверительного интервала.
При отрицательном ответе на наличие ОКБ и ТКБ во всех исследованных объемах выдают заключение в протоколе «не обнаружены в 100 мл».
8.4.1. Определение понятия показателя
Сулъфитредуцирующие клостридии — спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре при температуре (44 ± 1) °С в течение (16 — 18) ч.
Метод основан на выращивании посевов в железо-сульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.
8.4.3.1. Пробу воды 20 мл прогревают на водяной бане в пробирках при температуре (75 ± 5) °С в течение 15 мин для исключения вегетативных форм.
При исследовании хлорированной воды прогревание пробы можно не производить.
Из каждой пробы питьевой воды делают посев или фильтруют 20 мл. При необходимости подбирают объемы с таким расчетом, чтобы в посевах (на фильтрах) выросло не более 10 — 15 колоний. При этом ориентируются на результаты предыдущих исследований.
Фильтрование воды производят в соответствии с требованиями, изложенными в п. 7.
8.4.3.2. Определение методом фильтрования в пробирках
Перед посевом пробирки с железо-сульфитным агаром, приготовленным по п. 5.8, расплавляют на водяной бане (не кипятить!). В течение посева поддерживают среду нагретой до (70 — 80) °С в водяной бане.
После фильтрования установленного объема воды мембранный фильтр фламбированным пинцетом берут за два противоположных края и согнутый в виде трубочки помещают в пробирку с горячим агаром. Сторона фильтра с осевшими бактериями обращена внутрь. При этом фильтр распрямляется и располагается по стенке пробирки.
Сразу же после посева пробирку с агаром и фильтром для создания анаэробных условий быстро охлаждают, помещая в емкость с холодной водой. Культивируют посевы при (44 ± 1) °С в течение (16 — 18) ч.
8.4.3.3. Определение методом фильтрования в чашках Петри
Чашки Петри диаметром (55 — 60) мм заливают тонким слоем железо-сульфитного агара. После фильтрации фильтр поместить фильтрующей поверхностью вниз на застывшую питательную среду так, чтобы под фильтром не было пузырьков воздуха. Затем заливают расплавленным железо-сульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий. Культивируют посевы при (44 ± 1) °С в течение (16 — 18) ч.
8.4.3.4. Определение прямым посевом
Железо-сульфитный агар во флаконах и пробу воды готовят, как это описано в п. 8.4.3.1.
В стерильные пробирки вносят:
· по 10 мл в 2 пробирки (объемом не менее 30 мл) или
· по 5 мл в 4 пробирки (объемом по 15 мл).
Посевы заливают горячим железо-сульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливать по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирку быстро охлаждают, помещая ее в емкость с холодной водой для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при (44 ± 1) °С в течение (16 — 18) ч.
Количественному учету подлежат только те посевы, где получены изолированные колонии. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды.
Результат анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 мл воды.
При отсутствии роста черных колоний на всех фильтрах дают ответ «не обнаружено в 20 мл воды».
При невозможности учета колоний из-за сливного роста результат оценивается как качественный, в протоколе отмечают «обнаружено в 20 мл». При необходимости получения количественного результата анализ повторяют.
8.5.1. Определение понятия показателя
Колифаги — бактериальные вирусы, способные лизировать E. coli и формировать при температуре (37 ± 1) °С через (18 ± 2) ч зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре.
8.5.2. Титрационный метод определения колифагов
Определение колифагов в питьевой воде заключается в предварительном накоплении колифагов в среде обогащения на культуре E. coli и последующем выявлении зон лизиса (просветления) газона E. coli на питательном агаре.
Метод предназначен для проведения текущего контроля качества питьевой воды.
8.5.2.3. Подготовка тест-культуры E. coli К12 Str R .
На всех этапах исследования используют бактериальную взвесь, приготовленную следующим образом: культуру E. coli засевают в пробирку со скошенным питательным агаром со стрептомицином ( п. 5.3.5). Через (18 ± 2) ч инкубации при температуре (37 ± 1) °С произвести смыв бактерий с косяка 5 мл стерильного физиологического раствора (0,85 %-ный раствор NaCl ) и по стандарту мутности готовят взвесь E. coli в концентрации 10 9 бактериальных клеток в 1 мл.
Допускается использование 4-часовой бульонной культуры E. coli, полученной путем подращивания в термостате при температуре 37 °С. Концентрация 10 9 бактериальных клеток E. coli содержится в 2 мл.
8.5.2.4. Проведение качественного анализа
В исследуемую пробу воды объемом 100 мл вносят 10 мл 10-кратного питательного бульона (приготовленного по п. 5.2.2) и 1 мл подготовленного смыва тест-культуры или 2 мл 4-часовой бульонной культуры ( п. 8.5.2.3).
Для контроля культуры 0,1 мл смыва бактерий Е. c oli (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром.
Исследуемую пробу воды (100 мл) и чашку Петри с контролем E. coli помещают в термостат и инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 ± 2) ч.
После инкубации из исследуемой пробы воды отливают в пробирку 10 мл и добавляют 1 мл хлороформа.
Пробирку закрывают стерильной резиновой или силиконовой пробкой, энергично встряхивают для равномерного распределения хлороформа по объему пробы и оставляют при комнатной температуре не менее 15 мин до полного осаждения хлороформа.
В предварительно расплавленный и остуженный до (45 — 49) °С питательный агар добавляют приготовленный смыв бактерий E. coli ( п. 8.5.2.3) из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на 100 мл агара.
В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1 мл обработанной хлороформом пробы (не касаясь хлороформа) и заливают смесью расплавленного и остуженного до (45 — 49) °С питательного агара объемом (12 — 15) мл, а также одну дополнительную чашку Петри для контроля культуры E. coli и осторожно покачивают для равномерного перемешивания пробы воды и агара. Для полного застывания чашки оставляют на столе при комнатной температуре на 10 мин. После застывания чашки переворачивают и помещают в термостат на (18 ± 2) ч при 37 °С.
При выполнении серии проб ставится общий контроль для всей серии.
Просмотр посевов осуществляют в проходящем свете.
Проба считается положительной при наличии полного лизиса, просветления нескольких бляшек, одной бляшки на чашке с пробой воды при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.
В протоколе анализа отмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в 100 мл воды (результат качественный).
При наличии зон лизиса в контроле культуры результат считается недействительным.
8.5.2.5. Проведение количественного анализа
Исследуемую пробу воды в количестве 100 мл разлить на 6 объемов: 1 флакон 50 мл и 5 пробирок по 10 мл. В 50 мл пробы добавить 5 мл десятикратного питательного бульона (по п. 5.2.2) и 0,5 мл смыва (или 1 мл 4-часовой бульонной культуры) бактерий E. coli ( п. 8.5.2.3). В каждые 10 мл пробы внести по 1 мл десятикратного питательного бульона и 0,1 мл смыва (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) бактерий E. coli.
Для контроля культуры 0,1 мл смыва бактерий (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) E. coli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром.
Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 18 ± 2 ч.
После инкубации из объема 50 мл отлить в пробирку 10 мл. Во все исследуемые 6 объемов добавить по 1 мл хлороформа. Пробирки закрыть стерильными резиновыми или силиконовыми пробками, энергично встряхнуть для равномерного распределения хлороформа по объему пробы и оставить при комнатной температуре не менее 15 мин для осаждения хлороформа.
В предварительно расплавленный и остуженный до (45 — 49) °С питательный агар добавить приготовленный смыв бактерий E. coli ( п. 8.5.2.3) из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на 100 мл агара. Приготовленную смесь разлить в чашки Петри: 1 чашку для контроля культуры E. coli на лизогенность и по одной чашке на каждую исследуемую пробу воды. При одновременном анализе нескольких проб воды ставится один контроль культуры E. coli.
После застывания агара чашки, предназначенные для посева проб, разделить на 6 секторов, промаркировать их в соответствии с исследуемыми объемами. На каждый сектор из соответствующей пробирки нанести пастеровской пипеткой (микропипеткой или бактериологической петлей продольным штрихом) по 1 капле надосадочной жидкости (без хлороформа).
После подсыхания капель чашки с исследуемыми пробами и контрольную чашку поместить в термостат при (37 ± 1) °С на (18 ± 2) ч.
Просмотр результатов осуществляется в проходящем свете.
Учет проводится по наличию зон просветления (лизиса) на секторах газона E. coli.
При применении капельного способа посева пипеткой образуется зона лизиса в виде округлого пятна или отдельных бляшек. При посеве продольным штрихом бактериологической петлей отмечается лизис по ходу штриха.
Проба считается положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.
Оценка проводится по таблице наиболее вероятного числа (НВЧ) бляшкообразующих единиц (БОЕ) (табл. 1.2). В протоколе анализа указывается наиболее вероятное количество колифагов в 100 мл воды и диапазон возможных колебаний: НВЧ БОЕ (нижний предел — верхний предел) колифагов в 100 мл. Результат полуколичественный.
При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат считать недействительным.
8.5.3. Прямой метод определения колифагов
Определение колифагов в питьевой воде заключается в исследовании нормируемого объема воды (100 мл) путем его прямого посева и последующего учета зон лизиса (бляшек) на газоне E. coli в чашках Петри с питательным агаром.
Прямой метод выделения колифагов из воды проводят параллельно с титрационным при исследованиях по эпидемическим показаниям.
В питательный агар двойной концентрации ( п. 5.3.2), расплавленный и остуженный до (45 — 49) °С, добавить смыв E. coli ( п. 8.5.2.3) из расчета 2,0 мл смыва (или 4 мл 4-часовой бульонной культуры) на каждые 100 мл агара, перемешать. Исследуемые 100 мл воды разлить по 20 мл в большие пробирки, нагреть до (35 — 44) °С и немедленно (не более чем через 5 мин по достижении требуемой температуры) разлить в 5 чашек Петри и сразу же внести в каждую чашку по 20 мл смеси агара с культурой E. coli.
Для контроля культуры E. coli в одну чашку Петри внести 20 мл стерильной водопроводной воды, предварительно прогретой до (35 — 44) °С, залить 20 мл приготовленного агара с E. coli и осторожно перемешать.
Содержимое чашек осторожно перемешать и оставить при комнатной температуре до застывания. Чашки с застывшим агаром поместить дном вверх в термостат и инкубировать при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 ± 2) ч.
Просмотр посевов осуществляется в проходящем свете.
Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл пробы воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.
Наиболее часто зоны лизиса выглядят прозрачными пятнами на фоне газона тест-культуры питательного агара в виде круглых изолированных бляшек (от 1 до 5 — 7) мм в диаметре с четко выраженными либо стертыми границами.
При высоких концентрациях фага наблюдается разная картина лизиса.
Слияние негативных колоний дает «ажурный» газон E. coli, рост единичных колоний E. coli на фоне сплошного лизиса, либо полное отсутствие роста на чашке.
При прямом посеве возможен лизис, маскируемый негомогенно застывшим агаром, а также закрытый сопутствующей микрофлорой. Капли конденсата и негомогенно застывший при прямом посеве агар могут приводить к образованию артефактов на газоне E. coli, визуально напоминающих лизис.
Предварительный учет результатов можно проводить через (5 — 6) ч инкубации. На этом этапе при наличии четких зон лизиса может быть выдан предварительный ответ о присутствии колифагов в воде.
Окончательный количественный учет прямого посева проводится через (18 ± 2) ч. Результаты выражают количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 100 мл пробы воды.
Если отмечен сливной рост бляшек и счет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выдан качественный результат: «обнаружено в 100 мл воды».
При получении отрицательного результата при работе прямым методом окончательный ответ выдается по результатам титрационного метода.
При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследования считается недействительным.
8.5.4.1. Отрицательный контроль
Отрицательный контроль подтверждает отсутствие контаминации фагом питательных сред, лабораторной посуды, оборудования на этапах подготовки и проведения анализа, а также позволяет оценить способность тест-культуры E. coli давать равномерный газон.
Отрицательным контролем служит исследование стерильной водопроводной воды, проводимое аналогично анализируемой пробе воды. Так, при анализе воды титрационным методом 10 мл стерильной водопроводной воды вносят в дополнительную пробирку. При анализе воды прямым посевом в дополнительную шестую чашку Петри вносят 20 мл стерильной водопроводной воды.
Дополнительные посевы исследуются на колифаги аналогично основным пробам.
При анализе серии проб отрицательный контроль может быть один на каждый вид анализа: титрационный и прямой. В этом случае постановка отрицательного контроля поэтапно осуществляется после обработки всех проб данной серии.
В случае обнаружения бляшек колифагов в чашках с отрицательным контролем результаты исследования всей серии проб воды недействительны.
Следует проверить стерильность лабораторного оборудования, посуды, питательных сред, а также повторить контрольный посев на чистоту тест-штамма E. coli К12 F + Str R .
Кратность проведения отрицательного контроля — 1 раз в день.
8.5.4.2. Методика подтверждения фаговой природы лизиса
В сомнительных случаях при работе как титрационным, так и прямым методами необходимо провести контрольный посев на подтверждение фаговой природы лизиса.
С этой целью бактериологической петлей извлекают участок агара, подозрительный на колифаги, помещают его в 5 мл питательного бульона, куда добавляют каплю тест-культуры E. coli и инкубируют при 37 °С в течение (16 — 18) ч. Полученную культуру обрабатывают хлороформом и исследуют на наличие фага. Высев осуществляют петлей или пипеткой на сектора питательного агара аналогично способу, описанному в п. 8.5.2.5. Лизис на любом из секторов расценивается как подтверждение наличия фага.
Таблицы расчета наиболее вероятного числа микроорганизмов
Расчет наиболее вероятного числа бактерий в 100 мл питьевой воды
источник