Титрационный метод анализа питьевой воды

Исследованию подлежит вода:

1) централизованного водоснабжения;

2) из колодцев различного типа;

3) открытых водоемов (рек, озер, морей);

Примечание. Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором (гипосульфитом).

Отбор проб воды. Из открытых водоемов воду берут с помощью специальных бутылей или батометров, снабженных грузилами. Пробу воды рекомендуют брать на глубине 10-15 см от поверхности (так как поверхность подвергается воздействию атмосферных факторов) и на расстоянии 1,5 м от берега (вода у самого берега может быть загрязнена микрофлорой почвы).

Для отбора проб водопроводной воды используют стерильные флаконы вместимостью 500 мл, закрытые ватно-марлевыми пробками и покрытые бумажными колпачками.

Кран предварительно обжигают тампоном, смоченным спиртом, после чего воду спускают в течение 10-15 мин и набирают во флаконы. Заполненные флаконы закрывают стерильными пробками.

Примечание. Исследуют 333 мл воды (табл. 54).

Таблица 54. Эмпирическая таблица ГОСТ 16963-73

В распределительной сети водопровода отбор проб воды осуществляют в зависимости от количества населения, проживающего в зоне обслуживания.

Стандартные методы исследования регламентированы для воды центрального водоснабжения (ГОСТ 18963-73) и предусматривают:

1. Определение общего числа микроорганизмов (в 1 мл исследуемой воды должно быть не более 100).

2. Определение коли-индекса и коли-титра (коли-индекс 3, коли-титр 333 и выше; для Москвы и Ленинграда коли-индекс не более 2, а коли-титр более 500).

3. Исследование по эпидемиологическим показаниям на патогенную микрофлору (патогенных микроорганизмов не должно быть обнаружено).

Согласно ГОСТу 18963-73 общее число бактерий — это то количество микроорганизмов, которое содержится в 1 мл исследуемой воды, способных в течение суток при температуре 37° С образовывать колонии, видимые невооруженным глазом (или при увеличении с помощью лупы).

При исследовании водопроводной воды засевают 2 чашки. В одну из них вносят 1 мл неразведенной воды, в другую 1 мл воды, разведенной в 10 раз (т. е. 0,1 мл исходной пробы).

При исследовании более загрязненной воды засевают 1 мл воды, разведенной в 100 раз. Это соответствует 0,01 и 1 мл .воды, разведенной в 1000 раз (0,001 мл) и т. д. Для получения таких объемов готовят последовательно десятикратные разведения, по 1 мл каждого разведения вносят в чашку и заливают тонким слоем (12-15 мл) растопленного и остуженного до 45° С питательного агара. Для равномерного распределения исследуемой воды залитые агаром чашки перемешивают путем вращения их. После застывания агара посевы ставят в термостат и инкубируют при температуре 37° С 24 ч.

Чашки с посевами вынимают из термостата и подсчитывают число выросших колоний. Учитывают только те чашки, где число колоний находится в пределах 30-300. Если колоний немного, их подсчитывают невооруженным глазом или при помощи лупы.

Если колоний много, то подсчет можно вести с помощью специального прибора для счета микробных колоний (рис. 54).

Рис. 54. Прибор для счета колоний микроорганизмов. 1 — столик для чашки Петри; 2 — игла с пружинным устройством; 3 — показатель счетчика; 4 — тумблер для включения импульсного счетчика; 5 — тумблер для включения лампы освещения счетчика

Подсчитанное количество колоний умножают на разведение и узнают число микробов в 1 мл исследуемой воды.

Наличие БГКП (бактерий группы кишечной палочки) является показателем фекального загрязнения, интенсивность которого характеризуют:

Коли-индекс — количество кишечных палочек, обнаруженных в 1 л воды.

Коли-титр — наименьшее количество воды, в котором обнаруживают присутствие кишечной палочки * .

* ( Коли-титр и коли-индекс — это один показатель, различно выраженный.)

Для выявления в воде БГКП можно пользоваться двумя методами: титрационным (бродильным) и методом мембранных фильтров.

Для исследования воды используют среду накопления глюкозопептонную (ГПС) среду Эйкмана с индикатором и бродильными трубками. Среда готовится концентрированной (в 10 раз) и нормальной концентрации — для посева 1 мл воды.

Исследуемую воду засевают по 100 мл в 3 колбы, по 10 мл в 3 пробирки (с концентрированной средой) и по 1 мл в 3 пробирки (со средой нормальной концентрации) — всего 333 мл. Посевы инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.

Вынимают посевы из термостата и просматривают их.

При наличии помутнения в колбах или пробирках из них производят посев петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри. Посевы инкубируют в термостате при 37° С.

Вынимают чашки из термостата. Из подозрительных колоний делают мазки. При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазную активность. Положительная проба на оксидазу дает право дать отрицательный ответ.

Проба на оксидазу. 1-й способ: со среды Эндо снимают петлей 2-3 колонии каждого типа и наносят на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной диметилпарафенилендиамином. Положительная реакция характеризуется посинением штрихов, сделанных из колоний.

2-й способ: реактив можно нанести на изолированную колонию на среде Эндо (красная колония — синеет) (рис. 55).

Рис. 55. Определение коли-индекса воды титрационным методом

Отрицательная проба на оксидазу свидетельствует о наличии в воде БГКП. В этом случае вычисляют коли-индекс и коли-титр с помощью стандартных (эмпирических) таблиц ГОСТа 16963-73 (см. табл. 54).

Эти таблицы предусматривают любую возможную комбинацию объемов посева, из которых выделена кишечная палочка.

Для фильтрации воды можно использовать воронку Гольдмана вместимостью 700-800 мл.

В воронку смонтированного и простерилизованного фильтровального прибора Зейтца наливают отмеренный объем исследуемой воды. С помощью насоса создают вакуум в приемном сосуде (обычно воду фильтруют через фильтры № 2 и 3). По окончании фильтрации стерильным или обожженным в огне пинцетом снимают фильтр и накладывают его на среду Эндо в чашке Петри так, чтобы поверхность с осевшими на ней микробами была обращена вверх (на одну чашку можно помещать 3-4 мембранных фильтра).

Посевы инкубируют в термостате при температуре 37° С 18-24 ч.

Чашки с посевами (фильтрами) вынимают из термостата. Отсутствие подозрительных колоний дает право дать отрицательный ответ.

Учету подлежат все красные и розовые колонии с металлическим блеском или без него. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму (рис. 56).

Рис. 56. Определение коли-индекса воды методом мембранных фильтров

При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Положительная оксидазная проба дает право дать отрицательный ответ. При отрицательной оксидазной пробе производят посев на полужидкую среду с глюкозой и индикатором или на среду ГПС с бродильными трубками — для выявления ферментации углевода до кислоты и газа. При наличии кислоты и газа вычисляют коли-индекс. Например, на всех фильтрах, находящихся на среде Эндо, выросло 3 колонии, пропущено через фильтр было 300 мл воды.

Примечание. Титрационный метод более точный и может быть использован при наличии в воде примесей. Метод мембранных фильтров экономичнее и дает возможность дать ответ на 2-й день.

Для определения наличия в воде свежих фекальных кишечных палочек производят посев воды (3-х объемов) на лактозопептонную среду с борной кислотой. Инкубируют при 43° С 24 ч. Наличие кислоты и газа свидетельствует о свежем фекальном загрязнении.

По эпидемиологическим показаниям в воде определяют сальмонеллы, шигеллы, энтеровирусы.

Примечание. Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения питьевой воды являются энтерококки. При проведении бактериологического исследования определяют все группы энтерококков, хотя санитарное значение имеют преимущественно фекальные стрептококки, обнаружение которых является показателем свежего фекального загрязнения.

1. Какова основная задача санитарной микробиологии?

2. Что такое санитарно-показательные микроорганизмы?

3. Что такое коли-индекс и коли-титр?

4. Какие Вы знаете методы определения БГКП?

Определите общее число микробов в исследуемой пробе воды. Среда ГПС (Эйкмана).

ГПС (Эйкмана) концентрированная. В 1 л воды растворяют 100 г пептона, 50 г хлорида натрия. Нагревают смесь до кипения, фильтруют, прибавляют 100 г глюкозы, устанавливают рН 7,4-7,6 и разливают по 10 мл в колбы вместимостью 250 мл, по 1 мл в 3 пробирки (концентрированной среды) и по 1 мл в 3 пробирки со средой нормальной концентрации (во всех емкостях среду до нужной концентрации доводят стерильной водой).

Примечание. При исследовании особенно загрязненных вод делают большие разведения (например, 10 -6 , 10 -7 и т. д.).

источник

Сущность метода и его достоинства

Титриметрический или объемный метод анализа является одним из методов количественного анализа. В основе этого метода лежит точноеизмерение объемов растворов двух веществ, реагирующих между собой. Количественное определение с помощью титриметрического метода анализа выполняется довольно быстро, что позволяет проводить несколько параллельных определений и получать более точное среднее арифметическое.

По характеру химической реакции, лежащей в основе определения вещества, методы титриметрического анализа подразделяют на следующие группы: метод нейтрализации или кислотно-основного титрования; метод окисления — восстановления; метод осаждения и метод комплексообразования.

Титрование — это постепенное прибавление титрованного раствора реагента (титранта) к анализируемому раствору для определения точки эквивалентности.

Титриметрический метод анализа основан на измерении объема реагента точно известной концентрации, затраченного на реакцию взаимодействия с определяемым веществом.

Точка эквивалентности — момент титрования, когда достигнуто эквивалентное соотношение реагирующих веществ. Достигнув точки эквивалентности, титрование заканчивают и отмечают объем раствора, пошедший на данную реакцию. Следовательно, в титриметрическом методе анализа первостепенное значение имеет точное определение точки эквивалентности. Точку эквивалентности (т.э.) определяют по изменению окраски индикатора (химического индикатора) или с помощью инструментальных индикаторов, приборов фиксирующих измене какого-то свойства среды в процессе титрования.

Индикаторы — это вещества, которые изменяют свое строение и физические свойства при изменении среды. В области точки эквивалентности индикатор изменяет свой цвет, образует осадок или вызывает какой-то другой наблюдаемый эффект. Индикаторы — это вещества, которые позволяют с известной степенью достоверности установить конечную точку титрования (к.т.т.). При правильном выборе индикатора точка эквивалентности (т.э.) должнасовпадать с конечной точкой титрования (к.т.т.). На практике между этимиточками наблюдается некоторая разница. Чтобы погрешность титрования была минимальной, необходимо чтобы разница между точкой эквивалентности и точкой конца титрования тоже была минимальной.

К реакциям, применяемым в количественном объемном анализе, предъявляют следующие требования:

1. Реакция должна протекать в соответствии со стехиометрическим уравнением реакции и должна быть практически необратима. Результат реакции должен отражать количество анализируемого вещества.

Константа равновесия реакции должна быть больше 10.

2. Реакция должна протекать без побочных реакций, иначе нельзя применять закон эквивалентов:

C1 (1/z*X V 1 (р-ра Х) = C2 (1/z*У) V 2 (р-ра У)

3. Реакция должна протекать с достаточно большой скоростью, т.е. за 1-3 секунды. Это главное достоинство титриметрического анализа.
4. Должен существовать способ фиксирования точки эквивалентности. Окончание реакции должно определяться достаточно легко и просто.

Достоинства титриметрического анализа:

1) быстрота определения;
2) простота оборудования;
3) возможность автоматизации;
4) точность — относительная погрешность 0,1 — 0,01 %.

Титриметрический метод анализа используется для определения неорганических и органических веществ. Титрование можно проводить в водных и неводных средах.[31]

Определение общей жесткости водопроводной воды

Отмерить мерным цилиндром 50 мл водопроводной воды (из-под крана) и перелить её в колбу емкостью 250 мл, добавить 5 мл аммиачно-буферного раствора и индикатор — эриохром черный Т — до появления розовой окраски (несколько капель или несколько кристаллов). Заполнить бюретку раствором ЭДТА 0,04 н (синонимы — трилон Б, комплексон III) до нулевой отметки.

Приготовленную пробу медленно при постоянном перемешивании оттитровать раствором комплексона III до перехода розовой окраски в голубую. Результат титрования записать. Повторить титрование ещё один раз.

Если разница результатов титрований превышает 0,1 мл, то оттитровать пробу воды третий раз. Определить средний объем комплексона III (V_{К, СР})

израсходованного на титрование воды, и по нему рассчитать общую жесткость воды.

Общую жесткость воды Ж_ОБЩ рассчитать по закону эквивалентов в единицах ммольэкв/л.

Определить класс жесткости водопроводной воды.

Умягчение воды методом катионирования и определение общей жесткости умягченной воды

Очистить водопроводную воду от примесей, пропустив её через колонку, заполненную катионитом. Умягченную воду собрать в стакан (можно пользоваться заранее приготовленной умягченной водой, собранной в колбу).

Определить общую жесткость 100 мл умягченной воды Ж К _ОБЩ по методике опыта 1 и класс жесткости умягченной воды.

Рассчитать величину ммольэкв/л ионов жесткости, поглощенных катионитом при умягчении водопроводной воды: Ж_ОБЩ — Ж К _ОБЩ.

Записать уравнения процессов, протекающих при катионировании, для случаев:

Определение карбонатной и некарбонатной жесткости воды

Отобрать мерным цилиндром 50 мл водопроводной воды и перелить её в коническую колбу. Добавить к исследуемой воде несколько капель метилового оранжевого до появления желтой окраски, которая должна соответствовать или быть очень близкой к окраске контрольного раствора с этикеткой «до титрования». Заполнить бюретку раствором соляной кислоты 0,1 н до нулевой отметки.

Оттитровать приготовленную пробу раствором соляной кислоты. Оттитрованная проба должна иметь оранжевую, но не розовую окраску индикатора, и соответствовать или быть очень близкой к окраске контрольного раствора с этикеткой «после титрования».

Результат титрования записать. Повторить титрование ещё один раз. Если результаты двух титрований совпадут (различие не должно превышать 0,1 мл), рассчитать карбонатную жесткость воды. В противном случае оттитровать ещё одну пробу воды. Определить среднее значение объема раствора соляной кислоты, израсходованной на титрование воды. Рассчитать карбонатную жесткость Ж_К воды в единицах ммольэкв/л, используя закон эквивалентов.

Определить некарбонатную жесткость:

Рис. 3. Титрование воды в лабораторных условиях

источник

Исследованию подлежит вода централизованного водоснабжения, колодцев, открытых водоемов, бассейнов, сточные воды.

Отбор проб водопроводной воды. Кран стерилизуют обжиганием с последующим стоком воды в течение 10 мин при полностью открытом кране. Пробу воды забирают в стерильную стеклянную посуду с плотно закрывающимися пробками. Доставка воды производится в контейнерах-холодильниках при температуре 4-10 0 С.

Для оценки санитарно-бактериологического состояния воды используют следующие показатели:

1. определение общего микробного числа (ОМЧ);

2. определение бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий;

3. определение спор сульфитредуцирующих клостридий;

5. определение патогенных бактерий кишечной группы.

Исследование питьевой воды на наличие колифагов, патогенных бактерий кишечной группы проводится по эпидемиологическим показателям. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий проводится при оценке эффективности технологий обработки воды.

Определение общего микробного числа (ОМЧ)

Для определения ОМЧ вносят два объема воды по 1 мл в стерильные чашки Петри, в которые выливают по 6-8 мл расплавленного и остуженного до 45 0 С МПА. Содержимое чашки смешивают, оставляют до застывания агара и помещают в термостат на 24 ч. Подсчитывают количество колоний на чашках, вычисляют среднее арифметическое. Результат выражают числом КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 мл воды.

Определение бактерий семейства Enterobacteriaceae

и термотолерантных колиформных бактерий

Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками бактерий семейства Enterobacteriaceae, но они способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре 44 0 С в течение 24 ч.

Для выявления бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий используют два метода: 1) метод мембранных фильтров, 2) титрационный метод.

Метод мембранных фильтров. Необходимый объем воды — 300 мл -фильтруют через мембранные фильтры по 100 мл. Фильтры переносят на среду Эндо в чашке Петри и инкубируют при 37 0 С 24 ч. Подсчитывают число красных и красных с металлическим блеском колоний.

Идентификацию бактерий проводят по оксидазному тесту и тесту образования кислоты и газа при ферментации лактозы (маннита) для чего исследуют не менее 10 колоний.

Так как, микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae и термотолерантные колиформные бактерии не обладают оксидазной активностью, то оксидазоположительные культуры дальше не исследуются.

Все лактозоположительные колонии засевают в две пробирки с одной из лактозных сред и 1 пробирку инкубируют при 37 0 (для культивирования микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae), а другую при 44 0 (для культивирования термотолерантных колиформных бактерий).

Учитывают бактерии семейства Enterobacteriaceae – показатели давнего фекального загрязнения воды и термотолерантные колиформные бактерии – показатели свежего фекального загрязнения.

Результаты анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий в 100 мл воды.

Титрационный метод. Принцип метода заключается в посеве установленного объема воды (300 мл – 3 объема по 100 мл – качественный анализ и 333 мл – 3 объема по 100 мл, 3 объема по 10 мл, 3 объема по 1 мл – количественный анализ) в лактозно-пептонную (или глюкозо-пептонную) среду, с последующим пересевом в среду Эндо и идентификацией культуры по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам для определения бактерий семейства Enterobacteriaceae.

Для выявления термотолерантных колиформных бактерий делают посев 2-3 изолированных колоний в пробирки с лактозной средой, нагретой на водяной бане или в термостате до 44 0 С.

При обнаружении бактерий семейства Enterobacteriaceae и термотолерантных колиформных бактерий хотя бы в одном из трех объемов делают заключение – об обнаружении колиформных бактерий в 100 мл воды.

Определение спор сульфитредуцирующих бактерий

Сульфитредуцирующие клостридии, преимущественно C. perfringens – спорообразующие анаэробные палочки, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре при 44 0 в течение 24 ч.

Определение сульфитредуцирующих клостридий проводят двумя методами: 1) метод мембранных фильтров, 2) прямым посевом.

Метод мембранных фильтров. Метод основан на фильтровании воды через мембранные фильтры, выращивании посевов в железо-сульфитном агаре в анаэробных условиях и подсчете черных колоний.

Результаты анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 мл воды.

Метод прямого посева. Производят посев 20 мл воды в пробирки с железо-сульфитным агаром (2 объема по 10 мл в 2 пробирки или 4 объема по 5 мл в 4 пробирки) инкубируют при 44 0 С 24 ч и посчитывают черные колонии. Результаты выражают числом КОЕ в 20 мл воды.

Колифаги – вирусы, лизирующие кишечную палочку и образующие зоны лизиса (бляшки) на бактериальном газоне.

Определение колифагов проводят прямым и титрационным методами.

Прямой метод. Исследуемую воду вносят в 5 стерильных чашек по 20 мл. В 6-ю — контрольную воду не берут. Затем во все чашки заливают расплавленный и остуженный до 45 0 агар с добавлением суточной культуры E.сoli, штамм К₂ (1,5 мл смыва E.сoli в концентрации 10 9 на 150 мл агара). Перемешивают, оставляют для застывания и инкубируют при 37 0 С 24 ч.

Учитывают результат подсчетом бляшек в чашках Петри в БОЕ (бляшкообразующих единицах) в 100 мл воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.

Титрационный метод. В основе метода — предварительное подращивание колифагов в среде обогащения в присутствии E.сoli и последующее выявления бляшек колифага на газоне E.сoli.

Определение бактерий родов сальмонелла и шигелла

Для выявления патогенных энтеробактерий исследуемый объем воды (не менее 2-3 мл) засевают в среды обогащения (Мюллера-Кауфмана, магниевая среда) с последующим высевом на плотные селективные и дифференциально-диагностические среды – Плоскирева, Эндо, Левина, висмут-сульфитный агар. Выделенные культуры идентифицируют по морфологическим, тинкториальным, биохимическим и серологическим свойствам.

Оценка воды по микробиологическим показателям

Критерии оценки воды разработаны дифференциально в зависимости от ее категории и назначения. Вода плавательных бассейнов по своим качествам должна соответствовать ГОСТу питьевой воды (табл. 3).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: При сдаче лабораторной работы, студент делает вид, что все знает; преподаватель делает вид, что верит ему. 9265 — | 7276 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

8.1. Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре

8.1.1. Определение понятия показателя

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24 ч, видимые с увеличением в 2 раза.

Из каждой пробы делают посев не менее двух объемов по 1 мл.

После тщательного перемешивания пробы воды вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. После внесения воды в каждую чашку вливают (8-12) мл (на чашку диаметром 90-100 мм) расплавленного и остуженного до (45-49) °С питательного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержится. Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашки оставляют до застывания агара.

Расплавленный агар на период проведения анализа помещают в водяную баню или термостат, поддерживающие температуру (45-49) °С.

После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (37±1)°С в течение (24 ±2) ч.

Подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300 изолированных колоний.

Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды.

Если на одной из 2 чашек подсчет невозможен, результат выдают на основании учета колоний на одной чашке. Если на двух чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не распространяющийся на всю поверхность чашки, или выросло более 300 колоний и анализ нельзя повторить, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают “число КОЕ/ мл — ориентировочно”.

Если подсчет колоний на чашках невозможен, то в протоколе отмечают “сплошной рост”.

8.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрация (основной метод)

8.2.1. Определение понятия показателя

Общие колиформные бактерии (ОКБ) — грамотрицательные, оксида-зоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (37 ± 1) °С в течение (24-48) ч.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч.

Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

8.2.3.1. Порядок исследования

При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 мл.

При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 мл воды через один фильтр.

При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличение количества фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например, 10, 40, 100, 150 мл воды).

Отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры с соблюдением требований, изложенных в п. 7.

Фильтры помещают на среду Эндо, приготовленную по п. 5.4. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 2) ч.

Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 мл исследуемой воды. Анализ заканчивают через 24 ч.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лакто-зоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.

Для подтверждения наличия ОКБ исследуют:

— все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний;

— не менее 3-4 колоний каждого типа.

Для подтверждения наличия ТКБ исследуют все типичные колонии, но не более 10.

Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на:

— наличие оксидазной активности;

— принадлежность к Граму (микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена);

— ферментацию лактозы до кислоты и газа.

8.2.3.2. Постановка оксидазного теста

Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и смачивают 2-3 каплями реактива для оксидазного теста по п. 5.7. Готовые бумажные системы смачивают дистиллированной водой. Часть изолированной колонии стеклянной папочкой или платиновой петлей (металлическая петля из нихрома может дать ложноположительную реакцию) наносят штрихом на подготовленную фильтровальную бумагу. Реакция считается положительной, если в течение 1 мин появляется фиолетово-коричневое (п. 5.7.1 вариант 1) или синее (п. 5.7.2 вариант 2 и СИБ-оксидаза) окрашивание штриха. При отрицательной реакции цвет в месте нанесения культуры не меняется. При положительном результате эту колонию из дальнейшего исследования исключают.

Если при исследовании колоний, окрашенных в темно-красный цвет, получают недостаточно четкий результат, необходимо пересеять культуру со среды Эндо на питательный агар. После инкубации тест повторяют.

8.2.3.3. Определение принадлежности к Граму

Из оксидазоотрицательной колонии делается мазок, окрашивается по Граму и микроскопируется.

На обезжиренное спиртом предметное стекло наносят петлей 1 каплю дистиллированной воды, вносят небольшое количество культуры из анализируемой колонии и распределяют по поверхности стекла. Мазок высушивают при комнатной температуре и фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки. На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генциана фиолетового на (0,5-1) мин, снимают бумагу, наливают раствор Люголя на (0,5-1) мин, сливают раствор Люголя и стекло промывают в этиловом спирте в течение (0,5-1) мин, пока не перестанет отходить краситель. Затем стекло тщательно промывают водой и докрашивают в течение (1-2) мин фуксином Циля, разведенным 1:10 дистиллированной водой. После промывания и просушивания препарата мазок микроскопируют.

Приготовление реактивов для окраски по Граму изложено в п. 5.9.

Грамотрицательные микроорганизмы имеют розовую окраску, грамположительные окрашиваются в синий цвет. Колиформные бактерии являются грамотрицательными палочками.

Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена, не требующим использования оптики.

Тест Грегерсена: в капле 3 %-ного водного раствора КОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры или колонии к грамотрицательному виду. У грамположительных бактерий слизистые нити не образуются — реакция отрицательная.

8.2.3.4. Определение ферментации лактозы

Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной изолированной колонии засевают параллельно в две пробирки с лактоз-ной средой (п. 5.6):

— для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 48 ч;

— для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно прогретую до температуры (43-44) °С, и инкубируют при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч.

Первичный учет образования кислоты и газа на подтверждающих полужидких средах и СИБ (п. 5.6) возможен через (4-6) ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ. При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки с посевами для окончательного учета ТКБ оставляют до 24 ч. Пробирки с посевами для подтверждения наличия ОКБ после просмотра через 24 ч и получения отрицательного результата оставляют для окончательного учета до 48 ч.

Если колония, подлежащая исследованию, незначительных размеров, ее пересевают на скошенный питательный агар и после инкубации в течение (18-24) ч выполняют все необходимые подтверждающие тесты.

8.2.3.5. Постановка подтверждающих тестов при наложении колоний или сплошном росте

Если на части или на всей поверхности фильтра наблюдается наложение колоний или сплошной рост, выполняют оксидазный тест путем помещения мембранного фильтра на кружок фильтровальной бумаги большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом, или на диск СИБ-оксидаза, смоченный дистиллированной водой. При появлении первых признаков реакции, но не более чем через 5 мин, мембранный фильтр переносят обратно на среду Эндо. После четкого проявления реакции определяют результат. При появлении фиолетово-коричневого или синего окрашивания (в зависимости от примененного реактива) оксидазный тест считают положительным.

Если на фильтрах все колонии оксидазоположительные, они не учитываются и выдают ответ об отсутствии ОКБ и ТКБ и завершают анализ.

При отрицательной оксидазной реакции проводят рассев до получения изолированных колоний и подтверждают их принадлежность к ОКБ и ТКБ по п. п. 8.2.3.3-8.2.3.4 (анализ качественный).

8.2.4.1. Грамотрицательные колонии учитываются как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 37 °С с образованием кислоты и газа.

Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44 °С с образованием кислоты и газа.

8.2.4.2. При отсутствии общих и термотолерантных колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают “не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 мл” и “не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 мл”.

8.2.4.3. В случае идентификации всех выросших подозрительных колоний число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 мл воды.

Вычисление проводят по формуле:

Х — число колоний в 100 мл;

V — профильтрованный объем воды через фильтры, на которых велся учет;

а — число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.

1. При посеве 3 фильтров по 100 мл выросло две колонии в 100 мл, на остальных двух фильтрах нет роста. Число общих или термотолерантных колиформных бактерий будет:

КОЕ ОКБ (ТКБ) в 100 мл

2. При посеве 10, 40, 100 и 150 мл на фильтрах с профильтрованным объемом 40 мл выросло 4 изолированные колонии, с профильтрованным объемом 100-3 ОКБ. Фильтры с объемами 10 мл и 150 мл заросли и учету не подлежат. Суммируют общее число колоний ОКБ (ТКБ) на тех фильтрах, где получены изолированные колонии, и пересчитывают на объем 100 мл.

КОЕ в 100 мл

8.2.4.4. Если при выборочной проверке колоний одного типа получены неодинаковые результаты, то вычисляют числа ОКБ или ТКБ среди колоний этого типа по формуле:

Х — число подтвержденных бактерий одного типа;

а — общее число колоний этого типа;

b — число проверенных из них;

с — число колоний с положительным результатом.

Полученные результаты учета по каждому типу колоний суммируют и далее подсчитывают по п. 8.2.4.3-8.2.4.4.

8.2.4.5. Окончательный результат выдают: количество КОЕ ОКБ в 100 мл, из них количество КОЕ ТКБ в 100 мл.

Ориентировочный результат может быть выдан при обнаружении типичных колиформных колоний на среде Эндо, образованных грамотрицательными оксидазоотрицательными бактериями. Окончательный ответ подтверждается по результатам ферментации лактозы.

8.2.4.6. При наложении колоний или сплошном росте на всех фильтрах (п. 8.2.3.5) в случае подтверждения принадлежности к ОКБ и ТКБ выдается качественный результат “обнаружено ОКБ в 100 мл”.

Если все колонии на фильтре оксидазоположительные или не подтвердилась их принадлежность к ОКБ и ТКБ, анализ завершается, в протоколе отмечают “зароет фильтров”.

В обоих случаях анализ повторяют.

8.3. Определение общих и термотолетарных колиформных бактерий титрационным методом

8.3.1. Определение понятия показателя

Определение понятия показателей ОКБ и ТКБ по п. 8.2.1.

Титрационный метод может быть использован:

— при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации;

— при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;

— в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.

При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий санэпиднадзор, производственный контроль) засевают 3 объема по 100 мл.

При исследованиях воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят посев: 3 объемов по 100 мл, 3 объемов по 10 мл, 3 объемов по 1 мл.

Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозо-пептонную среду, приготовленную по п.5.5. Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при (37 ± 1) °С в течение 48 ч. Не ранее 24 час. инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо (п. 5.4.1) для получения изолированных колоний.

Емкости без наличия роста и образования газа оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными и дальнейшему исследованию они не подлежат. Из емкостей, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают высев на сектора среды Эндо.

Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (18-20) ч.

При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий: темно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде, дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме пробы.

Наличие ОКБ требуется подтвердить:

— если в среде накопления отмечено только помутнение;

— если принадлежность к лактозоположительным колониям вызывает сомнение у исследователя. В этих случаях:

— проверяют наличие отпечатка на среде Эндо после снятия петлей подозрительной колонии;

— выполняют оксидазный тест по п. 8.2.3.2;

— подтверждают принадлежность к Граму по п. 8.2.3.3;

— подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных 1-2 колоний каждого типа с каждого сектора на среду с лактозой по п. 5.6 с последующей инкубацией посевов при температуре (37 ± 1) °С в течение (24-48) ч.

При отсутствии изолированных колоний проводят рассев на среду Эндо общепринятыми бактериологическими методами.

Отрицательный ответ дают, если:

— в среде накопления нет признаков роста;

— на секторах среды Эндо нет роста;

— на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные с неровными краями, расплывчатые и т. п.);

— все колонии оказались оксидазоположительными;

— все колонии оказались грамположителъными;

— если в подтверждающем тесте на среде с углеводом не отмечено газообразования.

Для определения термотолерантных колиформных бактерий работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии. Делают посев 2-3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред, приготовленных по п. 5.6.

Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °С. Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через (4-6) ч.

При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °С дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.

Допустимо для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ производить высев 1 мл из объемов среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование в пробирке с лактозо-пептонной средой с поплавком по п. 5.6 и прогретой предварительно до температуры 44 °С. Посевы выдерживают в термостате при температуре (44±0,5)°С в течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.

При исследовании 3 объемов по 100 мл результаты оцениваются качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из 3 объемов, делается запись в протоколе “обнаружены в 100 мл”.

При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по табл. 1.1 приложения 1.

Результат сообщают без доверительного интервала.

При отрицательном ответе на наличие ОКБ и ТКБ во всех исследованных объемах выдают заключение в протоколе “не обнаружены в 100 мл”.

8.4. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий

8.4.1. Определение понятия показателя

Сульфитредуцирующие клостридии — спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре при температуре (44 ± 1) °С в течение (16- 18) ч.

Метод основан на выращивании посевов в железо-сульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.

8.4.3.1. Пробу воды 20 мл прогревают на водяной бане в пробирках при температуре (75 ±5)°С в течение 15 мин для исключения вегетативных форм.

При исследовании хлорированной воды прогревание пробы можно не производить.

Из каждой пробы питьевой воды делают посев или фильтруют 20 мл. При необходимости подбирают объемы с таким расчетом, чтобы в посевах (на фильтрах) выросло не более 10-15 колоний. При этом ориентируются на результаты предыдущих исследований.

Фильтрование воды производят в соответствии с требованиями, изложенными в п. 7.

8.4.3.2. Определение методом фильтрования в пробирках

Перед посевом пробирки с железо-сульфитным агаром, приготовленным по 5.8, расплавляют на водяной бане (не кипятить!). В течение посева поддерживают среду нагретой до (70-80) °С в водяной бане.

После фильтрования установленного объема воды мембранный фильтр фламбированным пинцетом берут за два противоположных края и согнутый в виде трубочки помещают в пробирку с горячим агаром. Сторона фильтра с осевшими бактериями обращена внутрь. При этом фильтр распрямляется и располагается по стенке пробирки.

Сразу же после посева пробирку с агаром, и фильтром для создания анаэробных условий быстро охлаждают, помещая в емкость с холодной водой. Культивируют посевы при (44 ± I) °С в течение (16-18) ч.

8.4.3.3. Определение методом фильтрования в чашках Петри

Чашки Петри диаметром (55-60) мм заливают тонким слоем железо-сульфитного агара. После фильтрации фильтр поместить фильтрующей поверхностью вниз на застывшую питательную среду так, чтобы под фильтром не было пузырьков воздуха. Затем заливают расплавленным железо-сульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий. Культивируют посевы при (44 ± 1) °С в течение (16 — 1 8) ч.

8.4.3.4. Определение прямым посевом

Железо-сульфитный агар во флаконах и пробу воды готовят, как это описано в п. 8.4.3.1.

В стерильные пробирки вносят:

— по 10 мл в 2 пробирки (объемом не менее 30 мл) или

— по 5 мл в 4 пробирки (объемом по 15 мл).

Посевы заливают горячим железо-сульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливать по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирку быстро охлаждают, помещая ее в емкость с холодной водой для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при (44 ± 1) °С в течение (16-18) ч.

Количественному учету подлежат только те посевы, где получены изолированные колонии. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды.

Результат анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 мл воды.

При отсутствии роста черных колоний на всех фильтрах дают ответ “не обнаружено в 20 мл воды”.

При невозможности учета колоний из-за сливного роста результат оценивается как качественный, в протоколе отмечают “обнаружено в 20 мл”. При необходимости получения количественного результата анализ повторяют.

8.5.1. Определение понятия показателя

Колифаги — бактериальные вирусы, способные лизировать Е. coli и формировать при температуре (37 ± 1)°С через (18 ±2) ч зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре.

8.5.2. Титрационный метод определения колифагов

Определение колифагов в питьевой воде заключается в предварительном накоплении колифагов в среде обогащения на культуре Е. coli и последующем выявлении зон лизиса (просветления) газона Е. coli на питательном агаре.

Метод предназначен для проведения текущего контроля качества питьевой воды.

8.5.2.3. Подготовка тест-культуры Е . coli K12 StrR.

На всех этапах исследования используют бактериальную взвесь, приготовленную следующим образом: культуру Е. coli засевают в пробирку со скошенным питательным агаром со стрептомицином (п. 5.3.5). Через (18 ±2) ч инкубации при температуре (37±1)°С произвести смыв бактерий с косяка 5 мл стерильного физиологического раствора (0,85 %-ный раствор NaCl) и по стандарту мутности готовят взвесь Е. coli в концентрации 10 9 бактериальных клеток в 1 мл.

Допускается использование 4-часовой бульонной культуры Е. coli, полученной путем подращивания в термостате при температуре 37°С. Концентрация 10 9 бактериальных клеток Е. coli содержится в 2 мл.

8.5.2.4. Проведение качественного анализа

В исследуемую пробу воды объемом 100 мл вносят 10 мл 10-кратного питательного бульона (приготовленного по п. 5.2.2) и 1 мл подготовленного смыва тест-культуры или 2 мл 4-часовой бульонной культуры (п. 8.5.2.3).

Для контроля культуры 0,1 мл смыва бактерий Е. coli (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром.

Исследуемую пробу воды (100 мл) и чашку Петри с контролем Е. coli помещают в термостат и инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 ± 2) ч.

После инкубации из исследуемой пробы воды отливают в пробирку 10 мл и добавляют 1 мл хлороформа.

Пробирку закрывают стерильной резиновой или силиконовой пробкой, энергично встряхивают для равномерного распределения хлороформа по объему пробы и оставляют при комнатной температуре не менее 15 мин до полного осаждения хлороформа.

В предварительно расплавленный и остуженный до (45-49) °С питательный агар добавляют приготовленный смыв бактерий Е. coli (п. 8.5.2.3) из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на 100 мл агара.

В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1 мл обработанной хлороформом пробы (не касаясь хлороформа) и заливают смесью расплавленного и остуженного до (45-49) °С питательного агара объемом.(12-15) мл, а также одну дополнительную чашку Петри для контроля культуры Е. coli и осторожно покачивают для равномерного перемешивания пробы воды и агара. Для полного застывания чашки оставляют на столе при комнатной температуре на 10 мин. После застывания чашки переворачивают и помещают в термостат на (18 ±2) ч при 37 °С.

При выполнении серии проб ставится общий контроль для всей серии.

Просмотр посевов осуществляют в проходящем свете.

Проба считается положительной при наличии полного лизиса, просветления нескольких бляшек, одной бляшки на чашке с пробой воды при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.

В протоколе анализа отмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в 100 мл воды (результат качественный).

При наличии зон лизиса в контроле культуры результат считается недействительным.

8.5.2.5. Проведение количественного анализа

Исследуемую пробу воды в количестве 100 мл разлить на 6 объемов: 1 флакон 50 мл и 5 пробирок по 10 мл. В 50 мл пробы добавить 5 мл десятикратного питательного бульона (по п. 5.2.2) и 0,5 мл смыва (или 1 мл 4-часовой бульонной культуры) бактерий Е. coli (п. 8.5.2.3). В каждые 10 мл пробы внести по 1 мл десятикратного питательного бульона и 0,1 мл смыва (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) бактерий Е. coli.

Для контроля культуры ОД мл смыва бактерий (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) Е. coli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром.

Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 18±2ч.

После инкубации из объема 50 мл отлить в пробирку 10 мл. Во все исследуемые 6 объемов добавить по 1 мл хлороформа. Пробирки закрыть стерильными резиновыми или силиконовыми пробками, энергично встряхнуть для равномерного распределения хлороформа по объему пробы и оставить при комнатной температуре не менее 15 мин для осаждения хлороформа.

В предварительно расплавленный и остуженный до (45-49) °С питательный агар добавить приготовленный смыв бактерий Е. coli (п. 8.5.2.3) из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на 100 мл агара. Приготовленную смесь разлить в чашки Петри: 1 чашку для контроля культуры Е. coli на лизогенность и по одной чашке на каждую исследуемую пробу воды. При одновременном анализе нескольких проб воды ставится один контроль культуры Е. coli.

После застывания агара чашки, предназначенные для посева проб, разделить на 6 секторов, промаркировать их в соответствии с исследуемыми объемами. На каждый сектор из соответствующей пробирки нанести пастеровской пипеткой (микропипеткой или бактериологической петлей продольным штрихом) по 1 капле надосадочной жидкости (без хлороформа).

После подсыхания капель чашки с исследуемыми пробами и контрольную чашку поместить в термостат при (37 ± 1) °С на (18 ± 2) ч.

Просмотр результатов осуществляется в проходящем свете.

Учет проводится по наличию зон просветления (лизиса) на секторах газона Е. coli.

При применении капельного способа посева пипеткой образуется зона лизиса в виде округлого пятна или отдельных бляшек. При посеве продольным штрихом бактериологической петлей отмечается лизис по ходу штриха.

Проба считается положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.

Оценка проводится по таблице наиболее вероятного числа (НВЧ) бляшкообразующих единиц (БОЕ) (табл. 1.2). В протоколе анализа указывается наиболее вероятное количество колифагов в 100 мл воды и диапазон возможных колебаний: НВЧ БОЕ (нижний предел — верхний предел) колифагов в 100 мл. Результат полуколичественный.

При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат считать недействительным.

8.5.3. Прямой метод определения колифагов

Определение колифагов в питьевой воде заключается в исследовании нормируемого объема воды (100 мл) путем его прямого посева и последующего учета зон лизиса (бляшек) на газоне Е. coli в чашках Петри с питательным агаром.

Прямой метод выделения колифагов из воды проводят параллельно с титрационным при исследованиях по эпидемическим показаниям.

В питательный агар двойной концентрации (п. 5.3.2), расплавленный и остуженный до (45-49) °С, добавить смыв Е. coli (п. 8.5.2.3) из расчета 2,0 мл смыва (или 4 мл 4-часовой бульонной культуры) на каждые 100 мл агара, перемешать. Исследуемые 100 мл воды разлить по 20 мл в большие пробирки, нагреть до (35-44) °С и немедленно (не более чем через 5 мин по достижении требуемой температуры) разлить в 5 чашек Петри и сразу же внести в каждую чашку по 20 мл смеси агара с культурой Е. со li.

Для контроля культуры Е. coli в одну чашку Петри внести 20 мл стерильной водопроводной воды, предварительно прогретой до (35-44) °С, залить 20 мл приготовленного агара с Е. coli и осторожно перемешать.

Содержимое чашек осторожно перемешать и оставить при комнатной температуре до застывания. Чашки с застывшим агаром поместить дном вверх в термостат и инкубировать при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 ±2) ч.

Просмотр посевов осуществляется в проходящем свете.

Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшко-образующих единицах (БОЕ) на 100 мл пробы воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.

Наиболее часто зоны лизиса выглядят прозрачными пятнами на фоне газона тест-культуры питательного агара в виде круглых изолированных бляшек (от 1 до 5-7) мм в диаметре с четко выраженными либо стертыми границами.

При высоких концентрациях фага наблюдается разная картина лизиса.

Слияние негативных колоний дает “ажурный” газон Е. coli, рост единичных колоний Е. coli на фоне сплошного лизиса, либо полное отсутствие роста на чашке.

При прямом посеве возможен лизис, маскируемый негомогенно застывшим агаром, а также закрытый сопутствующей микрофлорой. Капли конденсата и негомогенно застывший при прямом посеве агар могут приводить к образованию артефактов на газоне Е. coli, визуально напоминающих лизис.

Предварительный учет результатов можно проводить через (5-6) ч инкубации. На этом этапе при наличии четких зон лизиса может быть выдан предварительный ответ о присутствии колифагов в воде.

Окончательный количественный учет прямого посева проводится через (18 ± 2) ч. Результаты выражают количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 100 мл пробы воды.

Если отмечен сливной рост бляшек и счет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выдан качественный результат: “обнаружено в 100 мл воды”.

При получении отрицательного результата при работе прямым методом окончательный ответ выдается по результатам титрадионного метода.

При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследования считается недействительным.

8.5.4.1. Отрицательный контроль

Отрицательный контроль подтверждает отсутствие контаминации фагом питательных сред, лабораторной посуды, оборудования на этапах подготовки и проведения анализа, а также позволяет оценить способность тест-культуры E . со li давать равномерный газон.

Отрицательным контролем служит исследование стерильной водопроводной воды, проводимое аналогично анализируемой пробе воды. Так, при анализе воды титрационным методом 10 мл стерильной водопроводной воды вносят в дополнительную пробирку. При анализе воды прямым посевом в дополнительную шестую чашку Петри вносят 20 мл стерильной водопроводной воды.

Дополнительные посевы исследуются на колифаги аналогично основным пробам.

При анализе серии проб отрицательный контроль может быть один на каждый вид анализа: титрационный и прямой. В этом случае постановка отрицательного контроля поэтапно осуществляется после обработки всех проб данной серии.

В случае обнаружения бляшек колифагов в чашках с отрицательным контролем результаты исследования всей серии проб воды недействительны.

Следует проверить стерильность лабораторного оборудования, посуды, питательных сред, а также повторить контрольный посев на чистоту тест-штамма Е. coli K12 F+ StrR.

Кратность проведения отрицательного контроля — 1 раз в день.

8.5.4.2. Методика подтверждения фаговой природы лизиса

В сомнительных случаях при работе как титрационным, так и прямым методами необходимо провести контрольный посев на подтверждение фаговой природы лизиса.

С этой целью бактериологической петлей извлекают участок агара, подозрительный на колифаги, помещают его в 5 мл питательного бульона, куда добавляют каплю тест-культуры Е. coli и инкубируют при 37°С в течение (16-18) ч. Полученную культуру обрабатывают хлороформом и исследуют на наличие фага. Высев осуществляют петлей или пипеткой на сектора питательного агара аналогично способу, описанному в п. 8.5.2.5. Лизис на любом из секторов расценивается как подтверждение наличия фага.

источник

8.3.1. Определение понятия показателя

Определение понятия показателей ОКБ и ТКБ по п. 8.2.1.

Титрационный метод может быть использован:

— при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;

Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.

При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий санэпиднадзор, производственный контроль) засевают 3 объема по 100 мл.

При исследованиях воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят посев: 3 объемов по 100 мл, 3 объемов по 10 мл, 3 объемов по 1 мл.

Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозо-пептонную среду, приготовленную по п. 5.5. Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при 37 +/- 1 °C в течение 48 ч. Не ранее 24 ч инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо (п. 5.4.1) для получения изолированных колоний.

Емкости без наличия роста и образования газа оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными, и дальнейшему исследованию они не подлежат. Из емкостей, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают высев на сектора среды Эндо.

Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре 37 +/- 1 °C в течение 18 — 20 ч.

Наличие ОКБ требуется подтвердить:

— если в среде накопления отмечено только помутнение;

— если принадлежность к лактозоположительным колониям вызывает сомнение у исследователя.

— проверяют наличие отпечатка на среде Эндо после снятия петлей подозрительной колонии;

— выполняют оксидазный тест по п. 8.2.3.2;

— подтверждают принадлежность к Граму по п. 8.2.3.3;

— подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных 1 — 2 колоний каждого типа с каждого сектора на среду с лактозой по п. 5.6 с последующей инкубацией посевов при температуре 37 +/- 1 °C в течение 24 — 48 ч.

Отрицательный ответ дают, если:

— в среде накопления нет признаков роста;

— на секторах среды Эндо нет роста;

— все колонии оказались оксидазоположительными;

— все колонии оказались грамположительными;

— если в подтверждающем тесте на среде с углеводом не отмечено газообразования.

Для определения термотолерантных колиформных бактерий работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии. Делают посев 2 — 3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред, приготовленных по п. 5.6.

Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °C. Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при температуре 44 +/- 0,5 °C в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через 4 — 6 ч.

При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °C дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.

Допустимо для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ производить высев 1 мл из объемов среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование, в пробирке с лактозо-пептонной средой с поплавком по п. 5.6 и прогретой предварительно до температуры 44 °С. Посевы выдерживают в термостате при температуре 44 +/- 0,5 °C в течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.

При исследовании 3 объемов по 100 мл результаты оцениваются качественно, и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из 3 объемов делается запись в протоколе «обнаружены в 100 мл».

При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по табл. 1.1 Приложения 1.

Результат сообщают без доверительного интервала.

При отрицательном ответе на наличие ОКБ и ТКБ во всех исследованных объемах выдают заключение в протоколе «не обнаружены в 100 мл».

источник