Мук методы микробиологического анализа воды

Несоответствие воды микробиологическим нормам, так же как и химическим, делает ее непригодной для питья. Если Ваш источник водоснабжения не защищен от прямого воздействия окружающей среды или коммунальные системы устарели или давно не чистились, то сделать микробиологический анализ воды просто необходимо. От этого зависит Ваше здоровье и безопасность! Особенно это важно для тех, кто пользуется колодцем. Колодезная вода – грунтовая, она на прямую контактирует с почвами, а значит, грозит «напоить» Вас и нитратами, и тяжелыми металлами, и аммиаком, и, конечно, вредными органическими веществами, которые попадают в почву в результате деятельности сельскохозяйственных ферм или угодий.

В таблице 1 представлены микробиологические показатели действующего норматива СанПиН 2.1.4.1074-01 для питьевой воды:

Таблица 1. Микробиологические нормативы для питьевой воды

Стандартный микробиологический анализ питьевой воды в МГУ включает определение трех показателей: общего микробного числа, количества общих колиформных и термотолерантных колиформных бактерий.

Расширенный микробиологический анализ воды включает анализ пяти показателей: общего микробного числа, количества общих колиформных бактерий, количества термотолерантных колиформных бактерий, титр колифагов и содержание спор сульфитредуцирующих бактерий.

Часто на наших участках или поблизости имеются водоемы, где мы и наши дети с удовольствием любим провести время. Конечно, вода в данных водоемах не является питьевой, но ее безопасность для человека также, как и питьевая, регламентируется. В таблице 2 представлены микробиологические показатели действующего норматива по гигиеническим требованиям к охране поверхностных вод (СанПиН 2.1.5.980-00)

Таблица 2. Микробиологические нормативы для рекреационного водопользования, а также в черте населенных мест

Микробиологический анализ воды, предназначенной не для питья, включает определение количества двух показателей: общих колиформных и колиформных термотолерантных бактерий.

Помимо двух основных показателей мы предлагаем провести дополнительный анализ на содержание: колифагов, условно-патогенных дрожжей и микромицетов (частых спутников опортунистических заболеваний) и индекса самоочищения водоёма.

При значительном превышении нормативов СанПиН 2.1.5.980-00, а также возможном фекальном загрязнении водоёма, мы предлагаем провести анализ на наличие возбудителей кишечных инфекций (род Salmonella и Enterococcus).

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза. Данный индикатор выявляет потенциальных бактерий, способных причинить вред здоровью человека.

Общие колиформные бактерии (ОКБ) – грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (37+1) °С в течение (24-48) часов. Многие представители данной группы являются микроорганизмами нормальной микрофлоры желудка, поэтому превышение данной группы микроорганизмов может говорить о возможно антропогенном (в том числе и фекальном) загрязнении воды.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (44±0,5) °С в течение 24 часов. Также, как и ОКБ являются индикаторной группой, однако более устойчивые в окружающей среде: вот почему обнаружение данной группы микроорганизмов в воде может говорить об однозначном загрязнении ее продуктами жизнедеятельности человека.

Колифаги, определяемые стандартным методом (МУК 4.2.1018-01), являются вирусами кишечной палочки (Escherichia coli) и рассматриваются эпидемиологами как дополнительный, а порой и более чувствительный, метод в определении загрязнения воды микроорганизмами группы кишечной палочки. Вирусные частицы, и в частности колифаги, более устойчивы к окружающей среде, чем их бактерии-хозяева. В связи с этим, наличие колифагов может служить достоверной меткой о более давнем фекальном загрязнении источника воды. Показана прямая корреляция между содержанием колифагов в воде и опасных для человека энтеровирусов, поэтому наличие колифагов в воде может говорить о вирусном заражении источника. Действующий нормативный документ (СанПиН 2.1.4.1074-01) подразумевает отсутствие колифагов в 100 мл воды.

Сульфитредуцирующие клостридии – спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, являющиеся дополнительным микробиологическим показателем фекального загрязнения водоема. В отличие от относительно неустойчивых колиформных и термотолерантных колиформных бактерий, споры клостридий могут сохраняться в водоемах долгое время. Клостридии встречаются в кишечнике человека и домашних животных, однако, при попадании с водой в большом количестве могут вызвать пищевые отравления. К сульфитредуцирующим клостридиям относятся в том числе и опасные для человека клостридии (Clostridiumbotulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani), вызывающие тяжелейшие заболевания. Согласно действующему нормативу (СанПиН 2.1.4.1074-01) споры клостридий должны отсутствовать в 20 мл воды.

К условно-патогенным дрожжам и микромицетам (плесени) относят большую неоднородную группу грибных организмов, способных сапротрофно расти при 37 °С. В нее входят такие представители, как Candida albicans и Cryptococcus neoformans, которые являются частым фактором оппортунистических заболеваний человека, вызывая кандидозы (грибковые заболевания кожи), молочницы и проч. Другие организмы микромицеты (Cladosporium cladosporioides, Aspergillusniger) могут являться активными сенсебилизаторами аллергических реакций, а иногда и самими аллергенами. В РФ не нормируется вода по плесеням и дрожжевым организмам в воде.

Общее число микроорганизмов не нормируется в воде водоемов в зонах рекреаций, поскольку уровень этой группы микроорганизмов в большей мере зависит от природных особенностей каждого объекта, времени года и т.п.

Однако при выборе нового источника водоснабжения или места рекреации в воде водоёмов дополнительно следует определять общую микробную численность, вырастающую:

• при температуре 37 °С в течение 24 часов;
• при температуре 22 °С в течение 72 часов.

1. ОМЧ при 37 °С представлена большей частью алохтонной микрофлорой (внесенную в водоем в результате антропогенного загрязнения, в том числе фекального);
2. ОМЧ при 20-22 °С представлена, помимо алохтонной, аборигенной микрофлорой (естественной, свойственной для данного водоёма).

Соотношение численности этих групп микроорганизмов позволяет судить об интенсивности процесса самоочищения. При завершении процесса самоочищения коэффициент ОМЧ 22 °С/ ОМЧ 37 °С. В местах загрязнения хозяйственно-бытовыми сточными водами численные значения обеих групп близки.

Показатель позволяет получить дополнительную информацию о санитарном состоянии водоемов, источниках загрязнения, процессах самоочищения.

источник

Методы санитарно-микробиологического анализа питьевой воды

Документ «Методы санитарно-микробиологического анализа питьевой воды» был заменен.

Выберите формат отображения документа:

Государственная система санитарно-эпидемиологического нормирования Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методические указания МУК 4.2.671-97

Минздрав России Москва» 1997

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методические указания МУК 4.2.671-97

М54 Методы санитарно-микробиологического анализа питьевой поды: Методические указания.—М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1997.-36 с.

1. Разработаны авторским коллективом н составе: Недачин А. В., Артемова Т. 3., Доскина Т. В., Дмитриева Р. А., Тишкова Н. К).. Сидоренко С Г. (НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина Российской Академии Медицинских Наук).

При участии Трухиной Г. М (Московский НИИ гигиены им Ф. Ф. Эрисмана Минздрава Российской Федерации); Кашкаро-вой Г. П., Ахапкиной Е. Н. (Аналитический центр контроля качества воды «Роса*); Кривопаловой Н. С., Воронцовой Г. В., Сорокиной Р. С. (Федеральный центр Государственного санитарно-эпидемиологического надзора), Русановой Н А. (НИИ коммунального водоснабжения и очистки воды).

2. Утверждены и введены в действие Председателем Госкомса-нэпиднадзора России — Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 4 июля 1997 года

3. Введены впервые к СанПиН 2.1.4.559—96 «Питьевая вода Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

© И нформацион но — издательски й центр Минздрава России

3. Отбор, хранение и транспортирование проб. 5

4. Оборудование, расходные материалы, реактивы, питательные среды . 7

5. Приготовление питательных сред и реактивов. 10

6. Подготовка к анализу. 15

7. Методика работы при использовании мембранных фильтров. 16

8.1. Определение общего числа микроорганизмов, образующих

колонии на питательном агаре. 17

8.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий

методом мембранной фильтрации. 19

8.3. Определение общих и термоталерантных колиформных бактерий

8.4. Определение споровых сульфитредуцирующих клостридий

методом мембранной фильтрации. 26

8.5. Определение споровых сульфитредуцирующих клостридий

8.6. Определение колифагов прямым методом. 29

8.7. Определение колифагов титрационным методом. 30

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации Г. Г. Онищенко

Дата введения: с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методические указания устанавливают методы микробиологического анализа питьевой воды по нормируемым показателям СанПиН 2.1.4.559—96 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества*. Настоящие методические указания являются обязательными для контроля качества питьевой воды в отношении ее эпидемической безопасности при проведении государственного и производственного контроля, а также сертификационных испытаний, и распростаняются на все лаборатории, выполняющие эти исследования, вне зависимости от подчиненности и форм собственности.

Издание официальное Настоящие методические указания нс

могут быть полностью или частично воспроизведены, тиражированы и распространены без разрешения Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России.

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие документы:

2.1. СанПиН 2.1.4.559—96 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

2.2. ИСО 9308-1: 1990. Качество воды. Обнаружение и подсчет колиформных организмов, термотолерантных колифор-мных организмов и предполагаемых Е. сой.—часть 1: Метод мембранной фильтрации.

2.3. Обнаружение и подсчет колиформных организмов, термотолерантных колиформных организмов и предполагаемых Е. сой—Часть 2: Титрационный метод (определение наиболее вероятного числа).

2.4. ИСО 6222-1988. Качество воды. Проведение анализа на наличие жизнеспособных микроорганизмов.

2.5. ИСО 6461-2: 1986. Качество воды. Обнаружение и подсчет спор сульфитредуцирующих анаэробов (клостридий).— Часть 2: Метод мембранной фильтрации.

2.6. Методические указания по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов. Москва, 1981, № 2285-81.

2.7. ГОСТ 18963-73. Вода питьевая. Методы санитарнобактериологического анализа.

2.8. Руководство по контролю качества питьевой воды. ВОЗ. Женева 1994. Часть 1.

3. Отбор, хранение и транспортирование проб

3.1 Общие требования к отбору проб

Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов.

Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги).

Многоразовая посуда, в том числе пробки, должна выдерживать стерилизацию сухим жаром или автоклавированием.

Пробу отбирают в стерильные емкости с соблюдением правил стерильности. Емкость открывают непосредственно

перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости нс должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду запрещается.

При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана производят после предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 минут при полностью открытом кране. При отборе пробы напор воды может быть уменьшен. Пробу отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок.

Если через пробоотборный кран происходит постоянный излив воды, отбор проб производят без предварительного обжига, нс изменяя напора воды и существующей конструкции (при наличии силиконовых или резиновых шлангов).

Если отбирают воду после обеззараживания химическими реаге1гтами, то для нейтрализации остаточного количества дезинфектанта в емкость, предназначенную для отбора проб, вносят до стерилизации натрий серноватистокислый в виде кристаллов или концентрированного раствора из расчета 10 мг на 500 мл воды.

После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком.

При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировании.

При отборе проб в одной и той же точке для различных целей, первыми отбирают пробы для бактериологических исследований.

Отобранную пробу маркируют и сопровождают актом отбора проб воды с указанием места, даты, времени забора и другой информации.

32 Хранение и транспортирование проб

К исследованию проб в лаборатории необходимо приступить как можно быстрее с момента отбора.

Доставка проб осуществляется в контейнерах-холодильниках при температуре +4—+ 10 °С. В холодный период года контейнеры должны быть снабжены термоизолирующими прокладками, обеспечивающими предохранение проб от промерзания. При соблюдении указанных условий срок начала исследований от момента отбора проб нс должен превышать 6 часов.

Если пробы нельзя охладить, их анализ следует провести в течение 2-х часов после забора.

Если не может быть соблюдено время доставки пробы и температура хранения, анализ пробы проводить не следует.

Пробы питьевой воды должны доставляться в отдельных продезинфицированных контейнерах.

4. Оборудование, расходные материалы, реактивы, питательные среды

Термостат, способный поддерживать рабочую температуру 37 °С и обеспечивать градиент температуры в камере ±1 °С Термостат, способный поддерживать рабочую температуру 44 °С и обеспечивать градиент температуры в камере ±1 °С Термостат или водяная баня, способные поддерживать рабочую температуру в камере 44 °С с градиентом температуры в камере ±0,5 °С

Водяная баня, обеспечивающая поддержание рабочего температурного режима 75 °С с 1радиентом температуры ±5 °С Водяная баня или термостат, способные поддерживать температуру 45—50 °С (для питательных сред)

Прибор для мембраной фильтрации под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм; вакуумный насос для создания разрежения 0,5—1,0 атм.; прибор вакуумного фильтрования ПВФ-35 и вакуумный насос СП-4-044 отечественного производства

Весы лабораторные общего назначения 4-го класса точности, наибольший предел взвешивания 200 г, допускается погрешность не более 0,02 г

Весы лабораторные общего назначения 4-го класса точности, наибольший предел взвешивания 1 кг, допускается погрешность не более 0,1 г

PH-метр, обеспечивающий измерение с погрешностью до 0,01 Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды не ниже ГОСТа 6709—72 Лупа измерительная 2 х

Шкаф сушильный, стерилизационный, обеспечивающий температуру +180 °С

Стерилизатор паровой с режимами стерилизации от температуры +100 °С (текучим паром) до +126 °С (под давлением) Холодильник бытовой

Вытяжной шкаф для работы с хлороформом при проведении анализа на колифаги

Магнитные мешалки с подогревом до 300 °С для варки сред, либо другой нагревательный прибор Дозаторы для разлива питательных сред Дозаторы нипеточные для использования в анализе. Примечание: к применению допускается только измерительное оборудование, вошедшее в Государственный реестр.

42 Мелкое оборудование и расходные материалы

Мембранные фильтры нитрат или ацетат целлюлозные для микробиологических целей с диаметром пор 0,45 мкм и размером 35 или 47 мм: отечественные фильтрующие мембраны Владипор МФАС-ОС-1, МФАС-ОС-2, МФА-МА (номер 4—6); или аналогичные мембраны зарубежного производства, имеющие международный сертификат качества ISO 9000 или EN 29 000 Горелки газовые или спиртовки

Индикаторы бумажные для определения pH в диапазоне 6—8 с интервалом определения 0,2 Петли бактериологические

Пинцеты для работы с мебранными фильтрами Штативы для пробирок

Фольга алюминиевая, колпачки силиконовые, металлические Лабораторная посуда стеклянная либо одноразового использования (колбы, цилиндры, пипетки, флаконы, стаканы, чашки Петри, пробирки, стеклянные палочки, поплавки, емкости для отбора проб) Пробки различных размеров: силиконовые, резиновые и другие, выдерживающие стерилизацию сухим жаром или автоклавированием

Бумага фильтровальная Вата хлопковая

Карандаши или фломастеры по стеклу Лейкопластырь

Марля медицинская в кусках или бинты Перчатки резиновые

Все химические реактивы должны соогветсвовать квалификации не ниже ч. д. а.

Железо сернокислое закисное ГОСТ 4148—78

Кислота соляная ГОСТ 3118—77

Натрий серноватистокислый ГОСТ 4215—66

Натрий хлористый Натрий гидрат окиси Спирт этиловый ректификованный 96 %-ный, медицинский Спирт этиловый технический для обработки столов, термостатов, холодильников и другого инвентаря Глюкоза Лактоза Маннит

Натрий сернистокислый (сульфит натрия) а-нафтол

ГОСТ 18300-87 ГОСТ 603 &—79 ГОСТ 6038-74 ГОСТ 8321-74 ГОСТ 903-76 ГОСТ 5838-79

Фенилендиаминовые соединения* (тетраметил — я- фенилендиамин гидрохлорид, диметил-п-фенилендиамин солянокис-лыЙ, диметил-п-фенилендиамин, дифенил-п-фенилендиа-мин и другие)

Фуксин основной’ ТУ 6—09—4119—75

Хлороформ технический* ГОСТ 20015-76

Примечание: ’вещества обладают канцерогенным и мутагенным действием, работать с соблюдением мер предосторожности.

4.4 Питательные среды промышленного производства Агар Эндо сухой

Агар микробиологический ГОСТ 17206—77

Сухой препарат с индикатором ВР и лактозой

Сухой препарат с индикатором ВР и маннитом

Сухой препарат с индикатором ВР и глюкозой

Пептон сухой ферментативный для

бактериологических целей ГОСТ 13805—76

Системы индикаторные бумажные (СИБ):

Допускаются к использованию коммерческие питательные среды, диагностические препараты и системы идентификации производства зарубежных фирм, предназначенные для целей описываемых методов. Питательные среды и биологические

препараты зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ISO 9000 или EN 29 ООО.

При использовании следует руководствоваться рекомендациями фирмы-производителя.

Все обезвоженные коммерческие питательные среды и препараты отечественного производства должны иметь сертификат соответствия, паспорт и инструкцию по применению.

4.5. Тест-культуры микроорганизмов

Pseudomonas aeruginosa или Pseudomonas fluorcscens

Контрольные штаммы получают в Российском Государственном институте медицинских и биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича или Областном Центре госсанэпиднадзора.

5. Приготовление питательных сред и реактивов

Предпочтительно использование стандартизованных сухих питательных сред промышленного производства.

При использовании промышленных сухих питательных сред их приготавливают в соответствии с указаниями изготовителя на этикетке. В этом случае следует соблюдать способ применения и срок хранения питательных сред, указанных на упаковках.

Сухие питательные среды хранят в сухих помещениях, в темноте, при комнатной температуре. Открытые упаковки тщательно закупоривают. Среды с измененным внешним видом (уплотненные, с комками), а также с истекшим сроком годности не используют.

Для приготовления растворов, реактивов и питательных сред применяют воду дистиллированную но ГОСТу 6709—72.

Питательные среды приготовляют в посуде из инертного материала.

Учитывая возможное изменение pH питательных сред после кипячения и стерилизации при приготовлении сред устанавливают pH на 0,2—0,3 выше заданного, что определяют опытным путем для каждой среды. Окончательный контроль pH проводят в готовой среде при температуре 25 °С с использованием pH-метра (жидкие среды) или бумажных индикаторов (агаризованные среды).

После стерилизации питательные среды оставляют для охлаждения при комнатной температуре.

Температура сред, хранящихся в холодильнике, перед посевом должна быть доведена до комнатной.

При необходимости разлить готовую питательную среду в чашки Петри, ее следует охладить до температуры 50—60 °С.

Готовые полужидкие питательные среды хранят при комнатной температуре.

500 г мясного фарша без жира и сухожилий заливают 1 л дистилированной воды, настаивают 12 часов на холоде или 1 час в водяной бане при 50—60 °С. Затем настой кипятят, фильтруют через марлю или вату и опять доводят дистилированной водой до 1 л, разливают во флаконы, стерилизуют при (120 ±2) °С (10 5 ПА) 20 мин и приступают непосредственно к приготовлению мясо-пептонного бульона или других питательных сред.

5.3.1. Мясо-пептонный бульон (МПБ)

К 1 л мясной воды прибавляют 10 г пептона и 5 г натрия хлористого, нагревают до полного растворения пептона и соли, устанавливают pH (7,2—7,4), осветляют, фильтруют и разливают в пробирки или во флаконы в количествах, необходимых для анализа, закрывают ватными пробками и стерилизуют при (120±2) °С (10 5 ПА) 20 мин.

5.3.2. Питательный бульон из заменителей мяса (ПБ)

Готовят из заменителей мяса (мясного экстракта, рыбного гидролизата или других) по способу, указанному на этикетке.

Для приготовления десятикратного питательного бульона количество пептона и хлористого натрия (п. 5.3.1) или сухого препарата (п. 5.3.2) увеличивают в 10 раз.

5.4.1. Питательный агар промышленного производства

Готовят из сухого препарата по способу, указанному на этикетке.

5.4.2. Мясо-пептонный агар (МПА)

1,5 % МПА — к 1 л мясо-пептонного бульона прибавляют 15 г агара в волокнах или порошке, нагревают до полного растворения, корректируют pH (7,2—7,4), осветляют, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр и разливают во флаконы или пробирки в количествах, необходимых для анализа. Стерилизуют при (120 ±2) °С (10 5 ПА) 20 минут.

2 % МПА готовят, увеличивая концентрацию агара до 20 г на тот же объем МП Б.

5.4.3. Питательный агар на основе (ПБ) из заменителей мяса

Готовят по п. 5.4.2, заменяя мясо-пептонный бульон на питательный бульон из заменителей мяса.

2 %-ный питательный агар готовят, увеличивая навеску сухого препарата на 1/4 от прописи.

55 Фуксин — сульфитная среда Эндо

Готовят из сухого препарата по способу, указанному на этикетке.

Для повышения дифференцирующих свойств среды в готовую и охлажденную до 60—70 °С среду перед разливкой в чашки допускается прибавлять на 100 мл среды 0,2 мл 5 %-ного спиртового раствора основного фуксина.

Если на поверхности среды заметны следы влаги, чашки перед посевом необходимо подсушить. Срок хранения чашек со средой не более 2—3 суток в темноте, раствора фуксина — нс более 1-го месяца.

5.5.2. Модификация среды с добавлением розоловой кислоты

При исследовании питьевой обеззараженной воды с преобладанием микрофлоры, не относящейся к бактериям кишечной группы, помимо фуксина, допускается добавление на 100 мл среды Эндо 0,2 мл 5 %-го спиртового раствора розоловой кислоты. Срок хранения розоловой кислоты — нс более 1-го месяца

5 6 Лактозо-пеггтонная (глюкозо-пептонная) среда

10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г лактозы (глюкозы) растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды. После растворения ингредиентов устанавливают. pH (7,4—7,6),

разливают по 10 мл в пробирки, стерилизуют при (112±2) °С (5,10 4 ПА) 12 минут.

Для приговления концентрированной лакгозо-пентонной (глюкозо-пептонной) среды все ингредиенты, кроме воды, увеличивают в 10 раз, разливают по 1 мл в пробирки и по 10 мл во флаконы.

57 Питательные среды для подтверждения способности ферментировать лактозу или маннит (глюкозу) до кислоты и газа

5.7.1. Полужидкая среда с лактозой или маннитом (глюкозой) Готовят из сухого препарата по способу, указанному на

этикетке. Срок хранения — не более 2-х недель.

5.7.2. Полужидкая среда с лактозой или маннитом (глюкозой) Готовят при отсутствии сухого препарата.

В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 4—5 г агар-агара, доводит до кипения, устанавливают pH (7,2—7,4), добавляют 1 мл 1,6 % спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при (120 ±2) °С (10 5 ПА) 20 мин. В расплавленную среду вносят 5 г лактозы или маннита (глюкозы), нагревают до кипения, разливают в стерильные ки на высоту 3—5 см и стерилизуют при (112 ±2) °С ПА) 12 мин. Срок хранения — не более 2-х недель. Правильно приготовленная среда — зеленого цвета с синеватым оттенком (цвет бутылочного стекла). Посев производят уколом до дна пробирки. При образовании кислоты цвет среды изменяется в желтый, при газообразовании газ скапливается или по уколу, или на поверхности, или в толще среды появляются разрывы. При инкубации посевов более 5 часов газ может улетучиться. В таких случаях на присутствие газа указывают оставшиеся в толще среды «карманы» — потемнения среды на месте бывшего пузырька газа.

5.7.3. Лактоэо-пептонная среда по п. 5.6 При использовании в качестве подтверждающей следует добавить 2 мл 1,6 %-ного неспиртового раствора индикатора бромтимолового синего на 1000 мл среды.

Глюкозу используют при отсутствии маннита.

Разливают по 4—5 мл в пробирки с поплавками или комочками ваты.

5.7.4. СИБ-лактоза или СИБ-ыаннит (глюкоза)

Готовят по прописи завода-изготовителя.

58 Реактивы для оксидазного теста

1 вариант — 1 %-ный водный раствор тетраметил-п-фенилендиамииа гидрохлорида.

2 вариант — 1 %-ный реактив — 1 %-ный спиртовой раствор а-нафтола, 2-ой реактив — 1 %-ный водный раствор фенилен-диаминового соединения.

Растворы сохраняют в темных флаконах с притертыми пробками: 1-ый — до одного месяца, 2-ой — до одной недели. Перед употреблением (при работе со 2 вариантом) к трем частям первого раствора добавляют семь частей второго раствора.

Вместо реактива можно использовать системы индикаторные бумажные (СИБ-оксидаза) или бумажки, приготовленные заранее.

Приготовление бумажек для оксидазного теста: 30 мг а-нафтола растворить в 2,5 мл 96 %-ного этилового спирта, добавить 7,5 мл дистиллированной воды и затем 50 мг диэтиланилинсульфата. Смочить фильтровальную бумажку, высушить и хранить в темноте в черной бумаге не более 6 месяцев.

С каждой новой партией реактивов, а также периодически в процессе хранения реактивов или готовой бумажной системы следует проводить контрольные испытания с тест-культурам и известных микроорганизмов, дающих положительную реакцию (Pseudomonas aeruginosa или Pseudomonas fluorescens) и отрицательную реакцию (Е. coli).

Основная среда. В 1000 мл стерильного расплавленного питательного агара (по п. 5.4) добавляют 10 г глюкозы, нагревают до растворения, разливают мерно во флаконы, автоклавируют при (112±2) °С 12 минут.

20 %-ный раствор сульфита натрия (ЫагБОз) и 8 %-ный раствор железа сернокислого закисиого (FC2SO4) готовят непосредственно перед употреблением в стерильной посуде на стерильной дистиллированной воде. Раствор сульфита натрия

нагревают до полного растворения. Перед выполнением анализа в 100 мл расплавленной основной среды вносят 5 мл 20 %-ного раствора сульфита натрия, перемешивают, затем вносят 1 мл 8 %-ного раствора сернокислого железа, перемешивают и разливают с соблюдением правил стерильности в стерильные пробирки высоким столбиком (12—15 см) — для работы методом мембранной фильтрации, или во флаконы — для работы методом прямого посева.

6.1. Подготовка посуды и материалов

Лабораторная посуда должна быть тщательно вымыта, ополоснута дистиллированной водой до полного удаления моющих средств и других посторонних примесей и высушена.

Пробирки, колбы, бутылки, флаконы должны быть заткнуты силиконовыми или ватно-марлевыми пробками и упакованы так, чтобы исключить загрязнения после стерилизации в процессе работы и хранения. Колпачки могут быть металлические, силиконовые, из фольги или плотной бумаги.

Флаконы для отбора проб закрывают силиконовыми, резиновыми и другими пробками, исключая ватно-марлевые, а также колпачками, изготовленными из фольги, плотной бумаги и др.

Новые резиновые пробки кипятят в 2 %-ном растворе натрия двууглекислого 30 мин и 5 раз промывают водопроводной водой (кипячение и промывание повторяют дважды). Затем пробки кипятят в дистиллированной воде 30 мин, высушивают, заворачивают в бумагу или фольгу и стерилизуют в паровом стерилизаторе. Резиновые пробки, использованные ранее, обеззараживают, кипятят 30 минут в водопроводной воде с нейтральным моющим средством, промывают в водопроводной воде, высушивают, монтируют и стерилизуют.

При приготовлении емкостей для отбора проб с притертой пробкой, между стенкой горлышка и пробкой следует вложить полоску тонкой бумаги.

Пипетки со вставленными тампонами из ваты должны быть уложены в металлические пеналы или завернуты в бумагу.

Чашки бактериологические в закрытом состоянии должны быть уложены в металлические пеналы или завернуты в бумагу. Бумага, используемая для обертывания лабораторной посуды, нс должна разрушаться при стерилизации.

Подготовленную посуду стерилизуют в сушильном шкафу при 160—170 °С 1 час, считая с момента достижения указанной температуры. Простерилизованную посуду можно вынимать из сушильного шкафа только после его охлаждения ниже 60 °С.

Материалы и лабораторная посуда, имеющие элементы материалов, разрушающихся при температуре 160 °С (резина и т. п.), следует стерилизовать в паровом стерилизаторе при температуре (121 ±2) °С (10 5 ПА) 20 мин.

После выполнения анализа все использованные чашки и пробирки обеззараживают в автоклаве при (126±2) °С 60 мин. Пипетки обеззараживают кипячением в 2 %-ном растворе ЫаНСОз.

После охлаждения удаляют остатки сред, затем чашки и пробирки замачивают, кипятят в водопроводной воде и моют с последующим ополаскиванием дистиллированной водой.

Прежде чем приступить к посеву, пробу необходимо тщательно перемешать и обработать горящим тампоном край емкости с тем, чтобы устранить его возможное загрязнение во время транспортирования. На используемых для посева пробирках и чашках необходимо обозначить номер пробы, объем воды или разбавление, дату посева.

Перед каждым отбором новой порции воды для анализа пробу необходимо перемешать стерильной пипеткой.

7. Методика работы при использовании мембранных фильтров

7.1. Подготовка мембранных фильтров

Мембранные фильтры должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями завода-изготовителя.

72 Подготовка фильтровального аппарата

Фильтровальный аппарат обтирают ватным тампоном, смоченным спиртом ректификованным, и фламбируют. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, ирижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора.

В верхнюю часть прибора для фильтрования наливают точно отмеренный объем воды, затем создают вакуум в нижней части прибора.

При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат сначала меньшие, а затем большие объемы воды, меняя каждый раз фильтры.

При фильтровании 1 мл исследуемой воды или ее разбавления следует в воронку налить предварительно не менее 10 мл стерильной водопроводной воды, а затем внести анализируемую воду.

После окончания фильтрования воронку снимают, фильтр осторожно приподнимают за край фламбированным пинцетом при сохранении вакуума для удаления излишка воды на нижней стороне фильтра, а затем переносят его, не переворачивая, на питательную среду, разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с оседавшими на ней бактериями должна быть обращена вверх. Вакуум отключают до внесения следующей порции анализируемой воды.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, даты посева и номера пробы. На одну чашку можно поместить 3—4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

Если исследуемая вода содержит большое количество взвешенных веществ, то ее фильтруют сначала через предварительный мембранный фильтр для удаления крупной взвеси, который помещают в фильтровальный прибор, накладывая на фильтр для бактериологического анализа. После окончания фильтрования фильтры переносят на плотную питательную среду раздельно и при выведении результатов анализа учитывают колонии, выросшие на обоих фильтрах.

8.1 Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре

8.1.1. Определение понятия показателя

Метод определяет в питьевой воде общее число ме-зофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.

8. 1.2. Выполнение анализа Из каждой пробы должен быть сделан посев не менее двух объемов по 1 мл.

После тщательного перемешивания пробы воды вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. Сразу же после внесения воды в каждую чашку вливают 6—8 мл (на чашку диаметром 90—100 мм) расплавленного и остуженного до 45—46 °С питательного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержится. Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашки оставляют до застывания агара.

Расплавленный агар на период проведения анализа помещают в водяную баню или термостат, поддерживающие температуру 45—46 °С.

Тонкий слой агара увеличивает эффективность учета сапрофитной микрофлоры за счет лучших условий для роста аэробных бактерий, преобладающих в воде. Колонии вырастают более крупными, легко подсчитываемыми на фоне прозрачного тонкого слоя агара. Ограничен рост расплывчатых колоний.

После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 24±2 часов.

8.1.3. Вычисление и представление результатов Должны быть подсчитаны все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Подсчет следует производить только на тех чашках, на которых выросло не более 300 изолированных колоний.

Подсчитанное количество колоний на каждой чашке суммируют и делят на два. Результат выражают числом колоний образующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды и заносят в протокол.

Результат дают на основании подсчета колоний на одной чашке, если на другой подсчет невозможен.

Если на всех чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не распространяющийся на всю поверхность чашки, или выросло более 300 колоний и анализ нельзя повторить, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают «число КОЕ в 1 мл — ориентировочно».

Если подсчет колоний на чашках невозможен, то в протоколе отмечают: «сливной рост*.

На качество результата метода влияет соблюдение деталей техники анализа (срока хранения пробы, температуры и времени инкубации посевов, правил учета результатов, качество питательного агара).

82. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации

8.2.1. Определение понятия показателя К общим колиформным бактериям относятся грамотринательные не образующие спор палочки, не обладающие оксидаз-ной активностью, ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 37 °С в течение 24-х часов.

Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, которые кроме тот способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре 44 °С в течение 24-х часов.

в. 2.2. Принцип метода Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на селективной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

8.2.3. Выполнение анализа При исследовании воды на выходе с водопроводных сооружений и в распределительной сети необходимо анализировать 3 объема по 100 мл.

Если анализируемая вода стабильно соответствует нормативам, то допустима фильтрация 300 мл воды через один фильтр.

При необходимости возможно увеличение количества фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например, из водопроводной сети можно фильтровать 10, 40, 100, 150 мл воды).

Необходимый точно отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры с соблюдением требований, изложенных в п. 7.

Фильтры помещают на среду Эндо, приготовленную по н. 5.5.1 или п. 5.5.2. Чашки с фильтрами ставят в термостат

источник

«МУК 4.2.2029-05. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Санитарно-вирусологический контроль водных объектов. Методические указания» (утв. Роспотребнадзором 18.11.2005)

службы по надзору в сфере

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

САНИТАРНО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ

1. Разработаны: ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН (А.Е. Недачин, Р.А. Дмитриева, Т.В. Доскина, Д.В. Лаврова, А.Г. Санамян); ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (О.Е. Иванова, Т.П. Еремеева); ГУ Центральный НИИ эпидемиологии (Г.А. Шипулин, В.П. Чуланов, Е.Н. Родионова, А.Т. Подколзин); ГУ Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера (В.В. Малышев, М.А. Бичурина, Н.В. Железнова); Санкт-Петербургской Военно-медицинской академией им. С.М. Кирова (П.И. Огарков); Белорусским НИИ эпидемиологии и микробиологии (Т.В. Амвросьева).

В подготовке материалов принимали участие: ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (Т.В. Воронцова); Аналитический Центр ЗАО «РОСА» (В.Б. Конторович); Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной (К.В. Блохин, М.И. Попкова); ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве» (С.Г. Курибко, Г.М. Бабкина); ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Вологодской области» (И.Р. Лесников); ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Воронежской области» (О.Т. Агеева); ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области» (В.О. Скворцов); ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии во Владимирской области» (Н.И. Джакаридзе); ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ленинградской области» (Э.В. Маликова); ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Калужской области» (Е.И. Косолапова); Территориальное управление Роспотребнадзора по Липецкой области (И.А. Ходякова); ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Ростове-на-Дону» (Т.А. Зыкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 6 октября 2005 года (протокол N 3).

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 18 ноября 2005 года.

4. С момента введения в действие методических указаний считать утратившими силу пункты 1.1 — 1.3; 3.1.1 — 3.1.3; 3.2; 4 методических рекомендаций «Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды», утвержденных Начальником Главного Управления карантинных инфекций В.П. Сергиевым 7 июня 1982 года.

1.1. Методические указания устанавливают методы санитарно-вирусологического контроля качества воды различного вида водопользования и степени загрязнения в отношении ее эпидемической безопасности по санитарно-вирусологическим показателям, регламентируемым СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества»; СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод»; СанПиН 2.1.4.1175-02 «Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников»; СанПиН 2.1.2.1188-03 «Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества»; СанПиН 2.1.4.1116-02 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества».

1.2. Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор за качеством питьевой воды, состоянием водоемов в местах водопользования населения, использованием сточных вод в системах промышленного оборотного водоснабжения и для орошения сельскохозяйственных угодий.

1.3. Методические указания также могут использоваться организациями, эксплуатирующими системы централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, системы канализования и осуществляющими производственный контроль.

2. Гигиенические и эпидемиологические показания

к проведению санитарно-вирусологического контроля качества

2.1. Виды санитарно-вирусологического контроля

В системе государственного санитарно-эпидемиологического надзора за загрязнением кишечными вирусами водных объектов используют следующие виды санитарно-вирусологического контроля:

Плановый санитарно-вирусологический контроль осуществляют в течение года в соответствии с разработанной программой для каждой системы водоснабжения на конкретной территории, согласованной с территориальными органами Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

В рабочую программу включают перечень контролируемых объектов, показателей, периодичность проведения исследований, перечень используемых методов, план точек отбора проб воды, количество контролируемых проб воды. При этом необходимо учитывать, что предварительную оценку возможного вирусного загрязнения водных объектов осуществляют с использованием косвенных показателей вирусного загрязнения — общей группы колифагов, а также обнаружением антигенов ротавирусов и (или) антигена ВГА методом ИФА.

При обнаружении колифагов либо вирусных антигенов (ВГА, ротавирусов) в исследуемых пробах необходимо исследовать воду на наличие энтеровирусов, а также РНК энтеровирусов, РВ и ВГА методом ОТ-ПЦР.

Внеплановый санитарно-вирусологический контроль предусматривает проведение исследований воды на наличие колифагов, антигенов ротавирусов и ВГА и энтеровирусов в случае внезапных или непредвиденных изменений санитарно-эпидемической ситуации на контролируемой территории:

— каких-либо аварий или нарушений в системах водоснабжения и канализации, в результате которых может произойти массивное микробное загрязнение поверхностных и подземных водоисточников, а также питьевой воды. В этот период все работы заинтересованных организаций, включая и санитарно-вирусологический контроль, координирует Чрезвычайная противоэпидемическая комиссия города, района, субъекта Российской Федерации;

— по санитарно-эпидемиологическим показаниям контроль осуществляют в случае наличия факторов-предшественников в санитарно-эпидемиологической ситуации на территории и последующего подъема заболеваемости населения кишечными вирусными инфекциями, которая превышает уровень круглогодичной заболеваемости, характерной для конкретной местности.

Санитарно-вирусологический контроль в период эпидемического риска предусматривает более частые исследования по сравнению с установленными в программе текущего контроля, его утверждает главный государственный санитарный врач города, района, субъекта Российской Федерации либо его проводят по решению Чрезвычайной противоэпидемической комиссии города, района, субъекта Российской Федерации.

Производственный санитарно-вирусологический контроль проводят постоянно, он предусматривает исследования воды водных объектов в организациях водоснабжения: на этапах водоподготовки, выходе с водоочистных сооружений (после обеззараживания), в разводящей сети; в организациях по производству воды, расфасованной в емкости; при выборе водоисточника; при оценке эффективности работы обеззараживающих установок, режима их работы; при превышении нормативов уровня колифагов либо при обнаружении антигенов ВГА и (или) ротавирусов.

Определение энтеровирусов и (или) РНК РВ и ВГА проводят в санитарно-вирусологических лабораториях, обеспечивающих деятельность государственного санитарно-эпидемиологического надзора, профильных учреждений и других организаций, имеющих разрешение на данный вид деятельности в установленном законодательством Российской Федерации порядке.

Объектами исследования является вода различных водных объектов:

— сточная на этапах очистки и обеззараживания;

— пресных и морских поверхностных водоемов, используемых в рекреационных целях, а также в качестве источников хозяйственно-питьевого водоснабжения;

— питьевая (водопроводная; вода, расфасованная в емкости и др.);

— из децентрализованных водоисточников.

Сточные воды, поступающие на очистные сооружения, исследуют с целью изучения спектра энтеровирусов, циркулирующих среди населения, и по эпидемическим показаниям.

Сточные воды на этапах очистки и обеззараживания исследуют для изучения эффективности работы очистных сооружений в отношении возбудителей кишечных вирусных инфекций в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод».

2.2.2. Вода поверхностных водоемов.

Воду пресных водоемов исследуют на наличие вирусного загрязнения с целью изучения процессов самоочищения, при выборе поверхностных водоемов в качестве водоисточников для централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, установления зон санитарной охраны, по эпидемическим показаниям.

Контроль воды морских и пресных водоемов за уровнем загрязнения осуществляют при использовании их в рекреационных целях в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод», по эпидемическим показаниям.

2.2.3. Вода подземных водоисточников.

Воду подземных водоисточников исследуют на наличие вирусного загрязнения при выборе источника хозяйственно-питьевого водоснабжения, контроле ее качества в соответствии с ГОСТ 2761-84 «Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения», по эпидемическим показаниям.

2.2.4. Вода плавательных бассейнов и аквапарков.

Контроль за уровнем вирусного загрязнения воды плавательных бассейнов проводят в соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил и нормативов СанПиН 2.1.2.1188-03 «Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества», СанПиН 2.1.2.1331-03 «Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству вод аквапарков», по эпидемическим показаниям.

Питьевую воду исследуют на наличие вирусного загрязнения в соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил и нормативов СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества», СанПиН 2.1.4.1116-02 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества», в соответствии с программой исследования воды, утвержденной главным государственным санитарным врачом города, района, субъекта Российской Федерации, по эпидемическим показаниям.

2.2.6. Контроль воды децентрализованных источников.

Исследование воды децентрализованных источников проводят в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами СанПиН 2.1.4.1175-02 «Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана водоисточников», по эпидемическим показаниям.

2.3. Санитарно-вирусологические показатели качества водных объектов

Санитарно-вирусологический контроль воды водных объектов предусматривает исследования по следующим показателям:

— кишечные вирусы (энтеровирусы и аденовирусы в культурах ткани);

— антигены ротавирусов и вируса гепатита А в качестве маркеров вирусного загрязнения;

— РНК вирусов гепатита А, ротавирусов, энтеровирусов и ДНК аденовирусов методом полимеразной цепной реакции со стадией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) для РНК-содержащих вирусов;

— колифаги (исследования проводят бактериологические лаборатории) в качестве косвенных показателей вирусного загрязнения вод различного назначения в соответствии с нормативными и методическими документами.

Выбор показателей осуществляют в соответствии с нормативными и методическими документами или по рекомендациям эпидемиолога.

2.4. Оценка эпидемической безопасности водных объектов

Вода водных объектов и питьевая вода подлежат обязательному санитарно-вирусологическому контролю.

Основным принципом регламентирования вирусного загрязнения воды на настоящем этапе является отсутствие возбудителей кишечных вирусных инфекций в нормируемом объеме воды водных объектов и питьевой воде.

Критерием эпидемической безопасности воды водных объектов является отсутствие спорадической и вспышечной заболеваемости населения, обусловленной кишечными вирусами, распространяющимися водным путем.

Санитарно-вирусологический контроль воды осуществляют в соответствии с положениями раздела 2 с использованием санитарно-показательных микроорганизмов — колифагов, косвенных показателей вирусного загрязнения, что является экономичным и дает быстрый ответ о потенциальной эпидемической опасности водных объектов в отношении вирусного загрязнения и риска заболевания населения вирусными кишечными антропонозами.

В соответствии с результатами исследований воды на колифаги проводят обязательное прямое определение энтеровирусов и аденовирусов с использованием «культуральных» методов.

Для выявления в пробах воды труднокультивируемых в клеточных культурах вирусов (вирус гепатита А, ротавирусы) проводят анализ воды на наличие их антигенов с использованием методов ИФА, или ОТ-ПЦР — на наличие РНК вирусов. Положительный результат анализа пробы воды в ИФА после обеззараживания хлором или озоном, содержащей только антиген или РНК определенного вируса, оценивают как ориентировочный, свидетельствующий о циркуляции данного возбудителя на изучаемой территории и возможного водного пути передачи в реализации эпидемического процесса данной инфекции.

Наличие в анализируемой пробе помимо антигена или РНК вируса других форм микроорганизмов (общее микробное число — ОМЧ, колиформных бактерий, колифагов) свидетельствует о вирусном загрязнении воды.

Подтверждением этому является развитие соответствующей эпидемической ситуации на изучаемой территории, а также гомологичность РНК вирусов, выделенных из воды и из материалов от больных.

Для получения информации о степени гомологии штаммов вирусов, выделенных из воды и из материалов от больных на исследуемой территории, проводят ПЦР-амплификацию вариабельного фрагмента генома вируса с последующим секвенированием. Полная гомология данных фрагментов генома свидетельствует в пользу водного пути распространения возбудителя, тогда как наличие генетических отличий исключает роль водного фактора в возникновении данной эпидемической вспышки (эти исследования выполняют в специализированных лабораториях, имеющих разрешение на данный вид деятельности в установленном законодательством Российской Федерации порядке).

3. Основные материалы, оборудование, питательные среды

Примечание. Могут использоваться материалы, оборудование, питательные среды, тест-системы с аналогичными характеристиками, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном законодательством порядке.

4. Общие правила отбора проб из различных водных объектов

Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или стерильные емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не оказывающих инактивирующего действия на вирусы. Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги). Емкость открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду не допускается. При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана производят после его предварительной стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 мин. при полностью открытом кране. При отборе пробы напор воды может быть уменьшен. Пробу отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок. Если через пробоотборный кран вода течет постоянно, отбор проб производят без предварительного обжига, не изменяя напора воды и существующей конструкции (при наличии силиконовых или резиновых шлангов).

Если отбирают пробу после обеззараживания химическими реагентами, то для нейтрализации остаточного количества хлорсодержащих дезинфектантов в емкость, предназначенную для отбора проб, вносят до стерилизации натрий серноватистокислый в виде кристаллов или концентрированного раствора из расчета 10 мг на 500 мл воды. После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком. При отборе проб в одной и той же точке для различных целей, первыми отбирают пробы для бактериологических исследований.

Отобранную пробу маркируют и сопровождают актом отбора проб воды с указанием места, даты, времени отбора и другой необходимой информации.

К исследованию проб воды необходимо приступить сразу же после доставки проб в лабораторию.

5. Методы концентрирования вирусов из воды

В данном разделе представлены современные методы концентрирования вирусов из воды, предназначенные для качественной или количественной оценки вирусного загрязнения. Перечень методов и область применения представлены в табл. 1.

ОБЪЕМ ПРОБ, УСЛОВИЯ И ПЕРИОДИЧНОСТЬ ОТБОРА ПРОБ ВОДЫ ВОДНЫХ

ОБЪЕКТОВ НА ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Выбор того или иного метода в практике контроля вирусного загрязнения определяют эпидемической ситуацией в регионе, задачами региональных планов по снижению заболеваемости кишечными вирусными инфекциями, уровнем оснащенности лабораторий.

Все работы, связанные с концентрированием и выделением вирусов, проводят с соблюдением правил эпидемиологической безопасности, в соответствии с нормативными документами: санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)», санитарными правилами СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами».

5.1. Метод концентрирования вирусов с использованием фильтрующих мембран

Метод используют для концентрирования вирусов из питьевой воды различных видов (водопроводной, бутылированной, из родников и др.), воды подземных водоисточников, воды из бассейнов и других чистых вод. Объем исследуемой воды составляет 10 л. При необходимости объем воды может быть увеличен. Время концентрирования данным методом из 10 л составляет в среднем 1,5 — 2,5 ч. Для концентрирования используют фильтрующие мембраны из нитроцеллюлозы типа ФМНЦ, ФМПА и мембраны микропористые капроновые (ММК) или другие, равные по эффективности.

5.1.2. Подготовка мембранных фильтров.

Фильтрующие мембраны должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями организации-изготовителя (листовка-аннотация, сопровождающая фильтры). Перед исследованием фильтрующие мембраны смачивают стерильной водопроводной водой в стерильной емкости.

5.1.3. Подготовка фильтровального аппарата.

Для фильтрования исследуемой воды используют установку, например, типа АФ-142 «К» или другую с аналогичными характеристиками, которая состоит из фильтродержателя, емкости на 10 и более литров для исследуемой воды и ее последующей фильтрации и устройства, нагнетающего жидкость.

Перед фильтрацией фильтродержатель протирают ватным тампоном, смоченным спиртом ректификованным 70%, и обжигают. После охлаждения на нижнюю часть фильтродержателя кладут стерильным пинцетом влажный мембранный фильтр, предварительно смоченный в стерильной водопроводной воде. Затем фильтр прижимают верхней частью фильтродержателя и закрепляют зажимами, равномерно завинчивая последние со всех сторон.

Исследуемый объем воды наливают в напорную емкость, крышку тщательно закрепляют зажимами, включают подачу давления (1,5 — 2,0 бара), после чего воду направляют в фильтродержатель со скоростью около 100 мл/мин. и фильтруют через мембрану. При использовании для концентрирования мембран, например, типа ФМНЦ, в исследуемую воду добавляют хлористый магний до конечной концентрации 0,05 М или хлористый алюминий до конечной концентрации 0,0005 М для увеличения сорбционной способности мембраны. При использовании фильтров ММК хлористый магний не добавляют.

5.1.5. Элюция сконцентрированных вирусных частиц.

Элюцию вирусов с мембран проводят 20 мл элюента с соблюдением всех правил эпидемической безопасности (перчатки, маска, спецодежда и т.д.) в ламинарном боксе. После окончания фильтрования откручивают зажимы и снимают верхнюю часть фильтродержателя. Мембрану осторожно приподнимают за край пинцетом, стерилизованным путем обжигания и переносят в стерильную емкость, соответствующую диаметру мембраны (может быть использована тарелка, чашка Петри диаметром не менее 142 мм и др.). Затем на поверхность мембраны наносят 10 мл элюента (3% бифэкстракт на трисбуфере с рН 9,1 — 9,5) и стерильной пипеткой с целым концом проводят механический смыв (соскабливанием и струей) вируса с поверхности мембраны в течение нескольких минут. К концу манипуляции мембрана должна приобрести первоначальный вид. Полученный элюат переносят в стерильный флакон. Затем на эту же мембрану наносят второй объем (10 мл) того же элюента и проводят вторичное смывание вирусов струей с обеих сторон мембраны, и вторую часть элюата помещают в тот же флакон, что и первую. Затем рН полученного элюата доводят до 7,0 — 7,5 1 N раствором соляной кислоты.

Для удаления бактериальной микрофлоры элюат подвергают обработке одним из двух методов: обработкой хлороформом или фильтрацией через стерилизующие мембраны.

5.1.6.1. При использовании хлороформа его добавляют в элюат (1 мл на 10 мл элюата), интенсивно встряхивают 10 мин. и центрифугируют 10 мин. при 2000 об./мин. для разделения фаз. Водную фазу (верхнюю) аккуратно отбирают пипеткой в стерильный флакон, добавляют 100 МЕ/мл пенициллина и 10,0 мг/мл стрептомицина.

5.1.6.2. При использовании стерилизующих насадок с фильтрами 0,22 мкм элюат пробы переносят в стерильный шприц объемом 5 — 20 мл с установленной фильтрующей насадкой и поршнем шприца продавливают в стерильный флакон. Этот способ позволяет избежать использования антибиотиков, токсичного хлороформа и связанных с этим мер безопасности, не требует длительного встряхивания и центрифугирования.

Стерильные элюаты хранят до испытания при 4 °С не более 24 ч. При температуре -20 °С их можно хранить в течение 1 года. При необходимости многократного исследования элюат делят на несколько порций, чтобы избежать повторного замораживания.

5.2. Метод концентрирования вирусов с использованием ионообменных смол

Метод рекомендуется для концентрирования вирусов из чистых вод, воды поверхностных водоемов и сточных вод. Объем проб для исследования определенного вида воды представлен в табл. 1.

5.2.2. Подготовка ионообменной смолы.

Подготовку ионообменных смол (аниониты АВ-17-8, АВ-17-8-чс) осуществляют следующим образом: сухую смолу замачивают в течение 2 — 3-х суток в дистиллированной воде. Затем воду сливают и смолу обрабатывают смесью равных объемов свежеприготовленных растворов 2% соляной кислоты и 10% хлорида натрия из расчета 1 л смеси на 100 г смолы. Продолжительность контакта 24 ч. После этого смолу отмывают дистиллированной водой до нейтрального рН 7,0.

5.2.3. Концентрирования вирусов из проб воды.

Перед концентрированием рН исследуемой пробы воды доводят до значений 5,5 — 6,0 путем добавления концентрированной соляной кислоты.

Для осуществления концентрирования стеклянную бюретку (колонку) диаметром 1,2 — 1,5 см, к нижнему концу которой присоединен резиновый шланг с завинчивающимся зажимом, устанавливают в штативе строго вертикально. На дно колонки помещают небольшой слой стекловаты для удержания смолы. В колонку вносят суспензию смолы, удаляя через нижний резиновый шланг избыток воды. Заполнение колонки следует проводить тщательно, избегая образования пузырьков воздуха в столбике смолы. Высота столбика смолы должна быть 10 — 12 см.

Емкость с пробой воды располагают выше колонок, в нее опускают стерильный резиновый шланг с битой пипеткой на конце. С другой стороны шланга должна быть резиновая пробка с отверстием для прохождения воды. Через резиновый шланг с пробкой на конце воду подают в колонку, закрывая ее пробкой. Винтовым зажимом на нижнем шланге регулируют подачу воды через смолу, создавая скорость 10 — 12 мл в минуту.

5.2.4. Элюция вирусов с ионообменной смолы

После окончания концентрирования (примерно через 16 — 18 ч, при исследовании 10 л) осуществляют элюцию вирусов со смолы 0,5 М раствором фосфатного буфера с рН 8,2. Для этого в колонку вносят 10 мл фосфатного буфера, интенсивно встряхивают и оставляют в горизонтальном положении в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем элюат переносят в стерильный флакон и доводят до рН 7,2 1 М раствором соляной кислоты.

Приготовление 0,5 М фосфатного буфера с рН 8,2.

5.3. Двухэтапный метод концентрирования вирусов (сорбция на ионообменной смоле и осаждение с помощью сульфата аммония)

Метод рекомендуется для концентрирования вируса гепатита А и энтеровирусов из проб питьевой воды и воды водоисточников. Объем проб может колебаться от 10 до 50 л.

5.3.2. I этап. Концентрирование и элюция вируса гепатита А и энтеровирусов из проб воды при помощи сорбции на ионообменной смоле.

В качестве сорбента используют смесь, состоящую из ионообменной смолы АВ-17-8 (подготовленной в соответствии с п. 5.2.2) и гидроксида алюминия, которой заполняют стеклянную бюретку (колонку) диаметром 36 — 38 мм и длиной 250 — 300 мм. Колонка должна иметь в нижней части впаянную перегородку из пористого стекла (стеклянный фильтр Шотта N 2) и резиновый шланг, присоединенный к нижнему концу колонки. После установки колонки в штативе в нее вносят ионообменную смолу (высота столбика смолы должна составлять не менее 30 — 40 мм) и навеску гидроксида алюминия (8 — 10 г).

Исследуемую пробу воды в бутылях или канистре подкисляют с помощью соляной кислоты до рН 3,0 — 4,5, располагают выше колонки и через резиновую трубку с пробкой для колонки подают воду в колонку, регулируя скорость прохождения с помощью винта на резиновой трубке, присоединенной к нижнему концу колонки. Скорость прохождения воды через колонку должна составлять 10 — 15 мл/мин.

После прохождения исследуемой воды через колонку нижний резиновый шланг перекрывают и осуществляют элюцию вируса с адсорбента при помощи 0,05 М глицинового буфера с рН 11,5, который вносят в колонку в объеме 100 мл. Адсорбент в колонке и элюент тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 — 15 мин. Затем элюат удаляют из колонки через нижний резиновый шланг и с помощью глицинового буфера с рН 1,5 устанавливают рН элюата на уровне 7,0 — 8,0.

Приготовление глицинового буфера с рН 11,5.

Навеску 0,385 г аминоуксусной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды и получают глицин. К 50 мл глицина добавляют 50 мл 0,1 N раствора гидроксида натрия и получают глициновый буфер с рН 11,5.

Для приготовления глицинового буфера (рН 1,5 — 1,6) к 38 мл глицина добавляют 62 мл 0,1 N раствора соляной кислоты.

5.3.3. II этап. Вторичное концентрирование антигена и энтеровирусов — осаждение с помощью сульфата аммония.

5.4. Метод концентрирования вирусов с использованием двухфазного разделения

Метод рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) «Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде», ВОЗ, 2003.

Метод концентрирования двухфазным разделением используют для индикации вирусов из 1 л очищенных и неочищенных сточных вод.

5.4.2. Подготовка реактивов (для 2-х проб по 1 л).

5.4.2.1. 22% декстран (по весу) — 40 г декстрана Т 40, 142 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при 4 °С.

5.4.2.2. 29% ПЭГ 6000 (по весу) — 363 г ПЭГ 6000 и 888 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при 4 °С. Раствор можно автоклавировать (15 мин. при 45 °С).

5.4.2.3. 150 мл (примерно) 5 М NaCl.

5.4.2.4. 1 N NaOH и 1 N HCL для установки рН.

5.4.3. Концентрирование пробы по 0,5 л.

5.4.3.1. Пробу центрифугируют в течение 10 мин. при 1000 g. Надосадочную жидкость переносят из пробирок в колбу Эрленмейра емкостью 1 л, осадок хранят при 4 °С.

5.4.3.2. Доводят рН надосадочной жидкости до нейтрального уровня (7,0 — 7,5) 1 N раствором NaOH и измеряют конечный объем надосадочной жидкости.

5.4.3.3. К 500 мл надосадочной жидкости добавляют 39,5 мл 22% раствора декстрана, 287 мл 29% раствора ПЭГ 6000 и 35 мл 5 N раствора NaCl. Тщательно перемешивают и выдерживают 1 ч при температуре 4 °С при непрерывном встряхивании или перемешивании, используя прибор горизонтального встряхивания или магнитную мешалку.

5.4.3.4. Для каждой пробы подготавливают стерильную коническую делительную воронку и закрепляют ее в штативе. Смазывают скользящие поверхности кранов, но так, чтобы не закрыть в них отверстие. Проверяют плотность кранов небольшим количеством воды. Смесь, приготовленную по п. 5.4.3.3, переливают в воронку и оставляют на ночь при 4 °С.

5.4.3.5. Утром осторожно открывают кран воронки, медленно выпускают жидкость и собирают нижний ее слой и промежуточную фазу в стерильную пробирку (обычно 5 — 10 мл от каждой пробы объемом 0,5 л.).

5.4.3.6. В полученную жидкость (п. 5.4.3.5) вносят осадок (п. 5.4.3.1), добавляют хлороформ (20% от объема образовавшейся взвеси) и встряхивают в течение 1 мин. Центрифугируют, отбирают верхнюю водную фазу в стерильную пробирку и добавляют антибиотики (пенициллин G или отечественный аналог и стрептомицин до конечной концентрации 100 МЕ/мл и 100 мг/мл соответственно).

5.4.3.7. Помещают 1 мл полученного концентрата в холодильник с температурой -20 или -70 °С для сохранения (при необходимости дальнейшего исследования). Остаток концентрата исследуют на наличие вирусов на культурах тканей, РНК-методом ОТ-ПЦР и антигена — методом ИФА.

5.5. Метод концентрирования вирусов с помощью флизелиновых пакетов с макропористым стеклом

Метод (качественный) используют для концентрирования вирусов из воды поверхностных водоемов, сточной воды. Время концентрирования вирусов должно составлять 3 — 7 суток.

5.5.2. Подготовка макропористого стекла (МПС) .

Можно использовать готовые стандартные наборы, разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном законодательством порядке.

В пакет из флизелина размером 5 х 7 см помещают 3,0 см подготовленного сорбента.

5.5.3. Концентрирование вирусов.

Пакет с сорбентом закрепляют с помощью лески за неподвижный предмет так, чтобы он оказался в токе воды. После экспозиции в течение 3 — 7 суток пакет вынимают, помещают в отдельный новый полиэтиленовый мешочек или стерильный флакон и доставляют в лабораторию в сумке-холодильнике в максимально короткий срок (не более 6 ч). Каждую пробу маркируют с указанием точки отбора, датой установки и времени экспозиции пакета. До обработки пробы можно хранить не более суток при 4 °С.

Пакет с сорбентом извлекают из транспортировочной емкости и помещают в стерильную чашку Петри. Обрезают край пакета, вымывают стекло дистиллированной водой (5 мл) с помощью пипетки в эту же чашку Петри и переносят пипеткой или через воронку в колонку объемом 5 — 10 мл. Вирусы элюируют ступенчато тремя растворами по 3 мл каждый, собирая фракции в отдельные пенициллиновые флаконы. Исследованию подвергают каждую фракцию в отдельности (всего 3 фракции). В качестве элюирующих растворов используют: 1) 0,05 М трис-НС1 рН 9,1; 2) 0,05 М трис-HCl рН 9,1 и 0,5 М NaCl; 3) 3% мясной экстракт на 0,05 М трис-HCl рН 9,1.

5.6. Метод концентрирования вирусов с использованием набора для сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды с помощью ловушечного устройства.

Ловушечное устройство состоит из насадки на водопроводный кран, к которой с помощью синтетической трубки прикреплен держатель. В держатель, состоящий из двух свинчивающихся частей с резьбой, вставляется специальная ловушка, внутри которой находится адсорбент, сорбирующий вирусы из воды. Применяемая ловушка является одноразовой, а само устройство может использоваться после стерилизации многократно в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Метод используют для концентрирования вирусов из водопроводной воды.

5.6.2. Подготовка ловушечного устройства и фильтрование воды.

Перед использованием в ловушечное устройство вставляют ловушку, после чего его заворачивают в бумагу для стерилизации и стерилизуют сухим жаром при температуре 80 °С 45 мин. Ловушечное устройство с вставленной ловушкой доставляют на место отбора в стерильной упаковке. После трехкратного обжигания водопроводного крана и спуска воды в течение 15 мин. устанавливают необходимую скорость ее протекания — 1 л за

1,5 мин., что составляет 40 — 45 л/ч. Ловушечное устройство извлекают из стерильной упаковки и устанавливают его на кран. Объем пропускаемой воды должен составить 1000 л, что достигается при скорости тока воды 40 — 45 л/ч в течение 24 ч. Спустя 24 ч ловушечное устройство снимают с крана и помещают в стерильный пакет, который доставляют в вирусологическую лабораторию. После извлечения ловушки использованное ловушечное устройство подвергают обеззараживанию в 3% растворе перекиси водорода в течение 12 ч, затем многократно (не менее 10 раз) промывают в проточной воде и высушивают для последующей стерилизации и повторного использования.

5.6.3. Элюция сконцентрированных вирусных частиц.

Ловушку с адсорбентом в стерильных условиях извлекают из ловушечного устройства и помещают в чашку Петри. С помощью ножниц ловушку вскрывают, содержащийся внутри адсорбент вымывают в чашку Петри стерильной дистиллированной водой в объеме 5 — 10 мл. Полученную взвесь адсорбента в дистиллированной воде переносят с помощью пипетки с отпиленным концом в стеклянную колонку. Вытекающую из колонки воду собирают в стерильный пенициллиновый флакон. Элюцию вирусов осуществляют с помощью специального элюента, содержащегося в наборе. Для получения рабочего раствора концентрат разводят стерильной дистиллированной водой в соотношении 1:10 (объем элюента/объем воды). Вирус элюируют путем пропускания 3 мл элюента через адсорбент в колонке. Полученную фракцию (элюат) собирают в стерильный пенициллиновый флакон.

Использованный адсорбент заливают 3% раствором перекиси водорода для обеззараживания на 12 ч.

С целью увеличения эффективности обнаружения вирусов в элюатах проб воды при исследовании методом ПЦР (обнаружение РНК энтеровирусов) и ИФА (обнаружение антигенов энтеровирусов) проводят дополнительное концентрирование элюатов с помощью ультрацентрифугирования либо обрабатывают элюаты полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ 6000).

5.6.3.1. Ультрацентрифугирование элюата.

Ультрацентрифугирование проводят при 40000 — 50000 g в течение 2 ч с использованием угловых или бакет-роторов. В стерильную центрифужную пробирку наливают вируссодержащий элюат, а затем с помощью шприца на дно пробирки наслаивают 10 — 20% раствор сахарозы так, чтобы она занимала 5 — 10% от объема пробирки. После центрифугирования супернатант удаляют. Осадок ресуспендируют в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды для ПЦР-исследований или в фосфатно-солевом твинсодержащем буфере (рН 7,2) для ИФА.

5.6.3.2. Обработка элюата полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ 6000).

В элюат добавляют ПЭГ 6000 и хлористый натрий, находящийся непосредственно в пробирках для центрифугирования, до конечных концентраций 10% и 0,5 М соответственно. Смесь тщательно перемешивают до растворения ПЭГ и затем выдерживают в течение 10 — 12 ч при 4 °С. Образовавшуюся суспензию центрифугируют при 10000 g в течение 1 ч или при 6000 g в течение 2 ч. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды для ПЦР-исследований или в фосфатно-солевом твинсодержащем буфере (рН 7) — для ИФА.

6. Методы выделения энтеровирусов в культурах клеток

Исследование полученных элюатов на энтеровирусы проводят в культуре ткани в соответствии с документом «Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита», рекомендованным Всемирной организацией здравоохранения (1998). При этом следует отметить, что для выделения вирусов используют максимально возможный полученный элюат (кроме 1 мл, заложенного на хранение, и объема, используемого для исследования в ИФА и ПЦР). Для выделения вирусов используют следующие культуры тканей: RD, Hep-2, BGM и другие чувствительные к энтеровирусам линии клеток.

Перевиваемые культуры клеток RD, Hep-2 (Cincinnatti), BGM наиболее пригодны для проведения лабораторных исследований и позволяют выделять достаточно широкий спектр энтеровирусов, которые могут присутствовать в водных объектах окружающей среды.

Культура клеток RD, происходящая из человеческой рабдомиосаркомы, обладает высокой чувствительностью к вирусам полиомиелита, многим типам вируса ECHO, некоторым вирусам Коксаки А. Вирусы полиомиелита и вирусы Коксаки В хорошо размножаются в культуре клеток Нер-2, полученной из эпидермоидной карциномы человека. Культура клеток BGM — перевиваемая культура клеток почек африканской зеленой мартышки — чувствительна к вирусам полиомиелита и вирусам Коксаки В. Использование, по крайней мере, двух культур позволяет выявлять, возможно, больший спектр вирусов, а комбинация клеток, обладающих различной чувствительностью к различным энтеровирусам, может помочь при идентификации выделенного цитопатогенного агента. Чрезвычайно полезным является поддержание и использование в лабораторных исследованиях культуры клеток L20B. Эта культура клеток создана на основе мышиной линии L-клеток, в которую экспрессированы человеческие рецепторы к полиовирусу. Она позволяет селективно выделять только полиовирусы, что делает ее незаменимой культурой при идентификации выделенных цитопатогенных агентов для разделения смесей вирусов. Чувствительность культур клеток к различным энтеровирусам представлена в табл. 2.

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК

К РАЗЛИЧНЫМ ЭНТЕРОВИРУСАМ

Культуры клеток для лабораторного исследования следует получать из аттестованного источника, например, из лаборатории, обладающей банком клеток. Необходимо периодически контролировать чувствительность используемых в лаборатории клеток. Для этого после каждых 8 — 10 пассажей клеток на них проводят титрование референс-штаммов вакцинного вируса полиомиелита. После 15 — 20 последовательных пассажей следует перейти на свежую линию из банка клеточных культур или получить ее в референс-лаборатории. Эта процедура позволяет сохранять высокую чувствительность клеток и снижает риск контаминации клеток микоплазмами.

При хорошем состоянии культуры клеток первичное заражение и один пассаж вместе составляют период наблюдения 14 дней. В ряде случаев (например, при выделении агента с низкой цитопатогенной активностью, или при наличии в пробе вируса в небольшом количестве) необходимо сделать последующие пассажи. При этом следует помнить, что каждый последующий пассаж увеличивает риск перекрестной контаминации.

При выделении вирусов из проб воды различного происхождения в культуре клеток можно столкнуться с рядом нежелательных явлений. Если при первичном заражении в культуре клеток развивается быстрая (в течение 1 — 2 дней после внесения исследуемого субстрата) дегенерация клеток, то, скорее всего, это связано с неспецифической токсичностью пробы. Такие культуры нужно заморозить при -20 °С, оттаять и выполнить пассаж. Если признаки токсичности обнаружатся вновь, то следует вернуться к исходной пробе, развести ее ФСБ 1:10 и повторить заражение. Бактериальная контаминация, которая проявляется в виде помутнения среды, приводит к гибели клеток и делает выявление вирусного ЦПЭ затруднительным или невозможным. В этом случае следует вернуться к исходной пробе, обработать ее хлороформом и повторить процедуры заражения.

Особое внимание следует уделять предупреждению перекрестной вирусной контаминации во время процедур заражения и пассирования. Нельзя сливать среду через край флакона или пробирки, в которые вносилась исследуемая проба, даже если ЦПЭ отсутствует. Удаление среды производят пипеткой, которую меняют после каждой процедуры. При заражении с помощью автоматических микропипеток используют только наконечники с фильтрами. Следует избегать процедур, при которых образуются аэрозоли (например, энергичное пипетирование); по возможности не рекомендуется использование посуды с резиновыми пробками, которые помещаются внутрь горлышка флакона или пробирки, целесообразно использовать посуду с внешней резьбой на горлышке, которая закрывается завинчивающимися крышками.

Известно, что в пробах воды присутствуют смеси вирусов, с чем могут быть связаны затруднения при идентификации выделенных изолятов. Для разделения смесей и правильной идентификации выделенных вирусов, а также для того, чтобы избежать потери вирусов полиомиелита, все изоляты, «положительные» на культуре клеток RD, следует пассировать на клетки L20B. Наличие выраженного ЦПЭ указывает на присутствие в пробе вируса полиомиелита. Некоторые реовирусы, аденовирусы, а также неполио-энтеровирусы могут проявлять ЦПЭ на клетках L20B и затруднять идентификацию выделенных изолятов и интерпретацию результатов исследования. Такие изоляты следует направить в соответствующую референс-лабораторию для заключительного исследования.

В лабораторной практике часто используют метод адсорбции исследуемого материала на клеточном монослое. При использовании этого метода из флакона/пробирки удаляют ростовую среду, ополаскивают монослой стерильным ФСБ, вносят исследуемую пробу и инкубируют флакон при температуре 36 °С в течение 1 ч. Таким образом, создают лучшие условия для адсорбции вируса клетками, если он присутствует в пробе. После истечения срока инкубации в каждый флакон/пробирку вносят необходимое количество поддерживающей среды. Применение этого метода может способствовать выявлению вируса при его незначительных количествах в исследуемом материале, а также ускорить проявление ЦПЭ, по крайней мере, на 1 сутки. Следует иметь ввиду, что при использовании этого метода, в результате дополнительных открываний крышек, во много раз возрастает вероятность контаминации (перекрестной вирусной или бактериальной). Его рекомендуется проводить в ламинарном шкафу. Ввиду высокого риска контаминации этот метод не следует использовать для пассирования или инокуляции изолятов вирусов.

7. Идентификация цитопатических агентов, выделенных

Реакцию нейтрализации проводят в панелях для культуры клеток с плоским дном (микрометод). Микрометод позволяет экономить все компоненты, необходимые для постановки опыта, однако при недостаточном опыте возникает опасность перекрестной лабораторной контаминации.

Титрование вирусов, а также постановку реакции нейтрализации выполняют в соответствии с документом «Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита».

8. Выявление РНК кишечных вирусов (вируса гепатита А,

ротавирусов, энтеровирусов) методом полимеразной цепной

реакции с этапом обратной транскрипции

Организация и постановка полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) для выявления РНК энтеровирусов, ротавирусов и вируса гепатита А из концентратов проб воды поверхностных, подземных источников, питьевой и сточных вод может быть осуществлена в лабораториях, оснащенных необходимым оборудованием.

8.1. Меры предосторожности и правила работы при постановке полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции

Организацию работы в ПЦР-лаборатории осуществляют в соответствии с документом «Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции», утв. Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации 22 июня 1995 года.

8.1.1. Лабораторию разделяют на зоны (комнаты) для каждой из стадий ПЦР-диагностики.

Следует иметь не менее двух комнат:

— пре-ПЦР-помещение, где проводят обработку образцов из объектов окружающей среды (элюаты), выделение нуклеиновых кислот, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановку ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении). В этих помещениях не допускается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты и т.д.), ПЦР-диагностику которых проводят в данной лаборатории;

— пост-ПЦР-помещение, где проводят детекцию продуктов амплицификации. В пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории.

8.1.2. Помещение для детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) располагают как можно дальше от пре-ПЦР-помещений,

8.1.3. Работу в лаборатории организовывают в одном направлении: от пре-ПЦР-помещений к пост-ПЦР-помещению.

8.1.4. При исследовании материала, зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I — IV групп, работу проводят в соответствии с нормативно-методическими документами.

8.1.5. Используют одноразовую пластиковую посуду.

8.1.6. Работают в одноразовых перчатках.

8.1.7. Перчатки и халаты меняют при переходе из одной зоны в другую.

8.1.8. Поверхности столов, а также помещения, в которых проводят постановку ПЦР, до начала и после окончания работ обеззараживают ультрафиолетовым излучением.

8.1.9. Для работы в ПЦР-лаборатории допускается персонал, прошедший специальную подготовку.

8.2. Меры предосторожности и правила работы при постановке электрофореза

Реагент бромистый этидий является сильным мутагеном, поэтому все манипуляции проводят с использованием перчаток. Все реагенты, содержащие бромистый этидий, перед утилизацией подвергают специальной обработке.

Отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с плотно завинчивающейся крышкой. Добавляют 1 объем 0,5 М раствора калия перманганата и один объем 2,5 М соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4 — 6 ч. Добавляют один объем 2,5 М натрия гидроксида, аккуратно перемешивают. Сбрасывают нейтрализованные реактивы в канализацию.

8.3. Контроль полимеразной цепной реакции

Положительный (ПКО) и отрицательный (ОКО) контрольные образцы используют для контроля специфичности ПЦР. В качестве ПКО используют любой штамм энтеровирусов, ротавирусов и вируса гепатита А для выявления соответствующих возбудителей. В качестве ОКО используют стерильную воду, не содержащую вирусной РНК.

8.4. Выявление РНК ротавирусов и вируса гепатита А

Метод ОТ-ПЦР используют для выявления РНК вирусных агентов в исследуемых пробах воды. Исследованию подлежат элюаты проб питьевой воды, воды подземных водоисточников, речной и сточных вод. Для выделения РНК из концентратов проб питьевой воды и воды подземных водоисточников применяют метод афинной сорбции РНК на частицах силикагеля в соответствии с документом «Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции», утв. Госкомсанэпиднадзором 22 июня 1995 года (для выделения РНК рекомендуется использовать готовые комплекты, например, типа «Амплисенс» и др.).

Для выделения РНК из концентратов проб воды поверхностных водоисточников и сточных вод необходимо применять метод двустадийного выделения :

— сорбция РНК на частицы силикагеля.

Проводят в соответствии с методическими указаниями МУ 1.3.1888-04 «Организация работы при исследовании методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами 3 — 4 группы патогенности».

8.5. Постановка реакции обратной транскрипции, проведение полимеразной цепной реакции и электрофоретический анализ продуктов полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции-амплификации (ОТ-ПЦР-амплификации)

Рекомендуется использовать ПЦР-тест-системы на вирус гепатита А и ротавирусы с электрофорезом в агарозном геле (кат. N V4-50-R0,5; V4-50-R0,2; V15-50-R0,5; 15-50-R0,2), разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном законодательством порядке.

8.6. Обнаружение энтеровирусов методом полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) с использованием культуры ткани для выявления репликативной «минус» нити РНК энтеровирусов

Для подтверждения инфекционности выделенных энтеровирусов проводят первичное заражение элюатом культуры клеток, через двое суток после культивирования зараженных клеток проводят ОТ-ПЦР с культуральной жидкостью при наличии ЦПД или с лизатом клеток культур тканей при отсутствии ЦПД. Суть методики состоит в выявлении с помощью ПЦР негативной минус цепи («-» цепи) РНК энтеровирусов после их культивирования в культуре ткани. Негативная цепь является промежуточным продуктом репликации вируса, и ее обнаружение служит косвенным доказательством потенциальной инфекционности вируса.

8.6.1. Заражение культур клеток и их последующая обработка.

Маркируют пробирки (по 2 на каждую исследуемую пробу), вносят в каждую по 0,1 мл элюата и помещают в термостат (36,5 — 37,0 °С). Для контроля оставляют по несколько пробирок с незараженной культурой (со сменой и без смены среды).

Инкубируют зараженные клетки в течение 5 суток, микроскопируя их ежедневно для контроля начала цитопатического действия. При первых признаках деградации культуры (но не позднее 5-х суток) пробирки извлекают из термостата, удаляют из них культуральную среду и промывают физраствором (или раствором Хенкса). После промывки тщательно (пипеткой) удаляют из пробирок остатки промывной жидкости.

Перед началом процедуры выделения РНК пробирки с культурой ткани, освобожденной от промывной жидкости, трижды подвергают замораживанию при -20 °С и размораживанию при 37 °С, что обеспечивает выход энтеровирусов из клеток культуры, после чего переходят к выделению РНК.

Выделение РНК можно осуществлять с использованием стандартных наборов в соответствии с инструкцией производителя, например, типа «Рибозоль», «Рибосорб» и др. РНК можно хранить в течение 1 месяца в изопропаноле при -20 °С. Для длительного хранения к раствору РНК добавляют два объема 70% этанола и помещают для хранения в морозильную камеру (при -70 °С).

8.6.3. Обратная транскрипция.

8.6.3.1. Праймерные последовательности.

Праймерные последовательности можно синтезировать под заказ в организациях-производителях. Для постановки ИКК-ПЦР необходимо специально синтезировать 1 энтеровирусспецифический праймер, используемый на стадии обратной транскрипции (последовательность указана в табл. 3).

Праймеры, необходимые для проведения ПЦР, входят в состав готовой стандартной тест-системы.

8.6.3.2. Расчет рабочих концентраций праймеров.

Поставку праймеров производителем осуществляют в количествах, измеряющихся в оптических единицах (ОЕ) на мл. Для расчета рабочих концентраций праймеров необходимо перевести ОЕ в мкМ. Для праймера длиной А пар нуклеотидов (п.н.), поставляемом в количестве В ОЕ, пересчет осуществляют следующим образом:

— определяют молекулярную массу (ММ) одноцепочечной ДНК (оцДНК) по формуле:

ММ = 330 дальтон (ММ 1 п.н.) х А;

— определяют концентрацию праймера, исходя из того, что 1 ОЕ оцДНК соответствует концентрации 37 мкг/мл, соответственно В ОЕ соответствуют концентрации 37 х В мкг/мл;

— определяют концентрацию праймера С в мкМ:

С = (37 х В х 1000) / (330 х А) (мкМ).

Ряд организаций — производителей обратной транскриптазы в инструкциях по постановке реакции обратной транскрипции указывают не концентрацию праймеров в мкМ, а количество праймера, добавляемое в реакцию (в pmol). В этом случае пересчет ОЕ в pmol следует производить по формуле:

где D — количество праймера (в pmol), содержащееся в 1 мкл раствора.

8.6.3.3. Постановка реакции обратной транскрипции.

Для обратной транскрипции можно использовать готовые стандартные наборы реагентов, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке. В состав наборов входят буферный раствор и фермент — обратная транскриптаза (ревертаза) различного происхождения. Ингибитор РНКаз и смесь ДНТФ некоторые производители поставляют отдельно. Все компоненты реакционной смеси для обратной транскрипции можно приобретать по отдельности.

— в 0,2 мл (или 0,5 мл) пробирки вносят: 10,0 — 14,5 мкл РНК пробы, 10 — 20 pmol прямого праймера НП1;

— смесь аккуратно перемешивают, осаждают центрифугированием (5 с при 5000 об./мин. или с использованием вортекса) и помещают в термоциклер на 70 °С 10 мин.;

— по истечении времени нагревания пробирки достают и помещают на лед;

— в пробы добавляют: 5х или 10х буфер для обратной транскрипции (конечная концентрация — 1х), 1 мкл ДНТФ (100 — 200 мкМ), обратную транскриптазу (100 — 200 ед.), ингибитор РНКаз (20 ед.). Общий объем реакционной смеси составляет 20 мкл. Объем реакционной смеси при необходимости доводят с помощью свободной от РНКаз воды;

— смесь перемешивают, осаждают центрифугированием и выдерживают при комнатной температуре 10 — 15 мин.;

— пробирки помещают в термоциклер и выдерживают 50 мин. при 37 — 42 °С (время и температуру, необходимые для работы фермента, указывают в инструкции производителя).

После синтеза кДНК на РНК матрице пробы используют для ПЦР-амплификации.

8.6.3.4. Полимеразная цепная реакция.

Амплификацию полученной в реакции обратной транскрипции кДНК осуществляют с использованием тест-системы для амплификации участка кДНК энтеровирусов длиной 207 п.н. (кат. N V-16-100-R0,5 или кат. N V-16-100-R0,2) в соответствии с прилагаемой инструкцией.

8.6.4. Анализ амплифицированной ДНК, учет результатов.

Для анализа амплифицированной ДНК используют разные методы, наиболее простым из которых является гель-электрофорез. Для постановки электрофореза можно использовать комплект стандартных реагентов для электрофореза в агарозном геле (кат. N К5-200) в соответствии с инструкцией производителя.

Учет результатов проводят визуально с помощью трансиллюминатора. При этом агарозный гель либо достают из кюветы и помещают на стекло трансиллюминатора, либо используют емкости из УФ-проницаемых материалов.

При постановке ОТ-ПЦР для выявления в пробе «минус» цепи РНК энтеровирусов, положительные образцы должны содержать полосу ДНК размером 207 п.н. Размер полосы определяют по соотношению с положительным контролем и ДНК-маркером. Результаты можно документировать посредством фотографирования или видеосъемки геля с использованием ультрафиолетовых фильтров.

8.6.5. Интерпретация результатов, полученных с использованием культур тканей методом ОТ-ПЦР.

Выявление негативной РНК («минус» цепи РНК) энтеровирусов в пробе исследуемой воды с помощью ОТ-ПЦР зараженных культур клеток свидетельствует о присутствии в ней инфекционных энтеровирусов и интерпретируется как положительный результат молекулярного теста на инфекционность энтеровирусов.

9. Определение вирусных антигенов ротавирусов и вирусного

гепатита А в иммуноферментном анализе

Элюаты, полученные после концентрирования исследуемых объемов воды, анализируют методом иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к готовому стандартному диагностическому набору.

10. Библиографические данные

1. Закон Российской Федерации от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2. Закон Российской Федерации от 19 декабря 1991 г. N 96-ФЗ «Об охране окружающей среды».

3. Водный кодекс Российской Федерации от 16 ноября 1995 г. N 167-ФЗ.

4. «Положение о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека», утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 30 июня 2004 г. N 322.

5. СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод».

6. СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

7. СанПиН 2.1.4.1116-02 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества».

8. СанПиН 2.1.4.1175-02 «Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников».

9. СанПиН 2.1.2.1188-03 «Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества».

10. СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)».

11. МУ 2.1.5.800-99 «Организация госсанэпиднадзора за обеззараживанием сточных вод».

12. «Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции», утверждены Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации 22 июня 1995 года.

13. МУ 1.3.1888-04 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III — IV групп патогенности».

14. «Положение о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения». М., 1980.

15. ГОСТ 2761-84 «Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения».

16. Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита. М., 1998.

17. Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. Женева, 2003.

18. Инструкция по использованию полимеразной цепной реакции для выявления энтеровирусного загрязнения воды. Минск, 2001.

19. Методики по санитарно-вирусологическому контролю питьевой воды и оценке ее эпидемической безопасности от 18.05.99 N 136-9811, Минск.

20. Инструкция по осуществлению санитарно-вирусологического мониторинга питьевых вод в Республике Беларусь от 11.11.00 N 138-0010, Минск.

21. Boom R., C.J.A. Sol, M.M. Salimans, C.L. Jansen, P.M.E. Wertheimvan Dillen, and J. Van der Noordaa. 1990. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. J. Clin. Microbiol. 28:495-503.

22. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Eds. J. Sambrook, P. MacCallum D. Russell. CSHL Press, London: 2001, 2344 p.

БОЕ — бляшкообразующая единица;

ВГА Аг — антиген вируса гепатита А;

ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения;

ИФА — иммуноферментный анализ;

МПС — макропористое стекло;

ОКВИ — острые кишечные вирусные инфекции;

ПЦР — полимеразная цепная реакция;

ОТ-ПЦР — полимеразная цепная реакция с этапом обратной транскрипции;

РН — реакция нейтрализации;

РНК — рибонуклеиновая кислота;

Рота Аг — ротавирусные антигены;

ТЦД 50/мл — тканевая цитопатическая доза вируса, вызывающая ЦПЭ в 50% зараженных клеточных культур;

ЦПА — цитопатический агент;

ЦПЭ — цитопатический эффект;

BGM — перевиваемые клетки почки африканской зеленой мартышки;

Нер-2 — перевиваемые клетки карциномы гортани человека;

RD — перевиваемые клетки рабдомиосаркомы человека;

L20B — перевиваемая мышиная линия L-клеток, в которую экспрессированы человеческие рецепторы к полиовирусу.

Судебная практика и законодательство — «МУК 4.2.2029-05. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Санитарно-вирусологический контроль водных объектов. Методические указания» (утв. Роспотребнадзором 18.11.2005)

Отбор проб из водных источников и их транспортирование проводят в соответствии с МУ 4.2.2029-05 «Санитарно-вирусологический контроль водных объектов».

Применение молекулярно-генетических методов исследования, а также сбор, упаковка, хранение и транспортирование биологического материала и образцов объектов окружающей среды (ООС) при обследовании очагов острых кишечных инфекций с групповой заболеваемостью различной этиологии регламентированы МУК 4.2.2746-10 «Порядок применения молекулярно-генетических методов при обследовании очагов острых кишечных инфекций с групповой заболеваемостью».

17. МУК 4.2.2029-05 «Санитарно-вирусологический контроль водных объектов».

18. МУК 4.3.2030-05 «Санитарно-вирусологический контроль эффективности обеззараживания питьевых и сточных вод УФ-облучением».

19. МУК 4.2.1018-01 «Санитарно-микробиологический анализ» питьевой воды».

20. МУ 2.1.5.800-99 «Организация госсаэпиднадзора за обеззараживанием сточных вод».

источник