Меню Рубрики

Микробиологические методы анализа исследование воды

Цель занятия.Ознакомить студентов с основными методами и показателями, необходимыми для санитарно-микробиологической оценки объектов внешней среды.

Оборудование и материалы. Прибор для подсчета колоний, колбы с пробами воды, бактериологические пробирки с 9 мл воды, пробирки с 10 мл расплавленного агара, мерные стериль­ные пипетки на 2 мл, стерильные чашки Петри, чашки Петри с МПА, чашки Петри с кровяным МПА, навески почвы, стериль­ная водопроводная вода в колбе — 270 мл, пробирки со средой Кесслера, Вильсона—Блера.

Для оценки санитарно-гигиенического состояния объектов окружающей среды проводят санитарно-бактериологические ис­следования, цель которых состоит в определении эпизоотологической и эпидемиологической безопасности. Показателем небла­гополучия служит выявление патогенных микроорганизмов. Од­нако прямое их обнаружение связано с большими трудностями, и прежде всего с низкой концентрацией данных микробов, кото­рые в основном не могут размножаться в воде, воздухе и почве. Поэтому в санитарно-микробиологической практике используют косвенные методы, направленные на определение микробной обсемененности объекта и обнаружение в нем так называемых санитарно-показательных бактерий. О бактериальной обсеме­ненности судят по микробному числу — общему коли­честву микроорганизмов, содержащихся в единице объема или массы (1 мл воды, 1 г почвы, 1 м 3 воздуха).

Содержание санитарно-показательных бактерий определяют по двум показателям: титру и индексу. Титром называют минимальный объем или массу, в которых выявляют данные бактерии, индексом — количество санитарно-показательных бактерий, содержащихся в соответствующем количестве среды.

К санитарно-показательным бактериям относят представи­телей облигатной микрофлоры организма человека и тепло­кровных животных, для которых среда обитания — кишечник или воздушно-дыхательные пути. Они характеризуются следую­щими свойствами: 1) постоянно выделяются с калом или ка­пельками слизи из воздушно-дыхательных путей; 2) не имеют других мест обитания; 3) способны сохраняться в окружающей среде то же время, что и патогенные бактерии, паразитирующие в кишечнике или воздушно-дыхательных путях; 4) не способны интенсивно размножаться вне организма хозяина и изменять свои свойства.

Перечисленные признаки присущи бактериям, признанным санитарно-показательными для различных объектов окружаю­щей среды.

Санитарно-показательные бактерии группы кишечных пало­чек принадлежат к различным родам семейства энтеробактерий.

Обнаружение кишечной палочки в разных объектах окружаю­щей среды считают наиболее достоверным признаком свежего фекального загрязнения. Наличие в этих же объектах бактерий родов Citrobacter и Enterobacter указывает на относительно давнее фекальное загрязнение.

Присутствие С. perfringens, С. sporogenes и других клостридий в почве свидетельствует о ее фекальном загрязнении, причем как свежем, так и давнем, поскольку эти бактерии образуют споры, что позволяет им длительно переживать в окружающей среде (в частности, в почве).

Обнаружение в объектах окружающей среды Streptococcus faecalis также свидетельствует об их фекальном загрязнении. Рез­кое увеличение количества этих бактерий в саморазогревающем­ся навозе и компостах может свидетельствовать о загрязнении почвы разлагающимися отбросами.

Гемолитические стрептококки, будучи облигатными обитате­лями носоглотки и зева, выделяются с капельками слизи ораль­но-капельным путем. Сроки выживания гемолитических стреп­тококков в окружающей среде практически не отличаются от сроков, характерных для большинства других возбудителей воз­душно-капельных инфекций. Обнаружение гемолитических стрептококков в воздухе помещений указывает на возможное его загрязнение микроорганизмами, содержащимися в зеве, носо­глотке, верхних дыхательных путях и вызывающими инфекции, передаваемые воздушно-капельным путем.

Staphylococcus aureus — также факультативный обитатель но­соглотки и зева. Его присутствие в воздухе помещений служит показателем орально-капельного загрязнения.

Одновременное обнаружение золотистого стафилококка и ге­молитических стрептококков свидетельствует о высокой степени загрязнения воздуха.

Санитарно-микробиологическое исследование воды. Вода — ес­тественная среда обитания микробов, которые в большом коли­честве поступают из почвы, воздуха, с отбросами, стоками. Осо­бенно много микроорганизмов в открытых водоемах и реках. Кроме сапрофитов в воде могут находиться возбудители инфек­ций животных и человека.

При контроле санитарного состояния воды исследованию подлежат: вода централизованного водоснабжения, колодцев, открытых водоемов (реки, озера), плавательных бассейнов, сточ­ные жидкости.

Отбор проб воды. Из открытых водоемов пробы воды отбира­ют с глубины 10. 15 см от поверхности и на расстоянии 10. 15 см от дна. Водопроводную воду набирают в стерильные флаконы объемом 0,5 л с притертой пробкой. Предварительно кран обжи­гают и спускают воду в течение 10. 15 мин. Хлорированную воду перед исследованием нейтрализуют тиосульфатом натрия из рас­чета 10 мл на 1л воды. Бактериологическое исследование проб воды следует проводить в течение двух часов после отбора или шести часов при температуре хранения 1. 5°С.

Определение микробного числа воды. Водопроводную воду засе­вают в количестве 1мл, воду открытых водоемов — по 1,0; 0,1; 0,01 мл. Все пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10. 12 мл расплавленного и охлажденного до 40. 45 °С питательного агара, который тщательно перемешивают с водой. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 1. 2сут. Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при 37 ºС в течение суток, другую — 2 сут при 20 °С. Затем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глубине колоний и вычисляют микробное число воды — количество микроорганизмов в 1 мл.

Определение коли-титра и коли-индекса воды. Минимальное количество воды в мл, в котором обнаруживают бактерии группы кишечных палочек (БГКП), называют коли-титром воды, количество БГКП, содержащихся в 1л исследуемой воды, называют кол и-и ндексом воды. Коли-титр и коли-индекс воды определяют титрационным (бродильным) ме­тодом или методом мембранных фильтров.

Титрационный метод. В глюкозо-пептонную среду (1%-я пептонная вода, 0,5%-й раствор хлорида натрия, 0,5%-й раствор глюкозы, индикатор Андреде и поплавок) проводят посевы различных объемов воды.

Воду открытых водоемов исследуют в объемах 100; 10; 1 и 0,1 мл. Для анализа водопроводной воды делают посевы трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток. О брожении судят по образованию пузырьков газа в поплавке. Из забродивших или помутневших проб делают посевы на среду Эндо. Из выросших колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, с помощью которого дифференцируют бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бак­терий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. С этой целью 2. 3 изоли­рованные колонии наносят «штрихом» на фильтровальную бума­гу, смоченную диметил-n-фенилендиамином. При отрицатель­ном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положительном она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин. Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, вновь ис­следуют в бродильном тесте — вносят в полужидкий питатель­ный агар с 0,5 % глюкозы и инкубируют при 37 °С в течение су­ток. При положительном результате определяют коли-титр и коли-индекс по статистической таблице.

Метод мембранных фильтров. Определенный объем воды про­пускают под давлением через мембранный фильтр № 3, предва­рительно стерилизованный кипячением в дистиллированной воде. Водопроводную воду и воду артезианских скважин фильт­руют в объеме 333 мл. Чистую воду открытых водоемов фильтру­ют в объеме 100, 10, 1 и 0,1 мл, более загрязненную воду перед фильтрованием разводят стерильной водой. Фильтры накладыва­ют на агар Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 °С в течение суток подсчитывают количество выросших красных колоний. Из двух-трех колоний делают мазки, окрашивают их по Граму и ставят оксидазный тест. Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, принадлежат к БГКП. По существующим нормативам (ГОСТ 2874—82) питьевую воду считают качествен­ной, если ее коли-индекс не более 3, а микробное число — не бо­лее 100.

Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения воды служит количество S.faecalis. Для определе­ния его титра цельную воду и ее 10-кратные разведения засева­ют в жидкую элективную среду (щелочная полимиксиновая сре­да). После инкубирования при 37 ºС в течение двух суток, а за­тем еще через сутки и двое суток делают высевы на плотные элективные среды. Фекальные стрептококки идентифицируют по морфологическим, культуральным и тинкториальным свой­ствам.

Есть данные о корреляции между содержанием в воде фекаль­ных кишечных палочек и фагами бактерий группы кишечных па­лочек. Поэтому определение данных фагов служит косвенным показателем возможного присутствия кишечных палочек в ис­следуемой пробе воды.

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха. Мик­рофлора воздуха зависит от микрофлоры почвы и воды. Воз­дух — неблагоприятная среда для обитания микроорганизмов из-за отсутствия питательных веществ, действия солнечных лучей, высушивания. Наряду с сапрофитами в воздухе могут находиться патогенные бактерии, споры грибов родов Aspergillus, Mucor и др.

Санитарную оценку воздуха осуществляют по двум показате­лям: 1) определение микробного числа воздуха; 2) определение количества санитарно-показательных бактерий — гемолитичес­ких стрептококков и стафилококков.

Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), ас­пирации или фильтрации.

Седиментационный метод осаждения Коха. Чашки Петри с МПА оставляют открытыми на 5. 10 мин. Для определения са­нитарно-показательных бактерий берут чашки Петри с кровя­ным МПА и время экспозиции увеличивают до 40 мин. Чашки выдерживают при 37 °С и комнатной температуре 24 ч и подсчи­тывают выросшие колонии.

Микробное число воздуха (общее количество бактерий в 1 м3) определяют по формуле Омелянского

Х= а * 100 * 1000 * 5 / (b * 10 * T),

где X— количество микробов в 1 м 3 (1000 л) воздуха; а — количество выросших ко­лоний в чашках; b — площадь чашки; Т— время, в течение которого чашка была открыта; 5 — время по правилу Омелянского; 10 — объем воздуха в литрах. (Прави­ло Омелянского предусматривает, что на поверхности агара в чашке Петри площа­дью 100 см 3 за 5 мин из воздуха оседает такое количество микробов, которое нахо­дится в его 10 л.)

Прямое обнаружение патогенных микробов воздуха проводят только при специальных показаниях.

Аспирационный метод. Более точный количественный способ определения микробного числа воздуха, так как посев микроор­ганизмов из воздуха производят с помощью приборов. При использовании аппарата Кротова воздух с заданной скоростью за­сасывается через щель плексигласовой пластины и ударяется о поверхность питательной среды открытой чашки Петри, находя­щейся на вращающейся подставке, благодаря чему происходит равномерный посев бактерий из воздуха на поверхность МПА (при определении микробного числа) или кровяного МПА (при выделении гемолитических стафилококков и стрептококков). После инкубации в термостате в течение двух суток подсчитыва­ют количество выросших колоний и определяют микробное чис­ло воздуха. При исследовании воздуха могут быть использованы и другие приборы (Дьякова, Киктенко, ПАБ-1 — прибор аэро­зольный бактериологический и ПОВ-1 — прибор для отбора воз­духа). В практику входят ускоренные методы индикации микро­флоры воздуха с помощью мембранных фильтров, каскадных им-пакторов, фильтров Петрякова и др.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы. Анализ почвы включает в себя определение микробного числа, коли-тит-ра, перфрингенс-титра и титра термофильных бактерий. По эпи­демиологическим признакам проводят определение в почве па­тогенных микроорганизмов: сальмонелл, шигелл, возбудителей столбняка, ботулизма, злокачественного отека, сибирской язвы. Бактериологический анализ почвы нужен при выборе террито­рии под пастбище, ферму, хозяйственные постройки, детские сады, больницы и др.

Предварительно делают отбор проб почвы. На обследуемой территории площадью до 1000 м 3 выделяют два участка по 25 м 3 (один — вблизи источника загрязнения, другой — в отдалении от него), берут пробы из 5 точек (4 — по углам участка, 1 — в цент­ре) на глубине 10. 20 см стерильным совком (из более глубоких мест — с помощью специального бура Некрасова или Френкеля). Пробы почвы по 200. 300 г отбирают в широкогорлые стеклян­ные банки с ватными пробками (можно все взятые с одного уча­стка пробы перемешать и на исследование направить 1 кг). На банки наклеивают этикетки, отправляют с нарочным и сопрово­дительным письмом. Пробы почвы полагается исследовать сразу же или в течение 6. 18 ч, сохраняя их при температуре не выше 1. 5ºС.

В лаборатории почву измельчают, освобождают от камней, ос­колков стекол, корней растений, просеивают через сито, тща­тельно перемешивают и отвешивают 30 г. В колбу на 500 мл наливают 270 мл стерильной водопроводной воды и вносят в нее отвешенную пробу почвы, все интенсивно встряхивают 10 мин, не давая отстояться частицам суспензии, готовят серию десятикратных последовательных разведений. Для относительно чис­тых почв достаточно 4 степени разведения, для загрязненных — 6. 9 разведений. В штатив ставят нумерованные пробирки с 9 мл стерильной воды в каждой. В первую вносят 1 мл суспензии про­бы почвы, смешивают, затем 1 мл из первой пробирки вносят во вторую, смешивают, из нее — 1 мл в третью и т. д. В результате в пробирке № 1 получается разведение 1 : 100, № 2 — 1 : 1000 и т.д. Подготовленные таким образом пробы почвы исследуют.

Определение общего микробного числа. Из последних 3. 4 про­бирок с разведенной суспензией отдельными стерильными пи­петками вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри (каждое раз­ведение в отдельности). В каждую чашку добавляют еще по 10. 15 мл расплавленного и охлажденного до 45 ºС МПА. Равно­мерными осторожными круговыми движениями содержимое ча­шек перемешивают, оставляют на столе для уплотнения (затвердения) агара. С застывшей средой чашки перевертывают вверх дном, надписывают и помещают в термостат для культивирова­ния на 24. 48 ч при 37 °С. Выросшие колонии подсчитывают в каждой чашке, умножают на степень разведения, полученные числа суммируют и вычисляют среднеарифметическое число, что составит количество микробов, содержащихся в 1 г почвы.

Определение коли-титра, перфрингенс-титра и титра термо­фильных бактерий почвы. Для определения коли-титра почвы раз­личные разведения почвенной взвеси засевают по 1 мл в пробир­ки со средой Кесслера (на 1л дистиллированной воды — 10г пептона, 50 мл бычьей желчи — 2,5 г лактозы, 4 мл 1%-го водного раствора генцианвиолета) и инкубируют при 43 ºС в течение 48 ч. В дальнейшем исследования проводят по схеме, применяемой при определении коли-титра воды. Наибольшее разведение поч­венной суспензии, в котором отмечена ферментация лактозы (газообразование), соответствует коли-титру почвы. Для опреде­ления перфрингенс-титра почвы различные разведения почвен­ной суспензии по 1 мл засевают в пробирки со стерильным обез­жиренным молоком или железосульфитной средой Вильсона— Блера, приготовленной ex tempore. Посевы инкубируют при 43 °С в течение 24. 48 ч, после чего учитывают результаты по сверты­ванию молока или по образованию черных колоний С. perfringens в агаровом столбике среды Вильсона—Блера. Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют и вычисляют перфрингенс-титр, который соответствует наибольшему разведе­нию почвы, вызвавшему почернение и разрыв среды Вильсона— Блера в первые 12 ч роста.

Читайте также:  Стандартный анализ воды из скважины

Для определения титра термофильных бактерий разведения почвенной суспензии по 1 мл вносят в чашки Петри, заливают расплавленным и охлажденным агаром. Посевы инкубируют в течение суток при 60 ºС, а затем подсчитывают количество вы­росших колоний и пересчитывают на 1 г почвы.

Санитарно-микробиологическую оценку почвы проводят по комплексу показателей, из которых наиболее важный ление степени фекального загрязнения.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Определить микробное загрязнение воздуха.

2. Провести исследование воды с целью установления мик­робного числа и коли-титра.

3. Определить микробное число и перфрингенс-титр почвы.

1. Что такое санитарно-показательные микроорганизмы?

2. Как определяют коли-титр воды?

3. Как определяют микробное число почвы?

4. Как определяют перфрингенс-титр почвы?

5. Какие методы применяют для определения микробного числа воздуха?

6. Что такое санитарно-показательные микробы воздуха и как их определяют?

источник

Несоответствие воды микробиологическим нормам, так же как и химическим, делает ее непригодной для питья. Если Ваш источник водоснабжения не защищен от прямого воздействия окружающей среды или коммунальные системы устарели или давно не чистились, то сделать микробиологический анализ воды просто необходимо. От этого зависит Ваше здоровье и безопасность! Особенно это важно для тех, кто пользуется колодцем. Колодезная вода – грунтовая, она на прямую контактирует с почвами, а значит, грозит «напоить» Вас и нитратами, и тяжелыми металлами, и аммиаком, и, конечно, вредными органическими веществами, которые попадают в почву в результате деятельности сельскохозяйственных ферм или угодий.

В таблице 1 представлены микробиологические показатели действующего норматива СанПиН 2.1.4.1074-01 для питьевой воды:

Таблица 1. Микробиологические нормативы для питьевой воды

Показатель Норматив СанПиН 2.1.4.1074-01
Общая микробная численность Не более 50 КОЕ в 1 мл
Общие колиформные бактерии Отсутствие в 100 мл
Термотолерантные колиформные бактерии Отсутствие в 100 мл
Колифаги Отсутствие в 100 мл
Споры сульфитредуцирующих бактерий Отсутствие в 20 мл

Стандартный микробиологический анализ питьевой воды в МГУ включает определение трех показателей: общего микробного числа, количества общих колиформных и термотолерантных колиформных бактерий.

Расширенный микробиологический анализ воды включает анализ пяти показателей: общего микробного числа, количества общих колиформных бактерий, количества термотолерантных колиформных бактерий, титр колифагов и содержание спор сульфитредуцирующих бактерий.

Часто на наших участках или поблизости имеются водоемы, где мы и наши дети с удовольствием любим провести время. Конечно, вода в данных водоемах не является питьевой, но ее безопасность для человека также, как и питьевая, регламентируется. В таблице 2 представлены микробиологические показатели действующего норматива по гигиеническим требованиям к охране поверхностных вод (СанПиН 2.1.5.980-00)

Таблица 2. Микробиологические нормативы для рекреационного водопользования, а также в черте населенных мест

Показатель Норматив СанПиН 2.1.5.980-00
Общие колиформные бактерии Не более 500 КОЕ в 100 мл
Термотолерантные колиформные бактерии Не более 100 КОЕ в 100 мл
Колифаги Не более 100 БОЕ в 100 мл
Возбудители кишечных инфекций (анализ бактерий из сем. Enterobacteriaceae рода Salmonella) Вода не должна содержать возбудителей кишечных инфекций (полное отсутствие в 1000 мл)

Микробиологический анализ воды, предназначенной не для питья, включает определение количества двух показателей: общих колиформных и колиформных термотолерантных бактерий.

Помимо двух основных показателей мы предлагаем провести дополнительный анализ на содержание: колифагов, условно-патогенных дрожжей и микромицетов (частых спутников опортунистических заболеваний) и индекса самоочищения водоёма.

При значительном превышении нормативов СанПиН 2.1.5.980-00, а также возможном фекальном загрязнении водоёма, мы предлагаем провести анализ на наличие возбудителей кишечных инфекций (род Salmonella и Enterococcus).

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза. Данный индикатор выявляет потенциальных бактерий, способных причинить вред здоровью человека.

Общие колиформные бактерии (ОКБ) – грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (37+1) °С в течение (24-48) часов. Многие представители данной группы являются микроорганизмами нормальной микрофлоры желудка, поэтому превышение данной группы микроорганизмов может говорить о возможно антропогенном (в том числе и фекальном) загрязнении воды.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (44±0,5) °С в течение 24 часов. Также, как и ОКБ являются индикаторной группой, однако более устойчивые в окружающей среде: вот почему обнаружение данной группы микроорганизмов в воде может говорить об однозначном загрязнении ее продуктами жизнедеятельности человека.

Колифаги, определяемые стандартным методом (МУК 4.2.1018-01), являются вирусами кишечной палочки (Escherichia coli) и рассматриваются эпидемиологами как дополнительный, а порой и более чувствительный, метод в определении загрязнения воды микроорганизмами группы кишечной палочки. Вирусные частицы, и в частности колифаги, более устойчивы к окружающей среде, чем их бактерии-хозяева. В связи с этим, наличие колифагов может служить достоверной меткой о более давнем фекальном загрязнении источника воды. Показана прямая корреляция между содержанием колифагов в воде и опасных для человека энтеровирусов, поэтому наличие колифагов в воде может говорить о вирусном заражении источника. Действующий нормативный документ (СанПиН 2.1.4.1074-01) подразумевает отсутствие колифагов в 100 мл воды.

Сульфитредуцирующие клостридии – спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, являющиеся дополнительным микробиологическим показателем фекального загрязнения водоема. В отличие от относительно неустойчивых колиформных и термотолерантных колиформных бактерий, споры клостридий могут сохраняться в водоемах долгое время. Клостридии встречаются в кишечнике человека и домашних животных, однако, при попадании с водой в большом количестве могут вызвать пищевые отравления. К сульфитредуцирующим клостридиям относятся в том числе и опасные для человека клостридии (Clostridiumbotulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani), вызывающие тяжелейшие заболевания. Согласно действующему нормативу (СанПиН 2.1.4.1074-01) споры клостридий должны отсутствовать в 20 мл воды.

К условно-патогенным дрожжам и микромицетам (плесени) относят большую неоднородную группу грибных организмов, способных сапротрофно расти при 37 °С. В нее входят такие представители, как Candida albicans и Cryptococcus neoformans, которые являются частым фактором оппортунистических заболеваний человека, вызывая кандидозы (грибковые заболевания кожи), молочницы и проч. Другие организмы микромицеты (Cladosporium cladosporioides, Aspergillusniger) могут являться активными сенсебилизаторами аллергических реакций, а иногда и самими аллергенами. В РФ не нормируется вода по плесеням и дрожжевым организмам в воде.

Общее число микроорганизмов не нормируется в воде водоемов в зонах рекреаций, поскольку уровень этой группы микроорганизмов в большей мере зависит от природных особенностей каждого объекта, времени года и т.п.

Однако при выборе нового источника водоснабжения или места рекреации в воде водоёмов дополнительно следует определять общую микробную численность, вырастающую:

  • при температуре 37 °С в течение 24 часов;
  • при температуре 22 °С в течение 72 часов.
  1. ОМЧ при 37 °С представлена большей частью алохтонной микрофлорой (внесенную в водоем в результате антропогенного загрязнения, в том числе фекального);
  2. ОМЧ при 20-22 °С представлена, помимо алохтонной, аборигенной микрофлорой (естественной, свойственной для данного водоёма).

Соотношение численности этих групп микроорганизмов позволяет судить об интенсивности процесса самоочищения. При завершении процесса самоочищения коэффициент ОМЧ 22 °С/ ОМЧ 37 °С. В местах загрязнения хозяйственно-бытовыми сточными водами численные значения обеих групп близки.

Показатель позволяет получить дополнительную информацию о санитарном состоянии водоемов, источниках загрязнения, процессах самоочищения.

источник

Микроорганизмы – мельчайшие, главным образом одноклеточные существа, широко распространенные в природе. Они обнаруживаются во всех средах (воздухе, почве, воде), в организме человека и животных, в растениях.

Качественное разнообразие и количество микроорганизмов зависят в первую очередь от питательных соединений. Однако немаловажное значение имеют также влажность, температурный режим, аэрация, действие солнечных лучей и прочие факторы.

Методы санитарно-микробиологического исследования природных сред позволяют выявить наличие патогенных микроорганизмов, определить их количество и, в соответствии с полученными результатами, выработать меры по устранению или предупреждению инфекционных заболеваний. Кроме того, количественный учет необходим для моделирования экосистем и разработке принципов управления естественными процессами. Рассмотрим далее, какими бывают методы микробиологического исследования .

Она рассматривается учеными как один из возможных путей передачи инфекционных патологий. С выделениями больных людей или животных в почву проникают патогенные микроорганизмы. Некоторые из них, в частности, споровые, способны сохраняться в грунте продолжительное время (иногда несколько десятков лет). В почву попадают возбудители таких опасных инфекций, как столбняк, сибирская язва, ботулизм и пр. Методы санитарно-микробиологического исследования почвы позволяют определить «микробное число» (кол-во микроорганизмов в грамме грунта), а также коли-индекс (количество кишечных палочек).

К методам микробиологического исследования почвы следует в первую очередь отнести прямое микроскопирование и посев на плотную питательную среду. Популяции микроорганизмов и их группы, населяющие грунт, различаются по таксономическому положению и экологическим функциям. В науке они объединены под общим термином «почвенная биота». Грунт – среда обитания огромного числа микроорганизмов. В грамме почвы присутствует от 1 до 10 млрд их клеток. В этой среде активно протекает разложение органических веществ при участии разнообразных сапрофитных микроорганизмов.

Анализ среды начинается с отбора образцов. Для этого используют предварительно очищенный и протертый спиртом нож (можно использовать лопату). После этого осуществляется подготовка образца. Следующий этап – подсчет клеток на окрашенных мазках. Рассмотрим каждую стадию в отдельности.

При анализе пахотной почвы, как правило, пробы берут с глубины всего слоя. Сначала удаляется 2-3 см сверху грунта, так как в нем может присутствовать посторонняя микрофлора. После этого с изучаемого участка грунта берут монолиты. Длина каждого из них должна соответствовать толщине слоя, из которого нужно взять образец.

На участке в 100-200 кв. м отбирается 7-10 проб. Вес каждой – порядка 0.5 кг. Пробы необходимо тщательно перемешать в мешке. После этого берут средний образец, весом приблизительно 1 кг. Его следует поместить в пергаментный (стерильный) пакет, вложенный в тканевый мешок. До непосредственного анализа образец хранится в холодильнике.

Перемешанная почва высыпается на сухое стекло. Предварительно его необходимо протереть спиртом и обжечь над горелкой. При помощи шпателя почва тщательно перемешивается и раскладывается ровным слоем. В обязательном порядке необходимо удалить корешки, прочие посторонние элементы. Для этого используется пинцет. Перед работой пинцет и шпатель прокаливают над горелкой и остужают.

Из различных участков почвы, распределенной по стеклу, отбираются небольшие порции. Их взвешивают в фарфоровой чашке на технических весах. Обязательным этапом микроскопического метода микробиологического исследования является специальная обработка образца. Заранее необходимо подготовить 2 стерильные колбы. Их емкость не должна превышать 250 мл. В одну из колб наливают 100 мл водопроводной воды. Из нее берут 0.4-0.8 мл жидкости и увлажняют навеску почвы до пастообразного состояния. Смесь необходимо растереть пальцем или резиновым пестиком в течение 5 мин.

Водой из первой колбы почвенную массу переносят в пустую колбу. Далее ее снова растирают. После этого масса переносится в колбу возле пламени горелки. Емкость с почвенной суспензией встряхивают на качалке на протяжении 5 мин. После этого ее оставляют отстаиваться около 30 с. Это необходимо для того, чтобы крупные частицы осели. Через полминуты массу используют для приготовления препарата.

Прямое микроскопическое изучение грунта осуществляется по методу микробиологического исследования , разработанному Виноградским. В определенном объеме приготовленной суспензии подсчитывается число клеток микроорганизмов. Изучение фиксированных мазков позволяет сохранять препараты в течение длительного срока и выполнять подсчеты в любое удобное время.

Приготовление препарата осуществляется следующим образом. Определенный объем суспензии (как правило, 0.02-0.05 мл) наносится с помощью микропипетки на предметное стекло. К нему добавляют каплю раствора агар-агара (смеси полисахаридов агаропектина и агарозы, извлеченных из бурых и красных водорослей Черного моря), быстро перемешивают и распределяют на площади 4-6 кв. см. Мазок высушивается на воздухе и фиксируется 20-30 мин. спиртом (96 %). Далее препарат увлажняют дистиллированной водой, помещают в р-р карболового эритрозина на 20-30 мин.

После окрашивания его промывают и высушивают на воздухе. Подсчет клеток осуществляется с иммерсионным объективом.

Микроскопические методы микробиологического исследования позволяют выявить большое количество микроорганизмов. Но, несмотря на это, метод посева считается наиболее распространенным в практике. Суть его состоит в высеве объема препарата (почвенной суспензии) в чашке Петри на плотную среду.

Этот метод микробиологического исследования позволяет учитывать не только количество, но и групповой, а в ряде случаев и видовой состав микроскопической флоры. Подсчет числа колоний производится, как правило, со дна чашки Петри в проходящем свете. На подсчитанном участке ставится точка маркером либо чернилами.

Микрофлора водного объекта, как правило, отражает микробный состав почвы около него. В этой связи методы санитарно-микробиологического исследования воды и почвы имеют особое практическое значение при изучении состояния конкретной экосистемы. В пресных водоемах содержатся, как правило, кокки, палочковидные бактерии.

Анаэробы в воде обнаруживаются в малом количестве. Как правило, они размножаются на дне водоемов, в иле, принимая участие в процессах очищения. Микрофлора океанов и морей представлена преимущественно солелюбивыми (галофильными) бактериями.

В воде артезианских скважин микроорганизмов практически нет. Это обуславливается фильтрующей способностью почвенного слоя.

Общепринятыми методами микробиологического исследования воды считаются определение микробного числа и коли-титра либо коли-индекса. Первый показатель характеризует количество бактерий в 1 мл жидкости. Коли-индекс представляет собой количество кишечных палочек, присутствующих в литре воды, а коли-титр – минимальное количество или максимальное разведение жидкости, в котором их еще можно обнаружить.

Этот метод санитарно микробиологического исследования воды состоит в следующем. В 1 мл воды определяют количество факультативных анаэробов и мезофильных (промежуточных) аэробов, способных на мясопептонном агаре (основной питательной среде) при 37 град. на протяжении суток формировать колонии, видимые при увеличении в 2-5 р. или невооруженным глазом.

Ключевой стадией рассматриваемого метода микробиологического исследования воды является посев. Из каждой пробы делается посев не менее 2-х разных объемов. При анализе водопроводной воды в каждую чашку вносят по 1-0.1 мл чистой жидкости и по 0.01-0.001 мл загрязненной. Для посева 0.1 мл или меньшего объема жидкость разводится дистиллированной (стерильной) водой. Последовательно готовят десятикратные разведения. По 1 мл от каждого из них вносят в две чашки Петри.

Читайте также:  Срочный анализ воды московская область

Разведения заливаются питательным агаром. Его необходимо предварительно растопить и остудить до 45 град. После активного перемешивания среду оставляют на горизонтальной поверхности для застывания. При 37 град. посевы выращивают на протяжении суток. Рассматриваемый метод микробиологического исследования воды позволяет учитывать результаты на тех чашках, где количество колоний находится в пределах от 30 до 300.

Он считается транзитной средой для микроорганизмов. Основными методами микробиологического исследования воздуха являются седиментация (оседание) и аспирация.

Микрофлора воздушной среды условно разделяется на переменную и постоянную. К первой относятся дрожжи, пигментообразующие кокки, спороносные бациллы, палочки и прочие микроорганизмы, устойчивые к высыханию, воздействию света. Представители переменной микрофлоры, проникая в воздух из привычной для них среды обитания, недолго сохраняют свою жизнеспособность.

В воздухе крупных мегаполисов микроорганизмов намного больше, чем в воздушной среде сельской местности. Над морями, лесами бактерий очень мало. Очищению воздуха способствуют осадки: снег и дождь. В закрытых помещениях микробов намного больше, чем на открытых пространствах. Их количество повышается в зимний период при отсутствии регулярного проветривания.

Этот метод микробиологического исследования в микробиологии считается простейшим. Он основывается на оседании капель и частиц на поверхности агара в открытой чашке Петри под действием силы тяжести. Метод седиментации не позволяет точно определить число бактерий в воздухе. Дело в том, что на открытой чашке уловить мелкие фракции пылевых частиц и бактериальных капель довольно сложно. На поверхности задерживаются преимущественно крупные частицы.

Этот метод не используется при анализе атмосферного воздуха. Этой среде свойственны большие колебания скорости движения воздушных потоков. Седиментация, однако, может использоваться при отсутствии более совершенных приборов или источника электроэнергии.

Определение микробного числа осуществляется по методу Омелянского. В соответствии с ним, за 5 минут на поверхности агара площадью 100 кв. см оседает такое число бактерий, которое присутствует в 10 л воздуха.

Бактериологический анализ занимает важнейшее место в комплексе клинико-лабораторных мероприятий, направленных на диагностику, профилактику и лечение разнообразных инфекционных заболеваний. Однако исследованием окружающей среды они не ограничиваются.

Особое значение имеет бактериологический анализ биологического материала в лечебных учреждениях. К исследованиям, проводимым в медучреждениях, предъявляются повышенные требования. Целью Приказа «Об унификации микробиологических методов исследования» является совершенствование бактериологического анализа, повышение качества и эффективности микробиологической диагностики.

Оно является ключевым методом анализа при диагностике инфекций, передающихся половым путем, и оппортунистических заболеваний (вызываемых условно-патогенными бактериями).

Микроскопический анализ позволяет оценить качественный и количественный состав микрофлоры, проверить правильность взятия пробы. К примеру, наличие вагинального эпителия в мазке, взятом из цервикального канала, указывает на нарушение правил отбора биологической пробы.

Стоит сказать, что микробиологическое обследование в данном случае вообще сопровождается определенными проблемами. Они связаны с тем, что в нижних отделах полового тракта в норме присутствует разнообразная микрофлора, изменяющаяся в различные возрастные периоды. Для повышения эффективности исследования и были разработаны унифицированные правила.

Она осуществляется методами выявления РНК и ДНК-возбудителей. Они базируются преимущественно на определении нуклеотидных последовательностей в патологическом материале. Для этого используются молекулярные зонды. Они представляют собой искусственно полученные нуклеиновые кислоты, комплементарные (дополняющие) вирусным кислотам, меченные радиоактивной меткой или биотином.

Особенность метода состоит в многократном копировании конкретного фрагмента ДНК, включающего в себя несколько сотен (или десятков) нуклеотидных пар. Механизм репликации (копирования) заключается в том, что достраивание может начаться исключительно в определенных блоках. Для их создания используются праймеры (затравки). Они представляют собой синтезированные олигонуклеотиды.

ПЦР-диагностика (полимеразная цепная реакция) проста в исполнении. Этот метод позволяет быстро получить результат при использовании небольшого объема патологического материала. С помощью ПЦР-диагностики выявляются острые, хронические и латентные (скрытые) инфекции.

При чувствительности этот метод считается более предпочтительным. Однако в настоящее время тест-системы недостаточно надежны, поэтому ПЦР-диагностика не может полностью заменить традиционные методики.

источник

Загрязненность воды определяется по общей микро­бной обсемененности и обнаружению санитарно-показательных микроорганизмов — ин­дикаторов наличия выделений человека или животных. В воде регистрируют кишечную палочку, БГКП (колиформные палочки), энте­рококк, стафилококки;

На основании количественного выявле­ния этих санитарно-показательных бак­терий вычисляются индекс БГКП (число БГКП в 1 л воды), перфрингенс-титр, титр энтерококка и т.д. Так, например, титр энтерококка воды — это наименьшее ко­личество воды, в котором определяется энтерококк.

К бактериям группы кишечной палочки относят грамотрицательные палочки, сбра­живающие с образованием кислоты и газа лактозу или глюкозу при температуре 37°С в течение 24-48 ч и не обладающие оксидазной активностью. Наиболее часто этот показатель применяют как индикатор фекального за­грязнения воды. Другой сходный показатель фекального загрязнения — общие колиформные бактерии: грамотрицательные, оксида-заотрицательные палочки, ферментирующие лактозу или маннит (глюкозу) с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24 часов. Вместо последнего термина предлагается использовать термин «бактерии семейства Enterobacteriaceae», так как все бактерии этого семейства имеют ин­дикаторное значение. К бактериям семейства Enterobacteriaceae относятся грамотрицатель­ные, оксидазаотрицательные палочки, расту­щие на лактозосодержащих средах типа среды Эндо и ферментирующие глюкозу до кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24 ча­сов; колиформные бактерии (палочки).

При бактериальном загрязнении воды свыше допустимых норм следует провести дополни­тельное исследование на наличие бактерий — показателей свежего фекального загрязнения. К таким бактериям относят термотолерантные колиформные бактерии, фекальные кишечные палочки, ферментирующие лактозу до кислоты и газа при температуре 44 °С в течение 24 часов и не растущие на нитратной среде. О свежем фекальном загрязнении свидетельствует также выявление энтерококка. На давнее фекальное загрязнение указывают отсутствие БГКП и на­личие определенного количества клостридш перфрингенс, т. е. наиболее устойчивых споро-образующих бактерий.

В соответствии с нормативными докумен­тами регламентируются следующие нормати­вы микробиологических показателей питьевой воды при централизованном водоснабжении:

1. Общее микробное число водыне должно пре­вышать 100 микробов в 1 мл исследуемой воды;

2. Общие колиформные бактериидолжны от­сутствовать в 100 мл исследуемой воды;

3. Термотолерантные колиформные бактериидолжны отсутстовать в 100 мл исследуемой воды;

4. Колифагине должны определяться в 100 мл исследуемой воды (учет по бляшкооб-разующим единицам);

5. Споры сульфитредуцирующихклостридий не должны определяться в 20 мл исследуемой воды;

6. Цисты лямблийне должны определяться в 50 мл исследуемой воды.

Кроме того, загрязненность воды оценива­ется по обнаружению патогенных микробов с фекально-оральным механизмом переда­чи (энтеровирусы, энтеробактерии, холерные вибрионы и др.).

Влияние физических факторов.

Влияние температуры.Различные группы микроорга­низмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при средней (около 37 °С) — мезофилами, при вы­сокой — термофилами.

К психрофильным микроорганизмам относится боль­шая группа сапрофитов — обитателей почвы, морей, пресных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, све­тящиеся бактерии, бациллы). Некоторые из них могут вызывать порчу продуктов питания на холоде. Способностью расти при низких температурах обладают и некоторые патогенные бакте­рии (возбудитель псевдотуберкулеза размножается при темпера­туре 4 °С). В зависимости от температуры культивирования свой­ства бактерий меняются. Интервал температур, при кото­ром возможен рост психрофильных бактерий, колеблется от -10 до 40 °С, а температурный оптимум — от 15 до 40 °С, прибли­жаясь к температурному оптимуму мезофильных бактерий.

Мезофилы включают основную группу патогенных и услов­но-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10— 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С.

При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развива­ются термофильные бактерии. На дне океана в горячих сульфидных водах живут бактерии, развивающиеся при темпе­ратуре 250—300 °С и давлении 262 атм.

Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания на­воза, зерна, сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности навозом и компос­том. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассмат­ривают как показатель загрязненности почвы.

Хорошо выдерживают микроорганизмы действие низких тем­ператур. Поэтому их можно долго хранить в замороженном со­стоянии, в том числе при температуре жидкого газа (—173 °С).

Высушивание. Обезвоживание вызывает нарушение функ­ций большинства микроорганизмов. Наиболее чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы (возбудители гоно­реи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и др.). Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные слизью мокроты.

Высушивание под вакуумом из замороженного состояния — лиофилизацию — используют для продления жизнеспособнос­ти, консервирования микроорганизмов. Лиофилизированные куль­туры микроорганизмов и иммунобиологические препараты дли­тельно (в течение нескольких лет) сохраняются, не изменяя своих первоначальных свойств.

Действие излучения. Неионизирующее излучение — уль­трафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение — гамма-излучение радиоактивных ве­ществ и электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток времени. УФ-лучи применяют для обеззараживания воздуха и различных предме­тов в больницах, родильных домах, микробиологических лабо­раториях. С этой целью используют бактерицидные лампы УФ-излучения с длиной волны 200—450 нм.

Ионизирующее излучение применяют для стерилизации од­норазовой пластиковой микробиологической посуды, питатель­ных сред, перевязочных материалов, лекарственных препаратов и др. Однако имеются бактерии, устойчивые к действию иони­зирующих излучений, например Micrococcus radiodurans была вы­делена из ядерного реактора

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

источник

Самой чистой будет считаться вода, добытая из глубоководной артезианской скважины. Она или вовсе лишена загрязнителей бактериологического типа, или содержит небольшое количество загрязнителей, которые не несут в себе никакой опасности здоровью и жизни потребителя.

Артезианскую скважину можно по праву назвать стерильной. Особенно если сравнивать ее с иными источниками питьевой воды. Самыми опасными в плане повышенного уровня загрязненности считаются поверхностные воды.

Именно по этой причине можно говорить о том, что степень загрязнения источника питьевой воды выше, если глубина скважины минимальна. Для обеспечения загородного дома высококачественной питьевой водой следует провести профессиональное, грамотное бурение и оборудование артезианской глубоководной скважины.

Неукоснительное соблюдение абсолютно всех имеющихся и установленных технологических стандартов бурения, монтажа, устройства и последующего использования источника воды опасность бактериологического загрязнения питьевой воды минимальна и практически сводится к нулю.

Но в случае неправильного подхода и неправильно подобранного технического оборудования для артезианской скважины даже ее глубокое залегание не будет являться гарантией того, что в нее не попадут грунтовые и поверхностные воды, которые содержат микробиологические загрязнители.

Основными причинами, по которым происходит заражение питьевой воды, добываемой из артезианской скважины, могут быть:

  • ненадлежащего качества трубы для обсадки;
  • плохо проведенные работы, связанные со сваркой труб, осуществлением резьбы, соединяющей эти трубы;
  • неправильно проведенная герметизация пространства за обсадными трубами;
  • попадание поверхностных вод в скважину в момент ее бурения.

Если есть хотя бы малейшие подозрения на наличие причин, по которым вода может быть загрязнена, следует обязательно провести санитарно-микробиологический анализ питьевой воды.

Эффективность фильтров будет достигнута только в том случае, если параметры загрязнителей, находящихся в артезианской воде, имеют постоянные значения.

Именно по этой причине необходимо в обязательном порядке ежегодно сдавать артезианскую воду на микробиологический анализ, который проводится в соответствии с установленными санитарно-эпидемиологическими нормами.

В случае даже незначительных изменений химического состава воды важно провести перенастройку фильтрационной системы во избежание ухудшения водоочистки.

Процесс забора воды для проведения микробиологического анализа достаточно специфический. Взять правильно образец воды на микроанализ сложнее, чем на химический. Правильный забор пробы артезианской воды подразумевает следующие действия:

  1. Чтобы доставить воду в лабораторию с целью проведения бактериологического анализа, необходимо брать исключительно стерильную посуду, объем которой не менее 500 грамм. Стерильные емкости можно взять прямо в лаборатории, где в последующем будет осуществляться микробиологический анализ питьевой воды. Можно, в принципе, самостоятельно простерилизовать емкость, прокипятив ее в течение пяти-семи минут, или обработав паром. Можно для этих целей использовать духовой шкаф, где емкость должна находиться в течение 10-15 минут при температуре 180 градусов.
  2. Перед тем, как взять воду из водопроводной системы, необходимо в обязательном порядке обработать кран открытым огнем, затем тщательно протереть спиртом. Воду следует спустить, открыв на максимально возможную мощность кран и спускать воду приблизительно 5-7 минут и лишь после этого произвести забор воды в пастеризованную емкость. Категорически запрещено дотрагиваться до крышки, которой будет закрыта тара, и до горловины.
  3. Отвезти жидкость в лабораторию, где будет проведено исследование, необходимо в течение нескольких часов. Если сделать это в столь короткий срок по ряду причин невозможно, емкость с водой можно поставить в холодное место на 2-3 часа, плотно закрыв крышкой, после чего отвезти в лабораторию.
  4. Отправляемая на изучение питьевая вода должна сопровождаться соответствующими документами, в которых следует указать вид источника воды, откуда была отобрана проба, месторасположение источника, непосредственное место, где взята проба, дата и точное время взятия пробы.

Лаборатория будет проводить микробиологический анализ природных вод по нескольким основным показателям.

Желательно проводить исследование питьевой воды ежегодно, особенно в период после весеннего паводка, а также после произошедших техногенных катастроф или природных катаклизмов, когда вероятность загрязнения подземных источников питьевой воды очень высока.

Лабораторией проводится комплексное исследование пробы воды в соответствии с методиками, которые рекомендованы нормативно-правовыми актами РФ, а также Международным комитетом по стандартизации.

Микробиологический анализ воды подразумевает как выявление микроорганизмов, но и обнаружение вирусов и бактерий, жизнедеятельность которых приводит к развитию инфекционных заболеваний у людей, употребляющих загрязненную воду.

В настоящее время одной из самых удобных, эффективных, надежных методик осуществления микробиологического анализа водопроводной, артезианской питьевой воды является метод мембранной фильтрации. Суть метода заключается в пропускании исследуемой воды через специальную фильтрующую установку, где размер ячеек не превышает 0,65 мкм.

Присутствующие в воде болезнетворные микроорганизмы концентрируются на поверхности мембранного фильтра. После этого фильтр снимается и помещается в специальную среду, где происходит инкубирование микроорганизмов в созданных для них условиях.

Преимуществами методики мембранной фильтрации можно назвать:

  • высокоточный конечный результат исследования;
  • определение количества микроорганизмов;
  • результативность даже при наличии небольшого числа микроорганизмов в воде;
  • минимальные затраты рабочего времени;
  • быстрое получение результатов.
Читайте также:  Сроки проведения анализов сточных вод

Для того, чтобы провести микробиологический анализ природных вод методом мембранной фильтрации, необходимо наличие вакуумного фильтра, а также специальных питательных сред – картонных подложек.

источник

1) при выборе источника централизованного хозяйственно- питьевого водоснабжения и периодическом контроле этого источника;

2) при контроле эффективности обеззараживания питьевой воды централизованного водоснабжения;

3) при наблюдении за подземными источниками централизованного водоснабжения, за такими как артезианские скважины, почвенные воды и т. д.;

4) при определении состояния и степени пригодности воды источников индивидуального водопользования (колодцев, родников и т.д.);

5) при наблюдении за санитарно-эпидемиологическим состоянием воды открытых водоемов: водохранилищ, прудов, озер, рек;

6) при контроле эффективности обеззараживания воды плавательных бассейнов;

7) при проверке качества и степени очистки сточных вод;

8) при определении очага водных вспышек инфекционных болезней.

Все санитар н о-микробиологические исследования воды регламентируются соответствующей НТД (табл.2 ).

Объем засеваемой воды (в миллилитрах) Объемы засеваемой воды (в мл) для определения

2 или 3 повторности по 100, 10, 1 50, 5 повторностей по 10, 1 или 2 повторности по 100, 10, 1 и 0,1

50, 5 повторностей по 10, 1 или 2—3 повторности по 10; 1; 0,1; 0,01

повторностей по 10, 1 или 2-3 повторности по 10; 1;0,1; 0,001

Число положительных результатов из 3 объемов

Определение термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ)

Из всех бактерий, входящих в состав БГКП, наибольшее санитарно-показательное значение имеют микроорганизмы рода Escherichia. По способности расщеплять лактозу при температуре 37°С из БГКП (ОКБ) принято выделять Гр(-) бактерии, которые способны ферментировать лактозу при температуре 44 ,5°С. К ним относится Е. coli, не растущая на

цитратной среде. В соответствии с международной классификацией эту группу бактерий называют термотолерантные колиформные бактерии — ТКБ.

Число ТКБ характеризует степень фекального загрязнения воды водных объектов и косвенно определяет эпидемическую опасность в отношении возбудителей кишечных инфекций. ТКБ определяют теми же методами, как и БГКП (ОКБ), кроме последнего этапа идентификации, который проводится по ферментации лактозы на полужидкой питательной среде при 44 ,5°С. В случае роста на среде Эндо типичных лактозо- положительных колоний, Гр(-), оксидазоотрицательных, спсобных ферментировать лактозу при 44 ,5°С, их учиты-вают как ТКБ , индекс или титр определяют по таблице 6.

Определение Е. coli

Определение E . coli является дополнительным показателем для расшифровки происхождения биологической контаминации, определения свежести фекального загрязнения, при оценке качества воды в случае превышения норматива. Такое исследование проводится при периодических анализах воды, а также при неожиданных изменениях в основных показателях — индекса ОКБ, ТКБ.

Группа бактерий, условно обозначаемых как E . coli , включает лактозоположительные кишечные палочки, ферментирующие лактозу до кислоты и газа при температуре 4 3-44,5 °С в присутствии ингибиторов посторонней микрофлоры и образующие индол при той же температуре. В основном это бактерии рода Escherichia , но могут быть отнесены в эту группу и представители других родов, обладающие такими же свойствами (например, Citrobacter и др.). Е. coli определяют теми же методами: мембранных фильтров, прямого посева и тит рационны м.

Различие — на этапе исследования свойств микроорганизмов, выросших на среде Эндо. Результат исследования выражают количеством E . coli в 1 л (Col i -индекс ).

Метод прямого посева применяется при определении E . coli в сточных водах и сильно загрязненной воде водоемов. На чашки со средой Эндо засевают по 0 ,1—0,5 мл пробы воды (по 4 дозы из каждой пробы), тщательно втирают шпателем и инкубируют в течение 1 6—18 ч при температуре 37°С. Учитывают рост характерных колоний, определяют биохимические совйства бактерий и определяют коли-индекс, ориентируясь на таблиц ы.

Определение энтерококков

Энтерококки в последние годы привлекают к себе внимание как микроорганизмы — показатели фекального загрязнения. Они обнаруживаются в окружающей среде, куда попадают с испражнениями человека, животных, птиц, насекомых, являясь постоянными обитателями кишечника. В почве и воде они сохраняются до 6 недель, но не размножаются и не изменяют свои основные биологические свойства. Выживаемость энтерококков в воде приближается к выживаемости патогенных энтеробактерий. Они устойчивы к повышению температуры (нагревание до 5 5—60° С выдерживают в течение 1 ч), хорошо переносят низкую температуру, обладают значительной устойчивостью к хлору. Все это дает право считать энтерококки вторым после кишечной палочки санитарно-показательным микроорганизмом при исследовании воды.

Особое значение имеет определение энтерококков в воде плавательных бассейнов как более устойчивых к действию обеззараживающих веществ, чем БГКП.

Определение энтерококков проводят методом мембранных фильтров, титрационным, а при большой загрязненности воды (свыше 30 бактерий в 1 мл) -методом прямого посева.

Сущность метода мембранных фильтров состоит в концентрации энтерококков из определенного объема воды на мембранных фильтрах с последующим подращиванием микробов на специальных средах, идентификации и определении индекса энтерококко в.

Объем воды (2-3 десятикратных разведения) выбирают с таким расчетом, чтобы на фильтрах выросло не менее 10 и не более 50 изолированных колоний (ориентируясь по таблице 8). Фильтры, через которые пропускают выбранные объемы воды, помещают в чашки Петри на среду Сланеца или желчную среду и инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч. На среде Сланеца вырастают характерные колонии: некрупные, выпуклые, круглые, темно-вишневые или розовые с темно- вишневым центром (окраска колоний зависит от степени восстановления ТТХ). На желчной среде колонии плоские, крупные с ровными краями, белые с кремовым или розовым оттенком, а также малиновые. Малиновый цвет характерен для колоний S. faecalis. Принадлежность колоний к энтерококкам подтверждается микроскопией мазков, окрашенных по Граму, и отсутствием каталазной активности (приложение 3).

Подсчитывают количество выросших колоний и вычисляют число энтерококков в исследуемой воде исходя из объемов воды, профильтрованных через мембранные фильтры. Общее количество колоний делят на объем воды и умножают на 1000.

Сущность титрационного метода определения энтерококков заключается в посеве различных объемов исследуемой воды в жидкую элективную среду для накопления микроорганизмов с последующим высевом на плотную молочно-ингибиторную среду для получения отдельных колоний, их идентификации и подсчета индекса энтерококков. Титрационный метод дает более точные количественные данные о содержании энтерококков в воде. Объемы воды выбирают с таким расчетом, чтобы при наиболее высоком разведении наблюдался один или несколько отрицательных результатов (при этом следует ориентироваться на таблицу 10). Каждый объем или разбавление исследуемой воды засевают в 2 или 3 повторностях. Объемы воды 100 мл и 10 мл засевают в 100 и 10 мл (соответственно) щелочно-полимиксиновой среды двойной концентрации, 1 мл и по 1 мл десятикратных разведении засевают в 5 мл этой же среды обычной концентрации. Выдерживают в термостате в течение 24 ч при температуре 37°С, затем из всех колб и пробирок, в которых наблюдается рост бактерий (помутнение, изменение цвета среды с синего на зеленый или желтый), делают высевы на сектора в чашки Петри с молочно-ингибиторной средой. Пробирки с посевами в щелочно-полимиксиновую среду, в которых еще нет признаков роста, оставляют на сутки в термостате, и если в каких-нибудь пробирках появился рост, то также делают высев на молочно- ингибиторную среду. После 24 ч инкубирования в термостате учитывают колонии ас пи дно-черны е, выпуклые, с металлическим блеском (S. faecalis), а также колонии, окруженные узкой зоной просветления с выпадением по периферии осадка пара-казеина ( S . faecium, биовар liquefaciens), мелкие серые колонии (S. faecium, биовар durans). Из части колоний (выборочно) следует приготовить мазки, окрасить по Граму. Наличие энтерококков дает возможность дать заключительный ответ. Индекс энтерококков определяют по таблице 5.

При определении энтерококков методом прямого посева (в основном при исследовании сточных вод) делают посевы исследуемой воды непосредственно на чашки Петри со средой Сланеца или желчной средой в 2 или 5 повторностях. Обычно берут 1 мл, 0,5, 0,2 и 0,1 мл из каждого десятикратного разведения. Засеваемую воду тщательно втирают шпателем в поверхность питательной среды до полного впитывания воды. Идентификация и подсчет энтерококков проводятся так же, как при определении титрационным методом.

Определение споровых сульф итредуц ирующ их клостридий

Сульфитредуцирующие клостридии (представитель этой группы микроорганизмов — Clostr > perfringens ) спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре при температуре 44°С в течение 16-18 ч. Метод основан на выращиван бии посевов в железо-сульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.

Количественно эти микроорганизмы в воде можно определить методом мембранной фильтрации или прямым посевом. В качестве питательной среды для выделения и подсчета сульфитредуцирующих клостридий обычно используют среду Вильсона-Блера (ж елезосульфитный агар).

Перед посевом пробу воды прогревают на водяной бане при температуре (75±5)°С в течение 15 мин для исключения вегетативных форм. При исследовании хлорированной воды, ее можно не прогревать. Применяя метод мембранной фильтрации, пробу воды определенного объема пропускают через фильтр, который затем помещается в пробирку с подготовленной расплавленной питательной средой верхней стороной внутрь (пробирка с питательной средой после посева должна быть немедленно охлаждена в холодной воде во избежание попадания воздуха) или в чашку Петри на поверхность питательной среды, которая затем заливается той же питательной средой толстым слоем.

Метод прямого посева предполагает посев в стерильные пробирки 20 мл воды следующим образом: по 10мл в 2 пробирки (объемом не менее 30 мл), или по 5 мл в 4 пробирки (объемом не менее 15 мл ).

Сверху посевы воды заливают горячим (75-80°С) железосульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливают по стенке пробирки, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. Пробирки с посевами быстро охлаждают в стакане с холодной водой, инкубируют при 44°С в течение 24 ч.

Количественному учету подлежат только те посевы, где получены изолированные колонии. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтре, так и в толще питательной сред ы. Результат анализа выражают числом к олониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфит-редуцирующих клостридий в определенном объеме воды (подвергнутой анализу)

Определение бактериофагов

Присутствие бактериофагов в воде, говорит о фекальном загрязнении, и является индикатором или сигналом о возможном присутствии энтеровир усо в. Поэтому методы определения бактериофагов (в т.ч. и колифагов) включены в методические указания Минздрава России (2001г.) и регламентированы Международными стандартами (ИС О 1070 5- 1:1995; 10705-2:2000; 10705-3; 10705-4).

Существует несколько методов количественного и качественного определения бактериофагов в вод е.

Все методы основаны на чувствительности музейных культур микроорганизмов и предполагают использование следующих тест-организмов (по международным стандартам): мутант Salmonella tuphimurium , непатогенный для человека, штамм Escherichia coli К -12 Hfr из соответствующей коллекции культур АТСС 23631 или NTCT12486, штамм E . coli рода CN, называемый WG5, а также бактериофаги MS2, NCT C 12487 или АТСС 15597 для контроля чувствительности тест-организмов.

Международным стандартом регламентируются методы определения бактриофагов РНК типа F и соматических бактриофагов, которые позволяют определить присутствие/отсутствие бактериофагов, а также дать их количественную оценку (ИС О 10705 -1).

Бактериофаги РНК типа F — это бактериальные вирусы, способные инфицировать определенный штамм хозяина с помощью F-фимбрий или половых фимбрий. Соматические бактериофаги являются непатогенными для человека, однако являются устойчивыми к внешним факторам, особенно к высушивани ю.

Прямой метод выявления бактериофагов. Данный метод представлен в методических указаниях МЗ РФ- МУК 4.2.671-97 и применяется при определении исследований по эпидпоказаниям или в случае необходимости получения результатов в короткие сроки.

Ход определения. За 18-24 часа перед проведением анализа необходимо сделать посев тест-культуры E.coli К12 F+(Poc . roc . HH — T мед .и би ол.препаратов им. J 1. A. Тарасевича) на косяк с питательным агаром ( МП А). Перед проведением анализа сделать смыв с косяка 5 мл стерильной водопроводной воды и по стандарту мутности приготовить взвесь тест-организма в концентрации 109 бакт. клеток/мл.

Расплавить и остудить до 45°С 2%-ный питательный агар. Исследуемую воду 100 мл внести в 5 стерильных чашек Петри (по 20 мл в каждую). В питательную среду добавить смыв E.coli (из расчета 1,5 мл на 150 мл агара) и хорошо перемешать. Полученной смесью залить по 30 мл сначала пустую чашку Петри (контроль), а затем все чашки, содержащие исследуемую воду. Содержимое чашек перемешивают вращательными движениями. После застывания питательной среды чашки переворачивают вверх дном и ставят для инкубирования в термостат при 37°С на 18-24 ч.

Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5-ти чашкках Петри. Резулшьтаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл воды.

В контрольной пробе бляшки должны отсутствоват ь.

Санитарно-микробиологическая оценка воды

Оценка качества воды производится комплексно: по санитарно-микробиологическим показателям с учетом органолептических, гельминтологических и химических данных и регламентируется соответствующими ГОСТами, санитарными правилами и методическими указаниями. Безусловным показателем загрязненности воды является обнаружение патогенных микроорганизмов. В этом случае вода считается непригодной для любых целей.

Критерии оценки качества воды разработаны дифференциально в зависимости от категории воды и ее назначения представлены в таблице 1.2 (приложение 1).

При оценке питьевой воды руководствуются основным требованием: она не должна содержать патогенные бактерии и вирусы. При санитарно-бактериологической оценке воды колодцев исходят из того, чтобы в 1 л БГКП содержалось не более 10. Показателем фекального загрязнения воды колодцев является обнаружение энтерококков. Отсутствие обеззараживания колодезной воды, возможность биологической контаминации (осадки, просачивание загрязненных ливневых и грунтовых вод и т.д.) делают ее эпидемически опасной, и поэтому требуется постоянный контроль. При обнаружении в воде энтерококков вода считается непригодной к употреблению, и колодец подлежит очистк е.

Если при выборе нового источника водопользования коли- инд екс воды водоема превышает 10000 в 1 л, то проводится дополнительное исследование на присутствие Е. coli и энтерококков как показателей свежего фекального загрязнения и непосредственное обнаружение патогенных бактерий сальмонелл и шигелл.

При индексе Е. coli, энтерококков более 1000 в 1 л вода водоема расценивается как загрязненная, причем контаминация считается свежей, а вода -опасной в эпидемическом отношении. В последние годы разработаны и предложены [Григорьева Л. В., 1975] дополнительные критерии оценки санитарного состояния водоемов, в которые включены показатели титра энтерококков, перфрингенс-титр и индекс бактериофагов.

источник