Анализ воды на пирогенность осуществляется

Приходько А.Е. (ЗАО «НПК Медиана — Фильтр»)

Вода в фармацевтическом производстве относится к ключевым элементам, обеспечивающим безопасность изготавливаемых лекарственных средств. Без применения воды самого разного качества не обходится практически ни одно фармацевтическое предприятие. Она может использоваться как сырье, вспомогательный материал, а так же как энергоноситель.

В технологическом процессе изготовления лекарственных средств, особенно для парентерального применения, вода занимает одно из первых мест среди основных источников пирогенных веществ, химического, микробиологического загрязнения, поэтому важной задачей является обеспечение высокого качества воды для фармацевтических целей, что достигается оптимальным выбором системы водоподготовки.

При производстве лекарственных средств для парентерального применения необходимо использовать воду для инъекций, к которой предъявляются достаточно жесткие требования. Одно из них — отсутствие пирогенных веществ.

Получить апирогенный продукт, а это — одно из основных требований, предъявляемым к инъекционным препаратам, можно лишь при правильной организации всего технологического процесса получения лекарства, в частности, контроля на содержание пирогенов. Наиболее рациональные точки контроля при изготовлении парентеральных лекарственных средств следующие: контроль сырья, контроль воды для инъекций , проверка элементов фильтра на вымывание из них пирогенов, контроль растворов перед стерилизующим фильтрованием, контроль чистоты ампул, флаконов. Основными источниками пирогенных веществ в воде для инъекций являются системы умягчения воды, деионизации и угольный фильтр, которые требуют наиболее пристального внимания, частой регенерации, очистке и т.п.

Требование апирогенности воды для инъекций связано с возможностью возникновения пирогенной реакции, которая выражается повышеним температуры тела, ознобом и другими симптомами. Причиной такой реакции часто являются эндотоксины граммотрицательных бактерий, которые при внутривенном введении обладают значительно большей активностью, чем при подкожном или внутримышечном введении. В связи с этим особенно опасны инфузионные растворы, загрязненные бактериальными эндотоксинами, т.к. они вводятся человеку в больших объемах.

Согласно ГФ XI тест на пирогенность проводится биологическим методом на кроликах, основанным на измерение температуры тела животных после внутривенного введения испытуемого препарата. Использование млекопитающих, вида, близкого к человеку, позволяет установить влияние испытуемого препарата на целый организм. С помощью испытания на животных возможно определять действие обоих классов пирогенов – «экзо» и «эндо»-токсинов, а также пирогенов небактериальной природы.

Однако этот метод достаточно длителен (4-5 часов), дает значительную вариабельность результатов, связанную с индивидуальной чувствительностью (чувствительность животных в 3-4 раза ниже, чем у человека), сезонностью. Используемые в эксперименте животные, должны содержаться в строго определенных условиях. Кроме того, многие лекарственные вещества в дозах, близких к терапевтическим, могут вызвать токсические реакции и даже гибель животных.

Наряду с фармакопейным методом возможно использование люминесцентного метода, основанного на способности бактериальных эндотоксинов усиливать флуоресценцию родамина 6Ж и 1-анилина-нафталин-8-сульфоната; флуориметрического метода, основанного на измерении собственной интегральной флуоресценции бактериальных пирогенов в пределах длин волн эмиссии от 310 до 400 нм.

В настоящее время доминирующее значение для контроля за содержанием пирогенных примесей, а именно, бактериальных эндотоксинов (БЭ), получил LAL -тест, позволяющий проводить испытания in vitro . Этот метод основан на способности лизата амебоцитов (клеток крови) мечехвоста специфически реагировать с эндотоксинами граммотрицательных бактерий. В результате реакции происходит помутнение прозрачной реакционной смеси или образование твердого геля, что и служит индикатором присутствия эндотоксина. Этот метод широко используется за рубежом и в настоящее время внедряется в России. Основными преимуществами LAL- теста являются:

• Возможность оценить уровень БЭ в тех препаратах, которые невозможно проверить на животных (антипиретиков, радиофармацевтических, противоопухолевых, седативных, короткоживущих изотопов и др.);
• Чувствительность LAL -теста в 100 раз выше, нежели чем испытание пирогенности традиционным методом;
• С помощью LAL- теста можно количественно определить концентрацию БЭ до 0,03 ЕДэ /мл (с помощью опытов на животных удается выявить наличие пирогенов, содержание которых превышает 5-10 ЕДэ / мл);
• Быстрота выполнения LAL -теста – 1- 1,5 часа.

Этот метод введен в Американскую, Британскую, Европейскую и др. Фармакопеи. В 1997 году Фармакопейный Государственный Комитет РФ утвердил общую фармакопейную статью 42-2960-97 «Определение содержания бактериальных эндотоксинов («ЛАЛ-тест»)».

Быстрота выполнения и высокая чувствительность LAL -теста в первую очередь необходимы для анализов воды, которую получают на асептических участках фармацевтических предприятий и применяют в качестве растворителя для приготовления парентеральных лекарственных средств. В настоящее время контроль безопасности, качества воды осуществляется в опытах на кроликах. Замена этого трудоемкого и малочувствительного метода даст не только экономический эффект, но и значительно улучшит качество лекарственных препаратов, и соответственно, безопасность их применения.

Для оценки безопасности и качества воды для инъекций , получаемой на фармацевтических предприятиях и в аптеках, в частных статьях Фармакопей США, Европы установлен показатель «содержание бактериальных эндотоксинов», который не должен превышать 0,25 ЕДэ/мл . В данный момент в нашей стране утверждается изменение к частной фармакопейной статье 42-2620-97 «Вода для инъекций». Для оценки пирогенности, как альтернативный биологическому, предлагается LAL -тест для определения содержания БЭ (не более 0,25 ЕДэ/мл).

На многих предприятиях в США, Европе, Японии и др., занятых выпуском парентеральных препаратов, существуют собственные стандарты, регламентирующие содержание БЭ в воде для инъекций. Они значительно строже, чем требуемый предел 0,25 ЕДэ/мл (табл.1):

Пределы содержания БЭ в воде для инъекций

источник

ПИРОГЕННЫЕ ВЕЩЕСТВА. МЕТОДЫ ДЕПИРОГЕНИЗАЦИИ

Пирогенные вещества (от слов «пир» — огонь, «генан» — производить) впервые были выделены из загнивающего мяса Бердон-Сандерсеном в 1875 г. Пирогенные вещества образуют грамотрицательные бактерии. Установлено, что пирогенную реакцию вызывают живые и мертвые микробные клетки, а также продукты их жизнедеятельности. При попадании в кровь пирогенные вещества вызывают у человека и животных лихорадку, озноб, повышение температуры тела, падение артериального давления, цианоз, рвоту, понос, нейропению, лейкоцитоз.

Пирогенная активность грамположительных микроорганизмов в 10000 – 100000 раз слабее.

По химическому составу пирогенные вещества — это высокомолекулярные соединения липополисахаридной природы с молекулярной массой до 8000000 и размером частиц от 50 нм до 1 мкм. Молекула пирогена состоит из 3 частей:

1) общий полисахарид, он одинаков для многих грамотрицательных бактерий;

2) иммуноспецифическая полисахаридная цепь, характерная для каждого вида микробов;

3) липид А (токсичная часть) — именно он вызывает пирогенную реакцию организма. Представляет собой дисахарид глюкозамин, к которому амидными и эфирными связями присоединяются жирные кислоты.

Пирогены являются термостабильными веществами. Они не разрушаются при температуре стерилизации 120 о С и 132°С. Поэтому при приготовлении лекарственных форм для инъекций очень важно строгое соблюдение асептики. Кроме того, применяют следующие методы депирогенизации:

1) химические — обработка материалов 0,5-1% раствором калия перманганата, подкисленном серной кислотой; или нагревание в течение 1 часа при t=100°С в растворе пероксида водорода;

2) адсорбционные — поглощение пирогенов активированным углем, целлюлозой;

3) термический — прокаливание при t 180°С и выше;

4) механические — отделение пирогенов мембранным фильтрованием.

Испытания на пирогенность воды и растворов для инъекций проводят в соответствии с ГФ РБ Т 1, С.268. Ежеквартально испытание на пирогенность инъекционных растворов и воды для инъекций осуществляют в бактериологических лабораториях биологическим методом. Метод основан на измерении температуры тела кроликов после введения растворов испытуемых веществ.

Испытание проводят на здоровых взрослых кроликах обоего пола массой не менее 1,5 кг., желательно от 2,0 до 3,5 кг. Каждый кролик должен содержаться индивидуально в спокойном помещении при однородной подходящей температуре. В течение недели, предшествующей опыту, кролики не должны терять в массе. Температура тела кроликов должна быть в пределах 38,5-39,5 0 С (измеряется ректально, используют термометр или электрическое устройство). При уборке клеток и взвешивании животных оберегают от возбуждения (шум и резкие движения). Испытуемые лекарственные средства, вода для инъекций, шприцы и иглы должны быть стерильными и апирогенными. Предварительное испытание на животных проводят в соответствии с ГФ РБ. При испытании на пирогенность воды для инъекций из нее готовят изотонический раствор натрия хлорида. Растворы подогревают до температуры 37 0 С и медленно вводят в крайнюю вену уха каждого из кроликов в течение не более 2 минут, если иное не предписано в частной статье. Определение исходной и максимальной температуры проводят в соответствии с ГФ РБ. При определении исходной температуры кролики, у которых два последовательных значения температуры варьируются в пределах, превышающих 0,2 о С, изымаются из испытания.

Воду для инъекций или раствор лекарственного средства считают непирогенными, если сумма повышений температуры у трех кроликов меньше или равна 1,4 о С. Если эта сумма превышает 2,2 о С, то воду для инъекций или раствор лекарственного средства считают пирогенными. В случае, когда сумма повышения температуры у 3 кроликов находится в пределах от 1,5 до 2,2 о С, испытание повторяют дополнительно на 5 кроликах. В этом случае воду для инъекций или раствор лекарственного средства считают непирогенными, если сумма повышений температуры у всех 8 кроликов не превышает 3,7 0 С. Если же эта сумма равна 3,8 0 С или больше, воду для инъекций или раствор лекарственного средства считают пирогенными.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Сдача сессии и защита диплома — страшная бессонница, которая потом кажется страшным сном. 8718 — | 7129 — или читать все.

источник

Содержимое (Table of Contents)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Пирогенность ОФС.1.2.4.0005.15

Взамен ГФ XII, ч.1, ОФС42-0061-07

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на испытание пирогенности инъекционных растворов и фармацевтических субстанций, из которых они изготавливаются. Испытание основано на измерении температуры тела у кроликов до и после инъекции.

Каждого кролика содержат в отдельной клетке на полноценном пищевом рационе, ограждая от раздражающих воздействий (акустических, оптических и других). В помещениях, где находятся животные и проводятся испытания, поддерживают постоянную температуру воздуха 20 ± 3 ºС. Перед испытанием проводят осмотр животных и отбирают здоровых кроликов одного пола, не альбиносов, с массой тела от 2,0 до 3,5 кг, которые не теряли в массе в течение предыдущей недели.

За 18 часов до испытания кроликов лишают корма без ограничения воды. Во время опыта животные не получают ни корма, ни воды. Кроликов, впервые предназначенных для опыта или не участвовавших в опыте более четырех недель, предварительно готовят к процедуре испытания, осуществляя все рабочие операции (осмотр, взвешивание, измерение температуры тела) за исключением инъекции.

Кролики, ранее бывшие в опыте, могут быть использованы повторно через трое суток, если введенное им лекарственное средство было апирогенным. При повышении температуры тела у животного на 0,6 ºС и более, кролик может быть использован для дальнейших опытов не ранее, чем через две недели.

Если испытуемое лекарственное средство обладает антигенными свойствами, то порядок повторного использования животных для испытаний указывают в фармакопейной статье.

Посуда для разведения, шприцы и иглы для инъекций должны быть стерильными и апирогенными, что обеспечивается нагреванием при температуре 250ºС в течение 30 минут или 200ºС в течение 60 минут.

Для разведения испытуемых лекарственных средств используют 0,9 % раствор натрия хлорида для инъекций, если в фармакопейной статье не указан другой растворитель. Все растворители должны быть стерильными и апирогенными.

Ректальную температуру у кроликов измеряют с точностью до 0,1ºС медицинским максимальным ртутным или электронным термометром с термочувствительным датчиком. Термометр или датчик вводят в прямую кишку кролика на глубину от 5 до 7,5 см в зависимости от массы тела животного.

Испытуемое лекарственное средство вводят в ушную вену кролика, если в фармакопейной статье не указан другой путь введения. Объем инъецируемого раствора должен составлять не менее 0,2 мл и не более 10 мл на 1,0 кг массы тела животного. Перед введением раствор подогревают до температуры 37,0 ± 2ºС.

Тест-дозу испытуемого лекарственного средства, объём вводимого раствора и, если необходимо, скорость введения указывают в фармакопейной статье.

Испытание лекарственного средства проводят на группе из трех кроликов с исходной температурой 38,5-39,5 ºС.

Перед опытом, с интервалом не менее 30 минут, у каждого кролика дважды измеряют температуру тела. Различия в показаниях температуры у одного и того же животного не должны превышать 0,2ºС. В противном случае кролика исключают из испытания. За исходную температуру принимают величину последнего результата измерения.

Раствор испытуемого лекарственного средства вводят животным сразу после второго измерения температуры.

Измерения температуры после внутривенного введения испытуемого лекарственного средства проводят с интервалом не более 30 минут на протяжении трех часов. При других путях парентерального введения – на протяжении пяти часов.

Испытание лекарственного средства можно проводить поэтапно. На каждом этапе используют трех кроликов. Максимальное число этапов не должно превышать четырех.

По окончании каждого из этапов испытания определяют максимальное изменение температуры (Dt) тела каждого кролика по сравнению с исходным значением. Изменение температуры тела животного ниже исходной величины принимают за нулевое и не учитывают.

Для трех кроликов определяют сумму индивидуальных максимальных повышений температур (S Dt). Значения S Dt, полученные на разных этапах испытания, последовательно суммируют, а результаты сравнивают с уровнями, указанными в Таблице 1.

После первого этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 1,2 ºС (Таблица 1, колонка 3), а индивидуальное повышение температуры ни у одного из трех кроликов не превышает 0,5 ºС (колонка 4).

Если результат, полученный на первом этапе, превышает 1,2 ºС (колонка 5) или зарегистрировано индивидуальное повышение температуры более чем на 0,5 ºС хотя бы у одного из трех кроликов (колонка 6), то необходимо перейти к проведению следующего этапа испытания.

После второго этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 2,8ºС (колонка 3), а индивидуальное повышение температуры свыше 0,5ºС отмечено не более, чем у одного из шести кроликов (колонка 4).

Если результат, полученный на втором этапе испытания, больше 2,8ºС, но меньше 4,3ºС (колонка 5), или более, чем у одного животного зарегистрировано индивидуальное повышение температуры свыше 0,5ºС (колонка 6), то необходимо перейти к проведению следующего этапа испытания.

После третьего этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 4,5ºС (колонка 3), а индивидуальное повышение температуры свыше 0,5ºС отмечено не более, чем у двух из девяти кроликов (колонка 4).

Если результат, полученный на третьем этапе испытания, больше 4,5ºС, но меньше 6,0ºС (колонка 5), или зарегистрировано индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 ºС более, чем у двух животных (колонка 6), то необходимо перейти к проведению следующего этапа испытания.

После четвертого этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 6,6 ºС (колонка 3), а индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 ºС отмечено не более, чем у трех из двенадцати кроликов (колонка 4).

Лекарственное средство признают пирогенным, если результат на втором или последующих этапах испытания выше, чем величины, указанные в колонке 7. Лекарственное средство признают пирогенным и в том случае, если в результате четырех этапов испытания зарегистрировано индивидуальное повышение температуры свыше 0,5ºС более, чем у трех кроликов из двенадцати.

* При индивидуальном повышении температуры свыше 0,5 о С более, чем у трех кроликов из двенадцати, лекарственное средство признают пирогенным.

источник

Испытания на пирогенность. Бактериальные пирогены представляют собой вещества микробного происхождения, способные вызвать у человека и теплокровных животных при попадании в кровяное русло повышение температуры тела, лейкопению, падение кровяного давления и другие изменения в различных органах и системах организма. Пирогенную реакцию вызывают грамотрицательные живые и мертвые микроорганизмы, а т

акже продукты их распада. Допустимо содержание, например, в изотоническом растворе натрия хлорида 10 микроорганизмов в 1 мл, а при введении не более 100 мл допускается 100 на 1 мл. Испытанию на пирогенность подвергают воду для инъекций, инъекционные растворы, иммунобиологические лекарственные средства, растворители, используемые для приготовления инъекционных растворов, а также лекарственные формы, вызывающие, по сведениям клиник, пирогенную реакцию.

В ГФ XI, как и в фармакопеи других стран мира, включен биологический метод испытания пирогенности, основанный на измерении температуры тела кроликов после введения в ушную вену испытуемых стерильных жидкостей. Отбор проб проводится так же, как при испытании на токсичность. В общей статье (ГФ XI, вып. 2, с. 183—185) указаны требования к подопытным животным и порядок их подготовки к проведению испытаний. Испытуемый раствор проверяют на трех кроликах (не альбиносах), масса тела которых отличается не более чем на 0,5 кг. Температуру тела измеряют, вводя термометр в прямую кишку на глубину 5—7 см. Испытуемые жидкости считают непирогенными, если сумма повышенной температуры у трех кроликов равна или меньше 1,4°С. Если эта сумма превышает 2,2°С, то воду для инъекций или инъекционный раствор считают пирогенными. Если сумма повышения температуры у трех кроликов находится в пределах от 1,5 до 2,2° С, испытание повторяют дополнительно на пяти кроликах. Испытуемые жидкости считают непирогенными, если сумма повышений температуры у всех восьми кроликов не превышает 3,7°С. В частных ФС могут быть указаны другие пределы отклонений температуры. Кроликов, бывших в опыте, можно использовать для этой цели повторно не ранее чем через 3 сут., если введенный им раствор был непирогенным. Если же введенный раствор оказался пирогенным, то кроликов повторно можно использовать только через 2—3 недели. В ГФ XI по сравнению с ГФ X введена проверка на реактивность кроликов, впервые используемых для испытаний, и уточнен раздел о возможности их использования для повторных испытаний.

Рекомендуемый ГФ XI биологический метод отличается специфичностью, но не дает количественной оценки содержания пирогенных веществ. К существенным его недостаткам следует отнести трудоемкость и продолжительность испытаний, необходимость содержания животных, ухода за ними, сложность подготовки к проведению испытаний, зависимость результатов от индивидуальных особенностей каждого животного и т.д. Поэтому предпринимались попытки разработки других методов определения пирогенности.

Наряду с определением пирогенности на кроликах за рубежом используют микробиологический метод, основанный на подсчете общего числа микроорганизмов в исследуемой лекарственной форме до ее стерилизации. В нашей стране предложена простая и доступная методика обнаружения пирогенов, основанная На избирательной идентификации грамотрицательных микроорганизмов по реакции образования геля с применением 3%-ного раствора гидроксида калия. Методика может быть использована на химико-фармацевтических предприятиях.

Предпринята попытка заменить биологический метод определения пирогенности химическим. Растворы, содержащие пирогены, после обработки хиноном показывали отрицательную реакцию с тетрабромфенолфталеином. Пирогенал с триптофаном в присутствии серной кислоты образует буро-малиновое окрашивание при содержании пирогенала 1 мкг и более.

Исследовалась возможность спектрофотометрического определения пирогенных веществ в УФ-области спектра. Растворы фильтрата пирогенсодержащих культур микроорганизмов обнаруживают слабовыраженный максимум поглощения при 260 нм. По чувствительности спектрофотометрический метод определения пирогенов в 7-8 раз уступает биологическому испытанию на кроликах. Однако если перед спектрофотометрированием провести ультрафильтрование, то вследствие концентрирования пирогенов можно достигнуть сопоставимых результатов определения биологическим и спектрофотометрическим методами.

После обработки хиноном растворы пирогенов приобретают красную окраску и появляется максимум светопоглощения при 390 нм. Это позволило разработать фотоколориметрический способ определения пирогенов.

Высокая чувствительность люминесцентного метода создала предпосылки использования его для определения пирогенных веществ в концентрации до 1*10-11 г/мл. Разработаны методики люминесцентного обнаружения пирогенов в воде для инъекций и в некоторых инъекционных растворах с применением красителей родамина 6Ж и 1-анилино-нафталин-8-сульфоната. Методики основаны на способности пирогенов увеличивать интенсивность люминесценции указанных красителей. Они позволяют получать результаты, сопоставимые с биологическим методом.

Относительная ошибка спектрофотометрического и люминесцентного определения не превышает ±3%. Для определения пирогенности воды для инъекций используют также хемилюминесцентный метод.

Перспективным методом является полярография. Установлено, что фильтраты пирогенных культур даже в очень разбавленном состоянии оказывают сильное подавляющее действие на полярографический максимум кислорода. На этой основе разработан способ полярографической оценки качества воды для инъекций и некоторых инъекционных растворов.

Испытание на содержание веществ гистаминоподобного действия.

Данному испытанию подвергают парентеральные лекарственные средства. Выполняют его на кошках обоего пола массой не менее 2 кг под уретановым наркозом. Вначале животному, находящемуся под наркозом, вводят гистамин, проверяя его чувствительность к этому веществу. Затем с интервалом 5 мин продолжают повторные введения (0,1 мкг/кг) стандартного раствора гистамина до тех пор, пока при двух последовательных введениях не будет получено одинаковое снижение артериального давления, которое принимается за стандартное. После этого с интервалом 5 мин животному вводят испытуемый раствор с той же скоростью, с которой вводили гистамин. Препарат считают выдержавшим испытание, если снижение артериального давления после введения тест-дозы не превышает реакции на введение 0,1 мкг/кг в стандартном растворе.

5.2 Микробиологический контроль лекарственных средств

Впервые в ГФ XI включен новый вид биологического контроля — определение микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств, т.е. установление состава и количества имеющейся в препарате микрофлоры и ее соответствие нормам, ограничивающим микробную обсемененность (контаминацию). Патогенные микроорганизмы (синегнойная палочка, кишечные бактерии) способны находиться в таблетках и гранулах от 6 до 18 мес., сохраняя морфологические и биохимические свойства. Микробиологическая чистота нестерильных лекарственных средств находится в зависимости от санитарно-гигиенических условий производства, дополнительной обработки сырья с целью его деконтаминации и состояния микробиологического контроля ОТК на всех этапах производства.

источник

При парентеральном, особенно при внутрисосудистом введении препаратов, иногда наблюдается быстрое повышение температуры тела до 40°С, что сопровождается учащением пульса, ознобом, потовыделением, тошнотой и головной болью. В особо тяжелых случаях возможен смертельный исход, вызванный присутствием в растворе пирогенов — веществ бактериального происхождения. Пирогенностью обладают живые микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности, тела мертвых бактерий, которые могут находиться в растворах после стерилизации. Пирогенные вещества принято разделять на экзогенные (в основном бактериальные) и эндогенные (клеточно-тканевые). Источником эндогенных пирогенов могут быть лейкоциты и белки крови, которые в определенных условиях образуют и выделяют биологически активные вещества с пирогенными свойствами (лейкопирогены).

С химической точки зрения пирогены — это сложные вещества с высокой молекулярной массой и размером частиц от 50 до 1 мкм, состоящие в основном из липополисахаридов, адсорбированных на белковом носителе. Например, химический состав пирогенного вещества, выделенного из Proteus Vulgaris, состоит из углерода (25,83%), водорода (6,06%), азота (6%), фосфора (0,29%) и золы (8,33%).

Пирогены растворимы в воде, нерастворимы в спирте и ацетоне, устойчивы к воздействию повышенной температуры. Нагревание в автоклаве при 120°С в течение 20 мин приводит к гибели бактерий, но не уничтожает пирогены. Чувствительность пирогенов к высокой температуре различна. Изменение pH водного раствора практически не влияет на термолабильность пирогенов. В сухом виде их полное разложение происходит только при температуре 200°С в течение 30 мин; стерилизация сухим воздухом при 160°С в течение 2 ч не гарантирует полной апирогенности. Повышение температуры позволяет сократить время, необходимое для уничтожения пирогенов. При температуре 600°С достаточно минутного нагревания, при 450°С — двухминутного, следовательно, освободить от них воду и инъекционные растворы термической стерилизацией практически невозможно.

Пирогенные вещества чувствительны к действию окислителей, например, перекиси водорода или перманганата калия.

Пирогены обладают очень малыми размерами и пррходят через самые плотные фильтры с размерами пор от 0,005 до 0,001 мкм.

Существуют различные методы обнаружения и удаления пирогенов из растворов.

Для практических целей, наряду с методами удаления пирогенных компонентов, большое значение имеют методы их обнаружения:

Химические методы основаны на проведении определенных цветных реакций.

Физические методы основаны на измерении электропроводности и полярографических максимумов.

Из-за ряда недостатков первых двух методов чаще всего применяют методы биопроб, которые введены в Фармакопеи различных стран мира.

Биологические методы. До настоящего времени основным и официально принятым во всех странах методом испытания лекарственных средств на наличие пирогенных примесей считается метод, основанный на троекратном измерении температуры тела кролика после внутривенного введения исследуемого препарата. Повышение температуры на 0,6°С или более, согласно требованию фармакопей, считается доказательством наличия пирогенов.

Специальные статьи Фармакопей оговаривают условия . проведения этого испытания, поскольку факторы — химический (корм), физический (изменение температуры окружающей среды), физиологический (возбуждение животных при анальном измерении температуры) — могут повлиять на результат испытания. И даже при самом строгом соблюдении требований к проведению испытаний невозможно избежать случайных ошибок, связанных с индивидуальной чувствительностью животных к пирогену и препарату, различными климатическими условиями, времени постановки опыта и т. п. Все это может отразиться на показателях температуры, измеренной с точностью до ±0,1°С.

Согласно данным различных Фармакопей доза одного и того же препарата в ряде случаев колеблется в широких пределах. Очень часто при равных или весьма близких дозах препаратов объемы вводимых растворов различаются в 5 раз. Отмечено, что наблюдается большой разрыв между дозами для кроликов и человека. Нередко эти дозы различаются в 100—6000 раз. По мнению ученых, изучавших этот вопрос, тест-доза препарата при испытании пирогенности должна подбираться индивидуально, учитывая его фармакологию, переносимость кроликом, и ориентировочно должна составлять 1/10 максимальной суточной дозы для человека.

Существует вариант условий признания препарата пирогенным либо алирогенным: воду или раствор лекарственного средства считают апирогенным, если сумма максимальных повышений температур у 3 кроликов не превышает 1,2°С, и пирогенным, если она равна или больше 2,2°С. Если сумма повышений температуры у 3 кроликов больше 1,2°С, но меньше 2,2°С, то испытание повторяют на 5 кроликах. Воду или раствор лекарственного средства считают пирогенным, если сумма повышений температуры у 8 кроликов равна или больше 3,8°С, в противном случае — апирогенным.

В последнее время заметное распространение получает метод испытания лекарственных средств на пирогенность in vitro с использованием лизата амебоцитов краба Лимулюс. Этот метод имеет ряд преимуществ перед фармакопейным: он чувствительнее в 5—10 раз, результат получается быстрее, возможно количественное определение пирогена. Кроме того, с его помощью возможен контроль препаратов, которые нельзя испытать на кроликах. Одним из недостатков этого метода является его специфичность в отношении эндотоксина грамотрицательных бактерий, т. е. опасность не выявить наличие в лекарственных средствах пирогенов другого происхождения.

источник

Вопрос 4. Биологический метод определения пирогенности воды для инъекций и инъекционных растворов, достоинства и недостатки

Вода в фармацевтическом производстве относится к ключевым элементам, обеспечивающим безопасность изготавливаемых лекарственных средств. Без применения воды самого разного качества не обходится практически ни одно фармацевтическое предприятие. Она может использоваться как сырье, вспомогательный материал, а так же как энергоноситель. В технологическом процессе изготовления лекарственных средств, особенно для парентерального применения, вода занимает одно из первых мест среди основных источников пирогенных веществ, химического, микробиологического загрязнения, поэтому важной задачей является обеспечение высокого качества воды для фармацевтических целей, что достигается оптимальным выбором системы водоподготовки [4].

При производстве лекарственных средств для парентерального применения необходимо использовать воду для инъекций, к которой предъявляются достаточно жесткие требования. Одно из них — отсутствие пирогенных веществ. Получить апирогенный продукт, а, это — одно из основных требований, предъявляемым к инъекционным препаратам, можно лишь при правильной организации всего технологического процесса получения лекарства, в частности, контроля на содержание пирогенов. Наиболее рациональные точки контроля при изготовлении парентеральных лекарственных средств следующие: контроль сырья, контроль воды для инъекций, проверка элементов фильтра на вымывание из них пирогенов, контроль растворов перед стерилизующим фильтрованием, контроль чистоты ампул, флаконов. Основными источниками пирогенных веществ в воде для инъекций являются системы умягчения воды, деионизации и угольный фильтр, которые требуют наиболее пристального внимания, частой регенерации, очистке и т.п.

Требование апирогенности воды для инъекций связано с возможностью возникновения пирогенной реакции, которая выражается повышеним температуры тела, ознобом и другими симптомами. Причиной такой реакции часто являются эндотоксины граммотрицательных бактерий, которые при внутривенном введении обладают значительно большей активностью, чем при подкожном или внутримышечном введении. В связи с этим особенно опасны инфузионные растворы, загрязненные бактериальными эндотоксинами, т.к. они вводятся человеку в больших объемах.

Согласно ГФ XI тест на пирогенность проводится биологическим методом на кроликах, основанным на измерение температуры тела животных после внутривенного введения испытуемого препарата. Использование млекопитающих, вида, близкого к человеку, позволяет установить влияние испытуемого препарата на целый организм.

С помощью испытания на животных возможно определять действие обоих классов пирогенов — «экзо» и «эндо» — токсинов, а также пирогенов небактериальной природы. Однако этот метод достаточно длителен (4-5 часов), дает значительную вариабельность результатов, связанную с индивидуальной чувствительностью (чувствительность животных в 3-4 раза ниже, чем у человека), сезонностью. Используемые в эксперименте животные, должны содержаться в строго определенных условиях. Кроме того, многие лекарственные вещества в дозах, близких к терапевтическим, могут вызвать токсические реакции и даже гибель животных.

Наряду с фармакопейным методом возможно использование люминесцентного метода, основанного на способности бактериальных эндотоксинов усиливать флуоресценцию родамина 6Ж и 1-анилина-нафталин-8-сульфоната; флуориметрического метода, основанного на измерении собственной интегральной флуоресценции бактериальных пирогенов в пределах длин волн эмиссии от 310 до 400 нм. [3]

В настоящее время доминирующее значение для контроля за содержанием пирогенных примесей, а именно, бактериальных эндотоксинов (БЭ), получил LAL -тест, позволяющий проводить испытания in vitro .

В основе метода лежит способность лизата амебоцитов (клеток крови) мечехвоста Limulus polyphemus специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий — липополисахаридами. При взаимодействии эндотоксина и лизата происходит помутнение прозрачной реакционной смеси или образование твердого геля (тромбообразование), что и служит индикатором присутствия эндотоксина в реакционной смеси. Тест высокоспецифичен по отношению к эндотоксинам грамотрицательных бактерий. Чувствительность его во много раз превышает чувствительность фармакопейного теста на кроликах. ЛАЛ-тест имеет широкий спектр применения: контроль качества воды, парентеральных лекарственных средств, инъекционных и инфузионных растворов и медицинских изделий, в которых определение уровня бактериальных эндотоксинов предписано действующими нормативными документами, для оценки качества валидации в фармацевтической промышленности. Этот тест может быть использован и для оценки санитарного состояния питьевой воды и косвенного определения содержания в ней бактерий. К настоящему времени ЛАЛ-тест прочно внедрен в практику производства и контроля лекарственных средств на ведущих фармацевтических фирмах мира. Несмотря на высокую чувствительность ЛАЛ-теста, он, тем не менее, не является экспресс-методом. Кроме того, тест также имеет некоторые ограничения. В отличие от пирогенного теста на кроликах, выявляющего пирогены широкого спектра, ЛАЛ-тест позволяет выявить только бактериальные эндотоксины — высокомолекулярные комплексы, являющиеся структурными компонентами внешней клеточной стенки грамотрицательных бактерий [5].

В связи с развитием люминесцентных методов анализа и появлением на рынке России приборов, измеряющих люминесценцию (например, Флюорат02 АВФФ-ДХ), перспективной является разработка люминесцентного экспресс-метода определения пирогенности, который удобен для использования в условиях аптеки и на различных стадиях контроля воды для инъекций. В основе метода определения пирогенности воды для инъекций лежит измерение интенсивности люминесценции в присутствии липополисахаридобелкового комплекса (примесей).

источник

Н. В. Глазова, В. Л. Багирова, А. А. Крашенинников, А. В. Караваева,
Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия, НПФ «Люмекс», Институт стандартизации лекарственных средств

Основным источником пирогенных примесей в воде для инъекций является комплекс эндотоксина с белком грамотрицательных бактерий, который входит в состав наружной мембраны клеток [1]. Отделение связанного белка возможно лишь при наличии щелочей или фенола, что маловероятно в воде для инъекций. Поэтому в дальнейшем под термином «бактериальные эндотоксины в воде для инъекций» понимается липополисахаридобелковый комплекс.

До недавнего времени фармакопеями многих стран для испытания на пирогенность использовались кролики. Однако фармакологический тест опре­деления пирогенности на кроликах является качественным, т. е. запрещающим или разрешающим. Кроме того, результаты теста зависят от индивидуальных особенностей животных, их состояния. Не все лекарственные сред­ства могут быть тестированы с помощью данного метода [2].

Одним из активно развивающихся в настоящее время способов контроля пирогенности лекарственных препаратов, который вошел в фармакопеи многих стран, в том числе и России, является ЛАЛ-тест. В основе метода лежит способность лизата амебоцитов (клеток крови) мечехвоста Limulus polyphemus специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий — липополисахаридами. При взаимодей­ствии эндотоксина и лизата происходит помутнение прозрачной реакционной смеси или образование твердого геля (тромбообразование), что и служит индикатором присутствия эндотоксина в реакционной смеси.

Тест высокоспецифичен по отношению к эндотоксинам грамотрицательных бактерий. Чувствительность его во много раз превышает чувствительность фармакопейного теста на кроликах (табл. 1).

ЛАЛ-тест имеет широкий спектр применения: контроль качества воды, парентеральных лекарственных средств, инъекционных и инфузионных растворов и медицинских изделий, в которых определение уровня бактериальных эндотоксинов предписано дей­ствующими нормативными документами, для оценки качества валидации в фармацевтической промышленности. Этот тест может быть использован и для оценки санитарного состояния питьевой воды и косвенного определения содержания в ней бактерий. К настоящему времени ЛАЛ-тест прочно внедрен в практику производства и контроля лекарственных средств на ведущих фармацевтических фирмах мира. Несмотря на высокую чувствительность ЛАЛ-теста, он, тем не менее, не является экспресс-методом. Кроме того, тест также имеет некоторые ограничения. В отличие от пирогенного теста на кроликах, выявляющего пирогены широкого спектра, ЛАЛ-тест позволяет выявить только бактериальные эндотоксины — высокомолекулярные комплексы, являющиеся структурными компонентами внешней клеточной стенки грамотрицательных бактерий.

В связи с развитием люминесцентных методов анализа и появлением на рынке России приборов, измеряющих люминесценцию (например, Флюорат02 АВФФ-ДХ), перспективной является разработка люминесцентного экспресс-метода определения пирогенности, который удобен для использования в условиях аптеки и на различных стадиях контроля воды для инъекций. В основе метода определения пирогенности воды для инъекций лежит измерение интенсивности люминесценции в присутствии липополисахаридобелкового комплекса (примесей). Интенсивность люминесценции регистрируется при помощи анализатора биожидкостей типа Флюорат-02. В состав набора для анализа входит контрольный люминесцентный стандарт (КЛС), который должен быть предварительно откалиброван по эталонному люминесцентному стандарту (ЭЛС), который хранится у изготовителя.

Для установления порогового значения интенсивности люминесценции, которое определяет положительный или отрицательный результат на наличие пирогенных примесей в анализируемой воде для инъекций, мы проводили параллельное определение пирогенности на кроликах, определяли концентрацию бактериальных эндотоксинов по ЛАЛ-тесту и одновременно проводили измерение показателя люминесценции на приборе Флюорат-02.

Испытания на пирогенность на кроликах проводилось согласно ГФ XI, с. 186. Концентрацию бактериальных эндотоксинов проводили по ЛАЛ-тесту двумя способами: качественным гель-тромб-тестом согласно ОФС 42-002-00 [3] и количественным колориметрическим методом [1, 4].

Для проведения ЛАЛ-теста использовались реактивы производства «Charles River Endosafe» Inc (США) (регистрационное свидетельство МЗ РФ № 99/113 от 18.08.99), поставляемые в Россию фирмой «Тандра».

В работе использовался ЛАЛ-реагент чувствительностью 0,125 ЕДэ/мл (lot # L2061L) и 0,003 ЕДэ/мл (lot # L3111L), контрольный стандарт эндотоксина (0,5 мкг во фл.), оттитрованный по RSE (FDA) (lot # ES-6), вода для анализа по ЛАЛ-тесту (lot #P01411).

Качественный анализ содержания бактериальных эндотоксинов проводили в соответствии с ОФС 42-0002-00 [3]. Количественный анализ проводили колориметрическим методом [1, 4].

Расчет среднего геометрического значения интенсивности люминесценции в испытуемой пробе

*In — среднее арифметическое значение интенсивности люминесценции по результатам четырех повторных измерений одной пробы

Сравнительный анализ воды для инъекций на пирогенность различными методами на базе ОТК ООО «Самсон-Мед»

* — нормированная интенсивность люминесценции (In) представляет собой отношение интенсивности люминесценции пробы (Ii) к интенсивности люминесценции контрольного люминесцентного стандарта (Iо).
Н/д — не делали

Результаты определения пирогенности воды для инъекций различными методами в средней пробе* на базе ОТК ООО «Самсон-мед»

* — за среднюю пробу принята проба (не менее 500 мл), полученная смешением в асептических условиях шести разовых проб, отбираемых через каждые четыре часа из емкости через нижний штуцер под факелом;
** — за серию принято любое количество воды для инъекций, произведенное за единый промежуток времени (сутки) на одном оборудовании (осмотическая установка, дистиллятор).

В таблице 2 и 3 представлены данные анализа по трем методам серий образцов проб воды для инъекций, произведенных на ООО «Самсон-Мед». Следует отметить, что время проведения анализа на приборе Флюорат-02 занимало не более 5 минут, а на кроликах и по ЛАЛ-тесту — не менее 3х часов.

Как видно из таблиц 2 и 3, наблюдается корреляция (коэффициент корреляции r = 0,989, стандартная ошибка S = 0,0399 по программе CURVE EXPERT 1.3) между показателями нормированной интенсивности люминесценции (In) и концентрацией эндотоксина. По результатам таблицы 1 для удобства пользования был построен график зависимости In от концентрации эндотоксина (рис. 1), по которому можно рассчитать показатель In, соответствующий предельно допустимому содержанию бактериальных эндотоксинов в воде для инъекций, указанной в Фармакопеях США и РФ — 0,25 ЕЭ/мл [5, 6]. По графику это соответствует значению In равному 0,135. Кроме того, данное значение In можно рассчитать не используя график, а по среднегеометрическому значению логарифмов результатов, полученных по результатам измерений четырех повторностей (см. пример расчета ниже).

Рисунок 1. Зависимость нормированной интенсивности люминесценции от концентрации бактериальных эндотоксинов в воде для инъекций

Для определения значения интенсивности люминесценции в испытуемой пробе рассчитывают его среднее геометрическое значение, которое представляет собой антилогарифм среднего значения логарифмов результатов, полученных в каждой из четырех повторностей проб, отобранных из одной емкости.

Расчет производится по формуле:

Среднее геометрическое значение

где: — логарифм значения интенсивности люминесценции в каждой повторности,
— сумма логарифмов значений интенсивности люминесценции,
— количество повторностей.

Результат испытания в каждой пробе интерпретируется при In > 0,135 как положительный (пирогенная вода), при In —>

источник

Вода очищенная должна подвергаться химическому и бактериологическому контролю. Ежедневно (из каждого баллона, а при подаче воды по трубопроводу — на каждом рабочем месте ) — анализу на отсутствие хлоридов, сульфатов, солей кальция и др. Ежеквартально — полному химическому анализу. Два раза в квартал направляется в местную санитарно — бактериологическую лабораторию для бактериологического исследования.

Воду очищенную сохраняют в асептических условиях не более 3 суток в закрытых емкостях, изготовленных из материалов, которые не меняют свойств воды и защищают ее от механических включений и микробиологических загрязнений.

Большое значение для качества воды имеет способ ее сбора и хранения. Получаемая вода для инъекций собирается в чистые простерилизованные или обработанные паром сборники промышленного производства . Необходимые санитарно — гигиенические условия хранения воды для инъекций обеспечивают отечественные сборники.

Выбор сборника типа СИ для аптек зависит от объема работы и затраты очищенной воды. Сборники должны иметь четкую надпись: «Вода для инъекций». Если используется одновременно несколько сборников, они нумеруются.

В порядке исключения вода для инъекций может хранится в стерильных сборниках, которые плотно закрываются пробками с двумя отверстиями: одно — для трубки, по которой поступает вода, другой — для стеклянной трубки, в которую вставляется тампон из стерильной ваты для фильтрования воздуха. Приемник с меток защиты от пыли должен быть обязан закрыт в герметичный стеклянный бокс. Необходимо тщательно следить за чистотой баллонов и соединительных трубок, по которым поступает вода в сборник.

Обычные стеклянные бутылки с корковыми или притертыми пробками непригодны для хранения воды для инъекций.

Воду для инъекций используют свежеприготовленной или хранят при температуре от 5 до 10 С. При подготовке запаса воды для инъекций ее необходимо стерилизовать сразу же после пергонки в плотно закрытых сосудах 120 С в течении 20 минут или при 100 С в течение 30 минут, или подогревать в сборнике до температуры 80-95 С в процессе перегонки, сбора и затем хранить в септических условиях не более 24 часов.

Проверка качества воды для инъекций. В аптеках качество воды для инъекций проверяется химическими методами ежедневно с каждого баллона согласно требованиям ДФ на отсутствие хлоридов, сульфатов, солей кальция, возобновляемых веществ, аммиака и угольного ангидрида. Ежеквартально вода направляется в контрольно — аналитическую лабораторию для полного химического анализа. В этом случае, помимо вышеупомянутых анализов, в воде определяют рН, кислотность или щелочность, наличие сухого остаткаЮ нитратов, нитритов, тяжелых металлов.

Бактериологический контроль проводиться не реже 2 раз в квартал. В 1 мл очищенной воды, используемой для перегонки, предельно допустимое содержание микроорганизмов не должно превышать 10 -15 колоний.

Ежеквартально вода для инъекций контролируется на пирогенность, так как исследования на восстанавливающие вещества с калия перманганатом не может указывать на отсутствие пирогенных веществ.

Вода проверяется на отсутствие видимых механических включений.

Методы получения воды очищенной и воды для инъекций. Стадии технологического процесса получения воды.

Вода очищенная может быть получена дистилляцией, ионным обменом , электролизом, обратным осмосом. Вода — бесцветная , прлзрачная, без запаха и вкуса; рН может колебаться в пределах 5,0 — 7,0 ; не должна содержать восстанавливающих веществ, нитратов, нитритов, хлоридов, сульфатов, следов аммиака и других примесей.

Из методов получения воды очищенной распространенным является метод дистилляции (перегонки).

Перегонка воды должна проводиться в специально оборудованном для этого помещении. Стены помещения должны быть окрашены маслянной краской или выложены облицовочной плиткой и содержаться в абсолютной чистоте. В этих помещениях запрещается делать другие посторонние работы — мыть грязную посуду, стирать белье, хранить посторонние предметы. В порядке исключения может быть разрешена только стерилизация растворов лекарственных веществ.

Механические примеси обычно отделяют отстаиванием с последующим сливом воды из осадка или фильтрованием. Для этого используют фильтры, выполненные в виде емкости цилиндрической формы, заполненные антрацитом или кварцевым песком. Емкости имеют крышку и дно, Оснащенное устройством для ввода, вывода и распределения воды внутри фильтра. Фильтры могут быть однослойные или двухслойные. Высота загрузки колеблется в зависимости от количества взвешенных частиц и желаемого промывочного эффекта.

Нежелательно присутствие в воде солей кальция и магния, которые придают ей временную и постоянную жесткость, вследствие чего при дистилляции воды на стенках испарителя образуется накипь. Кроме того, при перегонке жесткой воды быстро выходят из строя нагревательные элементы дистиллятора. Временную жесткость обусловливает наличие кальция и магния гидрокарбонатов. От них можно избавиться кипячением воды. При этом гидрокарбонаты переходят в карбонаты и выпадают в осадок, который отфильтровывают. Но в этом случае вода насыщается углерода оксидом, медленно удаляется при кипячении, тем самым снижается рН воды очищенной. Поэтому для устранения временной жесткости целесообразно применять кальция гидроксил.

Постоянная жесткость воды обусловлена присутствием кальция и магния хлоридов, сульфатов и других солей. ее устраняют обработкой воды натрия карбонатом.

Доступен для каждой аптеки известково-содовый способ смягчения воды. Суть его в том, что в воду добавляют одновременно раствор кальция гидроксила и раствор натрия карбоната. Под действием кальция гидроксила устраняется временная (карбонатная) жесткость, поскольку кальция и магния гидрокарбонаты переходят в карбонаты и выпадают в осадок.

Под действием натрия карбоната выпадают соли постоянной (некарбонатных) твердости: сульфаты, хлориды и другие соли кальция и магния. Кальция гидроксил связывает также углерода диоксид, находящегося в воде.

Коагуляция коллоидных примесей. Коллоидную муть можно удалить только после предварительного укрупнения взвешенных частиц. Для разрушения коллоидной системы необходимо нейтрализовать электрический заряд частиц. Лишенные заряда частицы под действием сил взаимного притяжения соединяются-коагулируют. Укрупненные частицы имеют такую массу, при которой они теряют свою кинетическую устойчивость и выпадают в осадок. Нейтрализация заряда коллоидных частиц достигается добавлением в воду другого вещества также коллоидного характера, но частицы которой несут противоположный заряд.

Соединения кремниевой кислоты, находящиеся в воде, в коллоидно-дисперсном состоянии несут отрицательные заряды, поэтому для их коагуляции пригодны только вещества, заряженные в воде положительно. Как такое вещество чаще всего применяют алюминия сульфат или алюмокалиевые галуны. Обработку воды перед дистилляцией стоит делать в отдельных емкостях, чтобы избежать загрязнения аквадистилляторов.

Водопроводная вода, подготовленная таким образом, все же содержит достаточное количество солей, которые при дистилляции оседают на стенках испарителя и электронагревательных элементов, что значительно снижает производительность дистиллятора и нередко выводит из строя электронагреватели.

Метод магнитной обработки воды заключается в пропускании ее через зазоры, образованные в корпусе специального устройства между подвижными и неподвижными магнитами. В результате воздействия на воду магнитного поля изменяются условия кристаллизации солей при дистилляции. Вместо плотного осадка на стенках дистилляторов образуются рыхлые шламы, а в толще воды — суспендированных. При использовании устройства обязательное ежедневное сброса воды из аппарата для удаления шлама. Предложен электрохимический диализный аппарат с применением полупроницаемых мембран, а также ионообменная установка для получения обессоленной воды с использованием гранулированных ионитов и ионообменного целлюлозного волокна.

Общий принцип получения воды дистиллированной заключается в том, что питьевую воду, которая прошла водоподготовку, помещают в аквадистиллятор, состоящий из следующих основных частей: испарителя, пароотводной части (шлема и соединительных трубок), конденсатора (холодильника) и сборника. Для контроля уровня воды в камере испарения оборудовано водомерное стекло. Испаритель с водой нагревают до кипения. Пары воды поступают в конденсатор, где они скраплливаются и в виде дистиллята поступают в сборник. Все нелетучие примеси, находящиеся в исходной воде, остаются в аквадистилляторы.

источник

На всех фармацевтических предприятиях производится постоянный контроль качества используемой воды. Отбор проб и их анализ являются неотъемлемой частью системы отслеживания качества воды, которая была создана на основании проведенных валидационных испытаний. Объектами контроля являются:

• вода питьевая как материал для получения воды очищенной. В основном проверяется сторонними организациями, например, водоканалом.
• вода очищенная – вода, полученная дистилляцией, обратным осмосом, деионизацией, ультрафильтрацией или комбинацией перечисленных методов, используемая в нестерильном фармацевтическом производстве.
• вода для инъекций, полученная дистилляцией в несколько этапов и предназначенная для растворения лекарственных веществ перед фильтрацией и для последнего ополаскивания первичной тары фармацевтической продукции, приготовляемой асептически.

• Отбор проб проводится в определенных точках
• Пробы должны отбирать обученные работники, метод отбора проб должен быть задокументирован
• Пробы воды для проведения микробиологических анализов должны помещаться в стерильную тару
• Пробы воды в тот же день должны быть проанализированы в микробиологической лаборатории
• Пробы для определения эндотоксинов должны отбираться в специальную апирогенную тару
• Порядок пробоотбора – микробиология, эндотоксины, химический разбор, остальные анализы

WFI – вода для инъекций

Микробиологическая чистота – предельно допустимый показатель по Фармакопее – 10 КОЕ /100 мл (пример лимита действия – 1 КОЕ/100 мл)

Эндотоксины – макс. 0,25 МЕ / мл

PW – вода очищенная

Микробиологическая чистота – предельно допустимый показатель по Фармакопее – 100 КОЕ/1 мл (пример лимита действия – 30 КОЕ / мл)

Эндотоксины – макс. 0,25 МЕ/ мл

Лимиты тревоги и действия (для воды WFI и PW) устанавливаются на основании годового тренда на год вперед индивидуально для каждого производства. Если имеется несколько контуров воды, лимит действия устанавливается для каждого контура отдельно.

Определяется общее количество микроорганизмов в пробе установленного объема. Методикой первого выбора является фильтрование. В случае, если предполагается обнаружение большего количества микроорганизмов в воде, можно использовать альтернативный метод культивации пробы на агаровой среде.

Установление общего количества микроорганизмов – метод фильтрования.

• Используется стерильная фильтровальная аппаратура со стерильным мембранным фильтром с размером пор 0,45 ?м.
• Фильтрация проводится в контролируемой среде с использованием вакуумного насоса или центрального вакуума.
• Установленное количество контролируемой воды переливается в фильтровальное оборудование на мембранный фильтр, жидкость отфильтровывается, а мембранный фильтр при помощи стерильного пинцета переносится на поверхность агаровой среды.
• Количество воды для контроля – 200 мл воды для инъекций, 10 мл воды очищенной. Если ожидается высокое содержание микроорганизмов в воде очищенной, пробу необходимо перед анализом разбавить стерильной водой в соотношении 10x .
• Для установления общего количества бактерий в воде используется агаровая среда, предусмотренная Фармакопеей, способная поддерживать рост широкого спектра микроорганизмов (проводится подтверждающий анализ ростовых свойств)
• Инкубация фильтра на агаровой среде проходит в течение 5 дней при температуре 30 – 35°C.

Для фильтрации можно использовать оборудование Milliflex с одноразовыми простерилизованными фильтрами и воронками.

Установление общего количества микроорганизмов – метод подсчета на агаровой среде

• Стерильной пипеткой переносится по 1 мл анализируемой воды на 3 чашки Петри (? 9 см) с агаровой средой.
• Инкубирование, как и при фильтрационном методе.

Данная проверка не является обязательной, проводится для воды очищенной и устанавливает содержание Pseudomonas aeruginosa путем инкубации на цетримидовой агаровой среде. Это наиболее частый индикатор загрязненности фармацевтических вод.

Основная информация

Бактериальные эндотоксины представляют собой липополисахариды (ЛПС) клеточных стенок грамотрицательных бактерий. Высвобождение ЛПС происходит после прекращения жизнедеятельности и аутолиза клетки.

Бактериальные эндотоксины имеют пирогенные свойства, т.е. при внутривенном введении вызывают повышение температуры тела и другие нежелательные реакции вплоть до шока и летального исхода.

Бактериальные эндотоксины составляют более 90% всех эндотоксинов. К пирогенам небактериальной природы относятся вирусы, грибки, антигены или синтетические адъюванты. С учетом опасности бактериальных эндотоксинов и трудности их удаления (химического и физического) из зараженного лекарственного препарата, необходимо принимать меры к минимизированию риска контаминации на фармацевтическом производстве.

Источниками бактериальных эндотоксинов на производстве лекарственных средств являются вода, персонал, некоторые виды сырья. Поэтому особое внимание уделяется проверке отсутствия эндотоксинов в воде на разных этапах ее получения. С учетом вышеизложенного устанавливают содержание эндотоксинов в воде для инъекций, используемой для производства парентеральных препаратов, и в воде очищенной, используемой в производстве субстанций для последующего приготовления парентеральных препаратов.

Существует два основных метода определения эндотоксинов

1. Определение пирогенности на кроликах – установление всех пирогенов, включая эндотоксины
2. ЛАЛ тест (Limulus Amebocyte Lysate Test) – устанавливает эндотоксины (не пирогены как таковые)

ЛАЛ тест является «in vitro» методом, основанным на свойствах амебоцитов гемолимфы мечехвостов. Наиболее часто встречающимся представителем мечехвостов является Limulus polyphemus, от которого и произошло название реактива. Из амебоцитов приготовляется очищенный лизат, который используется для определения бактериальных эндотоксинов.

Принцип метода:

Бактериальный эндотоксин активирует в присутствии двухвалентных ионов (Ca, Mg) фактор B, содержащийся в лизате. Это дает начало каскадной реакции, в результате которой образуется гель.

Фактор B Эндотоксин Активированный фактор B

Проэнзим Активированный фактор B Коагуляционный энзим

Коагулоген Коагуляционный энзим Коагулин + гель

• Гелевый метод (оценивает возникновение геля, принцип лимитный или кинетический)
• Турбидиметрический метод (оценивает возникновение помутнения, принцип конечной точки «end-point» и кинетический)
• Хромогенный метод (оценивает возникновение окрашивания, принцип «end-point» и кинетический)

Гелевая методика является методикой первого выбора для определения эндотоксинов в воде.

Приготовление реактивов проводится согласно инструкции производителя набора (лизат + эндотоксин).

Лизат используется для установления эндотоксинов в неизвестных пробах. Чувствительность лизата обозначается буквой ? и указывается на каждом флаконе с лизатом.

Для фармацевтической воды (WFI или PW) максимально допустимое содержание составляет 0,25 МЕ/мл. В основном для установления данного лимита используется лизат с высокой чувствительностью ?=0,125.

Эндотоксин из набора используется для подтверждения приведенной чувствительности лизата, для валидации лабораторного метода и для приготовления ППК (позитивного продуктового контроля). Сила эндотоксина выражается в МЕ/мл или ЭЕ/мл. (МЕ – международная единица, ЭЕ – эндотоксиновая единица).

Эндотоксин растворяется в непирогенной воды согласно инструкции производителя таким образом, чтобы получился ряд 4, 2, 1, 1/2 и 1/4?, т.е. две более и две менее чувствительные концентрации, чем приведенная чувствительность ?.

Подготавливается ряд проб согласно таблице:

• В пробирки вносится по 0,1 мл приготовленных растворов
• Ко всем вышеперечисленным пробам добавляется по 0,1 мл растворенного лизата ЛАЛ
• Реакционная смесь смешивается и инкубируется в течение 60 минут при 37±1°C. После окончания реакции отсчитывается результат

Пробирки осторожно переворачиваются на 180° и отслеживается образование геля

• Позитивная реакция – гель густой, не стекает по стенкам
• Негативная реакция – жидкий гель, жидкость

Результат считается удовлетворительным, если:

• Ни в одной из пробирок с растворами A и D (негативный контроль и пробы) не произойдет реакция
• В растворе C подтвердится указанная чувствительность лизата (позитивный контроль)
• В растворе B не установлена чувствительность лизата менее 0,5 ? (0,06 МЕ/мл) и более 2 ? (0.25 МЕ/мл) – исследуемый раствор в данных условиях не содержит интерферирующие факторы и не влияет на добавленный эндотоксин.

Яна Гаклова (Jana Haklov?), доктор наук
эксперт компании FAVEA
Источник: favea.org

« Оцените, пожалуйста, публикацию
Загрузка.

источник