Как обнаружить аминокислоты при хроматографическом анализе

Общие сведения. Хроматографический метод анализа открыт русским ученым М. С. Цветом в 1903 г. В настоящее время многочисленные виды хроматографического анализа широко используются в различных областях химии и биологии.

В зависимости от физико-химических факторов, определяющих основной механизм процесса, методы хроматографического анализа делят на четыре основных вида: адсорбционные, распределительные, ионообменные и осадочные.

Для разделения смеси аминокислот чаще всего применяют метод распределительной хроматографии на бумаге. Он основан на различной степени распределения компонентов смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами (неподвижной водной фазой и подвижной фазой органического растворителя).

Органический растворитель (например, фенол, насыщенный водой, или смесь н-бутилового спирта, ледяной уксусной кислоты и воды), проходя через полоску фильтровальной бумаги, увлекает за собой аминокислоты, раствор которых был нанесен на бумагу. Различные аминокислоты передвигаются по бумаге с неодинаковой скоростью. Скорость перемещения аминокислот зависит от многих факторов: строения молекулы аминокислот, их способности легче растворяться в органическом растворителе или воде, избирательной адсорбции на бумаге, типа бумаги, условий проведения анализа и т. д. Чем лучше растворяется аминокислота в органическом растворителе, тем больший путь она пройдет с ним по бумаге.

Приняты два способа хроматографического разделения аминокислот на бумаге — восходящий и нисходящий. При восходящем способе растворитель поднимается по бумаге снизу вверх, при нисходящем — сверху вниз. Положение отдельных аминокислот обнаруживают путем проявления — обработки высушенной бумаги раствором нингидрина и последующего нагревания ее при 100° С. На полоске бумаги (хроматограмме) отчетливо видны пятна фиолетового, синего, голубого, желтого, оранжевого, коричневого цвета.

Положение аминокислот на бумаге можно установить и без проявления, рассматривая хроматограмму в ультрафиолетовых лучах. Пятна отчетливо флуоресцируют в ультрафиолете.

Для каждой аминокислоты характерна скорость перемещения, которую выражают с помощью коэффициента Коэффициентом называют отношение пути, пройденного аминокислотой (от места ее нанесения на бумагу до середины пятна на хроматограмме), к расстоянию от места нанесения смеси аминокислот до фронта растворителя:

где а — расстояние от места нанесения раствора смеси аминокислот до середины пятна данной аминокислоты, мм; b — путь, пройденный растворителем, мм.

Каждая аминокислота имеет определенное значение коэффициента которое может меняться в зависимости от вида применяемой бумаги, растворителя, температуры, pH среды и некоторых других факторов (табл. 2).

Табл. 2. Значения отдельных аминокислот (бумага ватман № 1),

Для разделения аминокислот применяют специальную хроматографическую фильтровальную бумагу высокого качества (она должна быть строго равномерной по толщине и одинаковой по плотности, характеризоваться незначительным содержанием примесей), например ленинградскую № 1 или 2 и импортную ватман № 1, 2, 3, а также (ГДР).

Реактивы: а) раствор смеси аминокислот: в 10 мл воды растворяют 60 мг аспарагиновой (или глютаминовой) кислоты, 40 мг глицина (или аланина) и 50 мг лейцина;

б) фенол, насыщенный водой: к 100 г перегнанного фенола добавляют 35 мл воды и перемешивают, для ускорения растворения фенола смесь можно слегка подогреть; в) смесь н-бутанола, ледяной уксусной кислоты и воды (4:1:1 по объему): реактивы смешивают в указанном соотношении. Для того чтобы смесь не расслаивалась, рекомендуется дополнительно прибавить несколько капель уксусной кислоты; г) нингидрин, 0,2%-ный раствор в этиловом или бутиловом спирте.

Оборудование: а) термостат, отрегулированный на температуру 37—38° С; б) сушильный шкаф, отрегулированный на 100—105° С; в) пробирки стеклянные большого размера (длина 18—20 см, диаметр см) с подобранными пробками; г) линейка с делениями на миллиметры; д) микропипетки; е) пульверизатор; ж) ножницы; з) игла с ниткой; и) штатив для пробирок.

Рис. 2. Упрощенный при бор для распределительной хроматографии аминокислот.

Материалы: Бумага фильтровальная хорошего качества (лучше пользоваться специальной хроматографической бумагой).

Вырезают полоску фильтровальной бумаги шириной 1,2 см, длиной 12—15 см (рис. 2). Один из концов полоски прокалывают иглой, протягивая нитку, которую завязывают петлей. На противоположном конце полоски, отступив на 1-1,5 см от ее края, графитовым карандашом очерчивают небольшой кружок (диаметром 3—5 мм), в который с помощью микропипетки вносят каплю раствора смеси аминокислот. Место нанесения раствора подсушивают на воздухе.

В сухую пробирку наливают около 1 мл насыщенного водой фенола или смеси -бутанола, уксусной кислоты и воды, следя, чтобы при этом не смочить стенки. В пробирку осторожно (за нитку) опускают полоску бумаги, погружая ее нижний конец в растворитель на 2—3 мм (не более!), и закрепляют в висячем положении с помощью

нитки и пробки. Полоска не должна касаться стенок пробирки. Пробирку ставят в термостат (при температуре 37—38°) на 1,5 ч, затем вынимают полоску и переносят ее на 10—12 мин. в сушильный шкаф, нагретый до 100—105°. В сушильном шкафу полоску подвешивают за нитяную петлю на стеклянную палочку. После испарения растворителя полоску вынимают из шкафа, опрыскивают раствором нингидрина (с помощью пульверизатора) и снова вносят в тот же сушильный шкаф на несколько минут. На хроматограмме появляются окрашенные пятна аминокислот (рис. 3). Линейкой измеряют расстояния:

а) от места нанесения капли раствора смеси аминокислот до середины данной кислоты;

б) от места нанесения капли раствора аминокислот до фронта растворителя. Рассчитывают каждой аминокислоты.

Рис. 3. Хроматограмма аминокислот.

При круговой хроматографии вместо пятен аминокислот на бумаге получают концентрически расположенные кольца. В принципе метод остается таким же, как и в предыдущей работе. Хроматографирование проводят в эксикаторах небольшого размера.

Реактивы: см. «Распределительная хроматография аминокислот на бумаге».

Оборудование: а) эксикатор малого размера с хорошо притертой крышкой; б) термостат (37—38° С);

в) сушильный шкаф (100—105° С).

Из хорошей фильтровальной бумаги (лучше — специальной хроматографической) вырезают круг соответствующего диаметра (на 2—3 см больше диаметра узкой части эксикатора). Для того чтобы поступал растворитель, из круга вырезают «фитиль» — полоску, шириной 2— 3 мм (рис. 4).

На расстоянии 0,5-0,6 см от центра круга наносят каплю раствора смеси аминокислот и высушивают на воздухе.

Растворитель наливают в стеклянный стаканчик или фарфоровую чашечку или же прямо на дно эксикатора.

Бумажный круг кладут на выступ над узкой частью эксикатора. «Фитиль» отгибают и опускают в растворитель.

Рис. 4. Распределительная круговая хроматограмма аминокислот: 1 — бумажный фильтр; 2 — фитиль; 3 — растворитель.

Эксикатор плотно закрывают и ставят в термостат (37—38° С) на 1,5-2 ч, после чего с хроматограммой проделывают все те же операции, что и при хроматографировании на полосках бумаги.

источник

Существует несколько разновидностей хроматографиче­ского метода анализа. Для разделения аминокислот наибо­лее доступным и сравнительно точным является метод рас­пределительной хроматографии на бумаге.

Метод основан на различной растворимости отдельных аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой — водонасыщенный органический растворитель (фенол, смесь бутилового спирта с уксусной кислотой и др.).

Сущность метода заключается в том, что каплю смеси аминокислот или гидролизата белка наносят на полоску хроматографической бумаги, конец которой опускают в под­ходящий органический растворитель. Растворитель всасыва­ется хроматографической бумагой и увлекает за собой нанесенные на бумагу аминокислоты. Скорость перемещения аминокислот на бумаге зависит от химического строения аминокислот и их способности растворяться в подвижном и неподвижном растворителе. В качестве подвижного раство­рителя употребляют, например, водонасыщенный раствор фе­нола, бутиловый спирт, амиловый спирт и др. Неподвижным растворителем является вода, пары которой насыщают хроматографическую бумагу (внешне бумага остается сухой). Чем меньше растворимость аминокислот в воде и чем больше их растворимость в органическом растворителе, тем быстрее они движутся вслед за его фронтом.

Положение аминокислот на бумаге можно обнаружить при помощи цветной реакции с нингидрином. Реакцию про­водят путем опрыскивания из пульверизатора высушенной полоски бумаги 0,5 % спиртовым раствором нингидрина и последующим нагреванием в сушильном шкафу. Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде пятен, окрашенных в голубой, фиолетовый или оранжевый цвета (в зависимости от химической структуры аминокислоты). Основной физико-химической характеристикой хроматографического процесса является коэффициент распределения Kd.

Коэффициент распределения (Kd) характеризует распределение вещества между подвижной и неподвижной фазами при достижении равновесия в хроматографическом процессе. Определить Kd непосредственно из эксперимента (т.е. найти концентрацию соединения в подвижной и неподвижной фазе) довольно сложно. Поэтому в качестве основной характеристики удерживания вещества, определяющей положение его зоны на бумаге используется фактор Rf.ФакторомRfназывают отношение расстояния (в мм) от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна ак расстоянию (в мм) от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя (в):

Фактор Rf является характерной вели­чиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги и т. д.). Идентификация аминокислот на хроматограммах проводится путем использования чистых аминокислот — «свидетелей», наносимых на ту же хроматограмму.

Исследуемые растворы аминокислот наносят вблизи цент­ра бумажного диска, зажатого по краям. Смесь растворите­лей подводят к центру диска при помощи «ножек» из бума­ги. Проводят разделение смеси, состоящей из трех аминокис­лот.

1 Цель работы – провести разделение и идентификацию аминокислот методом бумажной хроматографии

Приборы и материалы

Система растворителя — бутанол:уксусная кислота (конц.):вода в соотношении 3:1:1,4

Задача (раствор, содержащий смесь аминокислот)

Растворы аминокислот – «свидетелей» (глицин, лейцин, триптофан)

Раствор нингидрина в ацетоне 0,5 %.

Описание работы

1. Нанесение раствора на хроматографическую бумагу.

Из хроматографической бумаги вырезают диск диаметром 14 см. Диск перегибают по диаметрам, перпендикулярным друг к другу, и от центра круга чертят квадрат со стороной 2 см, далее делают надрез по диагоналям квадрата; полученные в виде уголков «ножки» отгибают. На расстоянии 0,5 см от линий сгиба «но­жек» простым карандашом чертят еще один квадрат, на середине каждой стороны отмечают точки. В одну точку при помощи капилляра наносят небольшую каплю исследуемого раствора смеси аминокислот. Диаметр получен­ного пятна не должен превышать 3 – 4 мм. В три другие точ­ки наносят растворы аминокислот-«свидетелей», входящих в исследуемую смесь. Рядом с точкой нанесения необходимо обозначить объект нанесения (задача, название аминокислоты-«свидетеля») простым карандашом. На одну и ту же точку следует наносить по 2 – 3 капли раствора, при этом после нанесения каждой капли бумагу слегка просушивают на воздухе и лишь затем наносят сле­дующую каплю.

2. Разделение в хроматографической ка­мере.

Просушенную на воздухе хроматограмму помещают между двумя половинами чашек Петри с одинаковыми диа­метрами, образующими хроматографическую камеру, так, чтобы «ножки» хроматограммы были погружены в органический растворитель бутанол – вода – уксусная кислота (3:1,4:1), который наливают в нижнюю чашку. Хроматографическое разделение проводят при комнатной температуре около 40 минут. Необходимо следить за линией фронта растворителя.

Насыщенный водой бутиловый спирт в уксусной кислоте впитывается бумажным диском и движется по нему, увлекая нанесенные вещества. Дальнейшее продвижение растворите­ля вызывает разделение исследуемой смеси на отдельные аминокислоты, движущиеся с разной скоростью соответствен­но коэффициентам их распределения между водой и органи­ческим растворителем.

3. Проявление хроматограммы.

После того как фронт растворителя пройдет 4/5 длины хроматограммы, хроматограмму извлекают из камеры, отмечают ка­рандашом фронт растворителя и сушат на воздухе под тягой до удаления растворителя. После этого хроматограмму проявляют, опус­кая в 0,5 % раствор нингидрина в ацетоне, и помещают в сушильный шкаф на 5 мин при температуре 80— 100°С, также можно проявить хроматограмму, нагревая ее над электроплиткой. На хроматограмме появляются пятна сине-фиолетового цвета. С по­мощью линейки измеряют расстояния а – от места нанесе­ния капли до середины каждого пятна и в – от места нане­сения капли до фронта растворителя. Проявившиеся пятна обводят карандашом и вычисляют фактор Rf для каждой аминокислоты. Сопостав­ляя положения пятен исследуемого раствора с положением пятен «свидетелей», определяют наличие тех или иных ами­нокислот в исследуемой смеси.

Дата добавления: 2017-02-28 ; просмотров: 1155 | Нарушение авторских прав

источник

Разделение аминокислот методом хроматографии на бумаге проводится с целью идентификации аминокислот, находящихся в растворе.

Определение свободных аминокислот важно для изучения обмена белков в организме. В норме в плазме крови и в моче содержится определенное количество аминокислот. При нарушении функции отдельных органов или физиологических систем (недостаточная функция печени, усиленный распад белков, ослабление выделительной функции почек и т.д.) в сыворотке, а иногда и в моче наблюдаются изменения в содержании аминокислот и в аминокислотном составе.

Метод основан на различной растворимости отдельных аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которой является вода, другой – водонасыщенный органический растворитель (смесь бутилового спирта с уксусной кислотой). Водная фаза неподвижна, так как в данном случае вода сорбирована на инертном носителе – целлюлозе, которая в насыщенной влагой атмосфере (хроматографической камере) удерживает до 20% воды, оставаясь внешне сухой; подвижной фазой является насыщенный водой органический растворитель. Чем больше растворимость аминокислоты в водной фазе и меньше – в органическом растворителе, тем медленнее движется аминокислота по бумаге с органическим растворителем. По ходу передвижения растворителя смесь аминокислот будет разделяться, причем те из них, которые растворяются в органическом растворителе лучше, продвигаются вдоль бумаги дальше, те же, которые растворяются в нем хуже, делают более короткий путь. Поэтому местоположение вещества на хроматограмме зависит от его коэффициента распределения — ά:

В распределительной хроматографии важен подбор такого органического растворителя (подвижная фаза), при котором различны значения » ά » для отдельных компонентов смеси.

В свою очередь от » ά » зависит коэффициент скорости движения – Rf (retention factor – фактор удерживания), который легко определить практически:

Rf данного вещества зависит не только от качества растворителя (его состава, рН), но и от температуры среды и качества используемой бумаги (плотность, толщина и др.). Поэтому очень важно хроматографию проводить при определенной и постоянной температуре (20-22°) и пользоваться только предназначенной для хроматографии бумагой.

Rf является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен для данных условий опыта. Поэтому им широко пользуются при идентификации веществ при их анализе методом распределительной хроматографии на бумаге. Для этого сравнивают Rf аминокислот исследуемой смеси с Rf известных стандартных аминокислот.

Основные преимущества хроматографического метода – простота, точность данных при незначительных количествах исследуемых веществ (десятые и сотые доли миллиграмма), быстрота и возможность одновременно проводить большое количество анализов.

Ход работы: Для разделения смеси аминокислот вырезают полоску хроматографической бумаги длиной 15-16 см и шириной 1,5 см, в зависимости от величины хроматографической камеры, в которой проводится хроматографирование. В качестве хроматографической камеры могут использоваться большие пробирки, стеклянные цилиндры. Хроматографическую бумагу, можно брать только пинцетом. Один из концов полоски «заостряют», отрезая от него кусочки ножницами, и на нем проводят простым карандашом линию на расстоянии 2 см от края. Этот конец бумаги зажимают между двумя стеклянными пластинками и проводят стеклянной палочкой, смоченной раствором смеси аминокислот, по начерченной линии. После подсыхания полоски вновь наносят порцию аминокислот. Эту процедуру повторяют 3-4 раза.

На дно хроматографической камеры осторожно, не смачивая стенок, наливают из пипетки 1-2 мл смеси бутанола, уксусной кислоты и воды (4:1:5).

Конец хроматограммы, где не нанесена смесь аминокислот, прикрепляют с помощью иголки к пробке, которой плотно закрывают хроматографическую камеру, при этом заостренный конец хроматограммы должен быть погружен в растворитель на 1 см, полоска со смесью аминокислот не должна касаться растворителя, (рис.1). Хроматографирование проводят в течение 1,5-2 часов. За это время проявитель пройдет по хроматограмме путь снизу вверх, равный примерно 10 см. Затем хроматограмму вынимают из камеры, отмечают границу фронта продвижения растворителя (делают надрезы ножницами слева и справа) и высушивают под тягой. На высушенную хроматограмму наносят с помощью пульверизатора 0,5% раствор нингидрина в ацетоне так, чтобы вся хроматограмма была равномерно (без подтеков) смочена раствором. Как только ацетон испарится, хроматограмму помещают в сушильный шкаф при температуре 70°С на 15 минут. Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде цветных (синих или фиолетовых) пятен, расположенных на разных расстояниях от места нанесения исследуемой смеси.

На хроматографической бумаге наблюдают нингидриновую реакцию (лабораторная работа №1).

Рис.1. Упрощенный прибор для распределительной хроматографии на бумаге: 1-пробка; 2-иголка; 3-фронт растворителя; 4-пробирка; 5-полоска хроматографической бумаги; 6-место нанесения смеси аминокислот, очерченное карандашом; 7-растворитель.

Идентификацию аминокислот осуществляют по значению Rf. Для этого измеряют с точностью до миллиметра расстояние, пройденное проявителем от линии нанесения аминокислот до границы фронта проявителя. С такой же точностью измеряют расстояние от точки нанесения аминокислот до центра цветного пятна. Путем деления величины пути, пройденного аминокислотой на хроматограмме, на величину пути, пройденного проявителем, находят значение коэффициента Rf.

Таким же образом вычисляют Rf для стандартных известных аминокислот (хроматограммы с известными аминокислотами ставятся параллельно). И сравнивая Rf известных аминокислот с Rf аминокислот смеси, определяют последние.

ЗНАЧЕНИЯ Rf АМИНОКИСЛОТ (при температуре 20°С)

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: При сдаче лабораторной работы, студент делает вид, что все знает; преподаватель делает вид, что верит ему. 9446 — | 7325 — или читать все.

193.124.117.139 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

В настоящее время для разделения и количественного определения белков и аминокислот, а также нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и их метаболитов широко используется метод хроматографии – динамического разделения смеси веществ.

Существует несколько разновидностей хроматографического метода анализа, различающихся по механизму разделения веществ. Важнейшими из них являются следующие:

адсорбционная хроматография, основанная на различной способности отдельных соединений адсорбироваться на тех или иных сорбентах;

ионообменная хроматография, основанная на различной способности разделяемых веществ к ионному обмену с тем или иным ионитом;

распределительная хроматография, основанная на различной растворимости разделяемых веществ в двух частично смешивающихся жидкостях;

диффузионная хроматография, основанная на разделении веществ по скорости диффузии внутрь сорбента; к этому типу хроматографии относится гель-фильтрационная хроматография, разделение веществ при которой основано на механическом явлении молекулярного просеивания;

хроматография по сродству, новый и высокоспецифический метод разделения различных соединений, основанный на применении нерастворимых биологически активных веществ, обладающих сродством к разделяемым веществам.

Различаются хроматографические методы анализа и по технике выполнения. Так адсорбционная, ионообменная, распределительная и диффузионная хроматографии могут проводиться в колонках и на плоскости (на бумаге или в тонких слоях).

При газовой хроматографии (адсорбционной или распределительной) разделение смеси веществ ведется в атмосфере газа (разделение компонентов газовой смеси).

Современные хроматографические методы позволяют быстро выделить отдельные компоненты из небольшого количества сложной смеси.

Для разделения аминокислот наиболее доступным и сравнительно точным является метод распределительной хроматографии на бумаге. Для этой цели можно применять любую фильтровальную бумагу хорошего качества. Метод основан на различной растворимости отдельных аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой – водонасыщенный органический растворитель (фенол, смесь бутилового спирта с уксусной кислотой и др.). Водная фаза неподвижна, так как в данном случае вода сорбирована на инертном носителе – целлюлозе, которая в насыщенной влагой атмосфере (в хроматографической камере) удерживает до 20-22% воды, оставаясь внешне сухой; подвижной фазой обычно является насыщенный водой раствор фенола. Чем больше растворимость аминокислоты в водной фазе и меньше – в органическом растворителе, тем медленнее движется аминокислота по бумаге с органическим растворителем.

Сущность метода заключается в том, что на хроматографическую бумагу в одну точку или по одной линии наносят исследуемую смесь веществ (аминокислот). После подсушивания конец бумаги погружают в смесь растворителей, которая вследствие капиллярности бумаги постепенно всасывается в нее. По ходу передвижения растворителя смесь аминокислот будет разделяться, причем те из них, которые растворяются в органическом растворителе лучше, продвигаются вдоль бумаги дальше, те же, которые растворяются в нем хуже, делают более короткий путь. Когда фронт растворителя начнет приближаться к другому краю бумаги, процесс прекращают и бумагу высушивают. Затем хроматограмму проявляют реагентом, дающим с аминокислотами цветную реакцию. Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде цветных пятен, расположенных на разных расстояниях от места нанесения исследуемой смеси.

Скорость перемещения отдельных аминокислот может быть выражена посредством коэффициента распределения (Rf). Коэффициентом распределения называется отношение расстояния (в миллиметрах) от места нанесения аминокислоты (в составе исследуемой смеси) до середины ее пятна (a) к расстоянию от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя (b):

Коэффициент распределения является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги и др.).

Наиболее часто идентификация аминокислот на хроматограммах проводится путем использования чистых аминокислот «свидетелей», наносимых на ту же хроматограмму. Методы хроматографического анализа на бумаге довольно разнообразны.

1. Хроматографическое разделение растительных пигментов на бумаге

Приборы. Ступка фарфоровмя, химический стакан на 250 мл., стеклянная палочка, полосы фильтровальной бумаги 4х25 мм, штатив с кольцом, воронка с бумажным фильтром.

Реактивы. Стеклянный песок, свежие зеленые листья, ацетон, 85% раствор, мел.

Ход работы. Берут 2,0 г мелкоизмельченных листьев, помещают их в фарфоровую ступку и добавляют небольшое количество стеклянного песка и щепотку мела (для нейтрализации органических кислот, находящихся в растительных соках). К полученной смеси небольшими порциями добавляют 10 мл ацетона, непрерывно растирая содержимое ступки. Когда в ступке образуется однородная масса, ее фильтруют через бумажный фильтр в химический стакан. В отфильтрованный ацетоновый экстракт из листьев опскают на 2-3 мм полоску фильтровальной бумаги, укрепленную при помощи скрепки на стеклянной палочке. Полоска бумаги не должна касаться стенок стакана. Спустя 20-30 мин наблюдают зональное разделение разноокрашенных растительных пигментов на полоске фильтровальной бумаги.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Хроматография – один из эффективных и широко применяемых в биохимических исследованиях методов разделения аминокислот. Наиболее простой и доступной является распределительная хроматография на бумаге. Для проведения ее используют систему растворителей, составляющих подвижную и неподвижную фазы, от правильного подбора которых зависит эффективность разделения аминокислот. В частности, применяют фенол, насыщенный водой. При обработке хроматографической бумаги этой смесью растворителей вода с небольшим количеством фенола впитывается в бумагу и образует неподвижную фазу, а фенол, насыщенный водой, служит подвижной фазой.

В зависимости от направления фронта передвижения растворителя различают следующие виды хроматографии: восходящую, нисходящую, одномерную, двухмерную и радиальную. Расположение отдельных аминокислот обнаруживают путем проявления хроматограмм. Для этого высушенную бумагу обрабатывают раствором нингидрина и затем нагревают ее в сушильном шкафу при 100°С, т.е. проводится качественная нингидриновая реакция на аминокислоты, находящиеся на бумаге.

Скорость перемещения аминокислот выражают коэффициентом R_f, который представляет собой отношение расстояния, пройденного данной аминокислотой, к пути, пройденному фронтом растворителя:

где a – расстояние от места нанесения раствора смеси аминокислот (линия старта) до центра пятна конкретной аминокислоты;

b – путь, пройденный растворителем от линии старта до его фронта окончания хроматографии, мм.

Для каждой аминокислоты характерно свое значение R_f, которое зависит от сорта хроматографической бумаги, системы растворителей, температуры, рН среды и т.д.

Реактивы. Фенол, насыщенный водой * ; нингидрин, 0,2%-ный раствор в ацетоне.

Оборудование. Термостат, отрегулированный на температуру 37-38°С; сушильный шкаф, отрегулированный на температуру 100-105°С и имеющий перекладины с крючками для подвешивания хроматограмм; большие пробирки (диаметр 2,0-2,5 см, длина 18-20 см) с плотно подогнанными пробками и штатив для них; полоски хроматографической бумаги (ленинградская, лучше марки «быстрая», 12х150 мм); простой карандаш и линейка; игла с ниткой; микропипетка; чашка Петри или пульверизатор; пинцет; ножницы; пипетка вместимостью 5 мл.

Материалы. Раствор смеси L-аланина, лейцина и глутаминовой кислоты, 0,04 моль/л.

Метод основан на разной скорости передвижения аминокислот по бумаге в зависимости от коэффициента распределения их между неподвижной (вода с примесью фенола) и подвижной (фенол, насыщенный водой) фазами растворителя.

Ход определения. Берут пинцетом за конец полоску бумаги (не касаться бумаги пальцами!), прокалывают его иглой с ниткой, которую завязывают петлей длиной 5-6 см. На противоположном конце полоски, отступив от края 2 см, проводят простым карандашом линию старта и в центре ее очерчивают кружок диаметром 3-4 мм для нанесения раствора смеси аминокислот.

Полоску укладывают на лежащие стеклянные пробирки и наносят 0,2 мл раствора смеси аминокислот, но не сразу, а порциями. После нанесения каждой порции пятно подсушивают, чтобы оно не расплывалось за пределы очерченного карандашом кружка.

В сухую пробирку с помощью пипетки вносят 2 мл фенола, насыщенного водой (при работе с фенолом соблюдать осторожность: вызывает ожоги! Не насасывать его в пипетку ртом!), следя за тем, чтобы не смочить стенки пробирки.

Ставят пробирку в штатив строго вертикально. Осторожно, держа за нитку, опускают в пробирку полоску бумаги, погружая ее нижний конец в растворитель не более чем на 2-3 мм, и закрепляют ее в висячем положении, прижав петлю плотно закрытой пробкой (рис.4).

Помещают штатив с пробиркой в термостат (при 37-38°С) на 1,5 ч.

Рис. 4. Прибор для хроматографии (а)

и хроматограмма аминокислот (б)

Затем вынимают полоску, подвешивают ее за петлю в сушильном шкафу и выдерживают при 100-105°С в течение 10 мин.

Для проявления хроматограммы полоску переносят в чашку Петри, в которую налито 15 мл раствора нингидрина, держа ее пинцетом, проводят через раствор и вновь помещают в сушильный шкаф на 5 мин при той же температуре.

Оформление работы. Зарисовать в рабочем состоянии прибор, отметив положение аминокислот на хроматограмме. Измерить линейкой расстояния (в мм) a и b для каждой аминокислоты и рассчитать их R_f. В выводе отметить возможность разделения хроматографией на бумаге разных аминокислот.

Практическое значение работы. Хроматографический анализ свободных аминокислот в сыворотке крови, моче и других жидких средах применяется в клинике для диагностики наследственных заболеваний обмена аминокислот, патологии печени, почек, а также при оценке степени тяжести сахарного диабета: в фармации – для контроля качества белковых гидролизатов и препаратов смеси аминокислот, а в научных экспериментах – для изучения аминокислотного состава гидролизатов очищенных белков.

Последнее изменение этой страницы: 2017-01-24; Нарушение авторского права страницы

источник

Хроматографические методы применяют для сорбционно-динамического разделения смесей аминокислот, белков, углеводов, липидов и их метаболитов. Существует множество видов хроматографии, каждый из которых имеет свои биохимические основы.

Достаточно точным и доступным является метод распределительной хроматографии (модификация адсорбционной хроматографии). В данной работе в качестве адсорбента используется специальная фильтровальная бумага.

В основе распределительной хроматографии лежит различная растворимость аминокислот в полярных и неполярных растворителях. При использовании двух жидкостей, одна из которых полярна, а другая неполярна, гидрофобные аминокислоты будут переходить в неполярную жидкость, гидрофильные аминокислоты – в полярную. Если какая-либо из этих жидкостей движется, то вместе с ней будут передвигаться соответствующие аминокислоты.

При хроматографии на бумаге вода (полярная жидкость) находится между целлюлозных волокон и является неподвижной полярной фазой. В качестве подвижной неполярной фазы используется органический растворитель бутанол.

При проведении анализа более гидрофобная аминокислота, лучше растворяющаяся в подвижном неполярном растворителе, движется с большей скоростью от линии старта, чем гидрофильная аминокислота, которая переходит в неподвижный водный слой. В результате этого отдельные аминокислоты по окончании хроматографического разделения оказываются на разном расстоянии от линии старта.

Радиальную хроматографию проводят на бумаге в чашке Петри. Растворитель перемещается от центра к периферии и захватывает аминокислоты, которые распределяются концентрическими кругами и обнаруживаются после высушивания бумаги и проведения нингидриновой реакции.

Хроматографическая смесь (бутанол : уксусная кислота : вода, 1,5:1,5:1,0); 2) 0,2% спиртовый р-р нингидрина.

Растворы аминокислот-свидетелей – глицина, аланина, лейцина (40 ммоль/л); исследуемые растворы 1, 2, 3, содержащие аминокислоты в различном сочетании.

Диск бумаги следует держать за края, чтобы избежать появления отпечатков пальцев на хроматограмме.

Диск специальной хроматографической бумаги карандашом делят на 4 сектора и обозначают их согласно исходным растворам. На расстоянии 1,0 см от центра карандашом отмечают круговую линию старта. В центре листа хроматографической бумаги делают отверстие диаметром около 0,2 см и вставляют фитиль из скрученной полоски бумаги. Высота фитиля должна быть равна высоте чашки Петри.

Стеклянными капиллярами на линию старта в секторах 1, 2, 3 наносят соответствующие растворы аминокислот-свидетелей и в сектор 4 – исследуемую смесь аминокислот.

Просушивают хроматограммы на воздухе до исчезновения влажных пятен.

Хроматограмму помещают в заранее приготовленную чашку Петри (хроматографическую камеру), на 1/3 заполненную хроматографической смесью. Разделение проводят в закрытой чашке Петри, чтобы избежать испарения растворителя, при комнатной температуре под визуальным контролем (в течение 15‑30 минут).

Когда фронт растворителя достигнет границ бумажного диска, разделение прекращают. Немедленно (!) карандашом обводят по всей окружности линию фронта растворителя.

Хроматограмму высушивают при температуре 90‑100С с целью устранения растворителей и фиксации аминокислот.

Далее хроматограмму опрыскивают раствором нингидрина, вновь выдерживают при 100С. На бумаге проявляются красноватые, пурпурно-красные, в большинстве случаев сине-фиолетовые пятна, соответствующие расположению различных аминокислот.

Рассчитывают коэффициент распределения R_fдля каждой аминокислоты:

R_f =, где

а – расстояние, пройденное от линии старта аминокислотой (мм), b ‑ расстояние, пройденное фронтом растворителя (мм).

Идентифицируют аминокислоты, находящиеся в исследуемом растворе (сектор 4), путем сравнения их положения (коэффициент R_f) с положением соответствующих аминокислот, используемых в качестве «свидетелей» (сектора 1, 2, 3).

источник

Метод распределительной хроматографии на бумаге

Метод распределительной хроматографии на бумаге является точным и доступным методом для разделения смеси аминокислот. При этом методе в качестве адсорбента используют специальную фильтровальную бумагу. Хроматографию проводят в закрытой камере, чтобы избежать испарения растворителя.

Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге используют для определения аминокислотного состава белка, для качественного и количественного определения аминокислот в биологических жидкостях и тканях. Этот метод позволяет выделить отдельные вещества из небольшого количества сложной смеси.

Радиальная хроматография является одной из разновидностей метода распределительной хроматографии.

Принцип метода. Отдельные аминокислоты обладают различной растворимостью в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой – водонасыщенный органический растворитель, например изопропанол (фенол, бутанол и др.) Из двух частично смешивающихся жидкостей один растворитель должен быть полярным (неподвижная фаза), а другой неполярным – подвижная фаза. Более гидрофобная аминокислота или другое вещество, лучше растворяющееся в неполярном растворителе, движется с большей скоростью от линии старта, чем гидрофильная аминокислота. В результате этого смесь аминокислот по окончании хроматогрфического разделения оказывается на разном расстоянии от линии старта.

Радиальную хроматографию проводят на бумаге в чашке Петри. Растворитель перемещается от центра к периферии и захватывает аминокислоты, которые распределяются концентрическими кругами и обнаруживаются после высушивания бумаги и проведения нингидриновой реакции.

Реактивы, оборудование, исследуемый материал

1. Изопропиловый спирт, насыщенный водой (смешать изопропанол с дистиллированной водой в соотношении 7:3)
2. Нингидрин, 0,2% раствор в ацетоне или в этиловом спирте 96%.
3. Чашка Петри (две половинки одного диаметра 11см)
4. Хроматографическая бумага (диск диаметром 12 см. или квадрат со стороной 12 см.)
5. Ножницы
6. Сушильный шкаф
7. Пинцет.
8. Линейка.
9. Карандаш простой.
10. Капельная пипетка или пульверизатор
11. Автоматический дозатор с объёмом на 5 мкл. или капилляр.
12. Пипетка одноразовая
13. Растворы аминокислот

1. Вырежьте бумажный квадрат со стороной 12 см. или диск диаметром 12 см. Это есть заготовка для хроматограммы (стороны бумажной заготовки должны на 1см быть больше диаметра чашки Петри)
2. Проведите в заготовке диагонали простым карандашом. Заготовку надо держать за края, чтобы избежать появления отпечатков пальцев на хроматограмме!
3. В точке пересечения диагоналей сделайте отверстие (≈ 0,5 см.).
4. Из хроматографической бумаги вырежьте прямоугольник размером 2х3 см., сверните его в трубочку по длине прямоугольника – это ножка для заготовки.
5. Оденьте ножку в отверстие заготовки.
6. Отступив от центра на 1 см, в каждом секторе заготовки обводите простым карандашом кружки диаметром ≈ 0,5 см. и обозначьте их цифрами 1,2,3,4.
7. В кружки 1,2,3 нанесите соответствующие аминокислоты аланин (1), глутаминовая (2), лейцин (3), а в кружок 4 нанесите смесь этих аминокислот. Для каждой аминокислоты надо брать чистый наконечник! Размер пятна наносимой аминокислоты не должен выходить за края кружка.
8. После нанесения аминокислот заготовку необходимо просушить 10 минут на воздухе, чтобы не было влажного пятна.
9. На дно чашки Петри налейте 10 – 12 мл водонасыщенного раствора изопропилового спирта. Заготовку положите на чашку Петри так, чтобы ножка заготовки была погружена в раствор, а сама бумажная заготовка лежала на краях нижней половинке чашки. Чашку Петри накройте крышкой (если ножка высока, то подрежьте её ножницами до нужной высоты) и проведите хроматографическое разделение в течение часа при комнатной температуре. По ножке растворитель поднимается вверх и распределяется по окружности бумаги, увлекая за собой нанесённые аминокислоты. При этом происходит разделение исследуемой смеси на отдельные аминокислоты, движущиеся с разной скоростью, соответственно коэффициентам их распределения меду водой и изопропанолом.
10. Когда фронт растворителя дойдёт почти до края заготовки, крышку чашки Петри снимите, на неё положите сверху заготовку, удерживая пинцетом её края, обведите простым карандашом фронт растворителя.
11. Поместите хроматограмму в термостат при температуре 90 – 100 о С на 10 минут с целью устранения растворителя и фиксации аминокислот.
12. Остатки растворителя пипеткой слейте обратно в ёмкость.
13. Для выявления пятен аминокислот хроматограмму опрысните 0,2% раствором нингидрина из пульверизатора ( или залейте из пипетки) и вновь высушите в сушильном шкафу при температуре 90 – 100 о С 5 минут. При этом проявляются аминокислоты в виде отдельных полос, окрашенных в розово-фиолетовый цвет, где каждое пятно соответствует определённой аминокислоте.
14. Сравнивая расположение пятен в исследуемой смеси в секторе 4 (опыт) с положением пятен отдельных аминокислот в секторах 1,2,3 (контролях), установите присутствие в смеси определённых аминокислот. Для чего рассчитайте для каждой аминокислоты коэффициент распределения – Rf или скорость перемещенияпо формуле: Rf = a/ b , где a – расстояние в миллиметрах, пройденное аминокислотой от места нанесения аминокислоты до середины её пятна; b – расстояние в миллиметрах от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя. Чем меньше растворимость аминокислоты в воде и чем больше её растворимость в органическом растворителе, тем быстрее она движется вслед за фронтом растворителя, тем больше величина Rf , и, наоборот, чем больше её растворимость в воде и меньше в органическом растворителе, тем медленнее аминокислота будет передвигаться и тем меньше величина Rf . Коэффициент распределения Rf – величина постоянная для каждой аминокислоты при постоянных условиях опыта (температура, сорт бумаги, растворитель).
15. Сравните коэффициенты распределения известных стандартных аминокислот (в контрольных секторах 1,2.3) с коэффициентом распределения аминокислот, выделенных из исследуемой смеси ( в опытном секторе 4) и сделайте вывод о наличие отдельных аминокислот в исследуемом материале.
16. Запишите вывод, хроматограмму приклейте или прикрепите степлером в тетрадь.

источник

Хроматографическое разделение аминокислот осуществляется при помощи различных адсорбентов: активированного угля, оксида титана, селикагеля, ионообменных смол и др. В последнее время широко применяют метод распределительной хроматографии на бумаге. [1]

Хроматографическое разделение аминокислот проводят по методике, описанной на стр. [2]

Хроматографическое разделение аминокислот проводят по методике, описанной выше ( см. стр. После развития хроматограммы вырезают участки пятен, занимаемые аминокислотами; сбоку хроматограммы вырезают равные по площади опытным контрольные участки, не содержащие определяемых веществ. [3]

Хроматографическое разделение аминокислот проводят по методике, описанной выше ( см. стр. [5]

Хроматографическое разделение аминокислот проводят по методике, описанной на стр. [6]

Хроматографическое разделение аминокислот проводят по методике, указанной на стр. После развития окраски на хрома-тограмме в течение 15 мин при 60 С или в течение суток при комнатной температуре вырезают участки хроматограммы, занимаемые пятнами аминокислот; сбоку хроматограммы вырезают контрольные участки, равные по площади опытным. Вырезанные участки бумаги измельчают ножницами и помещают в пробирки. В каждую пробирку добавляют по 10 мл 0 005 % — ного раствора сульфата меди GuSO4 — 5H2O в 75 % — ном этиловом спирте; объем доводят до 100 мл 96 % — ным этиловым спиртом. [7]

Хроматографическое разделение аминокислот на бумаге, а) Растворы аминокислот: 5 мг аминокислоты ( глицина, аланина, валина, лизина, фенилала-нина) растворяют в 5 мл 10-процентного изопропилового спирта, подкисленного соляной кислотой. [8]

Результаты хроматографического разделения аминокислот регистрируются на диаграммной ленте в виде профиля элюиро-вания, где на оси абсцисс откладываются объем элюата, на оси ординат — количество вещества в отдельных фракциях. Симметричные пики соответствуют отдельным аминокислотам: базовая линия — фракциям, не содержащим нингидринположительных компонентов. При расчете содержания вещества в отдельных фракциях из полученных величин вычитают среднее значение высоты базовой линии, соответствующее данному пику. Среднюю высоту базовой линии определяют, соединяя прямой значения фона до и после пика и отсчитывая величину, соответствующую полуширине пика. Среднюю высоту базовой линии умножают на число фракций, соответствующих данному пику, и вычитают из суммарного содержания вещества в зоне; таким путем получают количество вещества в данном пике в пересчете на лейцин. Чтобы определить истинное содержание данной аминокислоты, эту величину умножают на фактор, который носит название лейцинового эквивалента и представляет собой отношение интенсивностей окраски данной аминокислоты и лейцина в стандартных условиях. [9]

Приняты два способа хроматографического разделения аминокислот на бумаге — — восходящий и нисходящий. При восходящем способе растворитель поднимается по бумаге снизу вверх, при нисходящем — — сверху вниз. Положение отдельных аминокислот обнаруживают путем проявления — обработки высушенной бумаги раствором нингидрина и последующего нагревания ее при 100 О. Па полоске бумаги ( хроматограмме) отчетливо видны пятна фиолетового, синего, голубого, желтого, оранжевого, коричневого цвета. [10]

В связи с этим проведение хроматографического разделения аминокислот в газовой фазе позволяет анализировать природные соединения, доступные в миллимикрограммовых количествах, что на несколько порядков превышает чувствительность фотометрических определений. [11]

В связи с этим проведение хроматографического разделения аминокислот в газовой фазе позволяет анализировать природные соединения, доступные в миллимикрограммовых количествах, что на несколько порядков превышает чувствительность фотометрических определений. [12]

В этой работе описывается применение автоанализатора для хроматографического разделения аминокислот . В автоанализатор вводится как один из блоков разделительная колонка с ионообменной смолой. Пропорциональный насос автоанализатора используется для прокачивания элюирующего раствора через колонку, подачи нингидринового реактива и циркуляции воды через рубашку разделительной колонки для ее термостатирования. В проточном реакторе автоанализатора проводится нингидриновая реакция. [13]

Основное внимание было уделено препаративным способам разделения аминокислот в гидролизатах белков на группы нейтральных, кислых и щелочных продуктов и хроматографическому разделению аминокислот в пределах каждой из этих групп и в исходных смесях. [14]

Как уже отмечалось, иониты на основе целлюлозы и дек-страна не обладают необходимыми механическими и ионообменными свойствами и вследствие этого их редко используют для хроматографического разделения аминокислот . [15]

источник

Хроматография является эффективным методом для решения одной из важнейших задач биохимии – разделения и идентификации химических соединений (белков, аминокислот, жирных кислот, моно- и дисахаридов и др.). Метод предложен в 1903 г. профессором Воронежского университета М.С. Цветом для разделения растительных пигментов.

В настоящее время известно большое число различных видов хроматографии (распределительная, адсорбционная, ионообменная, на молекулярных ситах) и различных приемов их применения (на бумаге, колоночная, тонкослойная, газовая). Современные разновидности хроматографии, различающиеся по технике выполнения позволяют быстро разделить отдельные компоненты из небольшого количества сложной смеси.

Принцип распределительной хроматографии состоит в том, что вещества помещают в систему, которая содержит два физически различных компонента- подвижную и неподвижную фазы. Неподвижную (стационарную) фазу называют сорбентом. Если сорбентом служит жидкость, удерживаемая каким-либо твердым телом, то это тело называют носителем или матрицей. Подвижную фазу называют растворителем или проявителем; компоненты разделяемой смеси – растворенными веществами. В варианте распределительной хроматографии на бумаге носителем служит целлюлоза в виде листов хроматографической бумаги. Неподвижной фазой служат пары воды, насыщающие лист этой бумаги при данных условиях. В качестве подвижной фазы применяют насыщенный водой органический растворитель, который, двигаясь по бумаге, растворяет и увлекает за собой нанесенный образец.

Распределительная хроматография основана на том, что растворенное вещество распределяется между подвижной и неподвижной фазами. Этот процесс называется распределением и количественно описывается коэффициентом распределения, представляющим собой отношение концентраций растворенного вещества в каждой из двух фаз. Рассчитывают этот коэффициент по следующей формуле:

,

где, m_п – масса подвижной фазы;

m_н – масса неподвижной фазы;

R_f – коэффициент подвижности (скорости перемещения зоны компонента).

По мере движения растворителя происходит множество микроскопических актов распределения каждого из исследуемых компонентов между подвижной и неподвижной фазами, в результате чего вещества с разными коэффициентами распределения оказываются на различном расстоянии от старта.

Коэффициентом R_f (подвижности) называют отношение расстояния от места нанесения исследуемого вещества до середины пятна (а) к расстоянию, от места нанесения вещества до фронта растворителя (в): R_f = а/в. Каждое из разделяемых веществ имеет свой R_f. Этот коэффициент может быть использован для идентификации (определения) компонентов исследуемой смеси, но воспроизводимость его зависит от условий опыта (температура, сорт бумаги, чистота растворителя, однотипность процедур и др.).

Существуют различные виды хроматографии на бумаге: нисходящая (растворитель движется по бумаге сверху вниз), восходящая (растворитель движется по бумаге снизу верх), круговая (движение растворителя происходит от центра круга к периферии) и др. В учебных целях наиболее удобна круговая (радиальная) хроматография.

Все операции с хроматографической бумагой проделывают тщательно вымытыми перед работой руками или в чистых резиновых перчатках. Надписи на бумаге делают простым карандашом.

ХОД РАБОТЫ. Работа состоит из нескольких этапов, которые выполняются в определенной последовательности:

1.Разметка и маркировка хроматографической бумаги. Из хроматографической бумаги вырезают квадрат со стороной на 0,5 см больше диаметра используемой для работы чашки Петри (рис.3).

Двумя перпендикулярными линиями, проведенными карандашом через центр, квадрат делят на четыре сектора. По краю каждого сектора делают простым карандашом надпись о наносимом веществе.

На взаимно перпендикулярных прямых, отступив от центра 1,5 см к краю каждой стороны квадрата, сделать карандашом метки (1). Это будет место для нанесения пробы (стартовая линия).

2. Нанесение растворов. В отмеченные точки микропипеткой наносят растворы аминокислот (в соответствии с надписью) или смесь в объеме 0,002-0,01 мл. Нанесение осуществляют прикосновением острого конца заполненной микропипетки к бумаге в отмеченную точку и быстром ее поднятии. При этом на бумаге должно оставаться пятно диаметром не более 3-4 мм. После полного подсыхания пятна операцию повторяют. Так поступают до тех пор, пока весь раствор из микропипетки не будет перенесен на отмеченную точку (стартовую линию).

В центре хроматограммы просверливают отверстие (2) и в него вставляют фитилек (трубочку, скрученную из хроматографической бумаги). Фитилек (3) должен плотно прилегать к краям отверстия, высота его должна быть несколько меньше, чем внутренняя высота камеры.

3. Приготовление растворителя. В колбу объемом 100 мл приливают бутанол, уксусную кислоту и воду в соотношении 12:3:5 и тщательно перемешивают. Полученный раствор наливают в одну из половин чашки Петри по 15-20 мл, приготовленного для разделения смеси аминокислот.

4. Разгонка аминокислот. Хроматограмму укладывают на половинку чашки так, чтобы фитилек располагался в центре и касался ее дна. Для уменьшения испарения растворителя хроматограмму накрывают второй половиной чашки, добиваясь совмещения краев чашек.

Насыщенный неподвижной фазой растворитель по фитильку непрерывно поступает к центру хроматограммы и, двигаясь к краям, растворяет нанесенные аминокислоты и увлекает их за собой. При этом каждая из аминокислот движется по слою бумаги с определенной скоростью, что обусловлено коэффициентом распределения. Скорость аминокислот неодинакова, так как зависит от степени их растворения в неподвижной и подвижной фазе растворителя. Аминокислоты с полярными незаряженными, отрицательно и положительно заряженными (гидрофильными) радикалами движутся медленно, вместе с водой, некоторые чуть впереди воды. Аминокислоты с неполярными, гидрофобными радикалами перемещаются быстрее, так как вода, продвигаясь по бумаге, выталкивает их, а бутилово-уксусная фракция – увлекает за собой. Скорость перемещения аминокислот одновременно зависит от величины и объема радикала.

После того как растворитель дойдет почти до краев чашки, хроматограмму снимают, удаляют фитилек, простым карандашом проводят линию между сухой и мокрыми зонами бумаги (отмечают границу фронта растворителя) и высушивают в вытяжном шкафу.

5. Проявление. Хроматограмму смачивают в налитом в ванночку растворе с массовой концентрацией нингидрина в ацетоне 1 %, вновь высушивают в вытяжном шкафу и помещают для развития окраски пятен аминокислот на 1,5-2 мин в сушильный шкаф при температуре 100 °С или прогревают над плиткой до полного развития окраски комплексов аминокислот с нингидрином.

6. Определение коэффициента подвижности аминокислот. Описывают кратко принцип метода бумажной хроматографии, определяют R_f аминокислот-метчиков и аминокислот смеси, идентифицируют аминокислоты смеси, хроматограмму зарисовывают. Замеряют расстояние, пройденное каждой аминокислотой от точки старта до середины пятна (а), и расстояние пройденное растворителем в данном секторе (в). По формуле рассчитывают коэффициент подвижности:

7. Идентификация аминокислот, содержащихся в смеси, осуществляется по совпадению их позиций с позицией аминокислот-метчиков на хроматограмме, по совпадению коэффициентов подвижности и по однородности окраски пятен.

R_f для аминокислот при разделении на бумаге растворителем, состоящим из бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 12:3:5 приведены в табл.7.

Коэффициенты подвижности аминокислот (R_f)

Хроматографический метод позволяет произвести и количественное определение аминокислот в смеси. Для этого пятна аминокислот смеси и аминокислот-метчиков обводят карандашом, нумеруют, вырезают, делают в них надрезы и помещают в пробирки с соответствующим пятну номером.

Затем в пробирки наливают по 3 мл насыщенного сульфатом меди раствора с объемной концентрацией этанола 80 %, содержимое в пробирках перемешивают и ставят в темное место на 30 мин (каждые 10 мин содержимое пробирок перемешивают). Окраска с бумаги переходит в раствор этанола с образованием медных производных сине-фиолетового Руэмана, окрашенных в красный цвет. Оптическую плотность окрашенных растворов аминокислот-метчиков и аминокислот смеси измеряют при 540 нм (зеленный светофильтр) на ФЭКе против насыщенного сульфатом меди раствора с объемной концентрацией этанола 80 %. Массовую концентрацию каждой аминокислоты в смеси рассчитывают по формуле:

,

где, Х – массовая концентрация аминокислоты в исследуемой смеси, мг/мл;

С – массовая концентрация аминокислоты-метчика (свидетеля), мг/мл;

u — объем нанесенного на хроматограмму раствора аминокислоты-метчика, мл;

u₁ — объем нанесенного на хроматограмму раствора исследуемой смеси, мл;

D_пр – оптическая плотность раствора с пятна аминокислоты смеси;

D_св – оптическая плотность раствора с пятна аминокислоты метчика.

Результаты расчетов по количественному составу аминокислот смеси записывают и делают окончательный вывод по всей работе.

РЕАКТИВЫ. Хроматографическая бумага; вода дистиллированная; органический растворитель (бутанол, ледяная уксусная кислота, вода в соотношении по объему 12:3:5); этанол; раствор с массовой концентрацией нингидрина в ацетоне 1 %; смесь аминокислот (взвешивают по 10 мг лизина, аланина и лейцина, смешивают вместе и растворяют в 10 мл раствора с объемной концентрацией этанола 80 %, при отсутствии какой-либо из аминокислот для приготовления смеси можно взять другие аминокислоты с существенно отличающимися величинами R_f); растворы аминокислот-метчиков, или «свидетелей» (10 мг каждой из аминокислот, взятых для приготовления смеси, растворяют в отдельных флаконах в 10 мл раствора с объемной концентрацией этанола 80 %); раствор с объемной концентрацией этанола 80 % насыщенный сульфатом меди.

1. Общая характеристика метода хроматографии и ее роль в биохимии.

2. Назовите основные виды хроматографии.

3. Общая характеристика принципа хроматографии.

4. Назовите разновидности метода хроматографии на бумаге и чем они отличаются.

5. Назовите основные этапы радиальной хроматографии на бумаге.

6. Техника разметки и маркировки хроматографической бумаги.

7.Техника нанесения растворов в точки старта.

8. Состав и техника приготовления растворителя для «разгонки» аминокислот на бумаге.

9. От чего зависит скорость движения аминокислот в процессе хроматографии.

10. Как рассчитывается коэффициент подвижности (R_f) и что он характеризует?

11. Что такое «идентификация аминокислот» и как её проводят.

12. Назовите основные этапы количественного определения аминокислот методом хроматографии на бумаге.

13. Техника экстрагирования окрашенных пятен.

14. Как определяется содержание аминокислот в 1 мл смеси.

Дата добавления: 2015-02-13 ; просмотров: 5226 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

источник