Меню Рубрики

Как делают анализ на лептоспироз

Лептоспирозом называется зооноз (заболевание, возбудитель которого обитает внутри определенных животных), распространенный во всем мире, кроме полярных регионов. В течение предыдущих нескольких десятилетий эта патология незаслуженно игнорировалась, считаясь малоопасной. Но участившиеся вспышки, и около полумиллиона тяжелых случаев болезни в год, регистрируемых на всех континентах, заставили обратить на нее внимание.

Оказалось, последствия лептоспироза у человека могут быть весьма опасными. Это и воспаление оболочек головного мозга (менингит), и поражение печени, легких, и нарушение работы сердца. Наиболее опасным осложнением этого заболевания является острая почечная недостаточность, при которой может помочь только проведенная вовремя процедура гемодиализа (искусственной почки). Именно она зачастую становится невозможной из-за непрекращающегося кровотечения, возникающего вследствие острого поражения печени.

Лептоспироз имеет множество названий. Это и «7-дневная лихорадка», и «тростниковая лихорадка», и «лихорадка Форт-Брэгга». Исторически он известен под названием «черной желтухи», а в Японии его называют «лихорадкой нанукаями».

Вызывается заболевание бактериями лептоспирами. По общему строению идентифицирован 21 вид этого микроба. 13 из них может вызвать болезни у людей, а некоторые являются совершенно безвредными.

13 видов патогенных для человека лептоспир разделяются также по строению их оболочки, точнее, по тем антигенам, которые они выставляют на своей поверхности. В зависимости от набора и сочетания этих антигенов выделяют аж 250 видов бактерий. Соответственно, если человек перенес заболевание, вызванное одной из лептоспир, то это не защитит его от 249 остальных бактерий.

Для справки поясним про упомянутые антигены. Каждая клетка, имеющаяся в организме и попадающая в него извне, обязана представиться иммунной системе (они по-другому не «умеют»). Для этого она выставляет на поверхности особые молекулы – антигены, чем-то напоминающие антенны. Иммунная клетка подходит, подсоединяется к этим «антеннам» свой специальный участок, сканирует клетку, и если такая значится «в списке», то иммунитет не активируется на защиту, и иммунная клетка идет дальше. «Заучивать» свои клетки лимфоцитам приходится еще во время внутриутробного периода, и ошибки в этом деле могут обернуться тяжелейшими аутоиммунными заболеваниями, когда организм «бомбит» какую-то свою ткань, а лечение состоит в том, чтобы этот иммунитет подавить (и тем самым убрать защиту от инфекций и рака).

Как передается человеку лептоспироз? Бактерию распространяют как дикие, так и домашние животные:

  • кошки;
  • собаки (у них лептоспироз называется болезнью Штутгарта, и его можно заметить у животного);
  • крупный рогатый скот;
  • овцы;
  • свиньи;
  • лошади;
  • дикие кабаны;
  • куницы;
  • олени;
  • лисы;
  • бобры;
  • скунсы;
  • ежи;
  • еноты;
  • опоссумы.

Основными источниками инфекции являются грызуны: мыши и крысы. По животному не всегда видно, является ли оно больным, или нет.

От человека к человеку болезнь не передается.

Для того, чтобы лептоспира попала в человеческий организм, человек должен проконтактировать кожей, на которой имеются микротрещины (это, в основном, кожа рук), слизистой оболочкой рта или носа или непосредственно с мочой зараженного животного, или с водой/почвой, содержащей мочу зараженного животного. Заразиться можно также, если моча или частички почвы/воды, ее содержащие, попали в глаза человеку. Возможен также пищевой путь заражения: при питье сырой воды из природных водоемов, употреблении сырого или плохо прожаренного мяса, некипяченого молока.

Природные очаги лептоспироза существуют, в основном, в болотистых районах и там, где имеется множество поверхностных пресных водоемов: водохранилищ, озер, рек, систем каналов. Расширяют ареал распространения возбудителя и улучшают его выживаемость в окружающей среде такие природные явления, как циклоны, ливни и наводнения, происходящие в теплое время года. Нынешнее увеличение заболеваемости ученые связывают с глобальным потеплением. Кроме того, частота лептоспироза напрямую зависит от количества осадков. Поэтому, в умеренном климате это заболевание является сезонным, а в тропическом – круглогодичным.

Другими факторами, вызывающими распространение инфекции в умеренном климате, являются социально-экономические явления:

  • интенсивная миграция людей: они могут переносить лептоспиру, приобретенную в тропических регионах (где существуют идеальные условия для заражения ею), в новые места обитания;
  • ухудшение экономического статуса у отдельных людей и семей (они становятся бедными или бездомными, в результате чего у них сильно страдает уровень гигиены);
  • появление безлюдных кварталов населенных пунктов, которые становятся прибежищами для грызунов;
  • заселение необжитых, чаще всего, лесистых, районов.

В настоящее время выяснено, что источником заражения могут быть собаки и кошки, хотя ранее эти животные считались нечувствительными к лептоспирам. Заразиться можно также от сельскохозяйственных животных, поэтому, несмотря на улучшение защитных средств, которыми пользуется человек во время сельскохозяйственных работ, риск заразиться при выполнении такой деятельности увеличивается.

Более 50 лет назад ученый Бургдорфер экспериментально продемонстрировал возможность передачи лептоспиры аргазидными и иксодовыми клещами. Чуть позже 2 русские исследовательницы – Крепкогорская и Ременцова – выделили 35 видов клещей Dermacentor margatus, которые, паразитируя на крупном рогатом скоте, переносят лептоспиры.

Нужно сказать, во многих странах (особенно в субтропическом географическом поясе) плохо проводится и диагностическая, и просветительная работа. В результате люди не замечают у себя болезненные симптомы, и лечение, соответственно, начинает проводиться поздно, зачастую уже на стадии печеночной и почечной недостаточности.

Выше шансы заболеть у таких людей:

  • фермеров;
  • ветеринаров (особенно работающих в сельской местности, которым приходится контактировать с рождающимися и мертворожденными сельскохозяйственными животными и частями их плаценты);
  • мясников;
  • доярок;
  • пастухов;
  • рабочих скотобойни;
  • тех, кто работает в канализационных системах;
  • работники свинарников, коровников;
  • лесники;
  • охотники;
  • солдаты;
  • работники рыбоводческих хозяйств и хранилищ для рыбы;
  • рабочие портов;
  • триатлонисты;
  • спелеологи;
  • скалолазы;
  • гонщики;
  • занимающиеся каякингом, рафтингом.

Должно пройти от 2 до 30 дней после попадания на кожу или слизистые оболочки бактерии лептоспиры, прежде чем первые симптомы лептоспироза у человека появятся. В среднем, инкубационный период длится 1-2 недели, поэтому, подозревая у себя эту болезнь, нужно вспоминать:

  • не ловили ли вы в этот период рыбу или раков в пресном водоеме (больше вероятности заболеть, если ходить по дну водоема босиком, с голыми ногами, и заниматься своим промыслом голыми руками);
  • не могли ли вы заниматься чисткой подвала или погреба без перчаток;
  • не ходили ли вы на охоту;
  • не переехали ли вы в частный дом;
  • не купили ли вы новое животное (и домашнюю крысу, в том числе);
  • не могли ли вы пить воду непосредственно из водоема, без кипячения;
  • не ели ли вы бифштекс с кровью или полусырое мясо.

Если хотя бы один вопрос заставил вас задуматься или ответить «да», как можно скорее обращайтесь к врачу-инфекционисту. Как мы уже говорили, заболевание очень опасно, сопровождается довольно высокой смертностью.

Лептоспироз обычно проявляется в виде одной из 2 форм:

  1. желтушной, для которой характерно выраженное поражение печени;
  2. безжелтушной, имеющей более благоприятные прогнозы.

Протекает заболевание обычно в 2 фазы:

Первой фазой болезни считается период от появления первых симптомов до 7 суток – пока попавшие в кровь лептоспиры разносятся по кровотоку.

Проявлениями этой фазы являются неспецифические (то есть по ним трудно поставить какой-то определенный диагноз) симптомы:

  • повышение температуры – до 38-39°C, сопровождающееся ознобом. Оно длится 4-9 суток, потом снижается. Вторая «волна» повышения температуры (между 6 и 12 сутками) обычно говорит о том, что произошло инфицирование мозговых оболочек – развился менингит;
  • головная боль;
  • боль в мышцах, особенно в икроножных и брюшных;
  • с 3-4 суток развивается конъюнктивит (глаза становятся более красными, из них появляется скудное слизистое отделяемое);
  • бессонница;
  • отсутствие аппетита;
  • слабость;
  • на теле и конечностях на 2-4 день может появляться красная сыпь, очень напоминающая коревую. Она может держаться всего несколько часов, но чаще всего наблюдается несколько суток;
  • признак тяжелого течения – появление с 1-2 дня болезни на коже не кореподобной сыпи, а кровоизлияний, которые не бледнеют при надавливании на них стеклом или растягивании под ними кожи;
  • на губах могут появляться высыпания, похожие на герпетические, но с кровянистым содержимым.

Через 5-7 суток симптомы могут исчезать самопроизвольно, и потом больше не возвращаться (даже без лечения). В некоторых случаях болезнь начинает проявляться незначительными симптомами: легким пожелтением кожи и склер (или даже отсутствием этого признака), более темным цветом мочи, которой тоже становится меньше.

Чаще всего после 1-3 дня, в течение которых человек ощущает себя здоровым, начинается вторая фаза заболевания, при которой лептоспиры разносятся по внутренним органам.

В этой фазе лептоспироз может быть отнесен или желтушной, или безжелтушной форме.

  • с 3-6 дня отмечается легкое пожелтение склер, которое постепенно нарастает;
  • может отмечаться также появление крови в моче;
  • внезапные «месячные» у женщин (на самом деле – это маточное кровотечение, вызванное поражением печени, которая отвечает за свертывание крови);
  • с 4-5 дня может развиваться поражение почек, которое проявляется снижением количества мочи. Через 1-2 дня после этого мочеиспускание обычно прекращается полностью;
  • нарушается работа сердца. У тех людей, чье сердце было на момент заражения здорово, чаще всего просто учащается пульс, могут быть редкие внеочередные сокращения (экстрасистолы). У пожилых людей, лиц с заболеваниями сердца, у курильщиков и «профессионалов» в приеме алкоголя могут отмечаться серьезные нарушения ритма, и их опасность в том, что человек не всегда их ощущает;
  • могут появляться признаки менингита: головная боль, тошнота, невозможность наклонить голову к груди;
  • при этой форме заболевания могут развиваться различные формы поражения легких. Субъективно их различить нельзя: для всех характерна кашель, учащение дыхания, а в тяжелых случаях – ощущение нехватки воздуха.

Безжелтушная форма встречается чаще (примерно в 90% случаев). Она развивается после короткой и не сильно выраженной первой фазы болезни. Она характеризуется симптомами менингита:

  • повторным подъемом температуры;
  • вновь появившейся головной болью;
  • невозможностью наклонить голову так, чтобы подбородок достал до грудины.
  • угнетение сознания;
  • судороги;
  • асимметрия лица;
  • нарушение глотания;
  • нечеткость речи;
  • затруднение движений в конечностях,

можно говорить об энцефалите. Он при лептоспирозе встречается редко.

У некоторых пациентов может развиться увеит (воспаление сосудистой оболочки глаза, опасное слепотой), который выявляется через несколько недель или даже спустя годы после начала заболевания.

При безжелтушной форме лептоспироза также может отмечаться снижение количества мочи (вплоть до исчезновения мочи), кровоточивость десен, маточные и желудочно-кишечные кровотечения. Человек может также ощущать дискомфорт и тяжесть в области правого подреберья, что свидетельствует об увеличении печени.

Симптомы заболевания могут варьироваться от сочетаний незначительных признаков (например, головных, мышечных болей, лихорадки) до тяжелого течения (например, сильного кровотечения или менингоэнцефалита).

Если заболевание сопровождается сочетанием почечной и печеночной недостаточностью, осложненной кровотечением (наружным или внутренним), оно называется болезнью Вейля и с большой долей вероятности вызывается такой лептоспирой как лептоспира иктерогеморрагика.

Выздоровление при легком и среднетяжелом течении заболевания, если помощь начали оказывать вовремя, происходит через 3-4 недели. У каждого 3-5 переболевшего человека лептоспироз может рецидивировать, и даже несколько раз в течение ближайшего года.

Последствия лептоспироза всегда весьма серьезны. Это:

  • острая почечная недостаточность, которая может закончиться смертельно;
  • хроническое поражение почек, которое длится много месяцев и даже лет;
  • острая печеночная недостаточность;
  • менингит;
  • инфекционный миокардит (воспаление сердечной мышцы);
  • преренальная азотемия;
  • острый респираторный дистресс-синдром (отек легких, возникающий не вследствие заболеваний сердца), вызванный, в основном, пропитыванием ткани легких кровью;
  • интерстициальный пневмонит;
  • декомпенсация хронической сердечной недостаточности;
  • тромбоз вен полости черепа;
  • энцефалит;
  • некротизирующий панкреатит;
  • увеит;
  • потеря слуха.

Легкая форма лептоспироза редко заканчивается смертельно. Но у тех пациентов, чье заболевание протекало тяжело (это 5-10% всех больных лептоспирозом), смертность может достигать 5-40%.

Возможность хронической инфекции, то есть существования лептоспиры в тканях опровергается зарубежными учеными: очень мало объективных доказательств, подтверждающих или опровергающих эту гипотезу.

Лептоспироз у беременных может приводить к порокам развития плода, но чаще всего – к их гибели. Но есть шанс (его цифры трудно назвать), что при своевременном введении антибиотиков ребенок родится живым и здоровым.

Диагностика у человека заключается в:

  • посеве крови на среду Терских или среду Эллингхаузен-Маккалоу-Джонсон-Харрис (EMJH);
  • определении антител к лептоспире в сыворотке крови. Этот анализ выполняется не менее 3 раз: при лептоспирозе титр антител должен нарастать (то есть вначале антитела находили только в сыворотке, разведенной в 125 раз (тогда пишут «титр 1:125»), а затем, к разгару болезни, организм больного выработал уже много антител, и они обнаруживаются уже в сыворотке, разведенной в 1125 раз (пишут «титр 1:1125». Титр антител типа 1:25 или 1:50 с очень слабым его нарастанием ставит диагноз лептоспироз под сомнение;
  • выделении ДНК бактерий из крови, спинномозговой жидкости и мочи с помощью ПЦР-метода диагностики.

При этом сдают и другие анализы, для исключения заболеваний, похожих на лептоспироз симптомами. Это гепатит, сепсис, риккетсиоз, бруцеллез, малярия, хантавирусные инфекции.

При этом заболевании обязательно выполняют:

  • анализы мочи, скорость клубочковой фильтрации, определение в крови калия, мочевины и креатинина – для определения функции почек;
  • определение билирубина, АЛТ, АСТ, коагулограммы, протеинограммы – для выяснения работы печени;
  • кал на скрытую кровь – для ранней диагностики кровотечения;
  • общий анализ крови – с целью определения уровня воспаления и количества тромбоцитов;
  • рентгенографию легких;
  • ЭКГ;
  • УЗИ органов брюшной полости, в особенности почек, печени и селезенки.

Когда подозревают лептоспироз, лечение человека проводится обязательно в условиях инфекционного стационара, что обусловлено необходимостью контролировать работу его жизненно важных органов. Терапия на дому не проводится. Более того, при малейшем подозрении на почечную недостаточность (уменьшение количества мочи, нарастание креатинина, калия, снижение клубочковой фильтрации) больного переводят в отделение реанимации инфекционной больницы. Сюда же помещают больных с печеночной недостаточностью, декомпенсацией сердечной недостаточности, поражении легких.

Если же показатели работы почек находятся в критическом состоянии (смотрят по уровню калия, при высокой концентрации которого – выше 6 ммоль/л – создается серьезная угроза для сердца), больного переводят в отделение искусственной почки.

2 недели лечения режим строгий постельный. Это обусловлено необходимостью создать щадящие условия как для сердца (может развиться миокардит), так и для печени (кровоток в этом органе зависит от положения тела; в сидячем положении он уменьшается более, чем в 3 раза).

Диета – стол №7, применяемый при лечении почечных заболеваний плюс ограничение (или полная отмена) калий-содержащих продуктов. При высоком уровне натрия все блюда и чай делаются без соли, только на дистиллированной воде.

Читайте также:  Как делать анализ на английском

Для уничтожения самой бактерии-лептоспиры применяются антибиотики, обычно пенициллинового ряда. Это «Бензилпенициллин» или «Цефтриаксон». За границей работают также антибиотиками «Доксициклин» и «Эритромицин». Для помощи иммунитету человека назначают специфический противолептоспирозный иммуноглобулин.

  • инфузионная терапия – в том объеме, в котором позволяют почки. При снижении клубочковой фильтрации объемы вводимой внутривенно жидкости сильно ограничиваются и могут составлять только те препараты, без введения которых нельзя;
  • подавление секреции желудочного сока – препаратами «Омепразол», «Контралок», «Рабепразол», «Нольпаза»;
  • при крайне низком содержании тромбоцитов переливается тромбоцитарная масса;
  • профилактика или лечение кровоточивости – с помощью введения препаратов «Гордокс», «Контрикал», переливания плазмы крови той же группы, которая имеется у больного;
  • при почечной недостаточности – вводятся мочегонные препараты, гормональные препараты, больному могут выполнить несколько сеансов гемодиализа;
  • при поражении легких – проводится кислородная терапия, в том числе и с помощью аппарата искусственной вентиляции;
  • при поражении сердца – вводятся антиаритмические препараты и бета-блокаторы.

Предотвратить лептоспироз можно с помощью неспецифических мер:

  • работы в защитных перчатках и очках;
  • хождению по дну пресных (особенно стоячих) водоемов в рыбацких сапогах;
  • травле домашних грызунов;
  • стирке белья после контакта с домашними и сельскохозяйственными животными;
  • употреблении только кипяченого молока и кипяченой воды;
  • хорошей прожарке мяса перед употреблением

Использование антибиотика доксициклина или любого другого в качестве профилактики (например, для путешественников) необоснованно.

Вакцинация человека выполняется с помощью убитой лептоспирозной вакцины. Ее выполняют людям из группы риска, тем, кто проживает в очаге лептоспироза, а также путешественникам в страны тропического географического пояса.

Собак и других животных, как потенциальных носителей лептоспиры, также вакцинируют. Иммунитет, создаваемый стандартными прививками, эффективен только от тех типов бактерий, антигены которых введены в вакцину. Собаки, привитые неподходящими вакцинами, представляют особую опасность для людей.

источник

Цель исследования: выявление РНК патогенных спирохет Leptospira interrogans,L.alexanderi L.borgpetersenii, L.kirschneri, L.noguchii, L.santarosai. L. Weiliiв в патологическом материале методом полимеразной цепной реакции

Предназначено для диагностики у:
— собак
— кошек
— лошадей
— МРС, КРС
— свиней

Опасность для человеческого здоровья:
Зооноз. Зараженные собаки являются резервуаром инфекции и выделяют их в окружающую среду. Заражение может происходить при несоблюдении правил гигиены через инфицированную воду, мочу

Спецификация .
Лептоспироз(Leptospirosis) – инфекционная природноочаговая болезнь многих видов животных (болеют свиньи, крупный и мелкий рогатый скот, лошади, собаки, верблюды, пушные звери, мелкие дикие млекопитающие, человек), характеризующаяся кратковременной лихорадкой, анемией, желтухой, гемоглобинурией, некрозами слизистых оболочек и кожи, атонией желудочно-кишечного тракта, абортами, рождением нежизнеспособного потомсства. Инкубационный период от 3-х до 7-ми дней в зависимости от серовара и особенностей специфического иммунитета. Обнаружение лептоспир по крови возможно только в первые 5-7 дней после появления клинических признаков. Выделение лептоспир с мочой начинается на 7-10 день после проявления клинических симптомов и продолжается месяцами. Лептоспиры могут вызывать у собак хроническое поражение почек спустя месяцы и годы после острого повреждения почек.

Механизмы патогенеза лептоспироза у собак:
Лептоспиры проникают в организм собаки через слизистую оболочку или поврежденную кожу. В воротах инфекции обычно не развивается специфических поражений. Из них возбудитель в последующие 4-11дн проникает в кровь, вызывая септицемию. Клинически лептоспиремия проявляется лихорадкой, кратковременной гемолитической анемией, лейкоцитозом, гемоглобинурией и альбуминурией.
Продолжительность бактериемии благодаря усиливающемуся иммунному ответу обычно составляет 4-5 дн. Элиминация бактерий из крови сопровождается прекращением лихорадки. Во время септицемии ЛС разносятся кровью по всему организму, проявляя при этом (в зависимости от серовара) более или менее выраженный тропизм к печени, почкам, плаценте и плодам.
Благодаря высокой подвижности и небольшой толщине они избегают фагоцитоза ретикулоэндотелиальными клетками печени и проникают через эндотелиальную выстилку синусоидов, достигая пространства между клетками паренхимы (70). В печени эти сприрохеты активно размножаются, вызывая паренхиматозное воспаление с последующим включением основных патогенетических механизмов гепатита, в т.ч. характерной для этой формы лептоспироза желтухи. Поражения печени вызваны механическим повреждением гепатоцитов ЛС, а также действием их токсинов. Помимо нарушения динамики оттока из воспаленной печени желчи определенную роль в патогенезе желтухи играет диссеминированный геморрагический процесс, происходящий в результате воздействия на эритроциты гемолизинов возбудителя.
Пути заражения
Заражение собак происходит в основном горизонтальным путем — через пищеварительный тракт при приеме корма и воды, контаминированных ЛС, аэрозольно и, реже половым путем. Возможно также и вертикальное распространение инфекции от инфицированной суки — через плаценту плодам и через молоко подсосным щенкам. ЛС могут проникать в организм не только через слизистые оболочки, но и через поврежденную кожу.
ептоспироз собак может протекать безсимптомно или проявляться клинически в желтушной или безжелтушной формах. Их тяжесть зависит от возраста и иммунного статуса инфицированного животного, вирулентности вызвашего инфекцию серовара ЛС, заражающей дозы и пути заражения.
Симптомы
При типичном течении лептоспироз имеет 2-фазный характер: вначале развивается симптоматика, связанная с бактериемией, а на второй фазе на первый план выступают клинические признаки поражения определенных органов.
В подострых случаях собака может переболевать без появления характерной симптоматики. При таком течении инфекции у заболевшей собаки снижается аппетит, развивается субфебрильная температурная реакция (38,5-40 C), появляются мышечные боли, слабость, угнетение, иногда конъюнктивит, признаки анемии, а также клинические признаки описанных ниже желтушной или безжелтушной форм лептоспироза, но в стертом виде.
При обеих формах болезни у щенных сук инфекция может вызвать аборт.
При лептоспирозе у собак выявляют ряд гематологических изменений: анемию средней тяжести, лейкопению (на лептоспиремийной стадии инфекции), которая сменяется лейкоцитозом со сдвигом влево, тромбоцитопению, гипербиллирубинемию (3-50 мг/дцл), гиперазотемию, гиперкреатинемию (3-20 мг/дцл), гиперфосфатемию, а также повышение концентрации амилазы и липазы. Увеличение активности в сыворотке крови печеночных ферментов (аланинтрансферазы и аспартаттрансферазы ), а также при тяжелом поражении почек и/или печени — повышение концентрации в крови азота мочевины и креатинина свыше 25 и 2 мг/дцл.
Вакцина от лептоспироза относится к необязательным вакцинациям. Кратность ревакцинации 1 год.

Лептоспироз у кошек:
Явная клиническая картина клинического лептоспироза у кошек встречаются РЕДКО.
В организм кошки лептоспиры проникают с грязной водой, пищей, грызунами. Именно грызуны являются очень частыми переносчиками этого заболевания в природе. Основной мерой профилактики лептоспироза у кошек, это борьба с грызунами.
Скрытый период заболевания у кошек длится от двух до десяти суток. Заболевание может проходить в острой, подострой и хронической форме. Под действием возбудителя нарушается работа почек, органов пищеварения, сердца и сосудов. В первые дни заболевания у животного резко увеличивается температура тела, кошка лежит, отказывается от еды, может наблюдаться рвота, лапы подрагивают. Далее на слизистой оболочке рта образуются покраснения, перерастающие в язвы, из ротовой полости исходит неприятный запах, язвы часто кровоточат. Кошка теряет массу, слабеет, у нее хуже работает сердце. Если заболевание протекает не в острой форме, то все симптомы заболевания появляются постепенно, кожные покровы чаще всего не затрагиваются. Изменения в работе органов пищеварения наблюдаются время от времени. Если у домашней кошки появляются симптомы, напоминающие лептоспироз, ее следует обязательно показать ветеринару. Следует всячески предотвращать контакт домашней кошки с животными, зараженными данным заболеванием.

Требования к пробе: — Для исследования используют: 1. моча, после 7-10 дней от начала проявления клинических симптомов возможно исследование мочи на лептоспироз методом ПЦР. 2. паренхиматозные органы с очагами поражения (мозг, легкие, почки (обе)), 3. абортированный плод. 4. Кровь с К3ЭДТА В первые 5-7 дней заболевания на фоне лихорадки берется Кровь животного с К3ЭДТА. В остальных случаях, при настоянии и ответственности врача или владельца, с внесением соответствующей записи в комментарии заявки. После 5-7 дней заболевания Кровь животного с К3ЭДТА настоятельно рекомендуется исследовать методом ИФА на наличие АТ к лептоспирозу. — кровь с гепарином не подходит для исследований методом ПЦР! — смешанные пробы запрещены в связи с особенностями технологии проведения анализа! Хранение образцов: Материал для анализов доставляется в лабораторию в день взятия или на следующий день, сохраняя их при +2-+8⁰С. Допускается хранение секционного материала (ткани органов) или мочи в течение 1 мес при температуре не выше -16⁰С.

ВАЖНО! 1. Вакцинация инактивированными вакцинами клинически здоровых собак не приводит, как правило, к ложноположительным реакциям. 2. Субклинически инфицированные собаки могут выделять с мочой лептоспиры, значение положительного результата в этиологии заболевания в этом случае определяет ветеринарный врач. ВАЖНО! 1. Чтобы избежать ложноположительных результатов необходимо выдержать 2-3 недели после лечения перед сдачей анализа. 2. Положительный результат при отсутствии клинической картины заболевания может означать бактерио-/вирусоносительство.

источник

Выявление возбудителя лептоспироза (Leptospira) – инфекционного заболевания, которому подвержены многие животные (в том числе собаки, кошки, домашний скот, крысы) и которое может передаваться человеку. Распространяясь с мочой и калом, микроскопического размера лептоспиры поражают органы и ткани, отравляя организм продуктами своей жизнедеятельности.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Первую порцию утренней мочи.

Лептоспироз — острая инфекционная болезнь, возбудителем которой являются бактерии родалептоспира ( Leptospira ). Болезнь характеризуется поражением капилляров, часто поражением печени,почек, мышц, явлениями интоксикации, сопровождается волнообразной лихорадкой. Ранее это заболевание имело название иктеро-геморрагическая лихорадка

Инфекция проявляется острой лихорадкой. Предвестников заболевания нет.

У больного наблюдается общая интоксикация организма. Возникает озноб, сильная головная боль, высокая температура. У человека пропадает аппетит и сон. Он страдает от постоянной жажды.

Чаще всего инкубационный период длится около недели. Лептоспироз имеет 2 фазы. Первая фаза — лептоспиремия. В цереброспинальной жидкости и в крови можно обнаружить возбудителя. Вышеописанные явления наблюдаются в течение 4-9 дней. Повторные ознобы. Миалгия и повышения температуры тела — характерные симптомы заболевания.

Ярким признаком являются сильные мышечные боли. Пальпация икроножных мышц, поясничной области и мышц бедра причиняет боль. Иногда возникает гиперемия лица, верхних отделов грудной клетки и шеи. У некоторых больных появляется сыпь. Наиболее часто наблюдается эритематозная экзантема. Может возникнуть диарея, кашель и кровохарканье. При обследовании выявляется брадикардия. Иногда может быть ишемия и нарушения чувствительности.

Вторая фаза — токсемия внутренних органов. Недуг поражает нервную систему, печень и почки. В тяжелых случаях возможны: желтуха, менингит, острая почечная недостаточность и геморрагический синдром.

Синдром Вейля — специфический признак лептоспироза. Он характеризуется анемией, желтухой, длительной лихорадкой и нарушениями сознания. Своего максимального выражения синдром достигает на второй стадии недуга. При этом проявляются симптомы поражения почек или печени.

Синдром Вейля- характеризуется анемией, желтухой, длительной лихорадкой и нарушениями сознания

Если поражены печень, то больной страдает от болей в области этого органа. При этом печень увеличивается в размерах. Анализы выявляют изменения в сыворотке крови. При поражении почек наблюдается гематурия (наличие крови в моче), протеинурия(наличие белка в моче), азотемия и пиурия(наличие гноя в моче). Человек мучается от носовых и желудочных кровотечений и кровохарканья. Возможны кровоизлияния в надпочечники и геморрагические пневмонии.

Иногда признаком лептоспироза становится асептический менингит.

  1. фаза заражения. Лептоспиры проникают через повреждённую кожу и слизистые в кровь, затем внедряются в печень, почки, селезёнку,надпочечники, где они усиленно размножаются. Эта фаза соответствует инкубационному периоду болезни.
  2. фаза генерализованной инфекции — повторная лептоспиремия с последующим поступлением в почки, печень, надпочечники, оболочки мозга. Паразитируют на поверхности клеток. Это начальный период болезни.
  3. токсинемия — поражается эндотелий капилляров, повышается их проницаемость — возникает геморрагический синдром + поражение печени, почек, надпочечников — это период разгара болезни.
  4. формирование нестерильной стадии иммунитета — в крови появляются антитела — клинически угасание процесса.
  5. фаза формирования стерильной стадии иммунитета — сочетание гуморального с местным органным и тканевым иммунитетом. Клинически выздоровление.
  • острая печёночная недостаточность по типу печёночной комы;
  • острая почечная недостаточность;
  • кровотечения;
  • поражение оболочек глаз;
  • миокардит;
  • параличи, парезы.
  • инфекционо-токсический шок
  1. Противолептоспирозный гамма-глобулин ( лучше донорский, а не лошадиный)
  2. Антибактериальная терапия (пенициллин, тетрациклин, аминогликозиды).
  3. Дезинтоксикационная терапия (под контролем диуреза).
  4. Симптоматическая терапия — гемостатические средства, коррекция кислотно-щелочного равновесия.

Начиная со второй недели заболевания лептоспиры накапливаются преимущественно в извитых почечных канальцах и исчезают из крови и других тканей. Такая избирательная концентрация в эпителии и межклеточном пространстве почечной ткани приводит к тяжёлым повреждениям канальцев почек и нарушению мочеобразования, а в тяжёлых случаях вызывает анурию (отсутствие мочеиспускания) и уремию (накопление в крови токсических продуктов азотистого обмена, нарушение концентрации электролитов крови и др.). Лептоспирам свойственно длительно сохраняться в почках и выделяться с мочой до 40-го дня болезни.

При персистенции лептоспир в почках признаков острой инфекции, как правило, нет, заболевание часто протекает в латентной форме.

Решающими для подтверждения диагноза «лептоспироз» в любой фазе заболевания, в том числе и на более поздних сроках инфекционного процесса, являются результаты лабораторных исследований: бактериологического (посева), серологического (определения титров специфических антител в сыворотке крови), молекулярно-генетического (определения ДНК лептоспир методом ПЦР).

Недостатком бактериологического метода является длительность проведения исследования из-за медленного роста лептоспир на питательных средах.

Серологическое исследование теряет свою значимость после 19-20-го дня болезни в связи с постепенным снижением титра сывороточных антител вследствие прекращения циркуляции лептоспир в крови. Кроме того, при тяжелом течении лептоспироза, особенно на фоне интенсивной терапии антибактериальными препаратами, антитела могут выявляться лишь спустя 2-3 месяца от начала болезни.

Также малоэффективна серологическая диагностика персистентных форм лептоспироза в связи с низким титром сывороточных антител и отсутствием его нарастания.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это молекулярно-генетический метод исследования, в ходе которого выявляется генетический материал (ДНК) лептоспиры в образце мочи. Методу свойственна высокая специфичность (100 %), чувствительность (от 10 до 1000 копий ДНК в пробе) и высокая диагностическая эффективность, даже на фоне проводимого лечения антибактериальными препаратами.

Определение ДНК лептоспир в моче методом ПЦР используется для диагностики лептоспироза на более поздних сроках заболевания – начиная с конца второй – начала третьей недели заболевания, то есть в период, когда лептоспиры располагаются преимущественно в извитых канальцах почек и исчезают из крови и тканей, а также при персистенции лептоспир в почках. Одним из основных достоинств ПЦР также является то, что она позволяет выявить возбудителя даже при условии присутствия последнего в организме в очень малых количествах.

Вместе с тем отрицательный результат ПЦР не должен быть основанием для прекращения диагностики, так как определить точно конкретную фазу заболевания не всегда возможно. Чувствительность лабораторной диагностики при лептоспирозах может быть значительно повышена за счет параллельного использования серологических тестов (определения титров антител в сыворотке крови) и метода ПЦР вне зависимости от фазы заболевания.

  • Для диагностики лептоспироза на более поздних сроках инфекционного процесса (начиная с конца второй – начала третьей недели заболевания, когда лептоспиры накапливаются в извитых почечных канальцах и исчезают из крови и тканей).
  • Для дифференциальной диагностики лептоспироза с другими заболеваниями, для которых характерно поражение почек (ГЛПС, нефрозы и нефриты неинфекционной природы), развитие острой почечной недостаточности (нарушения мочеобразования, в тяжёлых случаях анурии и уремии).

Когда назначается исследование?

  • При диагностике лептоспироза.
  • При подозрении на персистенцию лептоспир в почках.

Референсные значения: отрицательно.

Причины положительного результата:

  • лептоспирозная инфекция (фаза начала формирования нестерильного иммунитета – который сохраняется, пока в организме есть возбудитель инфекции, персистенция лептоспир в почках).

Причины отрицательного результата:

  • период полного выздоровления, когда формируется стойкий иммунитет и лептоспиры в организме уже отсутствуют.

Специальной подготовки к анализу на лептоспироз не требуется

источник

Цель занятия. Ознакомить студентов с методами лабораторной диагностики лептоспироза, кампилобактериоза и дизентерии свиней, биологическими свойствами возбудителей, биопрепара­тами.

Оборудование и материалы. Пробирки с культурой лептоспир, предметные и покровные стекла, стерильные пастеровские пи­петки, мерные пипетки на 1. 2мл, резиновые груши, спирт, микроскопы с темнопольными конденсорами, осветители ОИ-19, пробирки со стерильной дистиллированной водой и физиологи­ческим раствором, пластины из плексигласа с лунками или чис­тые пробирки в штативах, лептоспирозные агглютинирующие сыворотки, антигены для диагностики лептоспироза в РМА, для демонстрации — пробирки с культурой лептоспир (L.bijlexa), таблицы, мазки для люминесцентной микроскопии, МЛ-2, нефлуоресцирующее масло, культуры кампилобактерий в полужид­кой среде, среде Китта—Тароцци и на плотной среде, неокра­шенные мазки с кампилобактериями, таблицы, биопрепараты.

Лептоспироз. Инфекционное природно-очаговое заболевание животных — свиней, крупного рогатого скота, лошадей, овец, коз, оленей, собак, верблюдов, пушных зверей, грызунов, сумчатых и др. Болеет и человек. Птицы к лептоспирозу невосприим­чивы.

У животных болезнь протекает, как правило, бессимптомно, типичные клинические проявления: кратковременная лихорадка, желтуха, геморрагия, гемоглобинурия, аборты.

Возбудитель лептоспироза отнесен к роду Leptospira, который включает в себя два вида: L. interrogans— патогенные лептоспиры и L. biflexa — лептоспиры, обитающие во влажной почве и пре­сных поверхностных водах. Вид патогенных лептоспир представ­лен 183 сероварами, которые по степени антигенного родства объединены в 25 серологических групп. Основными возбудителя­ми лептоспироза у сельскохозяйственных животных считают лептоспиры серогрупп Canicola, Grippotyphosa, Hebdomadis, Pomona, Tarassowi, Icterohaemorrhagiae.

Лабораторная диагностика лептоспироза основана на резуль­татах бактериологического и серологических исследований.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой и люминесцентной микроскопии, выделение чи­стой культуры посевом на питательные среды и методом биопробы и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим серологическим и патогенным свойствам. Материал для исследования. Кровь берут в период лихорадки на 1. 7-е сутки болезни; мочу собирают при естественном мо­чеиспускании в стерильные пробирки. У коров и свиноматок допустимо брать мочу катетером. Абортированный плод дос­тавляют в лабораторию целиком или берут от него желудок с содержимым, сердце, мочевой пузырь, паренхиматозные орга­ны. От трупов крупных животных направляют на исследование сердце, кусочки паренхиматозных органов, почку целиком, транссудат из грудной и брюшной полостей, перикардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым, спинномозговую жидкость. Трупы мелких животных доставляют в лабораторию целиком.

Пробы материала должны быть исследованы в летнее время в течение 6ч с момента взятия и 10. 12ч при хранении материала в охлажденном состоянии; мочу исследуют при температуре 30. 40°С в течение 3 ч, при 25. 30 °С — 4. 5 ч, при 20. 25 °С-6. 8 ч, при 16. 20°С — в течение 10. 12 ч с момента взятия.

Для бактериологического исследования материал предвари­тельно следует подготовить: мочу центрифугируют (при 10 000. 15 000 мин -1 30 мин), исследуют осадок; из проб органов готовят суспензию в стерильном физиологическом растворе, ис­следуют в нативном состоянии или после центрифугирования.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Лептоспиры разных сероваров не различаются по морфологическим и культу-ральным признакам. Длина лептоспир колеблется от 3 до 30 мкм и более, в среднем 7. 15 мкм, ширина 0,06. 0,15 мкм. Лептоспи­ры — грамотрицательные бактерии. Поскольку они плохо вос­принимают окраску, их обычно исследуют в неокрашенном со­стоянии. Готовят препарат «раздавленная капля» и изучают мето­дом темнопольной микроскопии при увеличении 40 x 7. 10 или 20 х 1,5 х 10, а для более детального изучения — при увеличении 40×10. 15 или 40 x 1,5 x 10. В каждой капле просматривают не менее 50 полей зрения. Лептоспиры представляют собой спира­левидные тонкие серебристые нити, концы которых — один или оба — загнуты в виде крючков (рис. 109).

Лептоспиры подвижны. Формы движения: вращательное, прямолинейное, поступательное с одновременным вращением вокруг собственной оси и круговое.

Для люминесцентной микроскопии готовят мазки из того же материала и обрабатывают их флуоресцирующим глобулином для диагностики лептоспироза.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Лептоспиры — факультативные анаэробы, температурный оптимум 28. 30°С. Для получения культуры лептоспир исследуемый
материал высевают пастеровской пипеткой по три — пять капель в 5. 7 пробирок со специальной питательной жидкой или полужидкой средой. Посевы культивируют при 28. 30 °С в течение трех месяцев. Обыч­но рост лептоспир появляется в течение 7. 20 сут, иногда их обнаруживают на 3. 5-е сутки или через 1. 2мес и очень редко — через 2,5. З мес культивирова­ния.

Для выявления роста лептоспир через 3, 5, 7, 10 сут и далее каждые 5 сут культивирования из всех пробирок готовят препа­рат «раздавленная капля» для исследования методом темнопольной микроскопии.

Макроскопически рост лептоспир выражен слабо. При доста­точном накоплении лептоспир после встряхивания пробирки с культурой в среде в проходящем свете заметны муаровые волны, а в спокойном состоянии отмечают легкую опалесценцию. Нали­чие пленки, осадка, помутнения среды свидетельствуют о при­сутствии посторонней микрофлоры, а полная прозрачность сре­ды — об отсутствии роста лептоспир.

Для культивирования лептоспир используют следующие пита­тельные среды.

Среда Ферворта—Вольфа (в модификации С. И. Тарасова): к 900 мл дистиллированной воды добавляют 0,5 г хлорида натрия, 1 г пептона (Дифко), 100 мл маточного раствора фосфатного буфера рН 7,2. 7,4. Смесь автоклавируют в колбе при 120 ºС 30 мин. На следующий день дважды фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 мл и вновь автоклавируют при 120 °С 30 мин. В пробирки добавляют по 0,5 мл кроличьей сыворотки и прогревают среду на водяной бане при 56. 58 ºС 30 мин.

Среда Любашенко: нехлорированную водопроводную (или ко­лодезную, речную) воду, профильтрованную через бумажный фильтр, стерилизуют в автоклаве при 1 атм 30 мин, охлаждают, устанавливают рН 7,3. 7,4, добавляют 5 % кроличьей или барань­ей сыворотки, прогретой при 56 ºС в течение 1 ч. Затем среду пропускают через фильтрующие пластины СФ в фильтре Зейтца и асептически разливают в пробирки. Для контроля стерильнос­ти среды пробирки помещают в термостат при 37 °С на 48 ч.

Можно применять и другие питательные cpeды. На плотных средах (Кокса, ВГНКИ и др.) лептоспиры образуют мелкие коло­нии в виде прозрачных дисков диаметром до 1. 2см с хорошо очерченными или размытыми краями или в виде матовых точек диаметром 1. 2 мм.

Для серологической идентификации выделенную чистую культуру исследуют в РМА с групповыми агглютинирующими лептоспирозными сыворотками, предварительно разведенными стерильным физиологическим раствором в соотношении 1 : 50, 1 : 500, 1 : 1000, 1 : 2000, 1 : 4000, 1 : 8000, 1 : 16 000 и 1 : 32 000. Ре­акцию ставят в агглютинационных пластинах (или в пробирках), смешивая 0,1мл сыворотки каждого разведения с 0,1мл выде­ленной (типируемой) 5-, 7-, 10-суточной культуры лептоспир с накоплением 70. 100 подвижных микробных клеток. Разведения сыворотки последовательно удваиваются. Пластины (пробирки) выдерживают в термостате при 37 °С 1 ч, затем учитывают ре­зультаты — из каждой лунки (начиная с наибольшего разведе­ния) готовят препараты «раздавленная капля», которые исследу­ют методом темнопольной микроскопии. Реакцию оценивают в крестах: (++++) — 100%-я агглютинация: склеивание лептоспир с образованием скоплений в виде «паучков» (рис. 110), содержа­щих от нескольких клеток до нескольких десятков и даже сотен; свободные концы клеток сохраняют подвижность; (+++) — аг­глютинировано 75% лептоспир; (++) —50%; (+) — агглютини­ровано 25%; (-) —агглютинация отсутствует. РМА считают по­ложительной, если она выражена на четыре, три и два креста. Исследуемую культуру относят к той серологической группе лептоспир, с сывороткой которой она дает реакцию на два. четыре креста до 50. 100 % ее титра, указанного на этикетке.

Рис. 110. Реакция микроагглютинации: «паучки» из склеившихся лептоспир

Биопроба. Метод используют для выделения культуры возбу-дителя из исследуемого материала, так как посевом на питательные среды изолировать лептоспиры удается не всегда, а также для установления патогенных свойств чистых культур. Биопробу ставят на золотистых хомячках 20. 30-дневного возраста, кроль­чатах-сосунках в возрасте 10. 20 дней и 3. 5-недельных морских свинках. Исследуемый материал (кровь, моча, суспензия из паренхиматозных органов или аборти­рованного плода и др.) вводят подкожно или внутрибрюшинно хомякам от 0,3. 0,5 до 1 мл, крольчатам — 2. 3 мл. На каждую пробу материала берут по 2 животных, одного из которых убива­ют на 4. 5-й день в период подъема температуры, другого, если животное не погибает,— на 14. 16-й день после заражения. Кровь последнего исследуют в реакции микроагглютинации (РМА), начиная с разведения 1: 10, с лептоспирами 13 серологи­ческих групп.

Высевы из органов убитых и павших животных (сердца, пече­ни и почек) делают в 2. 3 пробирки из каждого органа. Транссу­дат из грудной и брюшной полостей, перикардиальную жид­кость, содержимое мочевого пузыря исследуют методом темнопольной микроскопии.

Вирулентность выделенной культуры определяют на золотис­тых хомячках или крольчатах, которых заражают внутрибрюшин­но 5. 7-дневной культурой, содержащей 70. 100 лептоспир в поле зрения микроскопа. Высоковирулентные культуры лептоспир вы­зывают гибель золотистых хомячков в дозе менее 0,1 мл, средней вирулентности — 0,2. 0,4 мл, слабовирулентные — 0,5. 1 мл.

Серологическая диагностика включает в себя постановку реакции микроагглютинации (в качестве антагена используют живые культуры лептоспир определенных серологи­ческих групп) и реакции макроагглютинации (применяют кон­центрированную взвесь лептоспир).

В реакции микроагглютинации сыворотки крови исследуют в разведениях 1:50, 1:250, 1:1250.

Учет реакции: каплю из каждой лунки исследуют методом темнопольной микроскопии при увеличении 20×10 или 20x7x1,5. Агглютинация проявляется в образовании «паучков», содержащих от 3. 5 до нескольких десятков лептоспир.

Специфические антитела в сыворотке крови животных в титре 1:50. 1:100 и выше свидетельствуют об инфицированности дан­ной особи лептоспирами и возможном лептоспироносительстве.

По результатам серологических исследований диагноз на лептоспироз считают установленным, а хозяйство неблагополучным по лептоспирозу, если специфические антитела обнаружены в сыворотке крови при однократном исследовании в РМА в титре 1:100 и выше более чем у 25 % обследованных животных, а также при нарастании титра антител в 5 раз и более при повторном ис­следовании через 7. 10 дней сыворотки крови в РМА или при обнаружении антител у ранее нереагировавших животных.

Сыворотки животных, дающие положительную реакцию мик­роагглютинации в равных титрах с лептоспирами нескольких се­рологических групп или дающие наиболее высокий титр с лептоспирами, ранее неизвестными в качестве возбудителя лепто­спироза сельскохозяйственных животных, исследуют в реакции иммуноадсорбции.

Для постановки реакции иммуноадсорбции все штаммы леп­тоспир, с которыми данная сыворотка дала положительную реак­цию микроагглютинации, выращивают в 0,5. 1-литровых флако­нах в течение 5. 7 сут. Затем культуры лептоспир осаждают цент­рифугированием при

10 000 мин -1 30 мин. Надосадочную жид­кость сливают, а осадок суспендируют в 0,9 мл питательной среды или физиологического раствора. 0,1 мл исследуемой сыво­ротки смешивают с 0,9 мл концентрированного антигена и вы­держивают в течение 48 ч при 1. 5 ºС. Отделяют сыворотку цент­рифугированием при 10 000 мин -1 30 мин. Адсорбированную сы­воротку проверяют в реакции микроагглютинации на наличие остаточных антител к штамму-адсорбенту, а затем исследуют с лептоспирами всех групп, с которыми сыворотка дала положи­тельную реакцию до адсорбции. В результате адсорбции лепто­спиры, являющиеся возбудителем, удаляют из сыворотки антите­ла к лептоспирам всех других серологических групп; гетерологичные типы лептоспир не адсорбируют антитела к штамму-возбу­дителю.

Реакцию макроагглютинации ставят на стекле, на которое на­носят каплю исследуемой сыворотки крови, разведенной в соот­ношении 1 : 100, и равное количество антигена, компоненты пе­ремешивают, результат учитывают в проходящем свете. Положи­тельным результатом считают агглютинацию интенсивностью на два креста и выше, сомнительным — на один крест.

Антитела в крови можно обнаружить также методом иммуноферментного анализа.

Биопрепараты. Депонированная поливалентная вакцина против лептоспироза животных ВГНКИ содержит шесть штам­мов лептоспир с наиболее выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, относящихся к серогруппам Pomona, Tarassovi, Icterohaemorrhagiae, Canikola, Grippotyphosa, Hebdomadis. Выращенные культуры лептоспир сливают в общую емкость, инактивируют, концентрируют, добавляют адъювант. Вакцину проверяют на стерильность, безвредность и актив­ность (на кроликах).

Поливалентную вакцину против лептоспироза сельскохозяй­ственных и промысловых животных готовят из 7. 10-дневной культуры лептоспир, консервированных 5%-м раствором карбо­ловой кислоты до конечного содержания фенола в вакцине 0,5 %. Вакцину контролируют на стерильность, безвредность и активность (на кроликах).

Поливалентную сыворотку против лептоспироза сельскохо­зяйственных и промысловых животных получают методом ги­периммунизации волов-продуцентов. Антигены для гипериммунизации готовят из производственных штаммов шести серогрупп. Сыворотку консервируют 5%-м раствором фенола, прове­ряют на стерильность, безвредность (на белых мышах и морских свинках) и активность (в реакции микроагглютинации в разведе­ниях от 1:1000 до 1 : 100 000).

Антигены для диагностики лептоспироза реакцией макроаг­глютинации готовят из эталонных штаммов лептоспир. Выра­щенные культуры инактивируют формалином, концентрируют, расфасовывают по ампулам и подвергают сублимационному вы­сушиванию. Антигены контролируют на растворимость в физио­логическом растворе, на концентрацию. Активность антигена проверяют в РА на стекле с гомологичной лептоспирозной аг­глютинирующей сывороткой.

Групповые агглютинирующие лептоспирозные сыворотки предназначены для определения серогрупповой принадлежности лептоспир, выделенных из патологического материала, а также лептоспир, используемых в качестве антигенов в реакции микро­агглютинации при серологической диагностике лептоспироза.

Кампилобактериоз (вибриоз). Хроническое заболевание круп­ного рогатого скота, овец, свиней, которое проявляется аборта­ми, задержанием последа, временным бесплодием, вагинитами, метритами, рождением нежизнеспособного потомства. У кур возбудитель вызывает падеж цыплят, снижение яйценоскости несушек и прироста массы у бройлеров, у людей — гастроэнтери­ты, бактериемию, кожные поражения.

Возбудитель кампилобактериоза — бактерии семейства Spirillaceae, род Campylobacter. Основные виды: С. fetus (подвиды С. fetus venerealis и С. fetus fetus), С. jejuni, С. sputorum (подвиды С. sputorum sputorum, С. sputorum bubulus, С. sputorum faecalis) и не­патогенный С. coli (табл. 33). С. fetus sb. fetus вызывает аборты у овец, крупного рогатого скота. С.fetus sb. veneralis — патогенен для крупного рогатого скота. С. jejuni вызывает аборты у овец, энтериты у телят, ягнят и других животных. С. mucosalis патоге­нен для свиней, его выделяют от животных с признаками некро­тического энтерита, локального илеита.

Лабораторная диагностика кампилобактериоза основана на ре­зультатах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии, выделение чистой культуры посе­вом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным, серологичес­ким свойствам.

Материал для исследования. В лабораторию направляют абор­тированный плод (целиком с плодными оболочками или от круп­ных плодов голову, желудок, легкие, печень); плаценту; слизь из шейки матки, взятую стерильно в первые 3. 4 дня после аборта или в период охоты; от быков-производителей — препуциальную слизь и секрет придаточных половых желез; от убитых с диагнос­тической целью животных — матку, влагалище, лимфоузлы тазо­вой области.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Представите­ли рода Campylobacter — грамотрицательные, полиморфные, тон­кие палочки, изогнутые в виде «крыла чайки», запятой, спирали с одним или несколькими завитками или S-образные. Средние размеры (0,5. 8) х (0,2. 0,8) мкм. Подвижны за счет одного по­лярного жгутика на одном или обоих концах клетки, движение винтообразное; спор и капсул не образуют (рис. 111).

В мазках из патологического материала кампилобактерии об­наруживают в виде «крыла чайки», запятой или S-образной фор­мы; от животных, подвергавшихся лечению, — в виде длинных спирилл, малоизвитых нитей и мелких кокковидных форм.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбуди­тель — микроаэрофил, температурный оптимум 37. 38 °С. Для получения культуры кампилобактерии используют полужидкие и плотные питательные среды: плотный 2. 3%-й МППА и полу­жидкий 0,2%-й мясо-печеночный пептонный агар (ПЖА), среду Китта—Тароцци без масла, агар Мартена, сафранино-железо-новобиоциновую (СЖН) среду. Для обогащения в питательные сре­ды добавляют 5. 10 % дефибринированной крови крупного рога­того скота, овец, кроликов или сыворотку крови лошади. Куль­тивируют в течение 6. 10 сут в микроаэрофильных условиях при замене 10. 15% воздуха оксидом углерода (IV). Контаминиро­ванный материал высевают на среду СЖН: полужидкий агар — 985 мл, 2%-й раствор сульфата железа — 5 мл, 0,5%-й водный ра­створ сафранина Т — 5 мл и 0,2%-й водный раствор новобиоци-на — 5 мл. Среду фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки и автоклавируют при 115°С 25 мин. Готовая к ис­пользованию среда должна быть розового цвета, рН 6,8. При культивировании на данной среде кампилобактерии ее цвет не изменяется, другой микрофлоры — приобретает ярко-желтую окраску.

Каждую пробу высевают на несколько чашек Петри, растирая шпателем по поверхности среды. Выросшие колонии пересевают на полужидкий кровяной, сывороточный агар или среду Китта— Тароцци для получения чистой культуры.

При первичном выделении на плотной среде кампилобакте­рии образуют через 3. 4 сут колонии: гладкие, бесцветные, диа­метром 1 мм или шероховатые, непрозрачные, белые или кремовые до 2 мм в диаметре, могут быть плоские, серые или свет­ло-коричневые с неровными краями, редко растут в виде тон­кого налета. На кровяном агаре гемолиза не дают. При росте на сывороточном бульоне дают слабое помутнение, иногда с обра­зованием незначительного рыхлого осадка, на полужидком ага­ре растут в виде серовато-голубого диска около поверхности среды.

У выделенных культур кампилобактерии изучают фермента­тивную активность, ростовые потребности и на основании полу­ченных данных идентифицируют их на уровне вида, подвида, биовара (см. табл. 33).

Для серологической идентификации кампилобактерии выпус­кают агглютинирующие и люминесцирующие сыворотки против С. fetus subsp. fetus (так называемый Первый тип), С. fetus subsp. venerealis (Второй тип), С. sputorum subsp. bubulus (Третий тип).

Для ориентировочной идентификации выделенных культур ставят РА на стекле, используя указанные сыворотки, разведен­ные 1:50.

Для окончательной серологической идентификации кампило­бактерии ставят пробирочную РА: готовят последовательные раз­ведения каждой из трех моноспецифических сывороток в 3%-м растворе хлорида натрия, содержащем 0,3 % формалина, — 1 : 25, 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200. Затем в каждую пробирку с указанными раз­ведениями моноспецифических сывороток добавляют по 0,5 мл исследуемой суспензии вибрионов (концентрация 1 • 10 9 ).

После внесения компонентов пробирки тщательно встряхива­ют и помещают в термостат при 37 ºС до следующего дня. Затем их выдерживают З. 4ч при комнатной температуре и учитывают результаты реакции.

При положительной реакции с моноспецифической сыворот­кой одного типа и отрицательной— с моноспецифическими сы­воротками остальных двух типов исследуемый штамм относят к тому типу, с которым получен положительный результат.

При получении положительной реакции с двумя моноспеци­фическими сыворотками (что может быть при выделении ати­пичных или диссоциированных штаммов) опыт повторяют с обеими моноспецифическими сыворотками, агглютинировавшими исследуемую суспензию вибрионов, применяя более высокие разведения, чтобы определить титр каждой сыворотки. Типовую принадлежность исследуемого штамма устанавливают по той мо­носпецифической сыворотке, которая агглютинирует микробную суспензию в более высоком титре.

Для идентификации возбудителей кампилобактериоза в реак­ции иммунофлуоресценции используют как чистые, так и сме­шанные культуры, выращенные на общепринятых питательных средах.

Биопроба. Нативным материалом или выделенной культурой заражают беременных морских свинок внутрибрюшинно или во влагалище с последующим исследованием абортированных плодов. Если в течение 10. 12 сут аборта не наступает, морских сви­нок убивают и исследуют содержимое полости матки и плоды. При необходимости биопробу ставят на беременных телках и ов­цах, заражая их подкожно или перорально. Животные абортиру­ют, при отсутствии аборта их убивают с диагностической целью.

Серологическая диагностика кампилобакте­риоза у коров основана на результатах реакции агглютинации с вагинальной слизью (РАВС), а у овец — РА с сывороткой крови.

Слизь берут марлевым тампоном, который помещают в про­бирку с 5 мл формалинизированного 3%-го раствора хлорида на­трия. Выдерживают при температуре 1. 4°С 12. 14ч. Тампон от­жимают, жидкость центрифугируют при 2500. 3000 мин -1 30 мин.

После центрифугирования реакцию ставят с экстрактом ваги­нальной слизи в четырех разведениях (табл. 34). Для приготовле­ния кампилобактериозного антигена исходную концентрирован­ную суспензию бактерий разводят физиологическим раствором, содержащим 0,3 % формалина, в соотношении 1 : 10.

Наряду с исследуемыми пробами материала ставят контроли антигена: 1) контроль антигена (проверка самоагглютинации): в пробирку наливают 0,5 мл антигена в рабочем разведении и до­бавляют 0,5 мл 3%-го формалинизированного раствора хлорида натрия; 2) контроль активности антигена: в каждую пробирку с разведенной агглютинирующей кампилобактериозной сывороткой Первого типа добавляют по 0,5 мл антигена; 3) контроль спе­цифичности антигена: в две пробирки, содержащие по 0,5 мл нормальной сыворотки в разведениях 1 : 100 и 1 : 200, добавляют по 0,5 мл антигена. Все пробирки встряхивают и далее поступают с ними так же, как с опытными.

Вначале учитывают результаты контроля антигена. Отрица­тельная реакция в первом и третьем контролях при положитель­ной во втором свидетельствует о правильности постановки реак­ции.

Учет результатов: 1) положительная — реакция хорошо выра­жена (на три-четыре креста) во всех пробирках или только в 1-й и 2-й; 2) сомнительная — агглютинация на один-два креста в 1-й и во 2-й пробирках; 3) отрицательная — отсутствие агглютинации во всех пробирках.

У больных овец для исследования берут сыворотку крови, раз­водят ее в 100, 200 и 400 раз. Результат считают положительным, если исследуемая сыворотка дает положительную реакцию агглютинации в разведении 1 : 200 и выше на четыре или три креста, со­мнительным — на четыре или три креста в разведении 1 :100 либо на два или один крест в разведении 1:200, отрицательным — если агглютинация отсутствует или ее оценивают не выше чем на два или один крест в разведении 1 : 100. Сыворотку овец, вакциниро­ванных против кампилобактериоза, серологически не исследуют.

Кроме реакции агглютинации сыворотку животных можно ис­следовать в РСК, реакции иммунофлуоресценции или реакции иммунной сорбции антител, меченных ферментами. Разработа­ны экспериментальные партии диагностикумов для выявления антител в РНГА, пригодные для диагностики кампилобактериозов животных и человека.

Биопрепараты. Эмульсинвакцина инактивированная против кампилобактериоза овец.

Кампилобактериозные агглютинирующие сыворотки готовят методом гипериммунизации кроликов суспензией живых микро­бов кампилобактерии. Полученные сыворотки после адсорбции групповых антител проверяют на активность, специфичность и стерильность.

Кампилобактериозный антиген представляет собой инактивированную 0,3%-м раствором формалина суспензию кампилобак­терии Первого типа (концентрация микробных клеток 10 10 /мл). Предназначен для диагностики кампилобактериоза у крупного рогатого скота.

Дизентерия свиней. Инфекционная болезнь. Характеризуется геморрагическим поносом и некротическим поражением толсто­го отдела-кишечника. Восприимчивы свиньи всех возрастов, но чаще болеет молодняк в возрасте 1. 6мес.

Возбудитель дизентерии свиней — спирохета Serpulina hyodysenteriae, род Serpulina.

Лабораторная диагностика дизентерии свиней основана на ре­зультатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии (основной метод), а также выделе­ние чистой культуры посевом на питательные среды и идентифи­кацию возбудителя по культурально-морфологическим и фер­ментативным свойствам.

Материал для исследования. Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют фекалии, для посмертной — слизистую оболочку большой ободочной кишки, которую соскабливают после удаления из кишечника содержимого и промывания водой. От трупов материал берут не позднее чем через 2 ч после гибели животного, материал должен быть исследован в течение 2. 4 ч, а при хранении на холоде — 6. 8 ч.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Поскольку культивирование возбудителя весьма трудоемко, микроскопичес­кое исследование — это основной метод диагностики, доступный практическим лабораториям. Поступивший материал исследуют методом темнопольной, фазово-контрастной или обычной све­товой микроскопии.

При темнопольной микроскопии препарат «раздавленная капля» исследуют в водной иммерсии с объективом х 40 и окуля­рами х 7 или х 10. Возбудитель в этом случае виден как спирале­видная клетка с 3. 12 правильными витками размером (7. 9) х (0,3. 0,4) мкм, движущаяся змеевидно-поступательно. При температуре 22 °С наблюдают изгибание и скользящее дви­жение клетки, а при 37. 42 ºС клетка движется поступательно. У большинства больных дизентерией свиней в препарате «раздав­ленная капля» в одном поле зрения обнаруживают 5. 10 спиро­хет и более. В окрашенных по Граму препаратах видны грамотрицательные извитые клетки со строением, типичным для спи­рохет. Клетки возбудителя хорошо окрашиваются по Романовс­кому—Гимзе, фуксином Пфейффера. Сходные по морфологии с Serpulina hyodysenteriae вибрионы, обитающие в кишечнике, от­личаются тем, что их клетка в 2. 4 раза толще, с тупыми конца­ми, движение вращательное вокруг длинной оси.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбуди­тель—строгий анаэроб, температурный оптимум 36. 38 ºС, при 25 и 30 °С не растет, рН 7,0. 7,2. Для первичной изоляции ис­пользуют селективные среды, например следующие.

Кровяной агар со спектомицином: к перевару Хоттингера до­бавляют 0,001 % резазурина (индикатор ОКВП), 0,5 % хлорида на­трия, 0,25 % глюкозы, 1 % пептона, 2 % агара, кипятят, пропуска­ют через среду азот или оксид углерода (IV) в течение 10. 15 мин, устанавливают рН 7,0. 7,2, вносят 0,05 % гидрохлорида цистеина. Среду автоклавируют при 110º С 30 мин, охлаждают до 40. 45°С, пропуская при этом через среду стерильный обескислороженный газ, после чего вносят 10% дефибринированной крови барана (или крупного рогатого скота) и 400 мкг/мл спектомицина. Среду разливают в атмосфере оксида углерода (IV).

Культивируют также в жидкой или полужидкой среде, содер­жащей сердечно-мозговую вытяжку и 10 % эмбриональной теля­чьей или кроличьей сыворотки. На кровяном агаре через 48. 96ч инкубирования при 38 °С вырастают плоские просвечивающие колонии диаметром 0,5. 3 мм с зоной бета-гемолиза. В полужид­ком сывороточном агаре возбудитель растет в виде беловатого диффузного облачка ближе к поверхности среды.

После изучения морфологии и культуральных свойств у выде­ленных бактерий исследуют ферментативную активность. Пато­генные для свиней культуры гидролизуют эскулин, не ферменти­руют фруктозу, утилизируют пируват, при сбраживании глюкозы образуют водород, углекислоту, ацетат, бутират; нитрат не вос­станавливают; растут на средах, содержащих 6,5 % хлорида на­трия, но не растут на средах с 1 % глицина.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Из чистой культуры лептоспир приготовить препараты «раз­давленная капля» и изучить их методом темнопольной микро­скопии.

2. Поставить РМА с культурой лептоспир и двумя сыворотка­ми различных антигенных групп в пробирках или на пластинах, учесть результат реакции, начиная с наибольшего разведения сыворотки. Из пробирки (лунки) каждого разведения сыворотки приготовить препарат «раздавленная капля» и изучить методом темнопольной микроскопии.

3. Окрасить мазки с кампилобактериями по Граму, промикроскопировать, зарисовать.

4. Изучить характер роста кампилобактерии на питательных средах и сделать заключение о морфологических и тинкториаль-ных свойствах возбудителя.

1. В чем заключаются особенности микроскопирования лептоспир?

2. Каковы морфологические и культуральные свойства лептоспир?

3. Каковы правила взятия патологического материала для исследования на лептоспироз?

4. Какие методы применяют для серологической диагностики лептоспироза?

5. Как ставят биопробу при лептоспирозе?

6. Каковы морфологические и тинкториальные свойства возбудителя кампилобактериоза?

7. В чем состоит серологическая диагностика кампилобактериоза?

8. Каковы морфологические особенности возбудителя дизентерии свиней?

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Сдача сессии и защита диплома — страшная бессонница, которая потом кажется страшным сном. 8852 — | 7181 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

источник

Артикул Наименование услуг Цена, руб. Доступность экспресс Ед. измер. Материалы Заказать
017 Лептоспироз (ПЦР real time) 600 p (Время исполнения до 72 часов) 1 исслед. P U C