Анализ на парные сыворотки как собрать

Сущность серологических методов исследования состоит в определении титра антител в сыворотке крови больного в динамике болезни по отношению к известному антигену, вводимому в серологическую реакцию.

В клинической практике чаще всего используется реакция агглютинации (РА) Видаля, ее разновидности, РНГА, РСК и более информативные современные методы (ИФА, РИА, ЛИФА и др.).

РА — определение неизвестных антител с помощью известных антигенов и установление вида возбудителя с помощью известных антител. РИГА и РНГА — более специфичны, используются меченные эритроциты. РТГА — основан на способности некоторых вирусов агглютинировать эритроциты. РИ — реакция иммунодиффузии, различная способность антигенов и антител диффундировать в геле. РСК титрование антигенов или антител по степени фиксации комплемента с комплексом антиген-антитело. PH — способность антител нейтрализовать токсины и антигены вирусов. ИФА — используются антитела, конъюгированные с ферментом. РИА — используется радиоактивная метка антигенов или антител. ЛИФА — лантанидный иммунофлюоресцентный анализ — используются в качестве метки элементы редкоземельных металлов.

Забор крови для серологического исследования выполняется так же, как и при посеве, но в отличие от последнего, его лучше осуществлять самотеком, а не шприцом. Для этого берут иглу с более широким просветом и вводят в локтевую вену без шприца. В пробирку собирают 3—5 мл крови. При таком сборе эритроциты меньше травмируются и сыворотка крови реже бывает с явлениями гемолиза. После отстаивания и центрифугирования крови сыворотку с помощью пипетки переносят в другую пробирку или эпиндорф и хранят в холодильнике при температуре +4 °С до постановки реакции. Поскольку иммунный ответ при большинстве инфекционных болезней развивается с 5-7-го дня, а максимальное нарастание титра антител происходит лишь в периоде реконвалесценции, серологические методы менее пригодны для ранней диагностики и используются главным образом в целях ретроспективной расшифровки этиологии уже перенесенного инфекционного заболевания.

Однако кровь для серологических исследований берется и в первые дни болезни, что в дальнейшем дает возможность наблюдать за нарастанием титра антител в динамике заболевания. Повторные серологические исследования при бактериальных инфекциях производятся не раньше, чем через 5-7 дней. При вирусных заболеваниях берутся «парные сыворотки» с интервалом 10-12 дней и при нарастании титра антител в 4 раза и более подтверждается диагноз предполагаемого заболевания.

Структура ответа. Методы серологической диагностики, суть. Правила забора крови. Трактовка результатов. Парные сыворотки.

Дезинтоксикаиионная терапия. Основным видом детоксикации является инфузионная терапия и методы экстракорпоральной детоксикации. Основными задачами ин …

«>Патогенетическая терапия инфекционных больных — Виды патогенетической терапии, группы препаратов, примеры заболеваний — 17/08/2012 07:55
Из всех многочисленных классификаций побочных явлений антибиотикотерапии наиболее приемлема классификация, предложенная Х.Х. Планельесом и А. М. Харит …

«>Осложнения антибиотикотерапии — Классификация, характеристика — 16/08/2012 17:55
Антибиотикотерапия. Метод основан на использовании химических веществ микробного, растительного, животного, а в последние годы и синтетического проис …

Решающие симптомы представляют собой наиболее характерный для конкретной болезни признак (патогномоничный). Например, пятна Вельского — Филатова — Коп …

«>Симптомы и синдромы при инфекционных болезнях — 16/08/2012 16:18
Жалобы больного Следует подробно и точно перечислить субъективные жалобы больного и выяснить самочувствие при поступлении в стационар. При выявлении …

«>Осмотр и опрос инфекционного больного — особенности, план обследования, жалобы — 16/08/2012 16:16
Значение воздействия природных факторов на эти процессы известно давно. Человек пребывает в определенных природно-климатических условиях и его организ …

источник

Особую ценность имеет в том случае, если выделить возбудителя не представляется возможным. При этом необходимо выявить повышение титров АТ , в связи с чем исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале 10 – 20 суток (иногда этот интервал может быть более длительным). Антитело обычно появляется в крови на 1-2ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго, что позволяет использовать их выявление для ретроспективных эпидемиологических исследований. Определение классов Igчетко характеризует этапы инфекционного процесса, а также может служить косвенным прогностическим критерием. Особое значение имеют методы выявления микробных Аг. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс – диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.

источник

это обнаружение антител к определенному антигену в сыворотке

больного и определение их титра. Используются серологические

реакции: реакция агглютинации (РА), реакция непрямой

гемагглютинации (РНГА), реакция связывания комплемента (РСК), и др.

Существует два способа подтверждения диагноза заболевания

серологическим методом: 1 – определения наличия антител в

диагностическом титре; 2 – определение природы антител. По природе

антитела могут быть: инфекционные, прививочные,

анамнестические.Природу антител определяют при исследовании

парных сывороток. Парные сыворотки– это две сыворотки, взятые у

больного с интервалом в 5-10 дней. Титр инфекционных антител в

парных сыворотках возрастает в 4 раза и более, что подтверждает

клинический диагноз заболевания. Титр анамнестических и

прививочных антител в парных сыворотках не меняется или меняется

незначительно. Для обнаружения антител необходимы известные

антигены. Диагностические препараты, содержащие антитела и

используемые для серологической диагностики, называются

диагностикумы.Диагностикумы могут содержать взвесь убитых

микробов, отдельные антигены микробов, эритроциты с нагруженным на их поверхность антигеном (эритроцитарные диагностикумы).

Собственно иммунный метод диагностики. Цель метода – индикация и

идентификация антигенов возбудителя в исследуемом материале.

Используются РП, РИФ, ИФА, РСК. Собственно иммунный метод – это

экспресс-диагностика, результат исследования получается в течение

нескольких часов или одних суток.

Агглютинация — это склеивание и выпадение в осадок микроорганизмов или других клеток (корпускулярных антигенов) под действием специфических антител в присутствии электролитов.

РА применяется для серологической диагностики инфекционных заболеваний (реакция Видаля — при брюшном тифе и паратифах, р. Вейгеля — при эпидемическом сыпном тифе, р. Райта — при бруцеллезе и др.) и для серологической идентификации микробов.
В РА участвуют 3 ингредиента:
1) корпускулярный АГ (агглютиноген);
2) антитело (агглютинин);
3) изотопический раствор хлорида натрия (электролит).

Антигены — взвесь живых и убитых микроорганизмов.
Идентификацию вида (серотила) микроба, выделенного от больного или внешней среды, определяют по известному антителу (диагностической иммунной сыворотки). Положительный результат реакции укажет на то, что неизвестный микроб идентичен тому, который был взят в качестве антигена для приготовления иммунной диагностической сыворотки.

Агглютинирующая диагностическая иммунная сыворотка готовится в производственных условиях путем иммунизации кроликов (реже лошадей) соответствующими антигенами (взвесью живых или убитых микроорганизмов, эритроцитов и т.д.).

Полученную иммунную сыворотку, определив его титр, разливают по ампулам с добавлением консерванта. Иногда употребляют высушенную сыворотку.

Существует два основных метода постановки РА:
1) ориентировочная РА на предметном стекле, наступающая в течение нескольких минут. Применяется только с целью идентификации вида (серотипа) выделенной из организма больного чистой культуры по его специфичности как АГ к серотипу АТ;
2) развернутая РА в пробирках, которая учитывается через 2 часа выдерживания при 37 «С и на следующий день стояния при комнатной температуре. Применяется с целью идентификации микроба и обнаружения АТ в сыворотке крови.

РА входит в группу методов, в которых реакция протекает в две фазы:
1) соединение АГ с АТ (специфическая фаза)
2) выпадение образовавшегося комплекса АГ-АТ (агглю-тината) в растворе солей (электролите) в осадок (неспецифическая фаза).

Достоинства РА: простота постановки и экспрессность.
Недостатки: уступает по специфичности и чувствительности.

Таким образом, реакцией лизиса называется серологический тест, основанный на

растворении цельноклеточного АГ, соединенного с АТ, в присутствии комплемента.

б а к т е р и о л и з а— растворения бактерий и гемолиза.

Бактериолиз.Реакция бактериолиза состоит в том, что при соединении иммунной

сыворотки с соответствующими живыми бактериями в присутствии комплемента происходит

Реакция бактериолиза наблюдается как в организме иммунного животного, так и в

пробирке. Под воздействием антител — бактериолизинов микробы теряют подвижность,

меняют форму (набухают), затем распадаются как бы на отдельные зернышки и, наконец,

Комплемент проявляет литическое действие только в присутствии иммунного

комплекса «клетка + лизин». Большинство микроорганизмов

малочувствительны к литическому действию комплемента. Поэтому

реакция лизиса не нашла широкого применения в лабораторной практике.

В практике реакцией бактериолиза пользуются для: 1) определения вида неизвестного

микроба при помощи специфической бактериолитической сыворотки; 2) определения в

исследуемой сыворотке наличия бактериолизинов к заранее известному микробу. Реакция

бактериолиза воспроизводится в пробирке (in vitro) и в организме животного (in vivo).

Реакция гемолизаявляется разновидностью реакции лизиса. В качестве антигена в этой

реакции применяют эритроциты, которые лизируются гемолизинами в присутствии комплемента.

Гемолизины появляются в организме при искусственной иммунизации чужеродными

эритроцитами. Иммунная сыворотка, содержащая гемолизины, носит название гемолитической

сыворотки. Реакция гемолиза состоит в том, что при воздействии гемолитической сыворотки

на соответствующие эритроциты в присутствии комплемента происходит их растворение

(гемолиз), причем мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную

жидкость — так называемую лаковую кровь. Действие иммунной гемолитической сыворотки

строго специфично — она вызывает гемолиз только тех эритроцитов, которые были взяты для

иммунизации. Реакция гемолиза благодаря своей демонстративности получила широкое

применение в лабораторной практике: ею пользуются в качестве показателя адсорбции

комплемента при диагностических реакциях,

Обычно для реакции гемолиза принято пользоваться в качестве антигена бараньими

эритроцитами и, следовательно, гемолитической сывороткой, полученной при иммунизации

животного (кролика) теми же эритроцитами.

П о с т а н о в к а р е а к ц и и .

Для постановки реакции гемолиза необходимо иметь:

1) антиген: отмытые эритроциты барана в

2) иммунную гемолитическую сыворотку, содержащую гемолизины к бараньим

3) комплемент — свежую сыворотку морской свинки в разведении 1:10;

4) физиологический раствор (ИХН)

Титром гемолитической сыворотки называют ее максимальное разведение, которое в

присутствии комплемента при температуре 37° С вызывает полный гемолиз эритроцитов барана на протяжении 1 ч.

Последнее изменение этой страницы: 2017-01-19; Нарушение авторского права страницы

источник

Методика забора крови на парные сыворотки применяется для лабораторной серологической диагностики гриппа и других острых респираторных заболеваний. Серологический метод основан на определении нарастания титра антител к возбудителю заболевания в период реконвалесценции по сравнению с острым периодом болезни.

Кровь для исследования методом «парные сыворотки» берут из вены также как на серологическое исследование в количестве 2-3 мл. Кровь берут дважды: первую порцию в первые дни заболевания (не позднее 5 дня), вторую через 10-12 дней. После отстаивания и центрифугирования крови сыворотку переносят в другую пробирку, маркируют и хранят в холодильнике при температуре +2+4 0 С. В лабораторию доставляют обе порции сыворотки одновременно.

Охарактеризуйте состав аптечки для оказания экстренной помощи при возникновении аварийной ситуации (аптечка анти-СПИД).

Аптечка для оказания экстренной помощи при возникновении аварийной ситуации (аптечка анти-СПИД).

1. Спирт этиловый 70 -для обработки кожных покровов, полоскания ротовой полости.

—5% р-р йода – для обработки кожи;

Перевязочный материал: лейкопластырь – для заклеивания пореза, прокола после обработки. Салфетки медицинские – для обработки кожи

Аптечка хранится в промаркированной ёмкости из материала подвергающегося дезинфекции, в доступном месте.

6.Опишите порядок действий медицинского работника, в случае возникновении аварийных ситуаций.

Действия медицинского работника при аварийной ситуации.
— в случае порезов и уколов немедленно снять перчатки, вымыть руки с мылом под проточной водой, обработать руки 70%-м спиртом, смазать ранку 5%-м спиртовым раствором йода;
— при попадании крови или других биологических жидкостей на кожные покровы это место обрабатывают 70%-м спиртом, обмывают водой с мылом и повторно обрабатывают 70%-м спиртом;
— при попадании крови и других биологических жидкостей пациента на слизистую глаз, носа и рта: ротовую полость промыть большим количеством воды и прополоскать 70% раствором этилового спирта, слизистую оболочку носа и глаза обильно промывают водой (не тереть);

— при попадании крови и других биологических жидкостей пациента на халат, одежду: снять рабочую одежду и погрузить в дезинфицирующий раствор или в бикс (бак) для автоклавирования;
— Прием антиретровирусных препаратов должен быть начат в течение первых двух часов после аварии, но не позднее 72 часов.
— Необходимо в возможно короткие сроки после контакта обследовать на ВИЧ и вирусные гепатиты B и C лицо, которое может являться потенциальным источником заражения, и контактировавшее с ним лицо.

Опишите порядок действий медработника, проводимых для предупреждения профессионального заражения при работе с кровью и другими биологическими жидкостями.

(Выписка из СП 3.1.5.2826-10 «Профилактика ВИЧ-инфекции»)

Основным принципом работы медперсонала для предотвращения внутрибольничной передачи ВИЧ является применение в каждом ЛПУ мер предосторожности в отношении каждого больного как потенциально зараженного ВИЧ.

— при выполнении любых манипуляций медицинского характера сотрудник ЛПУ должен быть одет в халат, шапочку, одноразовую маску (а при необходимости — очки или защитные щитки).

— При наличии ран на руках, экссудативных поражений кожи или мокнущего дерматита, медработник на время заболевания отстраняется от ухода за пациентами и контакта с предметами для ухода за ними.

— Все манипуляции, при которых может произойти загрязнение рук кровью, сывороткой крови или другими биологическими жидкостями, проводить в резиновых медицинских перчатках. Резиновые перчатки, снятые единожды, повторно не используют из-за возможности загрязнения рук. В процессе работы перчатки обрабатывают 70% спиртом или любыми другими дезинфицирующими препаратами.

— соблюдать меры предосторожности при выполнении манипуляций с режущими и колющими инструментами (иглы, скальпели, боры и пр.); следует избегать уколов, порезов перчаток и рук;

-. При подготовке к проведению манипуляции больному с ВИЧ-инфекцией убедится в целостности аварийной аптечки;

—Выполнять манипуляции ВИЧ-позитивному пациенту в присутствии второго специалиста, который может в случае разрыва перчаток или порезе продолжить их выполнение.

-Передавать все острые инструменты в ходе операции через промежуточный лоток, а неиз рук в руки, исключить использование пальцев для направления иглы, желательноизменить хирургические приемы с переходом на использование иглодержателей.
— Все медработники должны проходить регулярное обучение по мерам профилактики профессионального заражения и внутрибольничной передачи ВИЧ-инфекции.

Папиллярные узоры пальцев рук — маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

источник

Серологическое исследование (СИ) основано на способности антигенов и антител связываться друг с другом. СИ позволяет с точностью выявить наличие у пациента определённого вируса либо бактерии, группу крови и резус, реактивность организма к антибиотикам, аутоиммунные заболевания, гормональные нарушения, индивидуальную специфичность белков, определить эффективность терапии.

Система иммунитета борется с проникающими в организм болезнетворными микробами (антигенами) при помощи антител, при этом создавая к каждому из вирусов, паразитов либо бактерий свой определённый тип защиты.

Способность иммунитета вырабатывать особые вещества, нейтрализующие вредоносные частицы, была известна учёным давно. Но увидеть реакцию антиген-антитело в лабораторных условиях удалось только в конце XIX века. Было обнаружено, что в результате образования связки, комплексы выпадают в осадок, образуя хлопья либо помутнение. Такие реакции получили названия агглютинации и преципитации. В XX веке серология — наука о свойствах сыворотки, стремительно развивалась, обнаруживались новые методы диагностирования на основе реакций антиген-антитело. На сегодняшний день существует множество способов выявления иммунных комплексов, а СИ являются незаменимым звеном в диагностике, лечении, создании новых медицинских препаратов и вакцин.

Серологические исследования сопровождают современного человека на протяжении всей жизни. Первые анализы на выявление определённых антител проводятся, когда малыш находится ещё в утробе. Беременная женщина сдаёт кровь на различные СИ для определения возможного резус-конфликта либо инфекций, способных навредить вынашиваемому плоду. Когда ребёнок появляется на свет, его ожидают серологические исследования, позволяющие диагностировать врождённые заболевания. Впоследствии анализы сдаются по следующим причинам:

вирусные, бактериальные, паразитарные инфекции;
выявление активности, стадии развития болезни;
гормональные патологии;
бесплодие;
аутоиммунные заболевания;
нарушение обмена веществ;
аллергии;
онкологические заболевания;
планирование беременности, период вынашивания, патологии беременных;
выявление ревматоидного фактора;
определение группы крови и резус-фактора;
эффективность терапии при различных болезнях;
эффективность вакцинации;
предоперационный и постоперационный период при необходимости оценки уровня некоторых антител;
изучение иммунного состояния организма.

Так как серологические исследования охватывают широкий спектр анализов, в каждом конкретном случае может понадобиться определённая подготовка, но существуют общие правила сдачи серологического теста:

За сутки до исследования следует ограничить в рационе жирное и жареное, исключить алкоголь.
Последний приём пищи должен завершиться за 10 — 12 часов до анализа.
В день сдачи крови не следует употреблять кофе, чай либо иные напитки. Можно в небольшом количестве пить чистую воду.
Лекарственные средства перед анализом исключаются. Если приём отменить невозможно, необходимо предоставить врачу полный перечень препаратов, в том числе витаминов, пероральных контрацептивов.
Все другие исследования либо медицинские манипуляции проводятся после СИ.
Курение рекомендуется прекратить за 12 часов до взятия образца крови.
В предыдущий день следует избегать физических и эмоциональных нагрузок, а перед исследованием желательно 15 минут посидеть в полном покое.
СИ назначаются на утреннее время и сдаются натощак.

Все методики определения комплексов антиген-антитело (Аг-Ат) основываются на использовании известного Аг либо Ат в поиске неизвестного. Если необходимо обнаружить Аг, необходимы диагностические иммунные сыворотки с содержанием специфических Ат. Если целью СИ является выявление Ат, используются диагностикумы — взвеси, содержащие определённые Аг.

Серологические анализы могут отражать качественный либо количественный результат. При качественном исследовании итог может быть отрицательный или положительный, то есть искомый элемент либо обнаружен, либо нет. Количественный итог выражается в виде числового значения либо знаками «+» (обычно от одного до четырёх).

Методы серологических исследований:

Агглютинация. Связывание Ат с Аг с последующим формированием хлопьев либо осадка. Применяются прямые, непрямые, развёрнутые, ориентировочные реакции, позволяющие выявить антитела в сыворотке.
Гемагглютинация. Используются эритроциты с адсорбированными на них Аг либо Ат, которые склеиваются с соответствующими Ат и Аг. Образуемые комплексы выпадают в виде фестонного осадка.
Преципитация. Образование комплекса Аг-Ат с последующим осаждением в виде помутнения, именуемого преципитатом.
Коагглютинация. Выявление Аг при помощи Ат, адсорбированных на белке клеток стафилококка.
Торможение гемагглютинации. Ат иммунной сыворотки подавляют вирусные Аг, в итоге вирусы теряют способность склеиваться с эритроцитами.
Непрямая реакция Кумбса. Определяются Ат к поверхностным Аг эритроцитов.
Кольцепреципитация. Проводится на основе иммунной сыворотки с наслоением растворимого Аг.
Двойная радиальная иммунодиффузия. Реакция основана на диффундировании компонентов антисыворотки и Аг в лунках агара либо агарозы.
Реакция связывания комплемента. Связь Аг и Ат сопровождается адсорбцией комплемента, в качестве индикатора используются эритроциты барана и Ат к ним в составе гемолитической сыворотки.
Нейтрализация. Основана на нейтрализации вирусного агента антителами.
Реакции, основанные на маркировании Ат и Аг флуоресцентным либо ферментным составом — иммунофлюорисцентный (РИФ) и иммуноферментный (ИФА) методы.

Данный метод основан на использовании Ат, меченных флуоресцентным веществом. Чаще всего в качестве метки используется флуоресцеинизотиоционат, обладающий зелёным свечением в лучах ультрафиолета. Результат анализа оценивается по степени яркости свечения. Может быть использован ручной метод определения при помощи люминесцентного микроскопа, оптического микроскопа с люминесцентной насадкой, а также автоматический способ с применением микрочипового цитомера, проточного цитомера либо роботизированного флуоресцентного микроскопа.

РИФ проводится прямым и непрямым методом. Прямой способ означает непосредственное связывание сорбированного Аг с меченым Ат. Непрямой метод подразумевает использование немаркированных Ат для связки с Аг, а затем добавление меченых Ат, что позволяет избежать неспецифических реакций.

ИФА основан на выявлении комплексов Аг-Ат при помощи маркирования одного из компонентов. В качестве метки используются различные ферменты, которые в результате ферментативной реакции образуют окрашивание. Существуют разнообразные методы ИФА, их можно классифицировать как гомогенные и гетерогенные методы.

Гомогенные означают, что все этапы реакции происходят в растворе.

Гетерогенные методы включают разделение на фазы с использованием твёрдого носителя.

Гомогенно-гетерогенные способы основываются на том, что комплексы Аг-Ат формируются в растворе, а затем для разделения используется твёрдая фаза.

Существует множество вариаций методов ИФА, некоторые из них представлены ниже.

Сэндвич-метод. К иммобилизованным Ат добавляется раствор с Аг, после образования комплексов носитель отмывают от лишних компонентов и добавляют маркированные Ат. В результате, Аг оказываются зажатыми иммобилизованными и мечеными Ат, откуда и произошло название метода.
Неконкурентный непрямой ИФА. К иммобилизованным Аг присоединяют исследуемую сыворотку с Ат. Когда образуются комплексы, лишние Ат смывают и добавляют маркированные Ат, способные связаться с прикреплёнными к поверхностям лунок иммунными комплексами.
Конкурентный прямой ИФА. К иммобилизованным Аг вносят исследуемую сыворотку и конъюгат, содержащий маркированные Ат. Формируются комплексы Аг-Ат нескольких видов: с мечеными Ат и с немаркированными Ат, которые вступают между собой в конкуренцию за связь с Аг.

Если у пациента присутствует определённая симптоматика либо иные исследования указывают на заболевание, назначается серологический анализ.

Серологические исследования используют для диагностики следующих инфекций:

вирус гепатита А, В, С, D, Е;
сифилис;
ВИЧ;
герпес;
цитомегаловирус;
краснуха;
корь;
паротит;
Эпштейн-Барр;
хеликобактер;
хламидии;
микоплазмы;
токсоплазмы;
лямблии;
гельминты;
уреаплазмы;
парвовирус;
вирус ветряной оспы;
вирус клещевого энцефалита;
вирус Денге;
коклюш;
боррелии;
легионеллы.

Высокая чувствительность и специфичность.
Широкий спектр определяемых инфекций.
Ранняя диагностика инфицирования.
Возможность мониторинга развития заболевания.
Быстрота и удобство в исполнении.
Возможность использования минимального объёма исследуемого материала.
Безопасность исследования.

источник

Патологический материал берется ветеринарным специалистом стерильными инструментами в стерильную посуду.

Поверхность органа (ткани), с которого будет браться патологический материал, на месте разреза обжигаем пламенем или прижигаем нагретой металлической пластинкой.

Для исследования патологического материала методом ИФА, РИФ, РГА патматериал берем в момент проявления клинических признаков болезни или не позднее 2-3-х часов после падежа животного.

Количество отобранного материала должно быть не менее 10-20 г, отрезок кишечника, освобожденный от фекалий и перевязанный с 2-х сторон, 10-20 см. Отобранная проба упаковывается во влагонепроницаемую тару и ложится в термос со льдом.

Пробы с фекалиями берутся в стерильные пенициллиновые флаконы, которые закрываются стерильными резиновыми пробками.

Смывы со слизистых оболочек берем стерильными тампонами и помещаем в стерильные флаконы с 1-2 мл физиологического раствора.

Отобранный для вирусологического исследования патматериал необходимо доставить в ветлабораторию в течение суток с момента его взятия.

В виде исключения допускается хранение отобранного патологического материала при температуре +4 – 6о с в течение 2-х суток, при температуре – 30о С не более 10 дней. Пробы замораживаем и доставляем в ветлабораторию в термосе-укладке со льдом.

В сопроводительной ветспециалист должен указать: наименование и адрес отправителя, вид животного, анамнестические и клинико-эпизоотические данные, сведения о всех проведенных вакцинациях животных.

1. Аденовирусная инфекция (РНГА).

Материал для исследования:

Парные сыворотки крови, взятые в начале заболевания и через 2-3 недели.
Кусочки органов – от павших животных.

2 .Вирусная диарея (ИФА, РНГА).

Материал для исследования:

Парные сыворотки крови, взятые в начале заболевания и через 2-3 недели.
Фекалии-от больных животных.
Кусочки органов, тонкий отдел кишечника — от павших животных.

Материал для исследования:

Парные сыворотки крови, взятые в начале заболевания и через 2-3 недели.
Кусочки органов – от павших животных.

4. Парагрипп-3 (РТГА, РИФ)

Материал для исследования:

Парные сыворотки крови, взятые в начале заболевания и через 2-3 недели.
Кусочки органов – от павших животных.

5. Респираторно-синцитиальная инфекция (РНГА, РДП, РИФ, ИФА)

Парные сыворотки крови, взятые в начале заболевания и через 2-3 недели.
Кусочки органов – от павших животных.

Материал для исследования:

Фекалии – от больных животных.
Кусочки органов, тонкий отдел кишечника – от павших животных

7. Коронавирусная инфекция (РГА, РТГА)

Материал для исследования:

Сыворотка крови, фекалии – от больных животных.
Тонкий отдел кишечника – от павших животных.

8. Хламидиоз (РИФ, биопроба)

Материал для исследования:

Соскобы с конъюнктивы, гениталий, фекалии. Пробы эякулята или замороженная сперма. Кусочки паренхиматозных органов, лимфоузлов, семенников – от павших или убитых больных животных, от абортировавших животных – кусочки плаценты, аборт. плоды целиком или паренхиматозные органы и сычуг плода. (ДЛЯ ВСЕХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ).

Материал для исследования:

Сыворотка крови от свиноматок с нарушением воспроизводительной способности и новорожденных поросят до приема молозива.
Аборт. Плоды длиной не более 15 см (до 65 дня внутриутробного развития).

Материал для исследования:

Патматериал (миндалины, селезенка, почки, легкие, лимфатические узлы(мезентариальные, и подчелюстные), красный костный мозг, кровь). Пробы органов и тканей берут от павших животных не позднее 8 часов после гибели, от больных и подозреваемых в заболевании – сразу после убоя.
Сыворотка крови от не вакцинированных – на наличие антител и от вакцинированных животных – на напряженность иммунитета.

Материал для исследования:

Фекалии – от больных животных, взятые в первые 6-12 часов после проявления клинических признаков заболевания.

Материал для исследования:

Фекалии – от больных животных.

5. Репродуктивно-респираторный синдром свиней (ИФА)

Материал для исследования:

Сыворотка крови от не вакцинированных и от вакцинированных животных.

Материал для исследования:

Пат.материал (лимфатические узлы (мезентериальный, портальный и подчелюстной), кусочки селезенки, легкого, красный костный мозг.
Сыворотка крови.
Пробы берут не позднее, чем через 10 часов после убоя или гибели животных.

7. Болезнь Ауески (ИФА, биопроба)

Материал для исследования:

Трупы животных или кусочки органов: головной и спинной мозг, легкие, печень, селезенка, лимфатические узлы, аборт. Плоды, плацента.
Сыворотка крови.

1. Грипп птиц (наличие антител, наличие антигена)

Материал для исследования:

Сыворотка крови от невакцинированных птиц.
Свежие трупы.

2. Болезнь Ньюкасла (напряженность иммунитета у вакцинированных, наличие антител у не вакцинированных, наличие антигена)

Материал для исследования:

Сыворотка крови от вакцинированных и не вакцинированных птиц.
Свежие трупы.

3. Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ)

Материал для исследования:

4. Синдром снижения яйценоскости (ССЯ-76) (напряженность иммунитета у вакцинированных, наличие антител у не вакцинированных)

Материал для исследования:

Сыворотка крови от вакцинированных и не вакцинированных птиц.

Материал для исследования:

Соскобы с конъюнктивы и клоаки, помет (не менее 3-х образцов от одной и той же особи в течение 5-ти суток). Павшая или вынужденно убитая птица, или патологический материал от них (кусочки органов, селезенки, экссудат брюшной полости) — отбирается не позднее 2-х часов после гибели или убоя, доставить для исследования в течение 24 часов.

Материал для исследования:

Кровь, фекалии, моча, носовые и конъюнктивальные смывы – от больных животных.
Кусочки органов – от павших животных.

Материал для исследования:

Кровь, носовые и конъюнктивальные смывы – от больных животных.
Кусочки органов – от павших животных.

Материал для исследования:

Кровь, фекалии (взятые в первые дни болезни).
Материал от вынужденно убитых или павших животных (селезенка, сердечная мышца, головной мозг, кишечник, взятые в первые часы после гибели).

4. Иммунодефицит кошек ВИД-Тест

Материал для исследования:

Сыворотка крови от больных животных.

Лейкемия кошек

Материал для исследования:

Сыворотка крови от больных животных.

Парвовирусный энтерит собак, панлейкопения кошек и вирусный энтерит норок

ПАРВО – Тест

Материал для исследования:

Фекалии от больных животных.

источник

Сайт предоставляет справочную информацию исключительно для ознакомления. Диагностику и лечение заболеваний нужно проходить под наблюдением специалиста. У всех препаратов имеются противопоказания. Консультация специалиста обязательна!

Серологический анализ крови представляет собой способ лабораторного исследования определенных антигенов или антител (специфических белков) в сыворотке крови пациента, основанный на иммунных реакциях организма. Данный метод применяется при диагностике инфекционных заболеваний для выявления наличия антител в крови больного к определенному виду вирусов или бактерий, а также для определения групповой принадлежности крови.

Данный анализ не требует специальной подготовки пациента. Забор крови проводится утром натощак и, производится в процедурных кабинетах лечебных учреждений, согласно общепринятым гематологическим методикам. Для серологического исследования забор крови производится двумя методами: венозную кровь забирают из локтевой вены пациента, а капиллярную кровь – из безымянного пальца. Кровь помещают в стерильные герметичные пробирки.

Серологические методы лабораторной диагностики используются для выявления таких заболеваний как эхинококкоз, трихинеллёз, токсокароз, описторхоз, цистицеркоз, токсоплазмоз, амебиаз, лямблиоз, для определения эффективности проведённого курса лечения и, наконец, для обнаружения повторного заболевания после полного выздоровления пациента.

Данная реакция является непрямым вариантом серологического исследования, то есть, производится она в два этапа. На первом этапе производят выявление необходимого антитела в циркулирующем комплексе антиген – антитело с помощью антиглобулина, схожего по своей структуре с белками иммунной сыворотки. Выявление искомого антитела возможно также при изучении заранее приготовленного антигенного препарата под люминесцентным микроскопом, без использования антиглобулинов.

Иммунофлюоресцентная реакция – очень трудоёмкий процесс, требующий от специалиста немало времени и ответственности. Начинается реакция с подготовки растворов, затем сыворотки и их контрольные образцы подвергаются титрованию (процесс, позволяющий определить содержание определённого вещества путём постепенного смешивания исследуемого раствора с контролируемым количеством реагента). Подготовленные ранее разведения и их контрольные образцы аккуратно наносятся на предметные стёкла с антигеном. Потом препараты подвергаются инкубации, затем следует их отмывание и высушивание на воздухе. На стёкла с антигеном тонким слоем наносится антисыворотка, после этого производится вторичная инкубация препаратов и, вся предыдущая цепь действий повторяется, завершаясь высушиванием препарата. В результате препарат на предметном стекле подвергается обработке глицерином и исследуется в люминесцентном микроскопе.

Результаты проведённой реакции оцениваются по четырёх бальной шкале, которая характеризуется интенсивностью поверхностного жёлто-зелёного свечения клеток антигенов:
+ очень слабое свечение клетки, заметное только на её периферии
++ слабое свечение периферии клетки, но с явно заметным зелёным оттенком
+++/++++ яркое свечение зелёного цвета периферии клетки
Титром реакции считается такое разведение сыворотки, где не менее 50 % клеток антигена проявляют чёткое поверхностное свечение, то есть результат реакции +++ или ++++. Значение тира реакции от 1/80 до 1/100.

Интенсивность реакции зависит от количества осаждённых эритроцитов на дне образованных лунок:
– отрицательная реакция, которая характеризуется осаждением эритроцитов на дно лунок в виде небольшого колечка с гладкими краями или «пуговки»
+ слабая интенсивность, для данной реакции характерны небольшие одиночные отложения на дне лунки. Неагглютинированные эритроциты образовывают «маленькое колечко» в центре лунки
++ средняя интенсивность, ей свойственно образование на дне лунки «широкого плотного кольца» из неагглютинированных эритроцитов
+++ интенсивная реакция, агглютинированные эритроциты образуют так называемые «зонтики», в центре которых, явно видны кольца, образованные осевшими неагглютинированными эритроцитами
++++ резко интенсивная реакция, в которой агглютинируются все эритроциты и, образуя «зонтики», выстилают дно лунок.
Титром данной реакции считают последнее разведение сыворотки, при котором выявляется явная агглютинация эритроцитов не менее +++, то есть при интенсивной или резко интенсивной реакции.

Принцип метода заключается в своеобразном взаимодействии антитела с антигеном. Одним из обязательных условий реакции является предварительная фиксация одного из её компонентов, то есть антигена или антитела, на твёрдых планшетах. Затем, при помощи ферментной метки обнаруживают возникнувшие комплексы антиген – антитело благодаря изменению оптической плотности первоначальной смеси (субстрата), что проявляется изменением интенсивности её окраски. ИФА свойственны некоторые преимущества перед остальными серологическими методами, например, данная реакция является наиболее чувствительной, в тестах используются универсальные реагенты, остающиеся стабильными не менее 6 месяцев, автоматизированный процесс учёта результатов реакции. Набор, необходимый для проведения реакции, содержит следующие компоненты: паразитарный антиген, специфические сывороточные антитела, конъюгат, планшета с зафиксированным на ней специфическим паразитарным антигеном, контрольные сыворотки.

Постановка реакции ИФА происходит в несколько этапов: вначале производится приготовление необходимых растворов, затем готовятся исследуемые образцы сывороток, а также контрольные сыворотки, позже следует нанесение приготовленных образцов сыворотки и контрольных сывороток на твёрдофазные носители, планшеты инкубируются, промываются и, только после проведённых процедур в лунки планшет вносится конъюгат. Через некоторое время он удаляется путём промывания лунок. На завершающем этапе в лунки вносится субстратная смесь и выдерживается в тёмном месте при комнатной температуре. Оценка результатов проводится автоматически при помощи специальных измерительных приборов, в некоторых случаях допускается визуальный учёт результатов проведённой реакции.

Достоверность и качество методов серологической диагностики зависят от организации проведённого внутреннего и внешнего лабораторного контроля, состоящих из нескольких независимых процедур, предназначенных для оценки качества результатов проведённого анализа.

источник

3.2. ПРОФИЛАКТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Серологические методы лабораторной диагностики
паразитарных заболеваний

1. РАЗРАБОТАНЫ: Институтом медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И.Марциновского ММА им. И.М.Сеченова (В.П.Сергиев, О.Г.Полетаева, Т.В.Продеус, Э.Е.Шуйкина, Е.А.Коврова, Н.Н.Красовская), кафедра паразитологии, паразитарных и тропических болезней МПФ ППО ММА им. И.М.Сеченова (Т.В.Старкова, Н.А.Романенко), Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Т.Н.Цыбина, Т.Г.Сыскова, Л.Г.Подунова, Т.А.Семенова), Российской Академией последипломного образования (А.Я.Лысенко, Т.Н.Константинова, Т.И.Авдюхина, А.Е.Беляев, М.Г.Владимова), НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалея (А.Л.Гинзбург, А.И.Грачева), Омским НИИ природно-очаговых инфекций (О.Ю.Старостина, В.К.Ястребов), Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии (Ю.И.Васерин, Т.И.Твердохлебова), Тюменским НИИ краевой и инфекционной патологии (Т.Ф.Степанова, Т.В.Постникова, К.Б.Степанова), Всероссийским НИИ гельминтологии им. К.И.Скрябина (А.В.Успенский, А.С.Бессонов, Н.В.Шеховцов), ЗАО «Вектор-Бест» (А.В.Масяго).

2. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 14 ноября 2002 г.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают основные методы серологической диагностики паразитарных заболеваний, проводимые аккредитованными, лицензированными лабораториями лечебно-профилактических учреждений, органов и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы, ведомственных учреждений, научно-исследовательских учреждений и других диагностических (испытательных) лабораторий вне зависимости от ведомственной принадлежности и форм собственности.

1.2. Методические указания предназначены для специалистов лабораторий, выполняющих серологические исследования на паразитарные заболевания и использующих медицинские иммунобиологические препараты (МИБП) отечественного и зарубежного производства, зарегистрированные на территории Российской Федерации и разрешенные к применению Министерством здравоохранения Российской Федерации.

Материалом при иммунологических исследованиях может быть биологический материал от людей (сыворотка крови, слюна, фекалии), а также материал из объектов окружающей среды (почва, вода и др.).

Для выявления антител к антигенам гельминтов и простейших у людей иммунологическими методами в настоящее время используется сыворотка крови обследуемого человека.

3.1. Забор крови на исследование проводится по общепринятым гематологическим методикам (забор венозной крови проводят в процедурных кабинетах лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ), капиллярной крови — в диагностических лабораториях ЛПУ и других аккредитованных лабораториях).

3.2. Подготовка сыворотки проводится в лабораториях.

3.2.1. Кровь в пробирке отстаивают в течение 1-2 ч при комнатной температуре или 0,5-1 ч при 37 °С в термостате, предварительно отслоив стерильной пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой сгусток от краев пробирки. Для лучшей ретракции сгустка пробирку помещают в холодильник при 4 °С на 1-2 ч или центрифугируют 10 мин при 3000 об./мин или 20 мин при 1500 об./мин. Сыворотку отсасывают стерильной пипеткой в стерильные стеклянные пробирки (ампулы, флаконы) или полистироловые микропробирки типа «Эппендорф» с крышками.

При массовых обследованиях населения ампулы с сывороткой перед транспортированием и хранением запаивают, избегая нагревания сыворотки, флаконы закрывают стерильными резиновыми пробками, микропробирки закрывают крышками. Ампулы, флаконы, микропробирки нумеруют согласно приложенному списку больных (обследуемых) или этикетируют с указанием фамилии, имени, отчества больного, даты взятия крови.

3.3. Хранение, транспортирование крови и сыворотки.

Кровь доставляется в лабораторию в день взятия. В этот же день из нее должна быть подготовлена сыворотка, которая может храниться до исследования в холодильнике при 2-4 °С не более 4-6 дней. При длительном хранении (более 2-х недель) сыворотку необходимо хранить в замороженном виде при температуре — 20-25 °С, допускается глубокое замораживание до — 70 °С. Не допускается замораживание и размораживание сыворотки более 1 раза.

Длительное хранение сывороток приводит к частичной потере активности антител, особенно иммуноглобулинов класса М (IgM).

При массовом заборе крови от населения, при длительном хранении сывороток до исследования (в течение года) и с целью предупреждения потери активности антител, необходимо хранить сыворотки в глубоком холоде, при температуре не выше — 20-40 °С.

До замораживания сыворотку от одного обследуемого можно разлить в несколько полистироловых микропробирок с крышками типа «Эппендорф», что позволяет размораживать не всю сыворотку, а ее отдельную часть.

Транспортирование замороженных сывороток должно быть при тех же температурных условиях, не допускающих размораживания (в сумках-холодильниках или термосах со льдом, можно использовать сухой лед).

Сыворотку перед исследованием необходимо разморозить полностью и тщательно перемешать во избежание потери концентрации антител.

В клинической практике серологические методы исследования являются дополняющими к комплексу клинико-инструментальных (эхинококкозы, цистицеркоз, токсокароз) и паразитологических (описторхоз, трихинеллез) показателей для целей дифференциальной диагностики паразитарного заболевания от заболевания со сходной клинической картиной. Серологическая диагностика применяется с целью выявления инвазированных, для оценки эффективности специфической терапии инвазированных, выявления рецидива заболевания.

Трихинеллез. Возбудитель нематода Trichinella spiralis и ее вариитеты. Острое заболевание, сопровождающееся лихорадкой, развитием отеков, миалгией и эозинофилией крови. При тяжелом течении возможно поражение миокарда, центральной нервной системы. Серологическая диагностика трихинеллеза осуществляется с учетом штаммовых особенностей возбудителя заболевания, а также состояния иммунной системы инвазированного. Выработка специфических антител происходит в период миграции личинок трихинелл и концентрации их в мышцах. Их выявление в серологических реакциях у лиц, заразившихся при употреблении в пищу мяса домашних животных (свиньи) с высокой или средней интенсивностью инвазии трихинеллами (200-500 личинок на 1 г мяса) происходит на 15-20 сутки после заражения. При меньшей интенсивности инвазии сроки выявления антител удлиняются. При заражении людей от диких животных (медведь, кабан, барсук, нутрия) антитела выявляются спустя 4-6 недель. В течение 2-4 месяцев показатели серологических реакций могут нарастать. Через 4-5 месяцев после заражения эти показатели снижаются, однако остаются на диагностическом уровне не менее 1,5 лет, а при интенсивном заражении до 2-2,5 и более лет.

Для ранней серологической диагностики трихинеллеза желательна одновременная постановка двух серологических реакций, например, одновременно реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и иммунноферментного анализа (ИФА). Совпадение их результатов свидетельствует о правильности диагноза.

Чувствительность ИФА и РНГА достигает 90-100%, а специфичность — 70-80%. Результаты двух реакций совпадают в 80-90% случаев. Ложноположительные результаты анализа чаще наблюдаются при острой фазе ряда гельминтозов (описторхоз, клонорхоз и др.), в связи с чем для дифференциального диагноза требуется тщательное изучение клинико-эпидемилогического анамнеза. Серологический диагноз трихинеллеза ставится на основании 4-кратного прироста титра антител. При невозможности исследования сыворотки в начале заболевания, исследуется сыворотка крови, полученная в период реконвалесценции. У больных с подозрением на трихинеллез, при первичном получении отрицательного или сомнительного результата реакции, исследование крови необходимо повторить через 10-14 дней, нарастание титров подтверждает инвазию трихинеллами.

Специфическая терапия трихинеллоцидными препаратами вызывает подъем титров антител, которые сохраняются в диагностических значениях на протяжении 6-12 месяцев, а затем снижаются. У лиц с подозрением на трихинеллез и получавших превентивное лечение серологическое обследование проводят через 2-3 недели после лечения. У переболевших трихинеллезом антитела сохраняются в течение длительного времени — от 2-х и более лет.

При массовых обследованиях населения на трихинеллез сыворотки крови исследуют в одном диагностическом разведении методом скрининга, как указывается в инструкциях к тест-системе ИФА и диагностическому набору РНГА. В случае положительного результата анализа у обследованных и при наличии у них клинической картины трихинеллеза, сыворотку титруют в последовательных двукратных разведениях, начиная от диагностического.

Показания к серологическому обследованию:

— наличие клинических симптомов (лихорадка неясного генеза, отек лица, миалгия, эозинофилия и др.); при миокардитах, менингоэнцефалитах неясного генеза, при лейкемоидной реакции по эозинофильному типу неясного генеза у пациентов, употреблявших в пищу свинину, медвежатину, кабана и мясо других животных — потенциальных хозяев трихинелл;

— расшифровка случаев групповой заболеваемости трихинеллезом (вспышки) и выявление контактных на эндемичных территориях (на неэндемичных территориях: при наличии в эпиданамнезе указаний на употребление в пищу мяса и мясопродуктов из свинины, медвежатины и других животных — потенциальных хозяев трихинелл).

Описторхоз. Возбудитель трематода Opisthorchis felineus. Tpeматодоз печени, протекающий на ранней стадии в виде острого аллергоза с высокой эозинофилией крови, на поздней — с преимущественным поражением гепатобилиарной системы, с умеренно повышенным или нормальным уровнем эозинофилов.

Серологическая диагностика описторхоза на ранней фазе заболевания, до начала яйцепродукции паразитом, является единственным методом лабораторной диагностики, при хроническом описторхозе является вспомогательным методом, при котором требуется подтверждение паразитологическими методами диагностики. Чувствительность реакции (ИФА и РНГА) в острую фазу приближается к 100%, в хронической фазе заболевания — до 70%, и зависит от интенсивности инвазии. Ложноположительные результаты анализа возможны при исследовании сыворотки здоровых лиц в 1,0%, больных непаразитарными заболеваниями (аллергозы, патология желудочно-кишечного тракта, гепатобиллиарной системы, системные заболевания) — в 1,5%, токсоплазмозом — в 5,6%, токсокарозом — в 7,3%, эхинококкозом — в 15,4%, трихинеллезом — в 20,0%, фасциолезом — в 29,4% случаев.

В очагах описторхоза у коренных жителей наблюдаются низкие показатели серологических реакций вследствие врожденной толерантности. У пришлого населения (рабочие-вахтовики, переселенцы и др.) вследствие отсутствия врожденной невосприимчивости к заражению описторхисами, как правило, регистрируются высокие показатели серологических реакций.

При серодиагностике возможно получение ложноотрицательных результатов на фоне иммунодефицитных состояний вследствие сопутствующих хронических заболеваний или индуцированных приемом медикаментов (антибиотиков, глюкокортикостероидов, химиопрепаратов).

Показания к серологическому обследованию:

— высокая эозинофилия крови или лейкемоидная реакция по эозинофильному типу у лиц, употреблявших в пищу речную рыбу;

— лица, работавшие или проживавшие в эндемичных по описторхозу районах, а в настоящее время страдающие заболеваниями желчевыводящих путей.

Эхинококкозы. Возбудитель однокамерного эхинококкоза — личиночная форма цестоды Echinococcus granulesus, многокамерного эхинококкоза — Echinococcus multilocularis. Тяжелые, хронически протекающие гельминтозы с поражением печени и других органов, приводящие в части случаев к инвалидизации и летальным исходам.

Серологические реакции при эхинококкозах используют для первичной диагностики, для оценки результатов оперативного и консервативного лечения и наблюдения за больными в динамике, для раннего выявления рецидивов заболевания. Локализация и жизнеспособность ларвоцист эхинококка гидатидозного и альвеолярного, интенсивность инвазии, а также состояние иммунной системы хозяина влияют на интенсивность антителообразования и выявляемость инвазированных с помощью серологических реакций.

Наиболее эффективными для диагностики эхинококкозов являются реакции РНГА и ИФА, с помощью которых выявляются до 90-98% инвазированных, независимо от видовой принадлежности паразита. Совпадение двух реакций наблюдается в 90% случаев. Максимальная выявляемость эхинококкозов серологическими методами (до 98%) наблюдается при локализации эхинококковых пузырей живого паразита в печени, брюшной полости и забрюшинном пространстве, а также при множественном и сочетанном поражении. При поражении легких, а также при наличии 1-3 кист небольшого (до 2 см) размера эффективность серологической диагностики ниже и колеблется в пределах 70-80%. Наименее информативны серологические методы диагностики при эхинококкозе нервной (спинной или головной мозг, глаз), мышечной или костной ткани, а также при погибшем и обызвествленном паразите. В этом случае чувствительность диагностических препаратов не превышает 40%. При серологической диагностике эхинококкозов возможна регистрация ложноположительных результатов, возникающих при наличии в крови неспецифических антител, сходных по структуре с антителами к эхинококку. Наиболее часто ложноположительные результаты выявляются при соматических и инфекционных заболеваниях, сопровождающихся обширными деструктивными процессами в пораженных органах (цирроз печени, туберкулез легких и других тканей, онкологические заболевания). Возникновение ложноположительных реакций возможно при других гельминтозах (описторхоз, фасциолез и цистицеркоз).

Низкие титры антител могут быть выявлены в ранний период болезни (кисты диаметром до 2 см), а также при обызвествленных оболочках ларвоцист; резкое снижение титров может наблюдаться при далеко зашедшем процессе, в поздней, неоперабельной стадии эхинококкозов. Высокие титры антител могут быть выявлены у больных с активным процессом, чаще локализованном в органах брюшной полости; в случае легочной локализации кисты эхинококка (даже при наличии кисты больших размеров) титры антител могут быть низкими.

Показания к серологическому обследованию:

— наличие объемного образования или кист в печени и других органах;

— эпидзначимые контингента — лица, относящиеся к группам риска (охотники и члены их семей; зоотехники; чабаны и пастухи; работники кожевенных предприятий и т.д.), лица, проживающие в очагах эхинококкозов.

Токсокароз — вызывается мигрирующими личинками аскаридат собак Toxocara canis. Инвазия с длительным рецидивирующим течением, полиморфными клиническими проявлениями и высокой эозинофилией периферической крови.

Серологическая диагностика токсокароза основана на результатах реакции ИФА с антигеном токсокар при исследовании сыворотки крови у лиц с характерным комплексом симптомов: лимфаденопатия, гепатомегалия, бронхит, бронхиальная астма неясного генеза, уртикарная сыпь на фоне эозинофилии крови, лейкемоидная реакция эозинофильного типа с характерным эпиданамнезом (например: геофагия) и др.

У пациентов, имеющих симптоматику, характерную для токсокароза, титры антител (AT) в ИФА 1:800 и выше подтверждает клинический диагноз. У лиц при отсутствии клинической симптоматики титр AT в ИФА 1:400 и ниже свидетельствует о контакте человека с возбудителем без развития патологического процесса. Ложноположительные результаты анализа могут наблюдаться у лиц с системными лимфопролиферативными заболеваниями и нарушениями в системе иммунитета. Это определяет необходимость проведения анализа клинической картины заболевания. Ложноотрицательный и сомнительный результат анализа может наблюдаться у лиц с поражением токсокарами глаз в результате слабого антигенного воздействия. Лиц с низким положительным результатом ИФА (титр 1:200-1:400) ставят на диспансерный учет и каждые 3 месяца проводят серологическое исследование. При появлении клинической картины заболевания и повышения титров специфических AT, врач принимает решение о необходимости проведения лечебных мероприятий.

Токсоплазмоз. Возбудитель внутриклеточные простейшие Toxoplasma gondii. Широко распространенное протозойное заболевание, характеризуется полиморфизмом клинических проявлений от бессимптомного носительства до выраженных клинических проявлений. Серологическая диагностика токсоплазмоза осуществляется с помощью ИФА для выявления IgM- и IgG-антител и реакции иммунофлюоресценции (РИФ). Является важной для дифференциальной диагностики от заболеваний со сходной клинической картиной. Сроки выявления специфических антител и кинетика смены концентраций иммуноглобулинов обоих классов индивидуальны, и зависят от интенсивности инвазии и иммунного статуса инвазированных. В ряде случаев выявление иммуноглобулинов класса IgM в РИФ и ИФА наблюдается через 7-12 суток после заражения в невысоких титрах. Через 2-3 месяца эти показатели достигают максимума, а через 3-4 месяца исчезают. Концентрация антител, относящихся к иммуноглобулинам класса IgG, достигает максимума к концу 2 месяца инвазии, затем снижается, но остается повышенной в течение всей жизни инвазированного.

Рекомендуется повторное обследование лиц с положительными титрами на токсоплазму через 10-14 суток, для установления динамики развития болезни. Отсутствие увеличения титров антител свидетельствует о хроническом токсоплазмозе. Увеличение титров на 3-4 разведения сыворотки свидетельствует об активном течении инвазии. Возможна иная схема кинетики выявления в РИФ и ИФА иммуноглобулинов классов М и G.

Высокие титры IgM свидетельствуют об острой стадии болезни. Высокие титры IgG могут свидетельствовать об обострении хронической инфекции, если есть клинические проявления, характерные для токсоплазмоза. Низкие титры IgG указывают на субклиническую, латентно протекающую инфекцию. Повышение и понижение титров антител можно считать достоверными, если разница предыдущего и последующего исследования различается по крайней мере на 4 разведения.

Показания к обследованию на токсоплазмоз:

— беременные женщины по показаниям, с сероконверсией;

— больные токсоплазмозом, получающие специфическое лечение;

— дети, рожденные от матерей с отягощенным анамнезом по токсоплазмозу;

— эпидзначимые контингенты: ветеринарные и другие специалисты, связанные в работе с кошками и собаками;

— больные с клиническими проявлениями, характерными для токсоплазмоза.

Амебиаз. Возбудитель Entamoeba histolytica.

Серологическая диагностика позволяет подтвердить внекишечный амебиаз, при котором паразитологическая диагностика невозможна. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) обладает высоким диагностическим потенциалом при выявлении этой инфекции за счет высокой чувствительности, специфичности и воспроизводимости.

Определение специфических антител в РИФ с амебным антигеном имеет принципиальное значение для уточнения этиологии процесса с локализацией поражений в толстом кишечнике; при проведении дифференциальной диагностики заболеваний, клинически сходных с амебным абсцессом печени (ААП), особенно для больных, прибывших или вернувшихся из стран жаркого или тропического пояса. Серологические исследования особенно ценны при выявлении внекишечных форм амебиаза: 98-100% клинически выраженного ААП. Реакция иммунофлюоресценции дает положительный результат в 75-80% случаев инвазивного амебиаза кишечника, особенно при молниеносном колите, амебоме и перитоните. При интерпретации результатов РИФ следует учитывать, что титр 1:320 и выше свидетельствует, как правило, о клинически выраженной, чаще внекишечной форме амебиаза. В титре 1:80-1:160 реакция может быть положительной у больных амебиазом в момент обследования или переболевших в недавнем прошлом, а также в случае вялотекущих, стертых форм кишечного амебиаза. РИФ в титре 1:40 может быть положительна у лиц с симптомами кишечного амебиаза при соответствующем эпиданамнезе и неотягощенном статусе больного. В этом случае эффективно исследование парных сывороток, т.к. подъем уровня антител после лечения, безусловно, свидетельствует в пользу амебной этиологии процесса. Ложноположительный результат в титре 1:40 может быть зарегистрирован у больных с системным аутоиммунным и онкопроцессом (III-IV стадии). Реакция иммунофлюоресценции в низких титрах (1:20-1:40) позволяет выявить среди зараженных бессимптомных носителей возбудителя амебиаза. Последовательное неуклонное снижение у переболевших уровня антител ниже 1:20 — показатель эффективности лечения в противном случае подъем титров и появление клинических симптомов следует оценивать как рецидив болезни.

При амебиазе реакция иммунофлюоресценции используется для подтверждения клинического диагноза, наблюдения за динамикой заболевания и последствий инфекции, вызванной дизентерийной амебой, при эпиднадзоре.

Отечественные тест-системы на амебиаз находятся в стадии разработки.

Лямблиоз. Возбудитель Lamblia intestinalis

В настоящее время на лямблиоз предприятиями бакпрепаратов выпускаются отечественные диагностические тест-системы как экспериментальные для проведения иммуноферментного анализа сыворотки крови. Имеются зарубежные диагностические тест-системы, в т.ч. для определения лямблиозных антигенов в фекалиях.

Антитела к антигенам лямблий проявляются на 10-14 день после начала инвазии и присутствуют в крови и секретах человека практически на всех ее стадиях. Через 1-2 месяца после полной элиминации паразита концентрация специфичных IgG в крови человека резко снижается.

Иммунофлюоресцентный метод (непрямой вариант) представлен двухэтапной реакцией, при которой обнаружение искомого антитела в комплексе антиген-антитело (АГ-AT) (1 этап) происходит с помощью конъюгата — антиглобулина, гомологичного по отношению к белкам иммунной сыворотки, меченного флюоресцеин-изотиоцианатом. Добавление конъюгата не обязательно для выявления комплекса АГ-AT при наблюдении в люминесцентном микроскопе. В диагностический набор для РИФ входит: антигенный препарат (специально размеченные предметные стекла с зафиксированной на их поверхности взвеси корпускулярного антигена), контрольные положительная и отрицательная сыворотки, люминесцирующая антивидовая сыворотка и реагенты.

Принцип проведения реакции иммунофлюоресценции
(непрямой вариант)

— Подготовка растворов.

— Титрование испытуемых сывороток и их контрольных образцов.

— Нанесение подготовленных разведении испытуемых и контрольных образцов сывороток на специально размеченные предметные стекла с антигеном.

— Инкубация препаратов с образцами во влажной камере (время и температура согласно инструкции).

— Отмывание препаратов в трех сменах фосфатно-солевого буфера (ФСБ) от непрореагировавших компонентов сыворотки.

— Высушивание препаратов на воздухе.

— Нанесение люминесцирующей антисыворотки (конъюгата) в рабочем разведении на стекла с антигеном.

— Инкубация препаратов во влажной камере при комнатной температуре.

— Отмывание препаратов в трех сменах ФСБ от непрореагировавших компонентов флюоресцирующей антисыворотки.

— Высушивание на воздухе.

— Нанесение препаратов на предметное стекло в забуференный глицерин под покровные стекла.

— Микроскопирование препаратов в люминесцентном микроскопе.

Результаты реакции оценивают по наличию и интенсивности поверхностного зеленовато-желтого свечения клеток антигена по 4-балльной системе:

— 3-4 креста — яркая флюоресценция зеленого цвета по периферии клетки токсоплазм, четко контрастирующая с телом клетки;

— 2 креста — слабое, но явно зеленое свечение периферии клетки;

— 1 крест — очень слабое свечение периферии клетки, не контрастирующее с телом клетки.

Отсутствие свечения клеток и их границ «ободка» в отрицательном контроле при ярком флюоресцировании «ободка» клеток, обработанных положительной контрольной сывороткой, подтверждает надежность проводимого исследования.

За титр реакции принимают то разведение сыворотки, в котором 50% и более клеток антигена в каждом изученном поле зрения имеют четкое специфическое поверхностное свечение. Значение диагностического титра — 1/80-1/100.

Реакция непрямой гемагглютинации основана на способности эритроцитов адсорбировать на своей поверхности антиген и при контакте со специфическими антителами склеиваться и образовывать осадок, видимый невооруженным глазом.

Она рекомендуется для диагностики описторхоза в острой фазе, трихинеллеза и эхинококкоза в острой и хронической фазах заболевания рекомендуется РНГА. Метод обладает высокой чувствительностью (до 90-98%) в острой фазе описторхоза, трихинеллеза и хронической — трихинеллеза и эхинококкоза. В хронической фазе описторхоза чувствительность РНГА не превышает 45%.

Реакцию непрямой гемагглютинации можно использовать в качестве теста, дополняющего результаты иммуноферментного анализа, для повышения достоверности серологической диагностики гельминтозов.

Диагностический набор содержит: формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные специфическим антигеном (Д+), эритроциты барана без антигена (Д-), сыворотка диагностическая агглютинирующая, положительный контрольный тест (К+), сыворотка нормальная человека — отрицательный контрольный тест (К-), эритроциты барана сухие (Э), реагент для приготовления раствора для разведения сывороток.

5.2.1. Принцип постановки РНГА

Проведение реакции непрямой гемаглютинации с использованием промышленных препаратов включает следующие этапы, которые должны точно соответствовать инструкции по применению используемого препарата:

1) подготовка растворов, необходимых для проведения анализа;

2) подготовка испытуемых сывороток и контрольных сывороточных образцов;

3) нанесение на планшет испытуемых и контрольных образцов;

4) внесение диагностикума (Д+) и эритроцитов без антигена (Д-);

6) учет результатов.

Результаты анализа учитываются в титрах и по интенсивности реакции, выраженной в крестах. При оценке результата реакции по 4-крестной системе учитывается характер осадка эритроцитов на дне лунок:

— резко интенсивная реакция (++++) — все эритроциты агглютинированы и покрывают дно лунок, образуя «зонтик»;

— интенсивная реакция (+++) — агглютинированы почти все эритроциты, образуя зонтик, в центре которого имеется заметное кольцо из осевших неагглютинированных эритроцитов;

— реакция средней интенсивности (++) — на дне лунки различается осадок из неагглютинированных эритроцитов в виде плотного широкого кольца;

— реакция слабой интенсивности (+) — мелкие агглютинаты на дне лунки, большинство эритроцитов не агглютинировало и осело в центре лунки в виде маленького кольца;

— реакция отрицательная (-) — эритроциты осели на дне лунки, образуя «пуговку» или маленькое колечко с ровными краями.

Учет проводится при соответствующих показателях контролей:

Д+ — не образует спонтанной агглютинации в отсутствии сывороток, с К- — не агглютинируют в разведении выше диагностического титра, с К+ — агглютинируют (см. инструкцию по применению).
Д- — не образуют спонтанной агглютинации в отсутствии сыворотки, а также с К+ и испытуемыми сыворотками.

Титром сыворотки считают последнее разведение, при котором наблюдается четкая агглютинация не менее чем на 3 креста (+++). Диагностические титры реакции с эритроцитарными диагностикумами указаны в инструкции по применению.

Реакция иммуноферментного анализа (ИФА) основана на специфическом взаимодействии антигена и антитела с предварительной иммобилизацией (фиксацией) одного из компонентов реакции (антигена или антител) на твердофазном носителе (в лунках полистироловых планшетов, стрипов и др.) и выявления образовавшегося комплекса АГ-AT посредством ферментной метки (конъюгат). Выявление образовавшегося комплекса осуществляется по изменению интенсивности окраски (оптической плотности) субстратной смеси, содержащей вещество, с которым реагирует фермент, и индикатор, изменяющий цвет под действием продуктов реакции фермент-субстрат.

Реакция ИФА обладает рядом преимуществ перед другими серологическими тестами, которые состоят в следующем:

— высокой специфичности и чувствительности;

— возможности использования универсальных реагентов и отконтролированных диагностических тест-систем; высокая стабильность реагентов (не менее 6 месяцев);

— возможность стандартизации проведения анализа и учета его результатов за счет автоматизации процесса.

В используемых в медицинской практике на территории России тест-системах ИФА участвует 3 компонента: антиген паразита, специфические антитела исследуемой сыворотки крови и конъюгат (меченные ферментом антивидовые антитела или протеин А стафилококка).

Реакцию АГ-AT с конъюгатом выявляют путем введения в состав субстратной смеси одного из хромогенов: ортофенилендиамина (ОФД), 5-аминосалицидовой кислоты (5-АС) или тетраметилбензидин (ТМБ).

Учет результатов при использовании 5-АС и ОФД проводят по оптической плотности при длине волны 492 нм, а при использовании ТМБ — при 450 нм на сканирующем спектрофотометре типа Мультискан, Униплан, Биоскрин, Стат-Факс и т.п. При отсутствии прибора автоматического измерения оптической плотности возможен визуальный учет результатов анализа по интенсивности цветовой окраски раствора в тех случаях, когда это предусмотрено инструкцией по применению.

Диагностический набор (тест-система) включает:

— твердофазный носитель с адсорбированным на нем специфическим антигеном паразита;

— контрольные тест-сыворотки (диагностические, отрицательные и положительные) для определения правильности хода реакции и оценки результатов анализа;

— основные ингредиенты для приготовления растворов, используемых в ходе реакции.

Режим работы лаборатории, выполняющей серологические исследования на паразитарные заболевания, должен соответствовать СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами».

Все исследуемые образцы сывороток крови следует считать потенциально инфицированными, независимо от результатов тестов, которые провел производитель тест-системы.

5.3.2. Подготовка проб исследуемых сывороток

Подготовку сыворотки крови проводить в соответствии с п.3 (п.п.3.2). Сыворотку во избежание гемолиза крови следует отбирать не позже чем через 2 ч после взятия крови. Тест-системы отечественного производства и некоторые импортные наборы чувствительны к наличию гемолиза в пробе и вследствие этого могут давать ложноположительные результаты. При приготовлении сывороток должны быть приняты все меры, позволяющие исключить их контаминацию.

5.3.3. Принцип постановки ИФА

Проведение иммуноферментного анализа с использованием промышленных диагностических препаратов включает следующие этапы, которые должны точно соответствовать инструкции по применению используемого препарата:

1. Подготовка растворов, необходимых для проведения анализа

источник