Меню Рубрики

Анализ на электрофорез белков мочи

Электорофорез белков мочи – метод выявления в моче патологических белков (парапротеинов) при ряде опухолевых заболеваний (множественная миелома). Основные показания к применению: уточнение причин протеинурии, клинические признаки множественной миеломы.

Наиболее ранним и постоянным признаком миеломной болезни (при развитии миеломной почки) является протеинурия, обнаруживаемая у 65% и более больных. В ряде случаев стойкая протеинурия является единственным признаком миеломной болезни. При помощи электрофореза мочи можно установить природу появления белка, в данном случае Бенс-Джонса. Белок Бенс-Джонса представляет собой димеры легких цепей иммуноглобулинов (моноклональные каппа или лямбда цепи иммуноглобулинов — L-цепи), синтезируемых плазматическими клетками в избыточных количествах при миеломе, болезни Ходжкина, макроглобулинемии Вальденстрема, хронических лейкозах. Поэтому, в случае обнаружения протеинурии неясной этиологии в разовой или суточной моче обычными биохимическими методами, следует проводить электрофорез белков мочи. Обнаружение белка Бенс-Джонса в моче является диагностическим критерием множественной миеломы. Этот белок, проникая в канальцы почек, повреждает их эпителий, что в конечном итоге приводит к склерозированию стромы почек и ведет к почечной недостаточности (одной из причин смерти при миеломной болезни). Исследование содержания этого белка имеет большое и прогностическое значение. Стойкое наличие этого белка свидетельствует о развитии необратимой почечной недостаточности.

  • Моча собирается за сутки в контейнер на 3 литра. В начале сбора первая порция мочи (утренняя) отбрасывается и далее собирается за 24 часа. На время сбора контейнер хранят в темном прохладном месте. После сбора моча перемешивается, определяется ее объем и переливается в сосуд меньшего объема. Для проведения анализа достаточно 20-30 мл мочи.
  • В норме парапротеины в моче не обнаруживаются.
  • Уточнить природу иммуноглобулинопатий. Ранняя диагностика множественной миеломы.

    Множественная миелома. Макроглобулинемия Вальденстрема. Хронический лейкоз.

    Электорофорез белков мочи – метод выявления в моче патологических белков (парапротеинов) при ряде опухолевых заболеваний (множественная миелома). Основные показания к применению: уточнение причин протеинурии, клинические признаки множественной миеломы.

    Наиболее ранним и постоянным признаком миеломной болезни (при развитии миеломной почки) является протеинурия, обнаруживаемая у 65% и более больных. В ряде случаев стойкая протеинурия является единственным признаком миеломной болезни. При помощи электрофореза мочи можно установить природу появления белка, в данном случае Бенс-Джонса. Белок Бенс-Джонса представляет собой димеры легких цепей иммуноглобулинов (моноклональные каппа или лямбда цепи иммуноглобулинов — L-цепи), синтезируемых плазматическими клетками в избыточных количествах при миеломе, болезни Ходжкина, макроглобулинемии Вальденстрема, хронических лейкозах. Поэтому, в случае обнаружения протеинурии неясной этиологии в разовой или суточной моче обычными биохимическими методами, следует проводить электрофорез белков мочи. Обнаружение белка Бенс-Джонса в моче является диагностическим критерием множественной миеломы. Этот белок, проникая в канальцы почек, повреждает их эпителий, что в конечном итоге приводит к склерозированию стромы почек и ведет к почечной недостаточности (одной из причин смерти при миеломной болезни). Исследование содержания этого белка имеет большое и прогностическое значение. Стойкое наличие этого белка свидетельствует о развитии необратимой почечной недостаточности.

    источник

    В плазме человеческой крови находится множество белковых компонентов. Они различны по своему составу, строению и подвижности в определенной среде, проводящей электрический ток. На этом и строится разделение общего белка, который локализуется в плазме, на различные белковые фракции. При проведении электрофореза сыворотки крови выясняют количественное отношение отдельных белковых составляющих и структур. Это необходимо для определения наличия у человека различных патологических явлений, например инфекций или онкологии. Именно электрофорез белков сыворотки крови имеет большое значение при проведении диагностики различных болезней.

    Для расщепления белковых фракций применяют электрофорез сыворотки крови, принцип которого основан на разной подвижности белковых компонентов в созданном электрическом поле. Такой метод исследования является более точным и информативным, в отличие от стандартного общего анализа крови. Но при этом электрофорез показывает только количество определённой фракции белка, характер и степень патологического процесса в общей форме. Анализ проведенных исследований позволяет медицинским специалистам выяснить, какое именно соотношение белковых фракций наблюдается в организме человека, и определить специфику патологии, присущую конкретному заболеванию.

    Большую часть основной биологической жидкости человека, или крови, составляют белки. В общем количестве их норма находится в пределах 60-80 г/л. Для получения точного анализа проводится электрофорез сыворотки крови на бумаге. Это исследование является самым распространенным способом анализа. Основной средой является особая фильтровальная бумага. Главная ее особенность – высокая гигроскопичность. Такая бумага может поглотить воды больше своего веса в 130-200 раз. В зависимости от применяемого оборудования электрофорез на бумаге длится 4-16 часов. Происходит подразделение белковых структур. Затем полосы бумаги обрабатывают специальными красками для получения анализа. Такая методика является самой распространенной в работе медицинских лабораторий. За счёт воздействия электрического тока белковые фракции, заряженные отрицательно, двигаются в сторону положительно заряженного электрода. Благодаря этому белковые составляющие крови подразделяются на 5 известных фракций:

    Альбумины заряжены отрицательно, имеют маленькую, по сравнению с другими фракциями, молекулярную массу. За счет этого скорость их передвижения гораздо выше, чем у остальных фракций, и они дальше всех локализуются от участка старта. Первые три фракции глобулина передвигаются с более низкой скоростью из-за своей массы. Но самая маленькая скорость регистрируется у γ-глобулинов. Эти белки имеют большую массу и крупные, относительно других, размеры. Их заряд почти нейтрален, поэтому данная белковая фракция практически не сдвигается с линии старта.

    В настоящее время электрофорез сыворотки крови часто проводимый анализ для постановки точного диагноза болезни. Этот анализ могут назначить как терапевты, так врачи узкого профиля. Показаниями по проведению исследований будут:

    • различные воспаления;
    • болезни хронической природы;
    • патологические процессы в соединительной ткани;
    • внутреннее кровотечение;
    • злокачественные новообразования.

    Для того чтобы полученные результаты поведенных исследований были верными, не менее чем за 8 часов до сдачи крови необходимо отказаться от приёма еды. Кроме того, необходимо согласовать прием лекарственных средств, если таковые имеются, с лечащим врачом.

    Для того чтобы результаты не были по ошибке завышены, необходимо снизить до минимума возможность свертывания крови для определения показателя белковых фракций и общего белка. Электрофорез сыворотки крови проводится аккуратно, поскольку существует вероятность искажения полученных результатов из-за фибриногена. Он может прятать ненормальные белки или быть спутанным с ними.

    В течение суток после сдачи пробы будет готов анализ на электрофорез белков сыворотки крови. Норма полученных показателей по категориям у взрослых людей:

    1. Общий белок – 63-82 г/л.
    2. Альбумины – 40-60 % от общего количества фракций.
    3. α1-глобулины – 2-5 %.
    4. α2-глобулины – 7-13 %.
    5. β-глобулины – 8-15 %
    6. γ-глобулины – 12-22 %.

    Изменение количества любой белковой фракции в большую или меньшую сторону может свидетельствовать о развитии той или иной патологии. Для получения достоверной информации об этом необходим электрофорез белков сыворотки крови. Расшифровка результатов облегчит медицинским специалистам постановку диагноза и выбор лечения.

    В самом начале при анализе полученных результатов определяют количество альбумина. Увеличение этой фракции может говорить об обезвоживании. Такое может произойти, если у больного отмечается затяжная рвота или нарушения в пищеварительной системе. Также увеличение альбумина происходит при ожогах большой площади кожного покрова.

    Гораздо опаснее, если в организме снижается количество альбуминов, это может говорить о следующих патологиях:

    1. Поражения почек и печени.
    2. Патологии желудочно-кишечного тракта.
    3. Инфекционные процессы.
    4. Нарушения в деятельности сердечно-сосудистой системы.
    5. Кровотечения.
    6. Злокачественные новообразования.
    7. Сепсис.
    8. Ревматизм.

    Незначительное уменьшение количества альбуминов может быть также:

    1. У будущих матерей.
    2. При превышении дозы лекарственных препаратов.
    3. При длительной лихорадке.
    4. У заядлых курильщиков.

    Уменьшение количества a1-глобулинов регистрируется при недостатке α1-антитрипсина. Увеличение же отмечают при обострении воспалений в организме, нарушениях в работе печени, при тканевом распаде.

    Регистрируют его при сахарном диабете, воспалительных процессах в поджелудочной железе, у новорожденных детей при желтухе, при гепатитах токсического происхождения. Свидетельствует оно и о неправильном, несбалансированном питании.

    Происходит при наличии следующих заболеваний:

    1. Воспаления, особенно с присутствием гнойного экссудата (воспаление легких и другие процессы с наличием гноя).
    2. Поражения соединительной ткани (например, ревматизм).
    3. Злокачественные новообразования.
    4. Периоды восстановления после ожогов.
    5. Поражение почек.

    Кроме того, такое явление характерно для гемолиза крови в пробирке во время проведения исследования.

    Проявляется при гиперлипопротеидемии (увеличении количества липидов в крови), патологиях печени и почек. Можно обнаружить при открытой язве желудка, а также гипотиреозе (нарушение работы щитовидной железы). Снижение фракции регистрируют при гипобеталипопротеинемии (повышение в крови компонента беталипопротеин).

    Эта фракция включает в свой состав иммуноглобулины. Поэтому увеличение γ-глобулинов регистрируется при сбоях в иммунитете. Обычно это происходит при различных инфекциях, развитии воспалительного процесса, изменениях ткани и ожоговых поражениях. Рост γ-глобулинов отмечают у больных хронической формой гепатита. Практически такая же картина характерна для цирроза печени. При запущенных случаях данного заболевания количество белковой фракции γ-глобулинов значительно выше показателя альбуминов. При определенных болезнях могут возникать сбои в образовании γ-глобулинов, и происходит развитие измененных протеинов в крови – парапротеинов. Для выяснения характера такого развития производится дополнительное исследование – иммуноэлектрофорез. Такая картина характерна для миеломного заболевания и патологии Вальденстрема.

    Увеличение количества γ-глобулинов также присуще следующим патологиям:

    • красной волчанке;
    • эндотелиоме;
    • ревматоидной форме артрита;
    • остеосаркоме;
    • хронической форме лимфолейкоза;
    • кандидомикозу.

    Снижение показателя γ-глобулинов подразделяют на 3 вида:

    1. Физиологический (характерен для детей в возрасте от трех до пяти месяцев).
    2. Врожденный (развивается с момента рождения).
    3. Идиопатический (когда причину развития установить не удается).

    Вторичное снижение регистрируется при развитии заболеваний, которые вызывают истощение иммунной системы. В последнее время в медицинской практике все чаще проводится анализ на определение количества преальбуминов. Обычно такое исследование проводят больным, находящимся в реанимации.

    Уменьшение количества преальбуминов очень важный и точный тест на определение недостаточности белковых структур в организме пациента. При проведении анализа на преальбумины выполняют коррекцию белкового метаболизма у таких пациентов.

    Принцип проведения подобного анализа схож с технологией выполнения электрофореза сыворотки крови. Проводят его для более точной постановки диагноза или обнаружения других патологий. Кроме того такой анализ поможет выявить у больного наличие протеинурии.

    Электрофорез сыворотки крови и мочи – важные методы в диагностике различных инфекционных заболеваний. Благодаря методике исследования и высокой точности они помогают определить вид патологии. Точный диагноз – верный путь к правильному лечению и полному выздоровлению.

    источник

    Исследование, направленное на определение количественного соотношения основных белковых фракций мочи для выявления типа протеинурии, характерного для заболеваний почек или патологических процессов внепочечной локализации.

    Электрофорез белков мочи; белковые фракции мочи; тип протеинурии.

    Electrophoresis of urine proteins; protein electrophoresis; urine electrophoresis; the type of proteinuria.

    Какой биоматериал можно использовать для исследования?

    Суточную мочу, среднюю порцию утренней мочи.

    Как правильно подготовиться к исследованию?

    • Исключить из рациона алкоголь в течение 24 часов до исследования.
    • Исключить (по согласованию с врачом) прием мочегонных препаратов в течение 48 часов до сбора мочи.

    Общая информация об исследовании

    Повышение уровня белка в моче, или протеинурия, представляет собой состояние, которое может сопровождать патологический процесс в почках, а также иметь преренальное и постренальное происхождение. Электрофоретический метод — это способ пространственного разделения молекул, имеющих разный заряд и размеры, путем помещения их в электрическое поле. Данный метод позволяет оценить количественное соотношение основных белковых фракций мочи в зависимости от молекулярной массы, предположить и описать тип протеинурии, что помогает в дальнейшей диагностике заболеваний или назначении лечения.

    В норме в результате процессов фильтрации и реабсорбции в почках количество белка, выделяемой с мочой, не превышает 100-150 мг/сут. При этом основное количество белка приходится на альбумин. Микроальбуминурия – это экскреция с мочой микроальбуминов в количестве от 30 до 300 мг/сут или от 20 до 200 мг/л в утренней моче. Она является ранним признаком нарушения функции клубочков почек. При выделении с мочой более 300 мг/сут белка развивается протеинурия.

    Важно отметить, что протеинурия не всегда является признаком патологического процесса и только у 2 % населения служит причиной серьезного заболевания. В остальных случаях развиваются функциональные, или транзиторные, протеинурии. Эта разновидность протеинурии не связана с заболеванием почек, и потеря белка при ней незначительна (менее 2 г/сутки). У новорождённых детей может отмечаться физиологическая протеинурия в первые 4-10 суток, и количество белка не превышает 0,5 г/л. Транзиторные протеинурии могут возникать после повышенной физической нагрузки, при эмоциональном стрессе, лихорадке, остром инфекционном заболевании, после перегрева или переохлаждения организма, при потере жидкости, при приеме пищи, богатой белком. При устранении этиологического фактора такие протеинурии быстро проходят. Уровень белка в моче может достигать 3-5 г/л. Известен вариант ортостатической протеинурии, которая появляется, только когда человек стоит, и исчезает в горизонтальном положении. Данный вариант протеинурии наиболее характерен для детей дошкольного и школьного возраста и может быть связан с особенностями развития и роста. Существует вариант гиперлордотической протеинурии, когда концентрация белка в моче неизменна в положениях стоя и лежа. Такие варианты доброкачественных протеинурий могут исчезать, но часто могут являться предвестниками почечной патологии.

    Преренальная протеинурия характеризуется появлением в плазме крови патологических белков в избыточном количестве и не связана с заболеваниями почек. Данные белки имеют низкую молекулярную массу, свободно проходят через неповреждённую почечную мембрану и обнаруживаются в моче. Отмечается увеличенное количество общего белка в моче, фракция альбумина в пределах нормы. Различают гемоглобинурию при гемолитической анемии, миоглобинурию при обширном поражении мышечной ткани, застойную протеинурию при сердечной недостаточности и нейрогенный вариант протеинурии.

    Появление в крови патологических белков – парапротеинов характерно для множественной миеломы, амилоидоза, макроглобулинемии Вальденстрема, болезни тяжелых цепей и ряда других заболеваний. Для диагностики парапротеинемий необходим одновременный анализ как сыворотки крови, так и мочи. Это связано с большой вариабельностью результатов, полученных при исследовании данных биоматериалов. Фрагменты иммуноглобулинов — каппа- и лямбда-легкие цепи — из-за низкой молекулярной массы легко фильтруются через нормальный почечный фильтр, формируя агрегаты и образуя в моче белок Бенс-Джонса. При этом легкие цепи иммуноглобулинов не обнаруживаются в крови, а могут быть обнаружены только при электрофорезе белков в моче (белок Бенс-Джонса). Чувствительность данного метода лимитирована процессом реабсорбции легких цепей, то есть легкие цепи не могут быть обнаружены в моче до начала развития поражения почечных канальцев. При доброкачественных парапротеинемиях данный белок в моче не обнаруживается.

    Ренальная протеинурия характерна для многих заболеваний почек и разделяется на клубочковую, тубулярную и смешанную. Клубочковая протеинурия возникает при повреждении базальной мембраны клубочков почек, а тубулярная – в результате нарушения функции реабсорбции белка в почечных канальцах.

    Клубочковая (гломерулярная) протеинурия характерна для всех заболеваний почек, протекающих с поражением коркового вещества почек. К таким заболеваниям относятся острый и хронический гломерулонефрит, липоидный нефроз, идиопатический мембранозный гломерулонефрит, фокальный сегментарный гломерулярный склероз и другие первичные гломерулопатии, а также нефропатии при сахарном диабете, беременности, при болезнях соединительной ткани, опухолях почек.

    Селективная гломерулярная протеинурия возникает в результате увеличения проницаемости клубочков для анионных белков средней молекулярной массы, в частности альбумина и трансферрина, с количеством белка около 0,03-0,3 г/сут. Картина электрофоретического разделения белков мочи не соответствует картине белков сыворотки крови, так как почечный фильтр остается непроницаем для высокомолекулярных белков – глобулинов. Данный тип протеинурии характерен для диабетической нефропатии, нефропатии беременных, при хроническом гломерулонефрите в стадии компенсации.

    При неселективной гломерулярной протеинурии увеличивается проницаемость почечной мембраны как для низкомолекулярных, так и для высокомолекулярных белков массой более 100 кДа, в частности альбумина, иммуноглобулинов классов IgG, IgG. Белки с очень большой молекулярной массой — иммуноглобулин IgM и альфа-2-макроглобулин — не проникают через базальную мембрану и не обнаруживаются в моче. Электрофорез белков мочи идентичен электрофорезу белков крови. Этот тип протеинурии встречается при заболеваниях, сопровождающихся нефротическим синдромом и увеличением количества белка более 3 г/сут. К ним относятся различные варианты гломерулонефритов, в том числе волчаночного нефрита, а также тяжелые варианты нефропатий.

    При тубулярной протеинурии нарушается реабсорбция белков в проксимальном отделе нефрона или усиливается продукция специфического белка клетками почечного эпителия дистального отдела нефронов (белка Тамма — Хорсфалла). В моче обнаруживаются низкомолекулярные белки: альфа-1-микроклобулин, бета-1-микроглобулин, бета-2-микроглобулин, цистатин С. Тубулярная протеинурия встречается при гипертензивном нефроангиосклерозе, интоксикации солями свинца и ртути, при синдроме Фанкони, врождённом дефекте почечных канальцев, интоксикации нефротоксичными препаратами, а также при применении нестероидных противовоспалительных препаратов и некоторых антибиотиков.

    При смешанной протеинурии электрофореграммы белков мочи могут показывать как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные белки плазмы крови. Она может возникать при пиелонефрите, острой почечной недостаточности.

    Причиной постренальной протеинурии является кровотечение или воспалительный процесс в мочевыводящих путях, а также она может наблюдаться при доброкачественных и злокачественных процессах мочевого пузыря. При электрофорезе белков мочи могут быть обнаружены плазменные белки: альбумин, иммуноглобулины, альфа-2-макроглобулин.

    Для чего используется исследование?

    • Для выяснения типа протеинурии в зависимости от выявления белковых фракций мочи электрофоретическим методом;
    • для диагностики и подтверждения варианта парапротеинемий;
    • для описания типа протеинурии в целях предположения патологического процесса, заболевания, возможно, назначения дополнительных методов лабораторной диагностики и лечения.

    Когда назначается исследование?

    • При симптомах поражения почек, сопровождающихся развитием нефротического синдрома;
    • при изменениях в общем анализе мочи, при повышении количества общего белка в моче;
    • при подозрении на функциональный тип протеинурии в зависимости от возраста обследуемого, протеинурии, возникающий после эмоционального стресса, физической нагрузки, инфекционно-воспалительных процессов, при чрезмерном употреблении белковой пищи;
    • для исключения типа протеинурии, не связанной с патологией почек, в частности при подозрении на заболевания, сопровождающиеся парапротеинемией, при гемолитической анемии, обширном повреждении мышц, при кровотечениях, воспалительных и опухолевых заболеваниях мочевыводящих путей;
    • в комплексной диагностике и для предположения типа протеинурии в зависимости от выявляемых белковых фракций в моче;
    • для комплексной диагностики заболеваний почек: гломерулонефритов, пиелонефритов, гломерулопатий, нефропатий, в том числе при беременности, сахарном диабете;
    • при назначении нефротоксичных препаратов: аминогликозидов, пенициллинов, циклоспорина, нестероидных противовоспалительных препаратов, диуретиков и некоторых других.
    Читайте также:  1 кетоновые тела при анализе мочи

    Белок в моче: не обнаружен.

    Общий белок мочи: 0 — 0,1 г/л.

    • первичные заболевания почек: липоидный нефроз, идиопатический мембранозный гломерулонефрит, фокальный сегментарный гломерулярный склероз, IgA-гломерулонефрит, мембранопролиферативный гломерулонефрит, пиелонефрит, синдром Фанкони, острый тубулоинтерстициальный нефрит;
    • поражения почек при других заболеваниях и патологических состояниях: сахарном диабете, артериальной гипертензии, системных заболеваниях соединительной ткани, амилоидозе, преэклампсии, эклампсии, злокачественных новообразованиях (легких, желудочно-кишечного тракта, крови);
    • поражение почек при лечении нефротоксическими препаратами: нестероидными противовоспалительными препаратами, диуретиками, аминогликозидами, пенициллинами, циклоспорином;
    • поражение почек при отравлении солями свинца и ртути.
    • множественная миелома, амилоидоз, макроглобулинемия Вальденстрема, болезни тяжелых цепей, лимфома, хронический лимфолейкоз;
    • гемоглобинурия при гемолитической анемии;
    • миоглобинурия при повреждении мышечной ткани;
    • застойная протеинурия при заболеваниях сердца в стадии декомпенсации, при асцитах, вызванным метастазами и онкологическими процессами в брюшной полости;
    • нейрогенная протеинурия при черепно-мозговых травмах, психоневрологических нарушениях.

    3. Протеинурия в результате кровотечений или воспалительных процессов в мочевыводящих путях, при доброкачественных и злокачественных процессах мочевого пузыря.

    4. Транзиторная (доброкачественная) протеинурия: дегидратация, стресс, диета с высоким содержанием белка, значительная физическая нагрузка, лихорадка, ортостатическая протеинурия.

    уменьшение белковых фракций для определения типа протеинурии диагностически неинформативно. Возможно снижение одной белковой фракции при увеличении другой.

    Что может влиять на результат?

    [02-006] Общий анализ мочи с микроскопией осадка [06-114] Альбумин в моче (микроальбуминурия) [08-019] Бета-2-микроглобулин в моче [13-101] Белок Бенс-Джонса, количественно (иммунофиксация мочи)

    Кто назначает исследование?

    Терапевт, врач общей практики, нефролог, уролог, гематолог, онколог, ревматолог, иммунолог, педиатр.

    1. Johnson DW. Global proteinuria guidelines: are we nearly there yet? / Clin Biochem // Rev. 2011 May;32(2):89-95.
    2. McTaggart MP1, Lindsay J, Kearney EMReplacing urine protein electrophoresis with serum free light chain analysis as a first-line test for detecting plasma cell disorders offers increased diagnostic accuracy and potential health benefit to patients/Am J Clin Pathol. // 2013 Dec;140(6):890-7.
    3. Fauci, Braunwald, Kasper, Hauser, Longo, Jameson, Loscalzo Harrison’s principles of internal medicine, 17th edition, 2009.
    4. Долгов В.В., Меньшиков В.В. Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство. – Т. I. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 928 с.

    источник

    Этот анализ является исследованием, которое позволяет определить их количественные и качественные показатели по тому, как белки распределяются в электрическом поле. Исследование основано на том, что белковые молекулы несут заряды, положительные или отрицательные в зависимости от того, какой кислотностью будет обладать среда, в которой будет проводиться непосредственно электрофорез. Молекулы, которые окажутся положительно заряженными, будут адсорбироваться лучше, нежели чем те, которые несут отрицательный заряд.

    Носителями, которые будут применяться для электрофореза, могут быть хроматографическая бумага, агаровый гель, полиакриловой гель, ацетатцеллюлозная бумага или акриловый гель. Значительно реже применяется капиллярный электрофорез.

    Во время анализа белки разделяют на 5 или 6 фракций, в зависимости от применяемого метода. Это будут гамма-глобулины, которые делятся на бета-1 и бета-2, альбумины — альфа-1 и альфа-2, а также бета-глобулины.

    Имеются установленные нормы белковых фракций, которые должны присутствовать в крови. Отклонение их от показателей является признаком нарушения в организме, что требует проведения обследования для выявления причины.

    Фракция Норма в г/л
    Альбумин 35-44
    Глобулин альфа-1 1-3
    Глобулин альфа-2 5-8
    Бета-глобулин 4-10
    Гамма-глобулин 5-12

    Значения показателей, в зависимости от того какие реактивы применяются в конкретной лаборатории, могут несколько изменяться. Поэтому в бланке результатов исследования в каждом медицинском учреждении обязательно указываются значения нормы, которые приняты в нем. На них будет ориентироваться врач при расшифровке анализа.

    Электрофорез белков крови назначают не очень часто, так как сегодня современные лабораторные исследования позволяют провести анализ на определенный белок, что ускоряет процесс диагностики. Абсолютным показанием к электрофорезу является наличие монолокальной гаммапатии. Также иногда анализ может быть показан в таких случаях:

    • чрезмерно высокая скорость оседания эритроцитов, когда она превышает 50 мм/ч;
    • значительно повышенный уровень гамма-глобулинов;
    • скрининговое обследование для контроля эффективности лечения миеломной болезни;
    • чрезмерно высокий общий белок в крови;
    • ряд аутоиммунных заболеваний, поражающих печень и почки;
    • слабость, для которой нет выраженной причины;
    • развитие патологических переломов костей и постоянные боли в костях;
    • частые рецидивы инфекционных заболеваний;
    • нарушения, обнаруженные в прочих анализах, указывающие на то, что у человека могут развиваться анемии, лейкемии, гиперкальциемия или гипоальбуминемия.

    При общей диспансеризации и получении медицинских справок для трудоустройства данное исследование крови не осуществляется. Не требуется оно и в процессе подготовки человека к хирургическому вмешательству.

    Для получения наиболее точных результатов рекомендуется соблюдение правил подготовки к анализу. Они включают в себя голодную диету в течение 15 часов до того как будет взята кровь, когда пациент может употреблять только чистую не газированную воду. За 90 минут до проведения исследования необходимо полностью исключить нагрузки как эмоциональные, так и физические, и курение в активной или пассивной форме. Чтобы не допустить искажение данных, забор материала не проводят сразу после того, как был осуществлен гемодиализ или проведена процедура, при которой использовались радиоконтрастные составы. Важно также, чтобы за несколько дней до исследования полностью было исключено лечение пенициллином, так как он вызывает расщепление амбулина, что исказит результат.

    Фракция Повышение Понижение
    Амбулин Злоупотребление алкоголем, период вынашивания ребёнка, дегидрация Холецистит в острой форме, лейкоз, миелома, саркоидоз, пневмония, остеомиелит, системная красная волчанка, лимфома
    Глобулин альфа-1 Цирроз печени, стрессовые состояния, лимфогранулематоз, период вынашивания ребёнка, язва желудка, острое или хроническое воспаление Гепатит вирусной природы в острой форме
    Глобулин альфа-2 Сахарный диабет, остеомиелит, гломерулонефрит в острой форме, стрессовые состояния, системная красная волчанка, узловатый полиартрит, цирроз Гипертиреоз, гепатит вирусной природы в острой форме, гемолиз интраваскулярный
    Бета-глобулин Сахарный диабет, саркоидоз, ревматоидный артрит, беременность, гломерулонефрит, желтуха подпеченочная, нефротический синдром Лейкоз, цирроз, склеродермия имеющая системный характер, лимфома, системная красная волчанка
    Гамма-глобулин Цирроз, склеродермия системного характера, ревматоидный артрит, лимфолейкоз в хронической форме, муковисцидоз, синдром Шегрена Лейкоз, склеродермия, гепатит вирусной природы в острой форме, лимфома, гломерулонефрит

    Исказить показатели, кроме неправильной подготовки к проведению анализа, могут 2 фактора: недавно проведенная процедура гемодиализа, из-за которой произошло разрушение эритроцитов в крови, и повышенный уровень билирубина в организме. В любом из этих случаев потребуется пересдача анализа через некоторое время, которое определит врач.

    источник

    Биоматериал: моча суточная

    Срок выполнения (в лаборатории): 4 р.д. *

    В клинической практике электрофорез белков мочи используется для уточнения происхождения и прогноза парапротеинемии и определения типа протеинурии. При парапротеинемии увеличение концентрации сывороточных протеинов, особенно макроглобулинов, которые объединены в иммунные комплексы с факторами свертывания крови или другими антигенами, обуславливает повышение вязкости крови и приводит к нарушению кровообращения в мелких сосудах, повреждению их стенок иммунными комплексами.
    В этом случае в первую очередь страдают почки, что проявляется протеинурией, причиной которой является появление патологических белков в моче. Увеличенное содержание общего белка мочи отмечается в 90 % у таких больных. Определение типа протеинурии при заболеваниях почек с помощью электрофореза белков мочи имеет значение для диагностики заболеваний почек, определения прогноза их течения и выбора правильной тактики лечения.

    Электрофорез белков мочи позволяет выявить патологические иммуноглобулины А, М, G, Н-цепи, парапротеины, белок Бенс-Джонса. В 20 % случаев множественные миеломы синтезируют только легкие цепи иммуноглобулинов. Из-за своей низкой молекулярной массы они быстро удаляются из кровотока и не обнаруживаются в сыворотке крови. Идентификация белка Бенс-Джонса в моче имеет важное диагностическое и прогностическое значение. Он проникает в канальцы, повреждает их эпителий, что в конечном итоге приводит к развитию почечной недостаточности, которая является наиболее частой причиной смертности при миеломной болезни.
    Выделение белка Бенс-Джонса с мочой свидетельствует также о наличии опухолевого процесса, поэтому выявление его даже в следовых концентрациях должно стать отправной точкой для ранней диагностики множественной миеломы.

    На данное исследование скидки не предоставляются (см. Положение о скидках)

    Уточнения происхождения и прогноза парапротеинемий (иммуноглобулинопатий);

    Определение селективности (типа) протеинурии;

    Диагностика миеломное болезни.

    Накануне сдачи анализа не употреблять овощи и фрукты, которые могут изменить цвет мочи (свекла, морковь и др.), исключить острую, соленую пищу. Не принимать препараты-диуретики за 48 часов до исследования. Исключить физическое и эмоциональное напряжение.

    Правила сбора мочи:

    ВАЖНО: Перед сбором суточной мочи необходимо получить в лаборатории набор для сбора суточной мочи с консервантом и инструкцию по его использованию! Суточная моча собирается в чистую тару объемом до 2,5-3 литров. В процессе сбора мочу хранить при +4°С.
    1. Утром опорожнить мочевой пузырь (эта порция мочи выливается в унитаз). Зафиксировать время мочеиспускания.
    2. Все последующие порции мочи, выделенные в течение дня, ночи и первую утреннюю порцию следующего дня (в течение суток) собрать в контейнер без консерванта. Последнее мочеиспускание произвести утром через 24 часа от отмеченного накануне времени.
    3. После завершения сбора мочи, содержимое емкости нужно измерить и записать объем суточной мочи (диурез). Тщательно перемешать, 15-30 раз плавно переворачивая плотно закрытый контейнер и отобрать в вакуумную пробирку.
    4. Доставить в лабораторию

    Загрязнение образца обильными уретральными или вагинальными выделениями, а также чрезмерное употребление жидкости накануне может привести к снижению количества белка в моче.

    Интерпретация результатов:

    Повышение референсных значений:
    Результаты обследования оценивает врач на основании клинической картины, жалоб, данных инструментальных и дополнительных методов обследования.

    Понижение референсных значений:
    Протеинурия не обнаружена.

    Адреса медицинских центров, в которых можно заказать исследование, уточняйте по телефону 8-800-100-363-0
    Все медицинские центры СИТИЛАБ в г. Москва >>

    Код Наименование Цена Заказ
    21-20-004 Щелочная фосфатаза от 1 р.д. 280.00 р.
    21-85-008 Альфа-амилаза панкреатическая в моче (разовая порция) от 1 р.д. 410.00 р.
    22-20-001 Общий белок от 1 р.д. 290.00 р.
    22-20-002 Альбумин от 1 р.д. 330.00 р.
    23-12-001 Глюкоза от 1 р.д. 260.00 р.

    * На сайте указан максимально возможный срок выполнения исследования. Он отражает время выполнения исследования в лаборатории и не включает время на доставку биоматериала до лаборатории.
    Приведенная информация носит справочный характер и не является публичной офертой. Для получения актуальной информации обратитесь в медицинский центр Исполнителя или call-центр.

    источник

    Позвоните в клинику, и мы расскажем, как правильно подготовиться к сдаче необходимых вам анализов. Строгое соблюдение правил гарантирует точность исследований.

    Накануне сдачи анализов необходимо воздержаться от физических нагрузок, приема алкоголя и существенных изменений в питании и режиме дня. Большинство исследований сдаются строго натощак, то есть должно пройти не менее 12 и не более 16 часов после последнего приема пищи.

    За два часа до сдачи следует воздержаться от курения и кофе. Все анализы крови сдаются до проведения рентгенографии УЗИ и физиотерапевтических процедур. По возможности воздержитесь от приема лекарств, а если это невозможно, предупредите доктора, назначающего вам анализы.

    Все анализы рекомендуется сдавать в утреннее время, так как лабораторные нормы рассчитаны именно для утренних показателей. Исключение составляют случаи, когда докторунеобходимо оценить ваше состояние на данный момент.

    Очень важно точно следовать указанным рекомендациям в избежание ошибок на преаналитическом этапе проведения исследования!

    Исследования крови

    Общий анализ крови

    Кровьсдается из пальца или из вены. Подготовка: кровь сдается натощак. Перед сдачей анализа избегайте физический нагрузок, стрессов. Время и место забора материала: в течение дня, в клинике.

    Биохимический анализ крови

    Кровь сдается из вены. Определение биохимических показателей позволяет оценить все обменные процессы, протекающие в организме, а также функцию органов и систем. Подготовка: кровь сдается натощак. Время и место забора материала: до 14 часов, в клинике (электролиты — в будние дни до 09.00).

    Глюкозотолерантный тест

    Соблюдение правил подготовки к сдаче анализа позволит получить достоверные результаты и правильно оценить работу поджелудочной железы, а следовательно, назначить адекватное лечение. Подготовка: необходимо соблюдать правила подготовки и рекомендации по питанию, данные вашим лечащим врачом. Количество углеводов в пище должно быть не менее 125 г. в день в течение 3-х дней перед проведением теста. Физические нагрузки не допускаются в течение 12 часов перед началом теста и во время его проведения. Время и место забора материала: ежедневно до 12.00, в клинике.

    Гормональные исследования

    Гормоны — вещества, концентрация которых в крови изменяется циклически и имеет суточные колебания, поэтому анализ должен забираться в строгом соответствии с физиологическими циклами или по рекомендации вашего лечащего врача. Подготовка: кровь сдается натощак. Время и место забора материала: ежедневно до 11.00, в клинике.

    Исследование системы гемостаза

    Кровь сдается из вены. Подготовка: кровь сдается натощак. Время и место забора материала: в будние дни до 09.00, в клинике.

    Определение группы крови

    Кровь сдается из вены. Подготовка: кровь сдается натощак. Время и место забора материала: до 14 часов, в клинике.

    Определение антител к возбудителям

    Кровь сдается из вены. Подготовка: кровь сдается натощак. Время и место забора материала: до 14 часов, в клинике.

    Гепатиты (В, С)

    Кровь сдается из вены. Подготовка: кровь сдается натощак. Время и место забора материала: до 14 часов, в клинике.

    Кровь сдается из вены. Подготовка: кровь сдается натощак. Время и место забора материала: до 14 часов, в клинике.

    Экспресс-анализ на ВИЧ

    Кровь сдается из вены. Подготовка: кровь сдается натощак. Время и место забора материала: в течение дня, в клинике.

    Исследования мочи

    Для получения адекватных результатов исследования мочи необходимо тщательно соблюдать правила гигиены наружных половых органов перед забором материала для анализа.

    • вымойте руки с мылом;
    • движениями спереди назад вымойте область наружных половых органов;
    • удерживая половые губы разведенными, выпустите немного мочи и приостановите мочеиспускание;
    • подставьте емкость и наполните ее;
    • тщательно закройте емкость крышкой.
    • вымойте руки с мылом;
    • тщательно (с мылом) вымойте головку полового члена;
    • удерживая крайнюю плоть в отведенном положении, наполните емкость;
    • тщательно закройте емкость крышкой.

    Общий анализ мочи

    Собирается первая утренняя моча в сухую, чистую, широкогорлую пластиковую посуду. Избегайте охлаждения материала. Подготовка: тщательная гигиена наружных половых органов. Время и место забора материала: до 09.00, забор может быть осуществлен как в клинике, так и вне клиники. Количество материала, необходимое для исследования: 50 — 100 мл. Время сдачи материала в клинику: в течение дня.

    Проба по Нечипоренко

    Первую порцию мочи следует спустить в унитаз, среднюю порцию в количестве 15-20 мл. собрать в чистую, сухую, широкогорлую посуду. Избегайте охлаждения материала. Подготовка: тщательная гигиена наружных половых органов. Время и место забора материала: в течение дня, забор может быть осуществлен как в клинике, так и вне клиники. Количество материала, необходимое для исследования: 15 — 20 мл. Время сдачи материала в клинику: до 14 часов.

    Проба Зимницкого

    В 6:00 утра следует опорожнить мочевой пузырь в унитаз. Затем через 3 часа вся накопленная за это время моча собирается в емкость №1 (9:00), через следующие 3 часа в емкость №2 (12:00). Так каждые 3 часа: №3 — 15:00, №4 — 18:00, №5 — 21:00, №6 — 00:00, №7 — 3:00, №8 — 6:00. Каждая порция после сбора закрывается и хранится в прохладном месте. Одновременно ведется учет выпитой жидкости. Очень важно правильно собрать мочу, не пропуская установленного времени, это позволит объективно оценить выделительную и концентрационную функции почек. Подготовка: емкости для сбора мочи (8 штук) заранее берут в клинике. Тщательная гигиена наружных половых органов. Время и место забора материала: вся моча за сутки, вне клиники. Количество материала, необходимое для исследования: вся моча за сутки. Время сдачи материала в клинику: до 14 часов.

    Трехстаканная проба

    Самую первую порцию мочи в количестве 10 мл. собирают в емкость №1, среднюю порцию (50-100 мл.) в емкость №2. В емкость №3 собирается самая последняя моча перед завершением мочеиспускания, то есть последние 10 мл. Очень важно строгое соблюдение сбора мочи, что позволит установить локализацию патологического процесса. Подготовка: емкости для сбора мочи (3 штуки) заранее берут в клинике. Тщательная гигиена наружных половых органов. Время и место забора материала: до 09.00, забор может быть осуществлен как в клинике, так и вне клиники. Количество материала, необходимое для исследования: 10 мл. / 50 — 100 мл. / 10 мл. Время сдачи материала в клинику: до 14 часов.

    Проба Реберга

    Моча собирается сутки, желательно начать с 7:00 утра. В 7:00 опорожнить мочевой пузырь в унитаз, затем всю мочу в течение времени до 07.00 следующего дня собирать в одну емкость и хранить в прохладном месте. Одновременно ведется учет выпитой жидкости. Вся собранная моча доставляется в лабораторию. Очень важно собрать всю мочу выделенную за сутки, так как только в этом случае будут получены достоверные результаты исследования. Подготовка: емкость для сбора мочи заранее берут в клинике. Тщательная гигиена наружных половых органов. При сдаче материала в клинику, необходимо сдать кровь из вены натощак (до 09.00). Время и место забора материала: вся моча за сутки, сбор материала осуществляется вне клиники. Количество материала, необходимое для исследования: вся моча за сутки, либо 100 мл, с указанием общего объема мочи за сутки. Время сдачи материала в клинику: до 12 часов.

    Моча для проведения ПЦР исследований

    Собираются первые 20 мл после сна. При сборе мочи желательно использовать широкий сосуд с крышкой, по возможности собирать мочу сразу в посуду, в которой она будет доставлена в лабораторию в количестве 20 мл. Собранную мочу доставляют в лабораторию в течение 1-3 часов без дополнительного охлаждения. Длительное хранение мочи при комнатной температуре до исследования приводит к изменению не только ее физических свойств и разрушению клеток, но и к размножению бактерий. Подготовка: моча сдается натощак. Тщательная гигиена наружных половых органов. Пробу мочи собирают только в стерильную посуду. Стерильную посуду необходимо заранее взять в клинике. Время и место забора материала: до 09.00, забор может быть осуществлен как в клинике, так и вне клиники. Количество материала, необходимое для исследования: 20 мл. Время сдачи материала в клинику: до 09.00 в будние дни.

    Читайте также:  1500 эритроцитов в анализе мочи

    Моча для проведения бактериологических исследований

    Мочу необходимо сдать до начала антибактериального лечения или спустя 3 дня после терапии. Если больной принимает антибактериальные препараты, то нужно решить вопрос об их временной отмене. Первую порцию мочи спустить в унитаз, среднюю порцию в количестве 3-5 мл. собрать в стерильную герметически закрывающуюся посуду. Мочу следует доставить в лабораторию в течение 1-2 часов. Подготовка: тщательная гигиена наружных половых органов. Пробу мочи собирают только в стерильную посуду. Стерильную посуду необходимо заранее взять в клинике. Время и место забора материала: до 09.00, забор может быть осуществлен как в клинике, так и вне клиники. Количество материала, необходимое для исследования: 20 мл. Время сдачи материала в клинику: до 09.00 в будние дни.

    источник

    Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

    Профессор Батюшин Михаил Михайлович — Председатель Ростовского областного общества нефрологов, заместитель директора НИИ урологии и нефрологии, Руководитель нефрологической службы ГОУ ВПО РостГМУ, заведующий отделением нефрологии клиники РостГМУ.

    Бова Сергей Иванович — Заслуженный врач Российской Федерации,заведующий урологическим отделением — рентгено-ударноволнового дистанционного дробления камней почек и эндоскопических методов лечения, ГУЗ «Областная больница №2», г. Ростов-на-Дону.

    Галушкин Александр Алексеевич — кандидат медицинских наук, врач-нефролог, ассистент кафедры внутренних болезней с основами физиотерапии №1 РостГМУ.

    Турбеева Елизавета Андреевна — редактор страницы.

    Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек.

    Книга: «Протеинурия» (А.С. Чиж).

    Еще Гофману и Сенатору (1874) было известно, что с мочой при заболеваниях почек выделяются не только альбумины, но и глобулины (цит. по: Н.Я.Червяковский, 1963). Позже это подтвердил A.Hiller (1927), а затем Е.М.Тареев и М.А.Благирева (1931).

    С введением в клиническую практику метода электрофореза белков на бумаге появилась возможность более глубоко изучить механизм протеинурии и ее особенности при различных заболеваниях почек.

    По мнению А.Я.Пытеля и С.Д.Голигорского (1968), электрофорез остается пока наиболее доступным методом определения качественных особенностей протеинурии и позволяет в известной мере уточнять некоторые стороны механизма ее происхождения. Белковый состав мочи при диффузных заболеваниях почек изучался методом электрофореза на бумаге многими исследователями.

    В последние годы для исследования качественных и количественных особенностей белков мочи используют предложенный в 1955 г. O.Smithies метод электрофореза в крахмальном геле. По мнению Е.М.Тареева (1968), А.Я. Лытеля и С.Д.Голигорского (1968), этот метод является перспективным не только для изучения качественных особенностей протеинурии, но и для выяснения некоторых звеньев ее патогенеза.

    К сожалению, работ с применением указанного метода пока еще очень мало (Д.БЛ.Дыкин, М.М.Щерба, 1969; Д.Б.Цыкини соавт., 1971, 1972; Т.Н.Александровская, 1972; Л.Р.Полянцева, 1972; J.Traeger и соавт., 1965,1966,1967).

    С помощью электрофореза белков в крахмальном геле по сравнению с электрофорезом на бумаге удается обнаружить в сыворотке крови и в моче значительно большее число белковых фракций,а следовательно,получить и более ценную информацию о белковом спектре этих биологических жидкостей при различных заболеваниях почек.

    Так, Д.Б.Цыкини соавт. (1969, 1971), используя данный метод для изучения состава уропротеинов при некоторых диффузных заболеваниях почек, выявили в моче обследованных ими 52 больных от 3 до 12 белковых фракций, в том числе по три фракции (преальбумины, альбумины, сидерофилин) при хроническом гломерулонефрите с изолированным мочевым синдромом, 11 (пре- и постальбумины, альбумины, «2-быстрые глобулины, сидерофилин, гаптоглобины и у-глобулин) — при смешанной форме хронического гломерулонефрита и 12 (кроме упомянутых, еще и «2-медленные глобулины) фракций при нефротическом синдроме на почве гломерулонефрита и амилоидоза почек.

    Содержание каждой из глобулиновых фракций, выраженное в относительных показателях (%), было наибольшим в моче больных с нефротическим синдромом.

    Как подчеркивают авторы, содержание «2-медленных глобулинов (макроглобулинов) было весьма незначительным (1,1 ±0,71%), и белки этой фракции выявлялись только при нефротическом синдроме и то лишь в единичных случаях. Однако в работе не указывается, как часто встречались другие глобулиновые фракции, в частности гаптоглобины и у-глобулины.

    Кроме того, не проведен раздельно анализ уропротеинограмм при одинаковых клинических формах острого и хронического гломерулонефрита и при нефротическом синдроме в зависимости от его этиологии. На наш взгляд, это могло бы представить определенный интерес для дифференциальной диагностики диффузных заболеваний почек.

    В работах J .Traeger и соавт.,(1965, 1966, 1967), материалы которых основаны на данных обследования больных (более тысячи) с различными врожденными и приобретенными заболеваниями почек, изучен белковый спектр мочи с одновременным использованием методов электрофореза на бумаге, в крахмальном геле и иммуноэлектрофореза.

    В большинстве случаев полученные данные сопоставлялись с результатами прижизненной пункционной биопсии почек и эффективностью кортикостероидной терапии. При некоторых врожденных тубулопатиях упомянутые исследователи выявили так называемый канальцевый (тубулярный) тип протеинурии, для которого на электрофореграмме в крахмальном геле характерно наличие:

    • 1) фракции преальбуминов в виде «шапки жандарма»;
    • 2) небольшой фракции альбуминов и большой постальбуминов, широкой полосы быстрых (что, по мнению Е. Butler, является специфичным для тубулярной протеинурии) и еще более широкой (шире, чем сывороточного сидерофилина) у-глобулинов;
    • 3) а2-медленных и b-глобулинов.

    Тубулярный тип протеинурии в чистом виде либо с некоторыми изменениями обнаружен также при пиелонефрите, поликистозе почек, острой почечной недостаточности, отравлении фенацетином, витамином Д, при гипоксии. Однако необходимо отметить, что в упомянутых работах изучались лишь качественные особенности уропротеинограмм без их количественного анализа.

    Анализируя литературные данные о качественном и количественном составе белков мочи при важнейших диффузных заболеваниях почек, следует отметить, что получены ОНИ в основном с помощью метода электрофореза на бумаге и в ряде случаев, существенно различаются между собой.

    При этом наиболее исследован нефротический синдром, в меньшей мере — другие клинические формы гломерулонефрита и незначительно — пиелонефрит. Содержание в моче отдельных белковых фракций выражалось, как правило, лишь в относительных (%), а не в абсолютных (г/л) величинах, и в подавляющем большинстве результаты исследований не подвергались статистическому анализу.

    Содержание общего белка, а тем более отдельных его фракций в моче, их качественные и количественные особенности в аспекте различных клинических форм важнейших диффузных почечных поражений до настоящего времени изучались весьма ограниченно.

    Более полного представления о качественных и количественных особенностях уропротеинограмм при различных клинических вариантах почечных заболеваний можно достичь при помощи метода электрофореза белков в различных гелях, в частности в крахмальном геле.

    Методом электрофореза в крахмальном геле нами изучен белковый спектр мочи у 288 больных от 16 до 65 лет, в том числе у 148 мужчин и 140 женщин. Среди них были 124 больных с различными клиническими формами хронического гломерулонефрита (22 — с острым гломерулонефритом с затянувшимся течением, 76 — с хроническим пиелонефритом, 9 — с интерстициальным нефритом, 3 — с амилоидозом почек, 26 — с хронической почечной недостаточностью, 21 — сострой почечной недостаточностью и 7 больных с застойной протеинурией). У части больных электрофорез белков проведен в динамике,в результате чего получено и проанализировано 336 уропротеинограмм.

    Данные качественного и количественного анализа протеинограмм мочи в зависимости от нозологической формы заболевания и его клинической формы приводятся ниже.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

    Прежде чем перейти к изложению полученных данных и результатов их анализа, целесообразно дать краткое описание методики исследования. При этом метод электрофореза белков сыворотки крови и мочи в крахмальном геле описан более детально ввиду его меньшей известности и необходимости изложения некоторых дополнений и усовершенствований, внесенных нами при обработке этого метода.

    Материалом для исследования являлись сыворотка крови и моча больных. Кровь (5—7 мм) брали из вены натощак. Получаемую после свертывания и центрифугирования сыворотку крови сливали в отдельную чистую пробирку и использовали для определения содержания общего белка, электрофореза белков и других исследований. Мочу брали у больных из утренней порции (сразу после сна), как это делали, например, М.А. Адо (1965) и другие. Предварительно ее подвергали диализу и концентрированию.

    Диализ и концентрирование мочи. В литературе описаны различные методы диализа и концентрирования мочи. Так, Н.К.Лебедева и соавт. (1967), A. Afonso (1967) 10-20 мл мочи, помещенной в целлофановый мешочек, подвергали диализу вначале против водопроводной воды в течение 6 часов, а затем против дистиллированной воды в течение 16—20 часов.

    Концентрирование осуществляли с помощью комнатного вентилятора до тех пор, пока в мешочке оставалось несколько капель мочи. М.П.Матвеев , Л.В.Шатунова (1969) диализ мочи проводили в целлофановых трубках против дистиллированной воды в течение двух дней,а концентрирование —в 16% растворе желатины. Дистиллированную воду в качестве диализирующей среды применяли и другие авторы (М.А.Адо, 1965; А.П. Пелещук и соавт., 1968 и др.).

    Причем М.А.Адо для концентрирования мочи использовала комнатный вентилятор, добиваясь увеличения концентрации белка в 10 раз, а А.П.Пелещук и соавторы сгущение мочи проводили аналогично, но лишь в тех случаях, когда концентрация белка в моче была ниже 1 г/л. Другие рекомендуют добиваться концентрации белка в моче до 10 г/л и более (И.Тодоров, 1963; Т.Дочев, 1965).

    Предложены методы диализа и концентрирования мочи в растворах высокомолекулярных веществ, например поливинилпирролидона, полиэтиленгликоля (В.Salle и соавт., 1967; J.Traeger и соавт., 1965, 1966 и др. ), гуммиарабика (И.Тодоров, 1963; Д.Дочев, 1965), а также с помощью особых фильтров под давлением, путем ультрафильтрации и т.п. (Ю.Я.Гофман, 1963; Г.В.Воскобойников, Н.Д.Сидорова, 1965; J.Traeger и соавт., 1966 и др.).

    Мы проводили диализ мочи против дистиллированной воды в течение 8— 12 часов, а сгущение ее при помощи комнатного вентилятора в течение 4-6 часов, добиваясь увеличения концентрации белка в 20 раз. Для этого необходимое количество мочи (20 мл) в начале наших исследований помещали в целлофановый мешочек.

    Однако в связи с рядом неудобств, связанных с приготовлением мешочков, внесением и взятием мочи из них, в дальнейшем для этих целей были использованы небольшие воронки. Широкую часть воронки обтягивали целлофаном, который в узкой ее части прочно обвязывали ниткой.

    Концами последней затем подвешивали воронку к штативу (при концентрировании мочи) или к специальному приспособлению (при диализе). Исследуемую порцию мочи мерной пипеткой вводили в воронку через узкую ее часть.

    Растекаясь относительно тонким слоем по целлофану, закрывающему широкую часть воронки, моча на сравнительно большой поверхности соприкасалась с ним, что способствовало более полному и быстрому проведению диализа и концентрирования.

    Определение концентрации общего белка в сыворотке крови и в моче.

    Содержание общего белка в сыворотке крови и в моче устанавливали биуретовым методом. Хотя этот метод определения белка был предложен давно (W.Autenriet, 1914; цит по: Л.А.Неделина и Н.А.Сентебова, 1971), однако для широкого использования его потребовались многочисленные дополнительные исследования (Л.Ф.Кельзон, 1952; Л.Г.Смирнова, Е.А.Кост, 1960; С.Г.Аптекарь, А.А. Покровский, 1969; G.Kingsley, 1939; R.Ardry, 1949; W.Bartosiewicz, 1956; M.Piscator, 1966 и др.).

    В результате была разработана наиболее приемлемая модификация этого метода, которая в настоящее время предложена в нашей стране в качестве унифицированной методики определения общего белка в сыворотке крови (Л.А.Неделина, Н.А.Сентебова, 1971).

    Биуретовый метод широко применяют и для количественного определения белка в моче (Л.Г.Смирнова, Е.А.Кост, 1960; Е.И.Кримкевич, 1972;

    Н.Я.Мельман, 1972; А.П.Пелещук и соавт., 1972; A.Hiller, 1927; W.Foster и соавт., 1952 и др.). Однако предварительно моча должна быть сконцентрирована, так как при низких концентрациях белка снижается чувствительность метода (Л.А.Неделина, Н.А.Сентебова, 1971).

    В наших исследованиях использована модификация метода, описанная Л.Г.Смирновой и Е.А.Кост (1960). Следует отметить, что в том количестве мочи, которое мы брали для исследований, существенной разницы в содержании общего белка не наблюдалось независимо от того, взята ли моча из суточного ее количества или из утренней порции.

    У 23 обследованных больных (2 больных с острым гломерулонефритом, 12 — с хроническим гломерулонефритом, 7 — с хроническим пиелонефритом и 2 — с интерстициальным нефритом) концентрация общего белка в порции мочи, взятой для исследования из суточного ее количества и из утренней порции .соответственно была равна 0,072±.0,013 и 0,071±0,010 (Р>0,3). На уропротеинограмме выявлялось и в том и в другом случае одинаковое количество белковых фракций.

    Содержание общего белка определяли у одного и того же больного одновременно в сыворотке крови и в моче (после ее диализа и концентрирования) . Для удобства дальнейших расчетов и проведения сравнительного анализа показателей общего белка и белковых фракций сыворотки крови и мочи применяли одни и те же величины (проценты и граммы на литр). Концентрацию белка в моче вычисляли по следующей формуле:

    Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

    где X — концентрация белка в несконцентрированной моче, г/л; а — объем сконцентрированной мочи (обычно 1 мл); С — концентрация белка в сконцентрированной моче, определяемая по биуретовой реакции, г/л; А — объем мочи, взятой для концентрирования (обычно 20 мл).

    Для определения концентрации белка в граммах на литр несконцентрированной мочи полученную величину умножают на 10.

    Электрофорез белков в крахмальном геле. Исследованиями последних лет установлена высокая эффективность электрофоретического анализа белков при использовании в качестве поддерживающих сред различных мелкодисперсных гелей (агарового, полиакриламидного, крахмального), а также иммуноэлектрофореза.

    Благодаря сравнительной простоте, доступности и высокой разрешающей способности в лабораторной практике последних лет широкое распространение получил метод электрофореза белков в крахмальном геле, который впервые был предложен в 1955 г. О.Smithies. Этот метод чаще всего используется для изучения различных белков крови, тканевых белков и некоторых ферментов.

    Он позволяет выявить в сыворотке крови от 12 до 13—17—22 белковых фракций (С.М.Раппопорт, 1956; В.Д.Успенская и соавт., 1968; Е.Д.Васильева, 1968; Ф.Гауровиц, 1965; Дж.Уилкинсон, 1968) ,а при использовании двухмерного электрофореза в сочетании с иммуноэлектрофорезом — до 30 фракций (Г.В.Троицкий, 1962; Е.М.Саминский, 1966; В.Д.Успенская и соавт., 1968 и др.).

    При этом каждую из пяти фракций, получаемых при электрофорезе на бумаге, можно разделить на ряд под фракций. Так, например, си-глобулин человека удалось разделить на 8 под- фракций (Дж.Уилкинсон, R68). С помощью этого метода выделены плазменные белки, обладающие индивидуальными различиями, а также установлен ряд наследственных типов гаптоглобина, трансферрина и некоторых других белков.

    Количество белковых фракций сыворотки крови, полученных с помощью электрофореза в крахмальном геле, так велико, что не все они идентифицированы, и в полной мере не установлено, какую сыворотку следует принимать за нормальную, так как у каждого здорового человека она может иметь свои индивидуальные особенности (Е.М.Саминский, 1966).

    Что касается применения метода электрофореза в крахмальном геле для исследования белкового состава мочи при заболеваниях почек, то по этому вопросу в литературе имеется сравнительно немного работ (Е.М.Тареев, 1968; Д.Б.Цыкин и соавт., 1969; 1972; P.Milliez и соавт., 1960; M.Debray -Sachs, 1966; J.Traeger и соавт., 1965, 1966, 1967 и др.).

    Между тем изучение качественного и количественного состава белков мочи с помощью упомянутого метода является перспективным как в отношении диагностики заболеваний почек, так и для выяснения некоторых сторон механизма протеинурии.

    Метод электрофореза в крахмальном геле чаще всего используется для изучения качественного состава белков, однако в настоящее время доказана возможность применения его и для количественного определения отдельных белковых фракций, хотя при этом встречаются довольно значительные трудности, о чем будет сказано ниже.

    Основные принципы и особенности метода. Поскольку трактовку результатов фракционного анализа белков сыворотки крови и мочи, полученных методом электрофореза в крахмальном геле, необходимо связывать с особенностями разделения белковых фракций при миграции их через гель, целесообразно кратко остановиться на основных принципах электрофореза белков в гелевых средах.

    При электрофорезе гели в качестве поддерживающей среды обладают рядом важных особенностей и преимуществ по сравнению с другими средами. Главная особенность гелей — малые размеры их пор, которые, кроме того, могут изменяться в зависимости от концентрации геля.

    По своему диаметру поры в геле можно сравнить с размером белковых макромолекул. Вот почему гель схож с молекулярным ситом, в котором скорость движения белковых молекул зависит от их размера: крупные молекулы (диаметр их равен или почти равен диаметру пор) движутся медленнее, чем мелкие, легко проникающие через гель (Э.Г.Ларский, 1971; Г.Маурер, 1971 и др.).

    Таким образом, электрофоретическое разделение белков в гелях зависит не только от электрического заряда молекул, но и от их размеров и формы (Е.М.Саминский, 1966; В.Д.Успенская и соавт., 1968; Дж.Хаггис и соавт., 1967). Кроме того, адсорбционные явления в гелях выражены очень слабо (Г.В.Троицкий, 1962; Е.М.Саминский, 1966).

    По этим причинам электрофорез в гелях обладает чрезвычайно высокой разрешающей способностью, которая наиболее выражена в крахмальном и полиакриламидном гелях. Агаровый гель, хотя и обладает малой адсорбционной способностью, но в связи с относительно большими размерами пор дает несколько худшее разделение белковых молекул (Е.М.Саминский, 1966).

    Считают, что электрофорез в мелкодисперсных гелях является единственным видом электрофореза, при котором происходит разделение белков с одинаковой электрической подвижностью, но с различными молекулярными массами (В.Д.Успенская и соавт., 1968).

    Аппаратура и другие принадлежности, необходимые для проведения электрофореза белков в крахмальном геле. Электрофорез белков в крахмальном геле можно проводить в обычном аппарате, предназначенном для электрофореза белков на бумаге, например типа ПЭФ, но описаны и специальные аппараты для проведения этого метода исследования (В.Д.Успенская, 1959; В.М.Родионов и соавт.; 1960; В.А.Давыдова, Н.И.Макаревич, 1964; М.Д.Луцик, 1968; S.Boyer, R.Hiner, 1963). Нами использован аппарат УЭФ (универсальный прибор для электрофореза).

    Для получения определенных размеров гелевой пластинки и проведения электрофореза необходима специальная кювета с крышкой. Предложены и описаны различные варианты плексигласовых кювет (Г.В.Троицкий, 1962; И.М.Маркелов, 1964; Н.Н.Старостин, 1966; А.А.Стрекалов, 1966 и др.).

    Читайте также:  100 анализ мочи по нечипоренко

    На наш взгляд, наиболее простой и удобной является конструкция кюветы, описанная В.Д.Успенской и соавт. (1968). Мы пользовались плексигласовой кюветой аналогичного типа, но несколько иных размеров: длина ее рабочей площади составляла 16,5 см, ширина 7,0 см и высота бортиков (от этого зависит толщина гелевой пластинки) 6 мм. Крышка кюветы имела те же размеры, за исключением меньшей высоты бортиков (3 мм), так как она одновременно использовалась в качестве лотка для разделения гелевой пластинки на две равные части одинаковой толщины.

    Формовочная пластинка (гребенка), необходимая для образования поперечного ряда щелей в геле, куда вносится исследуемый материал (сыворотка крови и моча), изготовлена нами из пластмассовой пластинки толщиной 0,5 мм и шириной 6,5 см; длина (высота) ее не имеет практического значения.

    На одном из концов пластинки вырезались прямоугольные зубцы высотой 6,5 мм, шириной 8 мм; расстояние между зубцами 2,8 мм. Таким образом,всего было шесть зубцов,что сразу позволило сделать в геле шесть насечек (щелей) и вносить в гель для проведения электрофореза такое же количество проб исследуемого материала. Гелевую пластинку обычно рекомендуется разрезать нихромовой проволокой диаметром 0,1 мм.

    Гидролиз крахмала. Успешное разделение белковых фракций во многом зависит от качества крахмального геля, который должен обладать определенной степенью дисперсности, эластичности и прочности. Это имеет существенное значение не только в процессе проведения электрофореза, но и при дальнейших манипуляциях с гелем (окрашивание, отмывка, фотографирование, сушка и т.п.). Качество же крахмального геля во многом зависит от сорта крахмала, тщательности и особенностей проведения его гидролиза.

    Процесс приготовления гидролизного крахмала — один из наиболее трудных и в то же время наиболее важных и ответственных моментов в методике получения крахмального геля. Описан ряд модификаций приготовления гидролизованного крахмала (Г.Ф.Троицкий, 1962; Е.М.Саминский, 1966; Н.Н.Старостин, 1966; Ю.Н.Берг и соавт., 1967; Е.Д.Васильева, 1968; В.Д.Успенская и соавт., 1968).

    Однако общий принцип гидролиза такой, каким его описал О.Smithies (1955): крахмал гидролизуют соляной кислотой в среде ацетона при строго определенной температуре и в течение определенного промежутка времени для каждого сорта крахмала. Мы пользовались гидролизованным крахмалом, который получали из лаборатории линейных животных Белорусского научно-исследовательского института животноводства.

    Гидролиз картофельного крахмала высшего сорта проводился в среде ацетона с добавлением соляной кислоты (из расчета на 300 г крахмала 600 мл ацетона и 9 мл соляной кислоты плотности 1,18) при температуре 38,6°С в течение двух часов.

    Приготовление крахмального геля. Предварительно необходимо приготовить буферные растворы двух видов:

    • 1) для разведения гидролизованного крахмала (крахмальный буфер) и
    • 2) для заливки электродных кювет (электродный буфер).

    Для электрофореза в крахмальном геле можно применять обычные буферные растворы с колебаниями pH от 2,0 до 11,0 (В.Д.Успенская и соавт., 1968). Наибольшее распространение получили боратные растворы, предложенные О.Smithies, различные модификации которых были в дальнейшем использованы многими авторами (Н.Н.Старостин, 1966; Ю.Н.Берг и соавт., 1967; В.Д.Успенская и соавт., 1968; Дж.Уилкинсон, 1968 и др.). Весьма эффективны комбинированные буферные системы, например трисцитратный буфер (Г.В.Троицкий,1962; M-Poulak, 1957 и др.).

    Нами использованы боратные буферные растворы следующего состава:

    1) для разведения крахмала — 1,86 г борной кислоты (Н^ВО^) и 0,48 г гидроксида натрия (NaOH) на 1000 мл дистиллированной воды;

    2) для заливки кювет — 18,6 г борной кислоты и 2,4 г NaOH на 1000 мл дистиллированной воды.

    При подготовке крахмального геля обычно оптимальной считают концентрацию крахмала,равную 12—15% (В.Г.Троицкий, 1962; Е.М.Саминский, 1966) или 12-17 (В.Д.Успенскаяи соавт., 1968), 12-13% (Дж.Уилкинсон, 1968), 12—16 (Ю.Н.Берг и соавт., 1967) и даже 18% (Д.БДыкин, М.М.Щерба, 1969).

    Следовательно, чтобы получить гель 12—18% концентрации,на 100 мл буферного раствора требуется 12—18 г гидролизованного крахмала. При этом описаны два варианта приготовления геля.

    Первый вариант — вся навеска крахмала растворяется в соответствующем количестве крахмального буфера, затем полученная суспензия, помещенная в круглодонную колбу с длинным горлом, нагревается на открытом пламени горелки при энергичном вращении до получения геля.

    Однако в таком случае не всегда удается установить точно момент, когда следует прекратить нагревание, а от этого зависит качество получаемого геля и его пригодность для электрофореза. Чтобы избежать погрешностей, даются различные рекомендации (Е.М.Саминский, 1966; Ю.Н.Берг и соавт., 1967; В.Д.Успенская и соавт., 1968 и др.).

    Однако полностью устранить упомянутые дефекты не всегда удается. Учитывая это, предложен второй вариант приготовления геля, сущность которого заключается в следующем (Н.Н.Старостин,1966).

    Приготовленную навеску крахмала помещают в отдельную колбу и добавляют туда примерно одну треть соответствующего количества буфёрного раствора; при взбалтывании получают суспензию крахмала. Остальные две трети буфера,находящегося в круглодонной колбе или другом сосуде достаточной емкости, нагревают до кипения, и затем при энергичном помешивании через воронку равномерной струей добавляют в него суспензию крахмала. В результате получается крахмальный гель заданной концентрации.

    Нами использован второй вариант приготовления крахмального геля, только кипящий буфер вливали в суспензию крахмала, находящегося в колбе Бунзена, что снижало потерю крахмала, остающегося на стенках колбы, и затем переходили к деаэрации геля. Колбу Бунзена, закрытую притертой пробкой, подключали к водоструйному насосу. Отсасывание воздуха продолжали до тех пор, пока не прекращалось выделение пузырьков.

    После этого колбу отсоединяли от водоструйного насоса и еще горячий гель медленно выливали в заранее подготовленную кювету, которая закрывалась крышкой таким образом,чтобы под ней не оставалось пузырьков воздуха, и поверх нее накладывали груз (обычно кирпич, обернутый в полиэтиленовую пленку). В таком виде крахмальный гель оставляли на два часа при комнатной температуре до образования плотной и эластичной гелевой пластинки.

    Крахмальный гель готовили непосредственно перед электрофорезом. В проводимых опытах концентрация его составляла 15%. Охлаждать гель можно при комнатной температуре, как это делала, например, Е.Д.Васильева (1968), либо в холодной комнате в течение 2-2,5 часов, либо в рефрижераторе в течение 30—60 минут (Ю.Н.Берг и соавт., 1967) или нескольких часов (Е.М.Саминский, 1966).

    Внесение в гель исследуемого материала. После того как гель остынет, необходимо аккуратно снять с кюветы крышку, тщательно очистить ее и борта кюветы от избытка геля (нами крышка промывалась водой и высушивалась) . С обоих концов гелевую пластинку осторожно отделяют скальпелем, от стенок кюветы,чтобы легче было подвести под нее мостики из фильтровальной бумаги.

    Последние готовят из двух-трех слоев фильтровальной бумаги днирина которой соответствует ширине гелевой пластинки,а длина на 5—7 см превышает расстояние от кюветы до поверхности электродного буфера, в наших условиях она составляет 12—15 см.

    Мостики из фильтровальной бумаги осторожно с помощью формовочной пластинки подводят на 1,5—2 см под гелевую пластинку с обоих ее концов.

    Затем приступают к внесению в гель проб исследуемого материала. Насечки или щели в геле, в которые вносятся образцы исследуемой биологической жидкости, готовят заранее различными способами — скальпелем (Н.Н.Старостин, 1966), лезвием бритвы (Ю.Н.Берг и соавт., 1967) или пластмассовой гребенкой (В.Д.Успенская и соавт., 1968). Последний способ, на наш взгляд, наиболее удобен: он позволяет сделать сразу необходимое количество одинаковых по размеру и расположенных строго на одной линии щелей (линия старта).

    Используя формовочную пластинку (гребенку), мы делали насечки в геле по линии, отстоящей на 2—3 см от края подведенной под гелевую пластинку полосы фильтровальной бумаги. В образованные таким образом отверстия с помощью пинцета и кусочков фильтровальной бумаги, размеры которых соответствовали размерам зубцов формовочной пластины, вносили пробы исследуемой сыворотки крови и концентрированной мочи.

    Кусочки фильтровальной бумаги перед внесением в стартовую выемку предварительно смачивали сывороткой крови или мочой. Некоторые авторы (Ю.Н.Берг и соавт., 1967) рекомендуют вносить в гель образцы исследуемых биологических жидкостей с помощью пастеровской пипетки. Однако этот способ неточен, так как в различные щели может вноситься неодинаковое количество исследуемого материала.

    В одну кювету было внесено сразу шесть проб: три—сыворотки крови и три—мочи.Причем сыворотку крови и мочу одного и того же больного помещали в рядом расположенные стартовые выемки, что представлялось удобным при идентификации белковых фракций мочи и сравнении их с аналогичными фракциями сыворотки крови.

    По окончании внесения образцов в крахмальный гель кювету закрывали крышкой, предварительно смазав ее тонким слоем вазелинового масла (для предотвращения высыхания геля), и помещали в аппарат для электрофореза. Переходные мостики смачивали электродным буферным раствором и свободные концы их опускали в электродные кюветы, заполненные буферным раствором. Затем аппарат для электрофореза включали в сеть.

    Условия для электрофореза. Большинство авторов электрофорез белков в крахмальном геле рекомендуют проводить при напряжении от 4-5 (Г.В.Троицкий, 1962; В.Д.Успенская и соавт., 1968) до 6—8 В/см (Ю.Н.Берг и соавт., 1967)и силе тока 2—2,5 тА на 1 см ширины кюветы или гелевой пластинки (Ю.Н.Берг и соавт., 1967; В.Д.Успенская и соавт., 1968).

    Другие электрофорез проводили при общем напряжении до 200 В и более и силе тока 0,5—2 тА на 1 см ширины кюветы (Д.БДыкин, М.М.Щерба, 1969; В.А.Давыдова, Н.И.Макаревич, 1964; Дж.Уилкинсон, 1968). Длительность электрофореза при комнатной температуре составляет от 4—6 до 18—2U часов (Н.К.Лебедева и соавт., 1968; В.Д.Успенская и соавт., 1968) и даже до нескольких суток (Ю.Н.Берг и соавт., 1967 и др.).

    Нами проведен электрофорез при силе тока 2,0—2,5 тА на 1 см ширины гелевой пластинки (14-16 тА) и напряжении 375—380В. Длительность электрофореза составляла 4 часа. При таких условиях проведения электрофореза, которые соблюдают большинство исследователей, было получено от 9 до 15 белковых фракций в сыворотке крови обследованных лиц.

    Кроме того, при данных условиях можно в течение рабочего дня полностью закончить весь процесс подготовки и проведения исследования, в том числе и окрашивание электрофореграмм.

    Окрашивание, проявление и фотографирование электрофореграмм. Окрашивание и проявление электрофореграмм в крахмальном геле выполнялось в соответствии с рекомендациями Ю.Н.Берг и соавт. (1967), В.Д.Успенской и соавт. (1968) и других. Поэтому отметим, что для приготовления раствора краски нами был использован растворитель, состоящий из метанола, дистиллированной воды и ледяной уксусной кислоты в соотношении 5:5:1.

    В качестве красителя взят амидошварц 10В (Чехословакия) и кислотный сине-черный краситель, применяемый на ткацких фабриках. Последний лучше и более интенсивно окрашивает белковые фракции.

    Раствор красителя готовили из расчета 10 г на 1000 мл растворителя. Окраска гелевых пластинок продолжалась 5-7 минут, после чего красящий раствор сливали, а гелевые пластинки 2-3 раза промывали в течение 5 — 10 минут растворителем. Затем кюветы с гелевыми пластинками заполняли этим же растворителем и, плотно закрыв стеклом, оставляли на ночь.

    Утром, слив растворитель, электрофореграммы промывали от оставшихся излишков краски дистиллированной водой и оставляли их в ней на несколько часов. После окраски и отмывки белковые фракции четко вырисовывались на бледном фоне крахмального геля, особенно под тонким слоем чистой дистиллированной воды.

    В таких условиях проводили фотографирование электрофореграмм аппаратом ’’Зенит-ЗМ” на пленку чувствительностью 130 единиц при искусственном освещении одной и той же интенсивности. Затем, отпечатав снимки на контрастной бумаге размером 9×12 см, получали фотоэлектрофореграммы (ФЭФГ).

    Последние можно сохранять длительное время и использовать для количественного определения (при необходимости — многократно) величины отдельных белковых фракций методом денситометрии в отраженном свете. Кроме того, по ним можно проводить точную идентификацию каждой из белковых фракций сыворотки крови и мочи.

    Для просветления фона гелевой пластинки и получения большей «выразительности» белковых фракций предложены различные методы дополнительной обработки гидролизованного крахмала, в частности ацетилированием (Е.Д.Васильева, 1968; В.Х.Панкина, 1971) и другими способами (Ю.Н.Берг, Е.А.Маркина, 1968).

    В наших исследованиях такие методы не применялись, так как гидролизованный крахмал получали уже в готовом виде, гель которого после окраски и отмывки давал сравнительно светлый тон.

    Для сохранения крахмальные гелевые пластинки с электрофореграммами на них высушивали следующим образом: после фотографирования гелевую пластинку помещали на 12—24 часа в специальный раствор, состоящий из двух частей метанола и одной части глицерина.

    Затем пластинку покрывали с обеих сторон фильтровальной бумагой и, расположив между стеклянными пластинками соответствующих размеров, вносили в термостат для сушки при температуре 50-60°С (сушку лучше проводить в потоке проходящего воздуха при температуре 40-50 С).

    Обработанная и высушенная гелевая пластинка становится эластичной и прочной. В таком виде электрофореграм- ма в крахмальном геле может долго сохраняться, не теряя четкости контуров и интенсивности окраски полученных в ней белковых фракций. Этот способ более прост и удобен, чем некоторые другие (А.В.Азявчик, 1969 и др.).

    Таким образом, в качестве документа можно хранить как гелевые пластинки (их заворачивают в целлофан, а затем в бумагу с необходимыми подписями на ней) ,так и снятые с них на фотопленку электрофореграммы. Кроме того, на бумаге можно делать схематические зарисовки полученных в геле протеинограмм сыворотки крови и мочи.

    Количественный анализ электрофореграмм в крахмальном геле. Для количественного определения белковых фракций предложено несколько методов (элюирование с последующим фотокалориметрированием элюатов, фотометрирование в проходящем свете с последующей обработкой электрофореграмм гравиметрическим либо планиметрическим методом, денситометрия в проходящем свете и др.). Однако о выборе метода количественной оценки электрофореграмм существуют разные мнения.

    Большинство исследователей считают метод денситометрии наиболее простым по технике выполнения, достаточно точным и поэтому наиболее перспективным (А.А.Соколов и соавт., 1956; А.Е.Гуревич, 1960; Е-А.Чуркин, 1965; Ат.Илков, Т.1 Николаев, 1959; Р.Даневев, Д.Стойнов, 1964 и др.), но отдельные авторы (О.А.Васильева, Г.Е.Барковская, 1960 и др.), признавая несомненную ценность денситометрии, отмечают, что метод элюирования дает меньше погрешностей.

    При помощи прямого денситометрирования можно точно определить количественные соотношения отдельных фракций без их предварительного элюирования, которое часто трудно осуществить на практике из-за его сложности (Р.Цаневев, Д.Стойнов, 1964).

    При этом количественный анализ электрофореграмм в агаровом геле чаще устанавливают методом прямой (или непосредственной) денситометрии в проходящем свете, так как пластинки агарового геля получаются достаточно прозрачными (В.А.Вайчювенас, 1963; A. Вилейшис и соавт., 1965; Р.А.Гуляева, В.А.Савран, 1967; Р.Протокалэ, B. Боеру, 1959 и др.).

    Таким же образом считают возможным проводить количественное определение белковых фракций в полиакриламидном и крахмальном гелях (Г.В.Троицкий, 1962; Р.Цаневев, Д.Стойнов, 1964; Е.М.Саминский, 1966; Э.Г.Ларскийи соавт., 1967 и др.).

    Однако гель крахмала по сравнению с агаровым и полиакриламидным менее прозрачен, что затрудняет деноитометрию, поэтому требуется предварительное просветление его, для чего, как уже указывалось, предложен ряд методов (Е. Д.Васильев а, 1968; В.Д.Успенская и соавт., 1968; Ю.Н.Берг, Е.А.Маркина, 1968; В.Х.Панкина, 1971 и др.).

    Кроме того, гелевую пластинку необходимо предварительно высушить, что также требует дополнительного времени, навыка и реактивов. Все это существенно усложняет процесс количественной оценки электрофореграмм в крахмальном геле методом прямой денситометрии в проходящем свете, не удовлетворяет полностью исследователей и заставляет искать новые, более простые, доступные, но не менее точные пути количественного анализа белковых фракций.

    Учитывая это, для количественной характеристики белковых фракций в крахмальном геле нами использован метод денситометрии с фотографий элекрофореграмм (ЭФГ), т.е. фотоэлектрофореграмм (ФЭФГ) в отраженному не проходящем свете (рис. 2).

    Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

    Для сравнительной оценки точности применявшегося нами варианта денситометрии предварительно был проведен параллельный количественный анализ 19 электрофореграмм белков сыворотки крови, полученных методом электрофореза на бумаге, с помощью денситометра ERL10 (Карл Цейсс, Иена, DDR) путем прямой денситометрии, т.е. в отраженном свете непосредственно с элекрофореграмм и методом непрямой денситометрии также в отраженном свете, но с фотоэлектрофореграмм.

    Средние показатели величины каждой из пяти белковых фракций, полученные двумя параллельно проводимыми методами денситометрии и подвергнутые статистическому анализу в целях установления достоверности их различий, представлены в табл.3.

    Как видно из табл. 3, количественные показатели величины белковых фракций, полученных при денситометрии с ФЭФГ, статистически значимо не отличаются от аналогичных показателей, полученных путем прямой денситометрии с ЭФГ (Р> 0,3). Это свидетельствует о том, что метод денситометрии с ФЭФГ в отраженном свете не уступает по своей точности методу прямой денситометрии с ЭФГ.

    Содержание белка в каждой фракции выражали в относительных (%) и абсолютных (г/л) величинах. Зная относительную величину белковой фракции и содержание общего белка сыворотки крови и мочи (г/л), расчет искомой фракции проводили по следующей формуле:

    Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

    где у — величина искомой фракции, г/л; М — содержание общего белка, г/л; х — величина искомой фракции, %.

    Как уже отмечалось, с помощью электрофореза в крахмальном геле в сыворотке крови здорового человека можно выделить до 12—20 и более белковых фракций.

    Терминология этих фракций окончательно еще не установлена, но большинство исследователей (Ю.Н.Берг и соавт. 1967; И.И.Иванов, И.А.Пелишенко, 1969; Дж.Уилкинсон, 1968; О.Smithies, 1955, 1959; J.Traeger и соавт., 1965, 1966) пользуются следующими их обозначениями: на электрофореграмме белков в крахмальном геле обычно выявляются две фракции преальбуминов (Pr j, Р), за которыми следует широкая гомогенная фракция альбуминов (А) , затем две-три фракции постальбуминов, за ними фракция с-быстрых глобулинов, обозначаемая чаще р-глобулинов, следующие три (иногда и больше) фракции являются гаптоглобинами (Нр) или обозначаются как ф-фракции; далее расположена фракция медленно движущихся а1-макроглобулинов и фракция b-липопротеинов и, наконец, по другую сторону стартовой линии расположена фракция b-глобулинов.

    Схема расположения упомянутых фракций и их количество представлены на рис. 3.

    Статистический анализ. Полученные результаты исследования подвергаются статистическому анализу в целях определения достоверности различий сравниваемых абсолютных и относительных величин (Л.С.Каминский, 1964; П.Ф.Рокицкий, 1967; Б.С.Бессмертный, 1967; Д.Сепетлиев, 1968).

    Критерий t для абсолютных показателей находим по формуле

    Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

    а для относительных — по формуле:

    Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

    источник