Комплексный количественный анализ, позволяющий определить в моче уровень уро- и копропорфиринов: уропорфирин, гептакарбоксипорфирин, гексакарбоксипорфирин, пентакарбоксипорфирин, копропорфирин I, копропорфирин III, общий порфирин. Исследование предназначено для диагностики как врождённых, так и приобретенных порфирий. В основе генетически обусловленной порфирии лежит нарушение биосинтеза гема, приводящее к избыточному накоплению в организме порфиринов и их предшественников. Вторичные порфирии возникают вследствие нарушения функций печени или кроветворных органов как результат воздействия тяжелых металлов, интоксикаций свинцом, фосфором, алкоголем, бензолом, четыреххлористым углеродом, при некоторых злокачественных опухолях и аллергических состояниях, циррозах печени и проч.
Высокоэффективная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС).
Нмоль/сут. (наномоль в сутки), мкмоль/сут. (микромоль в сутки).
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
- Исключить из рациона алкоголь в течение 24 часов до исследования.
- Исключить (по согласованию с врачом) прием мочегонных препаратов в течение 48 часов до сбора мочи.
Общая информация об исследовании
Порфирины — циклические соединения, образованные четырьмя пиррольными кольцами, связанными между собой метенильными мостиками, синтезируются из глицина и сукцинил-CoA через образование δ-аминолевулиновой кислоты и порфобилиногена. Это промежуточные соединения в синтезе гема, являющегося частью молекулы гемоглобина, осуществляющей перенос кислорода. При нарушении синтеза гема концентрация порфиринов в моче увеличивается.
Порфирины представляют собой оранжево-красные флюоресцирующие соединения, состоящие из 4 колец пиррола, которые образуются в процессе биосинтеза гема. Они обнаруживаются во всех клетках, принимают участие в энергетическом обмене, и экскретируются с мочой в небольших количествах. Повышение в моче уровня порфиринов или порфириногенов свидетельствует о нарушении биосинтеза гема, которое бывает врождённым, например при наследственных ферментопатиях, и приобретенным, например при заболеваниях печени и гемолитической анемии.
Принято различать первичные и вторичные порфинурии. К первым, обычно называемым порфириями, относят группу наследственных заболеваний, для каждого из которых характерен набор экскретируемых с мочой порфиринов и их предшественников. Вторичные порфинурии возникают вследствие нарушения функций печени или кроветворных органов в результате каких-либо первичных заболеваний, например тяжелых гепатитов, интоксикаций свинцом, фосфором, алкоголем, бензолом, четыреххлористым углеродом, при некоторых злокачественных опухолях и аллергических состояниях, циррозах печени и т. п. При вторичных порфинуриях в моче обнаруживаются значительные количества копропорфиринов.
Измеряются семь показателей порфиринов, включая общий порфирин, что позволяет идентифицировать токсический эффект металлов и увидеть, какое лечение необходимо. Также показатели конкретных порфиринов служат функциональными маркерами токсичности ядовитых металлов и органических химических веществ. С помощью порфириновых тестов можно определить уровень биохимического повреждения, вызванного воздействием токсических веществ, ртутное воздействие у пациентов, уровень токсинов у пациентов до и во время хелатирования, токсичность лекарственных препаратов, провести дифференциальную диагностику при отравлениях тяжелыми металлами.
Действие токсинов может вызвать повышенную чувствительность к химическим веществам, поведенческие расстройства и снижение обучаемости, иммунную дисфункцию, синдром хронической усталости, неврологические и психические, эмоциональные расстройства, анемии.
Также целесообразно при определении токсичности исследовать спектр заболеваний, связанных с аутизмом (ASD), и проводить разработку лечебных мероприятий по устранению недостаточной детоксикации и сульфатации, накопления тяжелых металлов. Источниками токсинов могут быть рыба, амальгамы, загрязненный воздух и почва, флуоресцентные лампы, краски, керамика, лечение с помощью методов народной медицины, грунтовые воды, табак. Симптомы интоксикации: усталость, слабость, повышенная химическая чувствительность, раздражительность, беспокойство, потеря памяти, бессонница, онемение и покалывание в руках и ногах, судороги, желудочно-кишечные расстройства, потеря аппетита.
Когда назначается исследование?
- Диагностика первичных (наследственных) порфирий;
- при подозрении на интоксикацию свинцом или ртутью, органическими растворителями, лекарственными препаратами (противосудорожные, анальгетики, анестетики, антипсихотики, противовоспалительные и гормональные), а также алкоголем и его суррогатами;
- болезни гепатобилиарной системы, сопровождающиеся порфиринуриями;
- гормональные изменения у женщин на фоне менструального цикла с обильными выделениями;
- анорексия на фоне низкокалорийной, низкоуглеводной диеты;
- острые атаки в анамнезе, одновременно сочетающие в себе острую боль в животе без симптомов раздражения брюшины с выделением красной или розовой мочи, появлением нарушений сердечного ритма, тошноты и рвоты, повышением артериального давления, повышением температуры тела на фоне различных проявлений полиневропатии.
источник
Талассемии — гетерогенная группа генетических нарушений, связанных с нарушением синтеза нормальных полипептидных цепей Hb. Эти аномалии приводят к развитию гипохромных микроцитарных анемий различной тяжести. Снижение синтеза а-глобиновых цепей вызывает а-талассемию, Р-цепей — р-талассемию. У человека два идентичных гена а-глобина на каждой хромосоме 16 и по одному гену Р-глобина на хромосоме 11.
Большинство случаев а-талассемии обусловлены делецией генов, контролирующих синтез а-глобиновых цепей. Тяжесть а-талассемии связана с количеством делеций этих генов. Делеция одного гена клинически не проявляется. При делеции двух генов возможна лёгкая анемия со снижением MCV. Результаты электрофореза Hb нормальны. Для установления диагноза используют методы ДНК-диагностики. При потере 3 генов развивается анемия различной степени выраженности с содержанием Hb 70-90 г/л. При электрофорезе выявляют HbH Делеция всех 4 генов приводит к несовместимой с жизнью водянке плода.
Р-Талассемия (*141900, 11p15.5, более 90% всех талассемий) развивается в результате экспрессии аномальных генов р-глобиновой цепи. Малая Р-талассемия возникает у лиц, гетерозиготных по патологическому гену. У большинства из них клинические проявления отсутствуют, однако выявляют гипохромию эритроцитов и снижение MCV. Диагноз подтверждаётся путём проведения электрофореза Hb (повышенное содержание HbA2 и/или HbF). Большая р-талассемия (анемия Кули) развивается у лиц, гомозиготных по патологическому гену. Уже на первом году жизни развивается тяжёлая гипохромная микроцитарная анемия. Лечение включает регулярные переливания крови в сочетании с введением железосвязывающих препаратов или пересадку красного костного мозга.
Порфирии — группа гетерогенных, преимущественно наследственных заболеваний, в основе которых лежат нарушения биосинтеза гема и накопление в организме порфиринов и/или их предшественников.
Синтез гема происходит в 8 этапов, для каждого из которых необходим специфический фермент. Ключевую роль играет фермент первого этапа — синтетаза аминолевулиновой кислоты, регуляция её активности лимитирует скорость синтеза гема. Под влиянием индуцирующих факторов активность этого фермента может повышаться в 5-6 раз, а при накоплении конечного продукта (гема) она снижается.
Форма порфирии определяется недостаточностью одного из 8 специфических ферментов цепи синтеза гема. Ферментативный блок на любом уровне данной цепи приводит к снижению количества гема и вызывает повышение активности синтетазы аминолевулиновой кислоты. В результате происходит накопление продуктов синтеза перед заблокированным участком цепи.
В зависимости от того, где происходит повышенное образование и накопление порфиринов и их предшественников, порфирии разделяются на печёночные и эритропоэтические. В большинстве случаев ферментативный дефект выражен во всех тканях, поэтому правильнее говорить лишь о преимущественном вовлечении в процесс либо печени, либо костного мозга. Референтные величины концентрации порфиринов приведены в табл..
Таблица Референтные величины концентрации порфиринов в крови [Henry J.D., 1996]
Таблица Референтные величины концентрации порфиринов в крови [Henry J.D., 1996]
По клиническому течению порфирии разделяют на острые (ОПП, наследственная копропорфирия и др.) и хронические (врождённая порфи-рия, кожная печёночная порфирия и др.).
Наиболее распространённый вариант — ОПП (частота — приблизительно 1:30 000), связанная с недостаточностью гидроксиметилбилан синтета-зы, порфобилиноген дезаминазы или уропорфироген синтетазы (*176000, 11q23.3, дефекты генов HMBS, PBGD, UPS).
У 70-90% носителей патологического гена ни разу в жизни не возникает каких-либо клинических проявлений. В остальных случаях болезнь проявляется приступами острых болей в животе, поражениями периферической (полиневропатия) и центральной (судороги, эпилептиформные припадки, бред, галлюцинации) нервной системы, провоцируемых принятием ряда ЛС и гормональных препаратов, а также различными стрессами, с возможным летальным исходом (летальность приблизительно 60%). ОПП относится к группе острых печёночных порфирий.
Предположительный диагноз острой порфирии может быть поставлен на основании появления окрашенной мочи во время приступа (от слегка розовой до красно-бурой). Розовый цвет мочи обусловлен повышенным содержанием в ней порфиринов, а красно-бурый — присутствием про-топорфирина, продукта деградации порфобилиногена. Для подтверждения диагноза проводят комплекс биохимических и генетических исследований.
На первом этапе исследуют мочу на присутствие в ней избытка порфо-билиногена — качественный скрининговый тест с реактивом Эрлиха, или
58-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК). Порфобилиноген, реагируя с реактивом Эрлиха, образует в кислом растворе окрашенный продукт розово-красного цвета. Этот тест почти всегда положителен при острых приступах порфирии и лишь в редких случаях бывает ложноположительным. Отрицательный результат теста не позволяет исключить диагноз острой порфи-рии. Это обусловлено целым рядом причин: в моче могут присутствовать вещества-ингибиторы, обусловливающие ложноотрицательный результат; повышение концентрации порфобилиногена может быть незначительным (ниже предела чувствительности метода); экскреция порфобилиногена может быстро снижаться и нормализоваться в течение нескольких дней после острого приступа. В связи с этим все положительные и некоторые отрицательные (при наличии соответствующей клинической картины заболевания) результаты теста должны быть подтверждены количественным определением порфобилиногена в моче. Учитывая, что в некоторых случаях при ОПП вначале резко повышается содержание 5-АЛК, необходимо при наличии клинических симптомов и отрицательной пробы на порфобили-ноген провести исследование на 5-АЛК.
В норме концентрация порфобилиногена в моче меньше 2 мг/л. При получении нормальных результатов количественного определения пор-фобилиногена в моче порфирию как причину острых симптомов можно в большинстве случаев отвергнуть. У пациентов с увеличенной концентрацией ПГБ в моче устанавливают диагноз «острая порфирия» и в дальнейшем выполняют исследования по дифференциальной диагностике ОПП и других форм острой порфирии. Для этих целей используется определение общих порфиринов в кале.
В норме концентрация общих порфиринов в кале меньше 200 ммоль/кг сухого кала. Нормальная концентрация общих порфиринов в кале подтверждает диагноз ОПП. При вариегатной порфирии и врождённой прото-порфирии эта концентрация увеличивается во много раз.
Таким образом, диагноз ОПП в период острого течения заболевания можно установить на основании повышенной концентрации порфобили-ногена в моче и нормального содержания общих порфиринов в кале. Вне обострения и в бессимптомных случаях повышенное содержание порфо-билиногена в моче выявляют только у 30% больных ОПП. В таких случаях необходимо провести исследование активности порфобилиноген дезами-назы в эритроцитах.
Порфобилиноген дезаминаза — цитоплазматический фермент, катализирующий конденсацию четырёх молекул порфобилиногена с образованием линейного тетрапиррола. Фермент существует в двух изоформах, одна из которых специфична для эритроцитов, а другая содержится в клетках практически всех тканей. В норме активность порфобилиноген дезамина-зы в эритроцитах — 5,8-11,7 нмоль/с/л [Тиц Н., 1997]. Приблизительно у 90% больных ОПП активность фермента в эритроцитах снижена в 2 раза. Приблизительно у 5% пациентов активность порфобилиноген дезаминазы может быть в пределах нормальных величин из-за перекрывания уровней активности фермента в норме и при ОПП. В таких случаях точный диагноз может быть поставлен только с использованием молекулярно-генети-ческих методов. Информативность различных методов диагностики ОПП
в зависимости от периода заболевания представлена в табл.-10-7, а на Рис. приведён алгоритм диагностики заболевания. Ген порфобилино-ген дезаминазы локализован на хромосоме 11 (11q23-11qter). Для выявления мутаций исследуют ДНК лимфоцитов больных методом ПЦР, секве-нирования или ПДРФ-анализа.
Рис. Алгоритм обследования пациентов с подозрением на порфирию
Рис. Алгоритм обследования пациентов с подозрением на порфирию
Таблица Информативность различных методов диагностики ОПП в зависимости от периода заболевания
Таблица Типичные биохимические изменения, ассоциированные с нарушениями метаболизма порфирина [Henry J.D., 1996]
Примечания: УП — уропорфирин; КП — копропорфирин; ПП — протопорфи-рин; 5-АЛК — 58-аминолевулиновая кислота; ПБГ — порфобилиноген; Т — повышение; ТТ — значительное повышение; Н — норма.
Примечания: УП — уропорфирин; КП — копропорфирин; ПП — протопорфи-рин; 5-АЛК — 58-аминолевулиновая кислота; ПБГ — порфобилиноген; Т — повышение; ТТ — значительное повышение; Н — норма.
источник
Уважаемые читатели, предлагаем вашему вниманию материал, посвященный редкому и малоизвестному широкому кругу практических врачей заболеванию.
При неправильной диагностике, а следовательно и лечении, оно является смертельным (летальность, в среднем, составляет 60%) и, напротив, четкая своевременная диагностика и адекватная терапия спасают практически всех больных, возвращая их к нормальной полноценной жизни. Особенность этой патологии такова, что в результате полисиндромности ее клинических проявлений больные могут поступать в стационары различных профилей, где многие врачи-специалисты оказываются привлеченными в процесс лечения. Пациенты с неясным диагнозом могут переходить из одной клиники в другую, получать разную терапию до тех пор, пока, в лучшем случае, им не поставят правильный диагноз, а в худшем – не наступит летальный исход. Поэтому мы решили ознакомить с этой патологией как можно большее число людей, чтобы в будущем в любой больнице могли ее правильно диагностировать и вовремя оказать больному квалифицированную помощь.
Что же такое острая порфирия?
Острые порфирии — это группа наследственных заболеваний, в основе которых лежит нарушение биосинтеза гема, приводящее к избыточному накоплению в организме порфиринов и их предшественников, а именно, порфобилиногена (ПБГ) и δ-аминолевулиновой кислоты (АЛК). Избыток этих веществ оказывает токсическое воздействие на организм и обуславливает характерную клиническую симптоматику. Причиной подобного нарушения является мутация гена, ответственного за активность одного из ферментов, участвующих в многостадийном синтезе гема.
Классификация острых порфирий
• острая перемежающаяся порфирия (шведская порфирия) — аутосомно-доминантный тип наследования. Проявление — в 10-50% случаев носительства. Дебют в возрасте полового созревания; • наследственная копропорфирия — аутосомно-доминантный тип наследования. Дебют в возрасте полового созревания; • вариегатная порфирия — аутосомно-доминантный тип наследования. Дебют в возрасте полового созревания; • порфирия, связанная с дефицитом АЛК-дегидратазы — наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Дебют в младенчестве — полинейропатия.
Самой распространенной среди них является острая перемежающаяся порфирия (ОПП). Что касается порфирии, связанной с дефицитом АЛК-дегидратазы, то с 60-ых годов, когда профессор Л.И.Идельсон начал впервые в нашей стране заниматься этой патологией, ни один случай этого редчайшего заболевания не был зарегистрирован. Поэтому далее мы будем говорить только о первых трех формах острой порфирии.
Практически все пациенты с острой порфирией, за единичным исключением, гетерозиготны по дефектному гену, ответственного за синтез соответствующего фермента. Большинство из них не имеет очевидных симптомов заболевания, поскольку активности фермента, сниженной до
50%, достаточно для поддержания нормальной скорости биосинтеза гема. Как показывает опыт, почти 85% носителей аномального гена проживают жизнь, не зная об этой болезни. У остальной части, преимущественно у женщин, в период после полового созревания острое течение заболевания может быть спровоцировано действием ряда факторов.
Факторы, провоцирующие острое течение заболевания
Наиболее распространенными являются следующие:
• лекарственные препараты (включая пероральные контрацептивные средства); • контакт с ядохимикатами (к примеру, с/хозяйственные удобрения); • нарушение гормонального профиля у женщин в предменструальный период или при беременности; • резкое изменение характера питания, голодание; • инфекционные заболевания; • стрессовые ситуации; • прием алкоголя.
Самое первое описание острого приступа порфирии было свя-зано с использованием сульфонала. На сегодняшний день наиболее распространенными медикаментозными препаратами — индукторами острого течения заболевания — являются анальгетики, сульфаниламидные и барбитуратные препараты. Все больные и скрытые носители этой патологии, а также клиницисты, сталкивающиеся с лечением острой порфирии, обязательно должны иметь при себе списки препаратов, безопасных и небезопасных для применения при острой порфирии. Ежегодно эти списки обновляются и публикуются Шведским центром порфирии.
Поскольку другим очень распространенным фактором, провоцирующим заболевание, является гормональный, то этот факт объясняет более частое проявление острой порфирии у женщин в сравнении с мужчинами.
Суммируя опыт собственных наблюдений а также других исследователей, занимающихся острыми порфириями, представляем наиболее характерные клинические симптомы этого заболевания:
I. Абдоминальный: • боли в животе — как правило в эпигастральной или правой подвздошной областях, реже не имеют четкой локализации; чаще всего носят приступообразный характер, иногда бывают постоянными, продолжающимися несколько часов или дней; • тошнота, рвота; • запор, реже понос.
II. Сердечно-сосудистый: • стойкая синусовая тахикардия (до 160 ударов в минуту); • гипертония.
III. Неврологический: • мышечная атония (затрагивает чаще мышцы конечностей и пояса); • боли в конечностях, голове, шее и грудной клетке; • потеря чувствительности (наиболее выражена в плечевой и бедренной областях); • поражение черепно-мозговых нервов (в виде дисфагии, диплопии, афонии, пареза лицевого и глазодвигательного нервов); • нарушение тазовых функций; • двигательные расстройства в виде вялых парезов и параличей; • паралич дыхания.
IV. Расстройства психики: • бессонница; • сильное беспокойство; • депрессивные и истерические компоненты; • спутанность сознания и дезориентация; • зрительные и слуховые галлюцинации; • тонико-клонические судороги; • мании; • коматозное состояние; • эпилептические припадки.
V. Кожный (только для больных с наследственной копропорфирией и вариегатной порфирией): • повышенная фоточувствительность; • изменение пигментации.
Исходя из перечисленных симптомов, логично сделать следующий вывод. Острую порфирию можно подозревать у любого больного, поступающего в клинику с неожиданной абдоминальной болью, периферической нейропатией или с нарушением психики. В каждом индивидуальном случае может наблюдаться либо целый набор перечисленных симптом, либо только отдельные из них.
Зачастую больные с острыми приступами порфирии проходят многоэтапные мытарства по различным отделениям клиник, включая хирургические, урологические, гинекологические, неврологические и психосоматические. При отсутствии правильного диагноза история болезни не редко может иметь следующий печальный конец: Тошнота и рвота, нестерпимые сильные боли в животе, отсутствие стула и перистальтики ошибочно наводят на мысль об острой хирургической патологии. Выполняемые в этих случаях хирургические вмешательства с применением барбитуратов в качестве вводного наркоза приводят к усугублению течения заболевания: развивается тетраплегия с параличом дыхательной, артикуляционной и фонирующей мускулатуры. Как следствие, больных подключают к аппарату искусственной вентиляции легких (ИВЛ). Часто ИВЛ осложняется пневмонией, тяжелой дыхательной недостаточностью, от которой наступает смерть больного. При этом диагноз теряется среди наименований, обозначающих острую полинейропатию с тетраплегией и выключением дыха-тельной мускулатуры (синдром Гийана-Барре, вирусный полирадикулоневрит, отравление суррогатами алкоголя и т.д.).
Таким образом, все неясные больные с подобной клинической картиной должны быть обязательно обследованы на наличие у них острой порфирии. Своевременная диагностика этой патологии просто необходима, поскольку правильно установленный диагноз и верно выбранная тактика лечения приводят всех больных к клиническому выздоровлению.
Диагностика острой порфирии
Первое, на что необходимо обратить внимание при диагностике, — изменился ли цвет мочи у больного. Появление окрашенной мочи от слегка розового до красно-бурого цвета является характерным, но необязательным признаком данного заболевания. В период его обострения наблюдается высокая экскреция с мочой порфиринов, порфобилиногена и дельта-аминолевулиновой кислоты. Высокое содержание порфиринов объясняет розовый цвет мочи, а избыток порфобилина, продукта деградации порфобилиногена, окрашивает мочу в красно-бурый цвет. При стоянии мочи на свету необычное окрашивание становится еще более заметным.
Однако изменение цвета мочи не является обязательным признаком острой порфирии. Существует ряд скрининговых качественных методов, позволяющих в обычных больничных условиях с большой долей вероятности обнаружить наличие порфиринов и порфобилиногена в моче. Проводить их необходимо в момент острого течения заболевания, чтобы избежать возможных ошибок. Ниже представим описание двух из них.
1. Скрининговый (ориентировочный) тест на присутствие порфиринов в моче.
Принцип теста: Моча здорового человека под действием ультрафиолета в диапазоне длин волн 320-405 нм люминесцирует бело-голубым цветом. Когда же в моче присутствует избыток порфиринов, она имеет красную флюоресценцию.
Реагенты: • Ледяная уксусная кислота; • Амиловый спирт.
Метод: В пробирку к 4 мл свежей мочи добавить 10 капель ледяной уксусной кислоты и 1 мл амилового спирта, хорошо перемешать и подождать полного разделения слоев. Розовая или красная флюоресценция верхнего органического слоя указывает на присутствие избытка порфиринов в моче.
Возможны ложноположительные результаты данного теста, но редко. Необходимо помнить, что при некоторых отравлениях (к примеру, свинцом, ртутью, мышьяком), прогрессирующих заболеваниях печени или пернициозной анемии наблюдается умеренное повышение выделения копропорфирина в мочу.
2. Качественная реакция мочи с реактивом Эрлиха на присутствие порфобилиногена.
Принцип теста: Порфобилиноген реагирует с реактивом Эрлиха, образуя в кислом растворе окрашенный продукт розово-красного цвета. Поскольку эта реакция может происходить с другими веществами, присутствующими в моче, в тесте используется экстракция и регулировка рН раствора для исключения влияния мешающих веществ.
Образец: Тест проводится с использованием только свежесобранной мочи без добавления консерванта, защищенной от контакта со светом и хранящаяся в холодном месте до момента проведения анализа. Образец ранней утренней мочи является предпочтительным, поскольку моча является более концентрированной. Моча, собранная более чем 4 часа назад, не может быть использована для анализа, поскольку концентрация ПБГ снижается на 20% в течение 24 часов при комнатной температуре. При хранении образца при — 200С уровень ПБГ в моче может быть стабилен в течение 6 месяцев.
Реагенты: • Реактив Эрлиха (0.7 г пара-диметиламинобензальдегида рас-творить в 100 мл Н2О дист., а затем добавить 150 мл НCl конц.) Хранится в темном флаконе, стабилен в течение 6 месяцев; • Насыщенный раствор ацетата натрия: 120 г CH3COONa растворить в 100 мл горячей (70-800С) дистиллированной воды; • Смесь амилового и бензилового спиртов в соотношении 3:1 (v/v); • Индикаторная бумага рН 4-5; • Реагент сравнения: разбавить 150 мл НСl конц. в 100 мл Н2О дист.
Метод: 1.) Добавить 0.5 мл реактива Эрлиха в стеклянную пробирку с 0.5 мл исследуемой мочи и перемешать. Подождать в течение 3-5 мин развития окраски и добавить при перемешивании 1 мл насыщенного раствора ацетата натрия. Проверить с помощью индикаторной бумаги, чтобы рН раствора был в диапазоне от 4 до 5. Если окраска не появится, то ПБГ не обнаружен. Если в течение 3-4 мин. содержимое пробирки приобретет розовый или красный цвет, то переходите к следующим пунктам исследования; 2.) Чтобы исключить присутствие мешающих веществ, повторить процедуру из пункта (1) с реагентом сравнения. Если снова появится розовая окраска, то вероятно в моче содержится кислотный индикатор (например, метиловый красный), который случайно попал в мочу после применения либо лекарственных пре-паратов, содержащих красители, либо легких алкогольных напитков, либо пищевых продуктов с различными добавками; 3.) Для исключения уробилиногена, как причины появления розовой окраски, добавить приблизительно 2 мл смеси намилового и бензилового спиртов в пробирку с содержимым из пункта (1). Хорошо перемешать путем встряхивания и дать разделиться слоям. Комплекс уробилиногена с реактивом Эрлиха должен проэкстрагироваться в верхний органический слой. Розовая окраска нижнего водяного слоя указывает на присутствие ПБГ.
В Москве фирма «Агат» выпускает реактив Эрлиха с разработанной подробной инструкцией по проведению скрининг-теста. Телефон для справок: +7 (495) 777-4192.
Этот тест почти всегда положителен про острых приступах порфирии, правда, иногда можно получить ложноположительный результат за счет вероятного присутствия в моче мешающих веществ.
Отрицательный результат теста на ПБГ снижает вероятность, но окончательно не исключает диагноз острой порфирии. Объяснением тому может служить либо наличие в моче некоторых веществ — ингибиторов, которые приводят к ложноотрицательному результату, или незначительное повышение концентрации ПБГ, что может быть ниже предела чувствительности скрининг-теста. Кроме того, при вариегатной порфирии, наследственной копро-порфирии и только в очень редких случаях при ОПП экскреция ПБГ в мочу может быстро снижаться и вернуться к нормальной в течение нескольких дней после острого приступа. Поэтому, если клинически диагноз острой порфирии до конца не отвергается, необходимо провести количественное определение порфиринов и их предшественников в моче.
Качественный тест с реактивом Эрлиха широко используется в клиниках многих стран, особенно в Скандинавии, Англии и Ирландии (где зафиксировано наибольшее число случаев заболева-ния острой порфирией) в качестве скрининга для быстрого выявления вероятных порфирий. Наладить первичную диагностику острых порфирий в каждой клинике России на основе вышеизложенных качественных тестов — является важной и не терпящих отлагательств задачей. Ее выполнение не требует особых финансо-вых и трудоемких затрат, с одной стороны, а с другой – многим больным острой порфирии уже на первых этапах развития болезни будет поставлен верный диагноз, что позволит своевременно провести необходимое лечение. В результате многие пациенты будут возвращены к здоровому образу жизни, минуя получения группы инвалидности при затяжном течении заболевания.
Качественные скрининг-тесты ни в кой мере нельзя принимать за абсолютные, в связи с возможными, указанными выше ошибками. Для подтверждения и уточнения диагноза рекомендуется провести следующие лабораторные исследования: 1.) Определение общих порфиринов и их предшественников — порфобилиногена (ПБГ) и δ-аминолевулиновой кислоты (АЛК) в моче. В норме содержание общих порфиринов в моче не превышает 0.15 мг/л; ПБГ — 2 мг/л; АЛК — 4.5 мг/л.; 2.) Определение общих порфиринов в кале. У здоровых людей содержание общих порфиринов в кале
источник
Гематологический Научный Цент РАМН, Москва, ИЧП «Агат», Москва.
(Проблемы гематологии и переливания крови, 1/98, стр.49—50.)
Увеличение выделения порфобилиногена (ПБГ) с мочой наблюдается при анемиях, связанных с нарушением порфиринового обмена. ПБГ является одним из главных маркеров острого состояния (атаки) при порфириях (острой перемежающей порфирии и порфирии Veriegata), в основе патогенеза которых лежат нарушения в синтезе гема, вызываемые дефицитом одного из ферментов его синтеза и экскрекцией с мочой предшественников — протопорфиринов.
Ввиду того, что клинически острые состояния при порфириях характеризуются комплексом терапевтических, нейрологических и психиатрических симптомов, таких как абдоминальные боли, тахикардия, гипертензия, поведенческие изменения, конвульсии, кома, парез дыхательной мускулатуры и др., определение ПБГ в моче наиболее целесообразно в нейрологических, психиатрических и хирургических стационарах.
В то же время при порфириях недопустимо применение целого ряда широко распространенных лекарств (барбитураты, этанол, хлорпропанид, сульфаниды и др.), поскольку они могут вызвать атаку порфирии. Поэтому определение ПБГ является основой для своевременной диагностики и адекватной терапии, поскольку в настоящее время существует препарат аргинат гематина (нормосанг), позволяющий купировать атаку при порфириях.
Обычно ПБГ, а также два других продукта порфиринового обмена — 5-d-аминолевулиновую кислоту (5-АЛК) и общие порфирины, количественно определяют методом колоночной хроматографии (например с применением наборов фирмы BioRad (США)). Определение этих показателей наиболее информативно для диагностики нарушений порфиринового обмена, однако реактивы эти чрезвычайно дороги, а методика сложна, что делает ее применение нецелесообразным в рамках рядового лечебного учреждения.
Определение ПБГ (а также 5-АЛК) можно проводить и по упрощенной схеме, применяя реактив Эрлиха, считая данный метод скринирующим, а при положительной реакции подтверждать указанными выше методами или обращаться в профильные лаборатории.
Реактив Эрлиха представляет собой раствор п-диметиламинобензальдегида 20 г/л в смеси ледяной уксусной и перхлорной кислот. При взаимодействии ПБГ с реактивом Эрлиха образуется порфобилиноген-альдегид, имеющий красную окраску. В качестве образца берется моча в первые 2—3 часа после мочеиспускания.
В ходе определения ПБГ к 0,5 мл мочи приливают 0,5 мл реактива Эрлиха. Реакцию следует считать положительной, если в первые 5 минут после добавления реактива Эрлиха произошло резкое изменение окраски (покраснение). При инкубации реакционной смеси более 5 мин возможно развитие окраски, не связанное с увеличением уровня ПБГ.
Используя хроматографические методы анализа, мы провели дифференциальную диагностику 65 больных, у которых наблюдались некоторые симптомы ОПП. У 25 больных диагноз ОПП был подтвержден. Применяя реактив Эрлиха по указанной методике, мы не обнаружили расхождения этого метода с данными колоночной хроматографии. Во всех положительных случаях наблюдалось резкое покраснение не позднее, чем через 1 мин, а в отрицательных — изменение окраски ранее, чем через 5 мин, не выявлено.
Учитывая тот факт, что в некоторых случаях при атаке при острой перемежающей порфирии вначале резко повышается содержание 5-d-аминолевулиновой кислоты (5-AЛК), которая также является предшественником порфиринов, рекомендуется, при наличии клинических симптомов и отрицательной пробы на ПБГ, провести определение 5-AЛК.
Для этого следует к 1 мл исследуемой мочи прибавить 0,5 мл ацетилацетона и пробу прогреть в водяной бане при 100.С в течение obr>10—15 мин. Затем прибавить 0,5 мл реактива Эрлиха и если в первые 5 минут произошло покраснение, то реакцию можно считать положительной.
Необходимо помнить, что в случае хранения мочи свыше 3 часов при комнатной температуре реакция может стать ложноотрицательной, что, по-видимому, связано с превращением ПБГ в порфирины и образованием ингибиторов реакции. Если нет возможности исследовать мочу в первые 2—3 часа, ее хранят в холодильнике при 4.С или в замороженном состоянии. При доведении рН мочи до 6,0—7,0 и хранении в холодильнике ПБГ стабилен длительное время.
Кроме того, посуда, используемая для проведения реакции должна быть свободна от следов моющих средств, которые могут вызвать ложноположительную реакцию.
При ярко выраженной положительной реакции на ПБГ или 5-АЛК и наличии клинических симптомов следует принять меры, необходимые для предупреждения атаки или ее купирования. Однако, данный метод является скрининговым, а его положительный результат лишь указывает на возможность наличия нарушений порфиринового обмена. Для установления диагноза, а также для определения динамики заболевания и его лечения требуется количественное определение ПБГ, АЛК, и общих порфиринов хромотографическим методом. Рекомендуется при обнаружении положительной реакции обращаться Гематологический Научный Цент РАМН (ГНЦ РАМН).
В настоящее время ООО «Агат-Мед» выпускает набор реактивов для качественного определения порфобилиногена в моче «ПБГ АГАТ».
Cайт Гематологического Научного Центра РАМН, посвященный порфирии
источник
ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ КЛИНИЧЕСКОГО АНАЛИЗА МОЧИ
1000 определений рН, глюкозы, уробилиноидов, кетонов
400 определений билирубина (качественная реакция)
Только для in vitro диагностики!
Набор реагентов для клинического анализа мочи, далее по тексту – набор, предназначен для определения рН, обнаружения глюкозы, кетонов, билирубина, уробилиноидов в моче в клинико-диагностических лабораториях.
Бромтимоловый синий – 1 флакон (20 мл)
Реактив Гайнеса (4-кр. концентрат) – 1 флакон (100 мл)
Реактив Фуше – 1 флакон (50 мл)
Барий хлористый – 2 флакона (по 150г)
Реактив Эрлиха – 1 флакон (100 мл)
Реактив Лестраде – 1 флакон (20г)
Число анализируемых проб: 1000 определений рН, глюкозы, уробилиноидов, кетонов
400 определений билирубина (качественная реакция)
рН мочи определяется по изменению цвета индикатора бромтимолового синего. Границы изменения окраски индикатора лежат в диапазоне значений рН 5,0 – 9,0.
Определение глюкозы, проба Гайнеса:
Глюкоза при нагревании в щелочной среде восстанавливает гидрат окиси меди (синего цвета) в гидрат закиси меди (зеленого, желтого, оранжевого или коричневого цвета).
Билирубин, после его осаждения хлоридом бария, под действием треххлористого железа (реактив Фуше) превращается в зеленый биливердин. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию билирубина.
Уробилиноген при реакции с п-диметиламинобензальдегидом (реактив Эрлиха) образует соединение, окрашенное в красный цвет. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию уробилиноидов.
Кетоны в щелочной среде взаимодействуют с нитропруссидом натрия (реактив Лестраде) с образованием соединений красно-фиолетового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию кетонов в моче.
Потенциальный риск применения набора – класс 1.
Все компоненты в используемых концентрациях являются нетоксичными.
При работе с набором необходимо соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены
при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР (Москва, 1981 г.).
При работе с биологическими жидкостями следует надевать одноразовые резиновые перчатки, так как исследуемый материал является потенциально инфицированным, способным длительное время сохранять или передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусной инфекции. Все использованные материалы дезинфицировать в соответствии с требованиями МУ-287-113.
- колбы конические вместимостью 100 мл, 200 мл; цилиндры мерные вместимостью 50 мл, 100 мл; флакон из темного стекла вместимостью 200 мл; колбы мерные вместимостью 200 мл, 1 л; весы лабораторные второго класса точности типа ВЛР-200 г; пипетки, позволяющие отбирать объемы жидкости 1,0; 2,0; 3,0;4,0 и 5,0 мл; пробирки стеклянные вместимостью 10 мл; бумага фильтровальная лабораторная; секундомер; чашки Петри; баня водяная; раствор натрия хлористого 9 г/л; вода дистиллированная; перчатки резиновые.
Исследуемый материал: свежесобранная моча.
Приготовление рабочего раствора бромтимолового синего: бромтимоловый синий развести дистиллированной водой в соотношении 1:4. Полученный рабочий раствор стабилен в течение 6 месяцев при хранении в темноте при температуре 18-25°С.
Приготовление рабочего раствора реактива Гайнеса: реактив Гайнеса (концентрат) разбавить водой дистиллированной в соотношении 1:4. Рабочий раствор реактива Гайнеса хранить при температуре 18-25°С в защищенном от света месте в течение срока годности набора.
Приготовление раствора бария хлористого 15 %: 150 г бария хлористого внести в мерную колбу вместимостью 1 л, добавить 800 мл дистиллированной воды, тщательно перемешать до полного растворения, довести дистиллированной водой до метки и вновь тщательно перемешать. Раствор бария хлористого хранить при температуре 18-25°С в течение срока годности набора.
Реактив Фуше: готов к применению. Перед применением взболтать. После вскрытия флакона раствор можно хранить при комнатной температуре в плотно закрытом флаконе в течение срока годности набора.
Реактив Эрлиха: готов к применению. После вскрытия флакона раствор можно хранить при комнатной температуре в плотно закрытом флаконе в течение срока годности набора.
Реактив Лестраде: готов к применению. После вскрытия флакона реактив можно хранить при комнатной температуре в плотно закрытом флаконе в течение срока годности набора.
К 1-2 мл свежесобранной мочи добавить 1-2 капли рабочего раствора бромтимолового синего.
Результаты: желтый цвет соответствует кислой реакции, бурый цвет соответствует слабокислой реакции, травянистый цвет соответствует нейтральной реакции, буровато-зеленый цвет соответствует слабощелочной реакции, зеленый и синий цвет соответствует щелочной реакции.
В пробирку вместимостью 10 мл внести 3-4 мл мочи, добавить 5-10 капель рабочего раствора реактива Гайнеса, перемешать и нагреть верхнюю часть пробирки до начала кипения над пламенем газовой горелки или спиртовки или выдержать на кипящей водяной бане в течение 5 мин. В присутствии глюкозы появляется зеленая, желтая, оранжевая или коричневая окраска жидкости и осадок. Синий цвет указывает на отсутствие глюкозы в моче.
Примечание: моча больных диабетом должна исследоваться в первую очередь, т. к. ферменты бактерий и дрожжевых грибов частично или полностью разлагают глюкозу. То же самое наблюдается при бактериурии. Нижний предел обнаружения глюкозы в моче составляет 0,5 ммоль/л
В пробирку вместимостью 20 мл внести 10 мл мочи и 5 мл 15% раствора бария хлористого, тщательно перемешать и профильтровать через фильтр. Барий хлористый осаждает билирубин. Фильтр поместить в чашку Петри и на него нанести 2 капли реактива Фуше. Появление сине-зеленого, голубовато-изумрудного пятна свидетельствует о присутствии билирубина в моче.
Примечание: если реакция мочи щелочная, то необходимо подкислить ее несколькими каплями 30 % уксусной кислоты.
4. Определение уробилиноидов:
В пробирку вместимостью 10 мл внести 1–2 мл свежесобранной мочи, охлажденной до комнатной температуры, добавить 1-2 капли реактива Эрлиха из расчета 1 капля реактива Эрлиха на 1 мл мочи, тщательно перемешать круговыми движениями и включить секундомер.
Окрашивание мочи в красный цвет в течение первых 30 сек, после добавления реактива Эрлиха, указывает на повышенное содержание уробилиногенов.
Отсутствие окраски или ее появление через 60 сек, после добавления реактива Эрлиха указывает, что концентрация уробилиногенов в моче в норме.
Примечание: определению уробилиноидов может мешать билирубин, при обнаружении билирубина его следует предварительно удалить, осадив раствором хлористого бария 15% (см п. определение билирубина).
Нижний предел определения уробилиноидов составляет 3,0 ммоль/л
Нанести небольшое количество (на кончике ножа) реактива Лестраде на фильтровальную бумагу, добавить 2-3 капли анализируемой мочи и включить секундомер. Появление розоватого, сиреневого или темно-фиолетового окрашивания через 2 мин указывает на наличие в моче кетонов.
Нижний предел обнаружения кетонов составляет 0,5 ммоль/л
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ
Транспортирование набора производится всеми видами крытых транспортных средств в соответствии с требованиями и правилами перевозки грузов, действующими на данном виде транспорта, при температуре от +2°С до +25°С
Набор должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя в крытых вентилируемых помещениях, не допуская воздействия прямых солнечных лучей, при температуре от +2°С до +25°С в течение всего срока годности.
Компоненты набора стабильны после вскрытия флаконов при температуре от +2°С до +25°С в течение всего срока годности при условии достаточной герметизации флаконов.
Рабочий раствор бромтимолового синего стабилен в течение 6 месяцев при хранении в темноте при температуре 18-25°С.
Рабочий раствор реактива Гайнеса стабилен при температуре 18-25°С в защищенном от света месте в течение срока годности набора.
Раствор бария хлористого стабилен при температуре 18-25°С в течение срока годности набора.
Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению раствора.
Срок годности: 1 год со дня приемки ОТК предприятия-изготовителя.
источник
Эрлиха диазореакция — это качественная проба обнаружения биологически важных веществ в крови и моче. Основана на неспецифической цветной реакции между диазореактивом Эрлиха и некоторыми органическими веществами (пиррол, крезол, индикан, белки, содержащие аминокислоты тирозин, триптофан, гистидин и др.).
Диазореакция в моче. Реактивы: 1) диазореактив (0,5 г сульфаниловой кислоты и 5 мл 25% раствора соляной кислоты в 100 мл воды); 2) 0,5% раствор азотистокислого натрия.
Методика выполнения этой реакции: к 4 мл I реактива прибавляют 1—2 капли II реактива, приливают 4 мл мочи, потом 1 мл 10% раствора аммиака; пробирку закрывают пробкой и взбалтывают жидкость до появления пены. Проба считается положительной при розовой или красной окраске и отрицательной — при желтой или оранжевой. Положительная реакция наблюдается при многих лихорадочных заболеваниях: брюшном и сыпном тифе, милиарном туберкулезе, лимфогранулематозе, кори, трихинеллезе и др. При наличии билирубина в моче появляется с диазореактивом красное окрашивание мочи еще до прибавления аммиака.
Диазореакция в крови. Применяется при определении билирубина, с которым смесь диазореактивов в определенных соотношениях дает красное окрашивание. Диазореакция Эрлиха лежит в основе большинства методов количественного и качественного определения билирубина (см.).
Эрлиха диазореакция (P. Ehrlich) — это цветная реакция между диазореактивом Эрлиха и рядом органических веществ (пиррол, крезол, индикан и др.), вступающих в соединение с азогруппой (—N=N—), используемая для количественного определения биологически важных веществ в крови и моче.
Приготовление диазореактива: в раствор 5 г сульфаниловой кислоты в 50 мл крепкой соляной кислоты (d=1,12) добавляют воду до объема 1 л; к полученному раствору добавляют 0,5% раствор азотистокислого натрия. При этом образуется диазофенилсульфоновая кислота (реактив Эрлиха), которая образует окрашенные азосоединения с некоторыми биологически важными веществами, находящимися в крови и моче.
Широкое применение диазореакция Эрлиха получила в клинике при качественном и количественном определении билирубина в крови (см. ниже). Диазореактив используют также для определения тирозина, гистидина и гистамина. Белки, в молекулу которых входят аминокислоты — тирозин, триптофан и гистидин, дают с диазореактивом оранжево-красное окрашивание. При определении некоторых веществ в качестве компонента для получения окрашенного азосоединения употребляется не сульфаниловая кислота, а другие циклические соединения, например при определении фенолов в крови и в моче — паранитроанилин, при определении сульфаниламидов — 2R-кислота и т. д.
Диазореакция в крови. Билирубин при диазореакции дает характерное красно-фиолетовое окрашивание. Это явление было использовано для большинства методов качественного и количественного определения билирубина крови. В настоящее время чаще всего применяют метод Ендрашика, позволяющий определять раздельно фракции билирубина.
Реактивы: а) кофеиновый реактив: 5 г кофеина, 7,5 г бензойнокислого натрия и 12,5 г уксуснокислого натрия растворяют при небольшом подогревании в дистиллированной воде и доливают водой до 0,1 л; б)диазореактив: первый реактив — 1 г сульфаниловой кислоты растворяют в небольшом количестве воды и, прибавив 15 мл концентрированной HCl, доливают водой до 1 л; второй реактив — 0,5% раствор азотистокислого натрия.
Перед употреблением смешивают 10 мл первого реактива и 0,25 мл второго. Для определения общего билирубина к 1 мл сыворотки приливают 3,5 мл кофеинового реактива и 0,5 мл диазореактива, а при определении прямого билирубина к 1 мл сыворотки прибавляют 3,5 мл физиологического раствора и 0,5 мл диазореактива. Хорошо перемешав, обе пробы через 5 мин. колориметрируют против компенсационного раствора, состоящего из 1 мл сыворотки, 3,5 мл кофеинового реактива и 0,5 мл физиологического раствора при зеленом светофильтре. Непрямой билирубин определяется вычитанием из общего прямого.
Диазореакция в моче состоит в прибавлении к 10 мл свежей мочи 10 мл диазореактива и 2 мл 10% раствора аммиака. При этом после энергичного взбалтывания появляется розовое или карминово-красное окрашивание. Реакция считается положительной, если окрашены не только жидкость, но и образовавшаяся пена. Желтый или оранжевый цвет свидетельствует об отрицательном результате. В сомнительных случаях образование на следующий день осадка сине-зеленого или черного цвета позволяет считать реакцию положительной. В настоящее время эта реакция не имеет практического значения, так как она неспецифична и характерна для многих лихорадочных заболеваний: брюшного и сыпного тифов, милиарного туберкулеза, полисерозита, кори, лимфогранулематоза, пневмонии, дифтерии, рожистого воспаления, трихинеллеза. Кроме того, лекарственные препараты: опий, морфин, дионин, атофан, гексаметилентетрамин, ревень, героин, хризаробин, сальварсан — дают похожее окрашивание, а препараты танина, фенол и его производные, крезол, гваякол и салол мешают реакции.
источник
ДИАЗОРЕАКЦИЯ (син. диазореакция Эрлиха) — цветная реакция между реактивом Эрлиха (диазофенилсульфоновой кислотой) и рядом органических веществ, способных реагировать с ароматическими диазосоединениями (пиррол, крезол, индикан и др.); используется в общей и клинической биохимии и гистохимии. Предложена П. Эрлихом в 1882 г. П. Эрлих в 1883 г. указал, что билирубин вступает в соединение с диазониевыми солями, давая характерное красное окрашивание.
Широкое применение Д. получила в клинике именно при качественном и количественном определении билирубина (см.). Диазореактив используется также для определения тирозина (см.), гистидина (см.) и гистамина (см.). Белки, в молекулу которых входят аминокислоты тирозин, триптофан и гистидин, дают с диазореактивом оранжево-красное окрашивание.
Диазореактив готовят непосредственно перед употреблением смешиванием двух р-ров — 0,15—0,5% р-ра сульфаниловой к-ты в разбавленной соляной к-те и 0,5% р-ра азотистокислого натрия, в результате чего происходит следующая реакция:
Вещества, дающие с диазофенилсульфоновой к-той цветную реакцию, замещают в ней атом хлора, результатом чего является образование окрашенного азосоединения.
При определении некоторых веществ в качестве компонента для получения окрашенного диазосоединения употребляется не сульфаниловая к-та, а другие ароматические амины, напр, при определении фенолов в крови и в моче — n-нитроанилин, при определении сульфаниламидов— 2R-кислота и т. д.
В норме Д. в моче отрицательна. В случае положительной реакции при добавлении диазореактива и аммиака появляется карминово-красное окрашивание (П. Эрлих, 1882). Д. в моче высокоспецифична для билирубина, другие желчные пигменты (см.) в моче не дают подобной реакции. Алкалоиды опия, сульфаниламиды, салол, сальварсан, ревень, нафталин, креозот, выделяющиеся с мочой, могут давать сходную цветную реакцию.
К 10 мл свежеприготовленного диазореактива прибавляют 10 мл свежей мочи, смешивают, приливают 2 мл аммиака (NH4OH) лочной реакции и хорошо встряхивают. При положительной реакции появляется розовое или карминово-красное окрашивание. Реакция считается положительной, если окрашена не только жидкость, но и образовавшаяся пена. Желтая или оранжевая окраска свидетельствует об отрицательной реакции. Сомнительную Д. нужно признать отрицательной. Интенсивность Д. оценивается количественно путем сравнения с окраской, образующейся в результате Д. со стандартным р-ром нафтолсульфокислого натрия. Хантер (G. Hunter, 1930), используя принцип Д., увеличил точность определения билирубина в моче путем предварительного осаждения его хлористым барием. Реакция проводится следующим образом: к 10 мл подкисленной мочи добавляют 4 мл 10% BaCl2, перемешивают, центрифугируют, осадок промывают дист, водой, затем в пробирку последовательно добавляют 0,5 мл реактива Эрлиха, 2 мл 96 % спирта и 0,3 мл 6% двузамещенного фосфорнокислого натрия. Смесь повторно центрифугируют. В присутствии билирубина надосадочная жидкость окрашивается в розовый цвет. Чувствительность метода 1 : 666 000. Иногда вместо реактива Эрлиха в этой реакции используют натрий изопаранитродиазобензол.
Однако, несмотря на специфичность и высокую чувствительность, Д. для определения билирубина в моче имеет свои недостатки. Ее точность зависит от степени свежести мочи, температуры мочи и ее прозрачности (мутную мочу приходится фильтровать), метод относительно трудоемок. Поэтому Д. для определения билирубина в моче не рекомендована в качестве унифицированного метода.
В первой половине 20 в. определению интенсивности Д. в моче придавали очень большое диагностическое и прогностическое значение, однако позднее она стала использоваться только как вспомогательный диагностический тест. Д. бывает почти всегда положительной при инфекционных заболеваниях, сопровождающихся лихорадочным состоянием, особенно при брюшном тифе и кори.
При брюшном тифе Д. обычно положительна уже на 3—4-й день заболевания и остается такой в течение всей болезни. При рецидиве брюшного тифа Д. снова становится положительной, что помогает дифференцировать рецидив с осложнениями болезни. Если при разведении мочи 1 : 50 и более сохраняется положительная Д., это свидетельствует о тяжелом течении заболевания. Раннее исчезновение положительной Д. рассматривается как благоприятный прогностический признак.
При кори положительная Д. в моче часто отсутствует в период высыпания, но почти постоянно обнаруживается на стадии шелушения. При помощи Д. можно отличить корь от краснухи, при к-рой Д. всегда отрицательна.
Помимо этих заболеваний, Д. положительна при ревматизме, рожистом воспалении, пневмонии, милиарном туберкулезе, трихинеллезе. Положительная Д. при туберкулезе легких, как правило, свидетельствует о тяжелом течении заболевания. При некоторых тяжелых инфекционных болезнях (скарлатине, дифтерии и др.) Д. почти всегда отрицательна.
Диазореакция в крови применяется преимущественно для определения билирубина; практически это является ее важнейшим применением в клинической лабораторной диагностике. Эту реакцию Ван-ден-Берг (A. A. Hijmans van den Bergh) в 1913 г. впервые использовал для качественного и количественного определения билирубина в сыворотке крови (см. Ван-ден-Берга реакция). Наиболее широко в клинике применяется модификация метода Ван-ден-Берга — метод Ендрашика и др. (см. Ендрашика-Клегхорна-Грофа метод).
Библиография Биохимические методы исследования в клинике, под ред. А. А. Покровского, М., 1969; Ворожцов H. Н. Основы синтеза промежуточных продуктов и красителей, М.— Л., 1950; Цоллингeр Г. Химия азокрасителей, пер. с нем., Л., 1960.
источник
Определение уробилина в моче также основано на образовании окрашенных в розовый или красный цвет соединений при взаимодействии уробилина с HCl, сульфатом меди или реактивом Эрлиха (парадиметил-аминобензальдегидом).
Проба Нейбауэра. К 3-4 мл свежевыпущенной мочи добавляют 3-4 капли реактива Эрлиха (пара-диметилбензальдегида). Окрашивание мочи в красный цвет свидетельствует о диагностически значимом повышении концентрации уробилина в моче.
У здорового человека с мочой выделяется не более 5-6 мг уробилина в сутки, который не выявляется качественными реакциями.
Положительная качественная реакция на уробилин свидетельствует:
· о выходе в общий кровоток уробилиногена, что обычно наблюдается у пациентов с поражениями паренхимы печени
· об увеличенном образовании стеркобилиногена (при усиленном гемолизе) в кишечнике, в избыточном количестве через vena hemorroidalis поступающего в кровоток и попадающего в мочу в большей, чем в норме, концентрации.
Проба Гмелина. Проба основана на способности желчных пигментов окисляться концентрированной азотной кислотой с образованием окрашенных в различные цвета продуктов окисления: биливердина (зеленого цвета), билицианина (синего цвета), холелетина (желтого цвета) и др.
Проба Гмелина может проводиться в пробирке или на фильтровальной бумаге. Она дает возможность открыть билирубин в разведении мочи
В пробирку наливается 1-2 мл концентрированной азотной кислоты, содержащей следы азотистой. Осторожно по стенке наслаивается равный объем исследуемой мочи. При наличии в моче желчных пигментов на границе раздела жидкостей появляются цветные кольца. Характерно наличие зеленого, синего, фиолетового, красного и желтого колец в указанной последовательности соответственно разным степеням окисления пигмента.
Проба Розенбаха (проба на фильтровальной бумаге). 2 мл исследуемой мочи несколько раз фильтруется через небольшой бумажный фильтр. При наличии в ней желчных пигментов они частично задерживаются на фильтре. В центр фильтра, развернутого на предметном стекле и слегка подсушенного, стеклянной палочкой наносится капля концентрированной азотной кислоты. Появляются характерные цветные кольца. При этом зеленое кольцо всегда располагается снаружи.
Желчные пигменты (билирубин, биливердин и др.) отсутствуют в моче здорового человека. Они появляются в ней в виде щелочных солей при желтухах.
Определение порфобилиногена в моче.При взаимодействии с р-метиламинобензальдегидом порфобилиноген образует окрашенные в красный цвет соединения. Продукты, имеющие красную окраску, образование которых не связано с порфобилиногеном, удаляются из реакционной смеси путем экстракции хлороформом и бутанолом.
В пробирку вносится 2,5 мл мочи, 2, 5 мл реактива Эрлиха и 5 мл насыщенного раствора уксуснокислого натрия. Проводится интенсивное встряхивание. При наличие в моче порфобилиногена развивается характерная красная окраска. Содержимое переносится в мерный цилиндр на 20 мл. Добавляется 10 мл смеси хлороформа с бутанолом (1:1). Проба интенсивно встряхивается, после чего оставляется до расслоения фаз. Верхний водный слой сохраняет при этом красную окраску.
В норме при помощи описанного метода порфобилиноген в моче не обнаруживается (0 – 2 мг/л).
Приготовление реактива Эрлиха: 1 г р-метиламинобензальдегида растворяется в 35 мл ледяной уксусной кислоты. Добавляется 8 мл концентрированной хлорной кислоты, после чего общий объем доводится до 50 мл.
источник
Нормальная моча содержит минимальное количество билирубина и уробилина, которое не может быть обнаружено обычными качественными пробами. Увеличение выделения билирубина явление патологическое и называется билирубинурией. В мочу выходит только прямой билирубин, непрямой не может пройти через здоровый почечный фильтр.
Билирубинурия возникает в результате затруднения прохождения желчных пигментов в тонкий кишечник. Подобное состояние имеет место при паренхиматозной и подпеченочной желтухах. При гемолитической желтухе билирубинурия не наблюдается, так как непрямой билирубин не проходит через неповрежденный почечный фильтр.
Принцип образования уробилиногена в моче
КАЧЕСТВЕННЫЕ ПРОБЫ НА БИЛИРУБИН
Большинство качественных проб на билирубин основано на его окислении йодом, кислотой и т.д. в биливердин зеленого цвета.
Йодная проба Розина.В качестве окислителя используют раствор Люголя (1 г йода, 2 г йода калия, 300 мл дистиллированной воды) или 1 %-ный раствор йода. На 4-5 мл мочи наслаивают один из указанных реактивов. При наличии билирубина на границе двух жидкостей появляется зеленое окно биливердина.
Проба Гаррисона— одна из самых чувствительных на обнаружение билирубина; ею можно пользоваться в сомнительных случаях.
Ход определения: ленту фильтровальной бумаги, предварительно пропитанную раствором хлорида бария и затем высушенную, погружают в мочу на 1 минуту, сушат, после чего наносят на нее 2 капли реактива Фуше (25 г ТХУК, 100 мл дистиллированной, воды, 10 мл — 10 %-ного раствора полуторахлористого железа). При положительной реакции появляется зелено-синее пятно на бумаге.
Существует ряд сухих проб на билирубин в виде таблеток, которые могут быть использованы для качественного и полуколичественного определения билирубина в моче.
а) 15%-ный раствор хлорида бария;
б) 100 мл 25 %-ного раствора ТХУК;
в) 10 мл 10 %-ного раствора хлорного железа (раствор Фуше).
Ход определения: к 10-12 мл мочи прибавляют объема хлорида бария, смешивают, фильтруют. Хлорид бария осаждает билирубин. На вынутый из воронки фильтр наносят 2-3 капли раствора Фуше. При положительной реакции на фильтровальной бумаге появляются зелено-синие или голубоватые пятна.
УРОБИЛИНОВЫЕ ТЕЛА
Уробилиновые тела являются производными уробилина. Они представляют собой в основном уробилиноген и стеркобилиноген.
Согласно современным представлениям образование уробилиногена из прямого билирубина происходит в верхних отделах кишечника (тонкого и начале толстого) под давлением кишечных бактерий (в желчных путях и желчном пузыре под давлением клеточных дегидрогеназ).
Часть уробилина резорбируется через кишечную стенку и с кровью портальной системы переносится в печень, где расщепляется полностью, при
этом в общий кровоток, и, следовательно, в мочу уробилиноген не попадет.
Нерезервированный уробилиноген подвергается дальнейшему воздействию
кишечных бактерий, превращаясь в стеркобилиноген. Небольшая часть стеркобилиногена резервируется и через портальную вену попадает в печень,
где расщепляется подобно уробилиногену.
Часть стеркобилиногена через геморроидальные вены всасывается в общий кровоток и почками выделяется в мочу; Наибольшая часть в нижних отделах
тонкого кишечника превращается в стеркобилин и выводится с калом, являясь его нормальным пигментом
ПРОБА НЕЙБАУЕРА
Принцип. Проба основана на реакции между уробилиногеном и раствором Эрлиха, при которой образуются красного цвета конденсационные соединения.
Реактивы. Реактив Эрлиха: 2 г парадиметиламинобензальдегида и 100 мл 20%-ного раствора соляной кислоты.
Ход определения: к нескольким миллилитрам свежей мочи добавить несколько капель реактива Эрлиха. При окрашивании жидкости в красный цвет в первые 30 сек. проба положительная и означает увеличение количества уробилиногена. Отсутствие красной окраски после стояния пробы говорит о нормальном количестве или отсутствии уробилиногена.
Проба Флоранса
а) концентрированная серная кислота;
в) концентрированная соляная кислота.
Ход определени: 8-10 мл мочи подкисляют несколькими каплями серной кислоты, взбалтывают и приливают несколько мл эфира. Закрывают пробирку плотно пробкой и осторожно смешивают жидкости. В другую пробирку наливают 2-3 мл концентрированной соляной кислоты. Пипеткой отсасывают из первой пробирки эфирный слой и наслаивают его на соляную кислоту. На границе двух жидкостей в присутствии уробилина образуется розовое кольцо, окраска которого может быть различной интенсивности.
Проба Флоранса дает положительный результат и в норме. Поэтому ее применяют для выявления полного отсутствия уробилина в моче.
Проба Богомолова
а) насыщенный раствор сульфата меди;
б) концентрированная соляная кислота;
Ход определения: к 10-15 мл мочи прибавляют 2-3 мл насыщенного раствора сульфата меди. Если появляется помутнение от образовавшейся гидроокиси меди, то прибавляют несколько капель соляной кислоты до прояснения раствора. Через 5 минут прибавляют 3 мл хлороформа и взбалтывают. При наличии уробилиновых тел хлороформ окрашивается в розово-красный цвет.
источник