Меню Рубрики

Анализ мочи на лептоспироз методом пцр

Цель исследования: выявление РНК патогенных спирохет Leptospira interrogans,L.alexanderi L.borgpetersenii, L.kirschneri, L.noguchii, L.santarosai. L. Weiliiв в патологическом материале методом полимеразной цепной реакции

Предназначено для диагностики у:
— собак
— кошек
— лошадей
— МРС, КРС
— свиней

Опасность для человеческого здоровья:
Зооноз. Зараженные собаки являются резервуаром инфекции и выделяют их в окружающую среду. Заражение может происходить при несоблюдении правил гигиены через инфицированную воду, мочу

Спецификация .
Лептоспироз(Leptospirosis) – инфекционная природноочаговая болезнь многих видов животных (болеют свиньи, крупный и мелкий рогатый скот, лошади, собаки, верблюды, пушные звери, мелкие дикие млекопитающие, человек), характеризующаяся кратковременной лихорадкой, анемией, желтухой, гемоглобинурией, некрозами слизистых оболочек и кожи, атонией желудочно-кишечного тракта, абортами, рождением нежизнеспособного потомсства. Инкубационный период от 3-х до 7-ми дней в зависимости от серовара и особенностей специфического иммунитета. Обнаружение лептоспир по крови возможно только в первые 5-7 дней после появления клинических признаков. Выделение лептоспир с мочой начинается на 7-10 день после проявления клинических симптомов и продолжается месяцами. Лептоспиры могут вызывать у собак хроническое поражение почек спустя месяцы и годы после острого повреждения почек.

Механизмы патогенеза лептоспироза у собак:
Лептоспиры проникают в организм собаки через слизистую оболочку или поврежденную кожу. В воротах инфекции обычно не развивается специфических поражений. Из них возбудитель в последующие 4-11дн проникает в кровь, вызывая септицемию. Клинически лептоспиремия проявляется лихорадкой, кратковременной гемолитической анемией, лейкоцитозом, гемоглобинурией и альбуминурией.
Продолжительность бактериемии благодаря усиливающемуся иммунному ответу обычно составляет 4-5 дн. Элиминация бактерий из крови сопровождается прекращением лихорадки. Во время септицемии ЛС разносятся кровью по всему организму, проявляя при этом (в зависимости от серовара) более или менее выраженный тропизм к печени, почкам, плаценте и плодам.
Благодаря высокой подвижности и небольшой толщине они избегают фагоцитоза ретикулоэндотелиальными клетками печени и проникают через эндотелиальную выстилку синусоидов, достигая пространства между клетками паренхимы (70). В печени эти сприрохеты активно размножаются, вызывая паренхиматозное воспаление с последующим включением основных патогенетических механизмов гепатита, в т.ч. характерной для этой формы лептоспироза желтухи. Поражения печени вызваны механическим повреждением гепатоцитов ЛС, а также действием их токсинов. Помимо нарушения динамики оттока из воспаленной печени желчи определенную роль в патогенезе желтухи играет диссеминированный геморрагический процесс, происходящий в результате воздействия на эритроциты гемолизинов возбудителя.
Пути заражения
Заражение собак происходит в основном горизонтальным путем — через пищеварительный тракт при приеме корма и воды, контаминированных ЛС, аэрозольно и, реже половым путем. Возможно также и вертикальное распространение инфекции от инфицированной суки — через плаценту плодам и через молоко подсосным щенкам. ЛС могут проникать в организм не только через слизистые оболочки, но и через поврежденную кожу.
ептоспироз собак может протекать безсимптомно или проявляться клинически в желтушной или безжелтушной формах. Их тяжесть зависит от возраста и иммунного статуса инфицированного животного, вирулентности вызвашего инфекцию серовара ЛС, заражающей дозы и пути заражения.
Симптомы
При типичном течении лептоспироз имеет 2-фазный характер: вначале развивается симптоматика, связанная с бактериемией, а на второй фазе на первый план выступают клинические признаки поражения определенных органов.
В подострых случаях собака может переболевать без появления характерной симптоматики. При таком течении инфекции у заболевшей собаки снижается аппетит, развивается субфебрильная температурная реакция (38,5-40 C), появляются мышечные боли, слабость, угнетение, иногда конъюнктивит, признаки анемии, а также клинические признаки описанных ниже желтушной или безжелтушной форм лептоспироза, но в стертом виде.
При обеих формах болезни у щенных сук инфекция может вызвать аборт.
При лептоспирозе у собак выявляют ряд гематологических изменений: анемию средней тяжести, лейкопению (на лептоспиремийной стадии инфекции), которая сменяется лейкоцитозом со сдвигом влево, тромбоцитопению, гипербиллирубинемию (3-50 мг/дцл), гиперазотемию, гиперкреатинемию (3-20 мг/дцл), гиперфосфатемию, а также повышение концентрации амилазы и липазы. Увеличение активности в сыворотке крови печеночных ферментов (аланинтрансферазы и аспартаттрансферазы ), а также при тяжелом поражении почек и/или печени — повышение концентрации в крови азота мочевины и креатинина свыше 25 и 2 мг/дцл.
Вакцина от лептоспироза относится к необязательным вакцинациям. Кратность ревакцинации 1 год.

Лептоспироз у кошек:
Явная клиническая картина клинического лептоспироза у кошек встречаются РЕДКО.
В организм кошки лептоспиры проникают с грязной водой, пищей, грызунами. Именно грызуны являются очень частыми переносчиками этого заболевания в природе. Основной мерой профилактики лептоспироза у кошек, это борьба с грызунами.
Скрытый период заболевания у кошек длится от двух до десяти суток. Заболевание может проходить в острой, подострой и хронической форме. Под действием возбудителя нарушается работа почек, органов пищеварения, сердца и сосудов. В первые дни заболевания у животного резко увеличивается температура тела, кошка лежит, отказывается от еды, может наблюдаться рвота, лапы подрагивают. Далее на слизистой оболочке рта образуются покраснения, перерастающие в язвы, из ротовой полости исходит неприятный запах, язвы часто кровоточат. Кошка теряет массу, слабеет, у нее хуже работает сердце. Если заболевание протекает не в острой форме, то все симптомы заболевания появляются постепенно, кожные покровы чаще всего не затрагиваются. Изменения в работе органов пищеварения наблюдаются время от времени. Если у домашней кошки появляются симптомы, напоминающие лептоспироз, ее следует обязательно показать ветеринару. Следует всячески предотвращать контакт домашней кошки с животными, зараженными данным заболеванием.

Требования к пробе: — Для исследования используют: 1. моча, после 7-10 дней от начала проявления клинических симптомов возможно исследование мочи на лептоспироз методом ПЦР. 2. паренхиматозные органы с очагами поражения (мозг, легкие, почки (обе)), 3. абортированный плод. 4. Кровь с К3ЭДТА В первые 5-7 дней заболевания на фоне лихорадки берется Кровь животного с К3ЭДТА. В остальных случаях, при настоянии и ответственности врача или владельца, с внесением соответствующей записи в комментарии заявки. После 5-7 дней заболевания Кровь животного с К3ЭДТА настоятельно рекомендуется исследовать методом ИФА на наличие АТ к лептоспирозу. — кровь с гепарином не подходит для исследований методом ПЦР! — смешанные пробы запрещены в связи с особенностями технологии проведения анализа! Хранение образцов: Материал для анализов доставляется в лабораторию в день взятия или на следующий день, сохраняя их при +2-+8⁰С. Допускается хранение секционного материала (ткани органов) или мочи в течение 1 мес при температуре не выше -16⁰С.

ВАЖНО! 1. Вакцинация инактивированными вакцинами клинически здоровых собак не приводит, как правило, к ложноположительным реакциям. 2. Субклинически инфицированные собаки могут выделять с мочой лептоспиры, значение положительного результата в этиологии заболевания в этом случае определяет ветеринарный врач. ВАЖНО! 1. Чтобы избежать ложноположительных результатов необходимо выдержать 2-3 недели после лечения перед сдачей анализа. 2. Положительный результат при отсутствии клинической картины заболевания может означать бактерио-/вирусоносительство.

источник

Лептоспироз – это зоонозная бактериальная инфекция, которую вызывают спирохеты Icterohaemorrhagiae. Идентифицировано более 230 видов бактерий рода Icterohaemorrhagiae, некоторые из которых являются патогенными для человека, а другие – нет.

Носителями лептоспироза, как правило, являются домашние животные и грызуны. Люди заражаются этой болезнью в результате контакта с инфицированной землей, водой или через контакт с выделениями зараженных животных. Бактерии проникают в организм через поврежденную кожу.

Чаще всего, течение болезни очень мягкое, преобладают неспецифические симптомы, которые через некоторое время сами исчезают. Однако, в тяжелых случаях болезнь может привести к серьезному повреждению почек и печени (так называемый, синдром Вейла), если его не лечить, может привести к смерти больного.

При столь тяжелых формах необходимо проведение точной диагностики и раннее внедрение соответствующего лечения. Среди доступных методов эффективной и точной диагностики, хотя и сравнительно дорогостоящий, является обнаружение генетического материала бактерий Icterohaemorrhagiae с помощью цепной реакции полимеразы (ПЦР).

Диагноз заражения бактериями рода Icterohaemorrhagiae довольно сложна, и, чаще всего, требует применения нескольких методов исследования. Прежде всего, необходимо учитывать характерный эпидемический анамнез, а именно, работа с животными, работа в очистных сооружениях сточных вод, купание в озерах и прудах.

Клинические проявления не являются, к сожалению, характерными для этого заболевания. В лабораторных исследованиях, мы можем наблюдать увеличение СОЭ и лейкоцитоз, повреждения печени, повышение активности АСТ и АЛТ, повреждение почек, повышение концентрации мочевины и креатинина в крови, а также протеинурию. Можно попробовать разглядеть спирохеты через микроскоп, но это довольно сложно. Большее значение имеют попытки изоляции и культивирования спирохет.

Очень полезными в диагностике лептоспироза являются серологические исследования, которые, главным образом, основываются на обнаружении в сыворотке крови больного специфических антител класса IgM и IgG, направленными против бактерий Icterohaemorrhagiae.

Однако, лучшим методом диагностики, хотя всё ещё редко используемым из-за цены, является поиск ДНК бактерий Icterohaemorrhagiae в образце крови или мочи больного с использованием цепной реакции полимеразы.

Обнаружение в контрольной пробе, взятой от пациента, генетического материала бактерий Icterohaemorrhagiae, позволяет диагностировать лептоспироз и как можно скорее начать лечение болезни.

Преимуществом метода ПЦР является высокая скорость проведения исследования, результат можно получить уже через несколько часов. Кроме того, его преимущество, в отличие от серологических исследований, заключается в том, что позволяет обнаружить присутствие бактерий уже в короткий промежуток времени после заражения, в то время как антитела выявляются с помощью серологических тестов не ранее, чем, примерно, через семь дней после заражения.

Кроме того, метод ПЦР позволяет дифференцировать патогенные и безопасные для человека виды лептоспир. Ещё одним преимуществом является тот факт, что чувствительность, специфичность и скорость анализ ПЦР позволяет отказаться от трудоемкого метода культивирования бактерий, что позволяет быстро и уверенно поставить диагноз.

Метод ПЦР работает даже у лиц, получавших ранее антибиотики, у которых разведение спирохет из загруженного материала значительно затруднено.

источник

Выявление возбудителя лептоспироза (Leptospira) – инфекционного заболевания, которому подвержены многие животные (в том числе собаки, кошки, домашний скот, крысы) и которое может передаваться человеку. Распространяясь с мочой и калом, микроскопического размера лептоспиры поражают органы и ткани, отравляя организм продуктами своей жизнедеятельности.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Общая информация об исследовании

Начиная со второй недели заболевания лептоспиры накапливаются преимущественно в извитых почечных канальцах и исчезают из крови и других тканей. Такая избирательная концентрация в эпителии и межклеточном пространстве почечной ткани приводит к тяжелым повреждениям канальцев почек и нарушению мочеобразования, а в тяжелых случаях вызывает анурию (отсутствие мочеиспускания) и уремию (накопление в крови токсических продуктов азотистого обмена, нарушение концентрации электролитов крови и др.).

При персистенции лептоспир в почках признаков острой инфекции, как правило, нет, заболевание часто протекает в латентной форме.

Решающими для подтверждения диагноза «лептоспироз» в любой фазе заболевания, в том числе и на более поздних сроках инфекционного процесса, являются результаты лабораторных исследований: бактериологического (посева), серологического (определения титров специфических антител в сыворотке крови), молекулярно-генетического (определения ДНК лептоспир методом ПЦР).

Недостатком бактериологического метода является длительность проведения исследования из-за медленного роста лептоспир на питательных средах.

Серологическое исследование теряет свою значимость после 19-20-го дня болезни в связи с постепенным снижением титра сывороточных антител вследствие прекращения циркуляции лептоспир в крови. Кроме того, при тяжелом течении лептоспироза, особенно на фоне интенсивной терапии антибактериальными препаратами, антитела могут выявляться лишь спустя 2-3 месяца от начала болезни.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это молекулярно-генетический метод исследования, в ходе которого выявляется генетический материал (ДНК) лептоспиры в образце биоматериала. Методу свойственна высокая специфичность (100 %), чувствительность (от 10 до 1000 копий ДНК в пробе) и высокая диагностическая эффективность, даже на фоне проводимого лечения антибактериальными препаратами.

Одним из основных достоинств ПЦР является то, что она позволяет выявить возбудителя даже при условии присутствия последнего в организме в очень малых количествах.

Вместе с тем отрицательный результат ПЦР не должен быть основанием для прекращения диагностики, так как определить точно конкретную фазу заболевания не всегда возможно. Чувствительность лабораторной диагностики при лептоспирозах может быть значительно повышена за счет параллельного использования серологических тестов (определения титров антител в сыворотке крови) и метода ПЦР вне зависимости от фазы заболевания.

Для чего используется исследование?

  • Для диагностики лептоспироза.
  • Для дифференциальной диагностики лептоспироза с другими заболеваниями.

Когда назначается исследование?

  • При диагностике лептоспироза.
  • При подозрении на персистенцию лептоспир в почках.

Референсные значения: отрицательно.

Причины положительного результата:

Причины отрицательного результата:

  • период полного выздоровления, когда формируется стойкий иммунитет и лептоспиры в организме уже отсутствуют.

Что может влиять на результат?

  • Применение некоторых противовирусных препаратов – ингибиторов полимераз – иногда приводит к ложноотрицательному результату.



Кто назначает исследование?

Инфекционист, нефролог, уролог, терапевт, врач общей практики, хирург, реаниматолог.

источник

Цель занятия. Ознакомить студентов с методами лабораторной диагностики лептоспироза, кампилобактериоза и дизентерии свиней, биологическими свойствами возбудителей, биопрепара­тами.

Оборудование и материалы. Пробирки с культурой лептоспир, предметные и покровные стекла, стерильные пастеровские пи­петки, мерные пипетки на 1. 2мл, резиновые груши, спирт, микроскопы с темнопольными конденсорами, осветители ОИ-19, пробирки со стерильной дистиллированной водой и физиологи­ческим раствором, пластины из плексигласа с лунками или чис­тые пробирки в штативах, лептоспирозные агглютинирующие сыворотки, антигены для диагностики лептоспироза в РМА, для демонстрации — пробирки с культурой лептоспир (L.bijlexa), таблицы, мазки для люминесцентной микроскопии, МЛ-2, нефлуоресцирующее масло, культуры кампилобактерий в полужид­кой среде, среде Китта—Тароцци и на плотной среде, неокра­шенные мазки с кампилобактериями, таблицы, биопрепараты.

Лептоспироз. Инфекционное природно-очаговое заболевание животных — свиней, крупного рогатого скота, лошадей, овец, коз, оленей, собак, верблюдов, пушных зверей, грызунов, сумчатых и др. Болеет и человек. Птицы к лептоспирозу невосприим­чивы.

У животных болезнь протекает, как правило, бессимптомно, типичные клинические проявления: кратковременная лихорадка, желтуха, геморрагия, гемоглобинурия, аборты.

Возбудитель лептоспироза отнесен к роду Leptospira, который включает в себя два вида: L. interrogans— патогенные лептоспиры и L. biflexa — лептоспиры, обитающие во влажной почве и пре­сных поверхностных водах. Вид патогенных лептоспир представ­лен 183 сероварами, которые по степени антигенного родства объединены в 25 серологических групп. Основными возбудителя­ми лептоспироза у сельскохозяйственных животных считают лептоспиры серогрупп Canicola, Grippotyphosa, Hebdomadis, Pomona, Tarassowi, Icterohaemorrhagiae.

Лабораторная диагностика лептоспироза основана на резуль­татах бактериологического и серологических исследований.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой и люминесцентной микроскопии, выделение чи­стой культуры посевом на питательные среды и методом биопробы и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим серологическим и патогенным свойствам. Материал для исследования. Кровь берут в период лихорадки на 1. 7-е сутки болезни; мочу собирают при естественном мо­чеиспускании в стерильные пробирки. У коров и свиноматок допустимо брать мочу катетером. Абортированный плод дос­тавляют в лабораторию целиком или берут от него желудок с содержимым, сердце, мочевой пузырь, паренхиматозные орга­ны. От трупов крупных животных направляют на исследование сердце, кусочки паренхиматозных органов, почку целиком, транссудат из грудной и брюшной полостей, перикардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым, спинномозговую жидкость. Трупы мелких животных доставляют в лабораторию целиком.

Пробы материала должны быть исследованы в летнее время в течение 6ч с момента взятия и 10. 12ч при хранении материала в охлажденном состоянии; мочу исследуют при температуре 30. 40°С в течение 3 ч, при 25. 30 °С — 4. 5 ч, при 20. 25 °С-6. 8 ч, при 16. 20°С — в течение 10. 12 ч с момента взятия.

Для бактериологического исследования материал предвари­тельно следует подготовить: мочу центрифугируют (при 10 000. 15 000 мин -1 30 мин), исследуют осадок; из проб органов готовят суспензию в стерильном физиологическом растворе, ис­следуют в нативном состоянии или после центрифугирования.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Лептоспиры разных сероваров не различаются по морфологическим и культу-ральным признакам. Длина лептоспир колеблется от 3 до 30 мкм и более, в среднем 7. 15 мкм, ширина 0,06. 0,15 мкм. Лептоспи­ры — грамотрицательные бактерии. Поскольку они плохо вос­принимают окраску, их обычно исследуют в неокрашенном со­стоянии. Готовят препарат «раздавленная капля» и изучают мето­дом темнопольной микроскопии при увеличении 40 x 7. 10 или 20 х 1,5 х 10, а для более детального изучения — при увеличении 40×10. 15 или 40 x 1,5 x 10. В каждой капле просматривают не менее 50 полей зрения. Лептоспиры представляют собой спира­левидные тонкие серебристые нити, концы которых — один или оба — загнуты в виде крючков (рис. 109).

Лептоспиры подвижны. Формы движения: вращательное, прямолинейное, поступательное с одновременным вращением вокруг собственной оси и круговое.

Для люминесцентной микроскопии готовят мазки из того же материала и обрабатывают их флуоресцирующим глобулином для диагностики лептоспироза.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Лептоспиры — факультативные анаэробы, температурный оптимум 28. 30°С. Для получения культуры лептоспир исследуемый
материал высевают пастеровской пипеткой по три — пять капель в 5. 7 пробирок со специальной питательной жидкой или полужидкой средой. Посевы культивируют при 28. 30 °С в течение трех месяцев. Обыч­но рост лептоспир появляется в течение 7. 20 сут, иногда их обнаруживают на 3. 5-е сутки или через 1. 2мес и очень редко — через 2,5. З мес культивирова­ния.

Для выявления роста лептоспир через 3, 5, 7, 10 сут и далее каждые 5 сут культивирования из всех пробирок готовят препа­рат «раздавленная капля» для исследования методом темнопольной микроскопии.

Макроскопически рост лептоспир выражен слабо. При доста­точном накоплении лептоспир после встряхивания пробирки с культурой в среде в проходящем свете заметны муаровые волны, а в спокойном состоянии отмечают легкую опалесценцию. Нали­чие пленки, осадка, помутнения среды свидетельствуют о при­сутствии посторонней микрофлоры, а полная прозрачность сре­ды — об отсутствии роста лептоспир.

Для культивирования лептоспир используют следующие пита­тельные среды.

Среда Ферворта—Вольфа (в модификации С. И. Тарасова): к 900 мл дистиллированной воды добавляют 0,5 г хлорида натрия, 1 г пептона (Дифко), 100 мл маточного раствора фосфатного буфера рН 7,2. 7,4. Смесь автоклавируют в колбе при 120 ºС 30 мин. На следующий день дважды фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 мл и вновь автоклавируют при 120 °С 30 мин. В пробирки добавляют по 0,5 мл кроличьей сыворотки и прогревают среду на водяной бане при 56. 58 ºС 30 мин.

Среда Любашенко: нехлорированную водопроводную (или ко­лодезную, речную) воду, профильтрованную через бумажный фильтр, стерилизуют в автоклаве при 1 атм 30 мин, охлаждают, устанавливают рН 7,3. 7,4, добавляют 5 % кроличьей или барань­ей сыворотки, прогретой при 56 ºС в течение 1 ч. Затем среду пропускают через фильтрующие пластины СФ в фильтре Зейтца и асептически разливают в пробирки. Для контроля стерильнос­ти среды пробирки помещают в термостат при 37 °С на 48 ч.

Можно применять и другие питательные cpeды. На плотных средах (Кокса, ВГНКИ и др.) лептоспиры образуют мелкие коло­нии в виде прозрачных дисков диаметром до 1. 2см с хорошо очерченными или размытыми краями или в виде матовых точек диаметром 1. 2 мм.

Для серологической идентификации выделенную чистую культуру исследуют в РМА с групповыми агглютинирующими лептоспирозными сыворотками, предварительно разведенными стерильным физиологическим раствором в соотношении 1 : 50, 1 : 500, 1 : 1000, 1 : 2000, 1 : 4000, 1 : 8000, 1 : 16 000 и 1 : 32 000. Ре­акцию ставят в агглютинационных пластинах (или в пробирках), смешивая 0,1мл сыворотки каждого разведения с 0,1мл выде­ленной (типируемой) 5-, 7-, 10-суточной культуры лептоспир с накоплением 70. 100 подвижных микробных клеток. Разведения сыворотки последовательно удваиваются. Пластины (пробирки) выдерживают в термостате при 37 °С 1 ч, затем учитывают ре­зультаты — из каждой лунки (начиная с наибольшего разведе­ния) готовят препараты «раздавленная капля», которые исследу­ют методом темнопольной микроскопии. Реакцию оценивают в крестах: (++++) — 100%-я агглютинация: склеивание лептоспир с образованием скоплений в виде «паучков» (рис. 110), содержа­щих от нескольких клеток до нескольких десятков и даже сотен; свободные концы клеток сохраняют подвижность; (+++) — аг­глютинировано 75% лептоспир; (++) —50%; (+) — агглютини­ровано 25%; (-) —агглютинация отсутствует. РМА считают по­ложительной, если она выражена на четыре, три и два креста. Исследуемую культуру относят к той серологической группе лептоспир, с сывороткой которой она дает реакцию на два. четыре креста до 50. 100 % ее титра, указанного на этикетке.

Рис. 110. Реакция микроагглютинации: «паучки» из склеившихся лептоспир

Биопроба. Метод используют для выделения культуры возбу-дителя из исследуемого материала, так как посевом на питательные среды изолировать лептоспиры удается не всегда, а также для установления патогенных свойств чистых культур. Биопробу ставят на золотистых хомячках 20. 30-дневного возраста, кроль­чатах-сосунках в возрасте 10. 20 дней и 3. 5-недельных морских свинках. Исследуемый материал (кровь, моча, суспензия из паренхиматозных органов или аборти­рованного плода и др.) вводят подкожно или внутрибрюшинно хомякам от 0,3. 0,5 до 1 мл, крольчатам — 2. 3 мл. На каждую пробу материала берут по 2 животных, одного из которых убива­ют на 4. 5-й день в период подъема температуры, другого, если животное не погибает,— на 14. 16-й день после заражения. Кровь последнего исследуют в реакции микроагглютинации (РМА), начиная с разведения 1: 10, с лептоспирами 13 серологи­ческих групп.

Высевы из органов убитых и павших животных (сердца, пече­ни и почек) делают в 2. 3 пробирки из каждого органа. Транссу­дат из грудной и брюшной полостей, перикардиальную жид­кость, содержимое мочевого пузыря исследуют методом темнопольной микроскопии.

Вирулентность выделенной культуры определяют на золотис­тых хомячках или крольчатах, которых заражают внутрибрюшин­но 5. 7-дневной культурой, содержащей 70. 100 лептоспир в поле зрения микроскопа. Высоковирулентные культуры лептоспир вы­зывают гибель золотистых хомячков в дозе менее 0,1 мл, средней вирулентности — 0,2. 0,4 мл, слабовирулентные — 0,5. 1 мл.

Серологическая диагностика включает в себя постановку реакции микроагглютинации (в качестве антагена используют живые культуры лептоспир определенных серологи­ческих групп) и реакции макроагглютинации (применяют кон­центрированную взвесь лептоспир).

В реакции микроагглютинации сыворотки крови исследуют в разведениях 1:50, 1:250, 1:1250.

Учет реакции: каплю из каждой лунки исследуют методом темнопольной микроскопии при увеличении 20×10 или 20x7x1,5. Агглютинация проявляется в образовании «паучков», содержащих от 3. 5 до нескольких десятков лептоспир.

Специфические антитела в сыворотке крови животных в титре 1:50. 1:100 и выше свидетельствуют об инфицированности дан­ной особи лептоспирами и возможном лептоспироносительстве.

По результатам серологических исследований диагноз на лептоспироз считают установленным, а хозяйство неблагополучным по лептоспирозу, если специфические антитела обнаружены в сыворотке крови при однократном исследовании в РМА в титре 1:100 и выше более чем у 25 % обследованных животных, а также при нарастании титра антител в 5 раз и более при повторном ис­следовании через 7. 10 дней сыворотки крови в РМА или при обнаружении антител у ранее нереагировавших животных.

Сыворотки животных, дающие положительную реакцию мик­роагглютинации в равных титрах с лептоспирами нескольких се­рологических групп или дающие наиболее высокий титр с лептоспирами, ранее неизвестными в качестве возбудителя лепто­спироза сельскохозяйственных животных, исследуют в реакции иммуноадсорбции.

Для постановки реакции иммуноадсорбции все штаммы леп­тоспир, с которыми данная сыворотка дала положительную реак­цию микроагглютинации, выращивают в 0,5. 1-литровых флако­нах в течение 5. 7 сут. Затем культуры лептоспир осаждают цент­рифугированием при

10 000 мин -1 30 мин. Надосадочную жид­кость сливают, а осадок суспендируют в 0,9 мл питательной среды или физиологического раствора. 0,1 мл исследуемой сыво­ротки смешивают с 0,9 мл концентрированного антигена и вы­держивают в течение 48 ч при 1. 5 ºС. Отделяют сыворотку цент­рифугированием при 10 000 мин -1 30 мин. Адсорбированную сы­воротку проверяют в реакции микроагглютинации на наличие остаточных антител к штамму-адсорбенту, а затем исследуют с лептоспирами всех групп, с которыми сыворотка дала положи­тельную реакцию до адсорбции. В результате адсорбции лепто­спиры, являющиеся возбудителем, удаляют из сыворотки антите­ла к лептоспирам всех других серологических групп; гетерологичные типы лептоспир не адсорбируют антитела к штамму-возбу­дителю.

Реакцию макроагглютинации ставят на стекле, на которое на­носят каплю исследуемой сыворотки крови, разведенной в соот­ношении 1 : 100, и равное количество антигена, компоненты пе­ремешивают, результат учитывают в проходящем свете. Положи­тельным результатом считают агглютинацию интенсивностью на два креста и выше, сомнительным — на один крест.

Антитела в крови можно обнаружить также методом иммуноферментного анализа.

Биопрепараты. Депонированная поливалентная вакцина против лептоспироза животных ВГНКИ содержит шесть штам­мов лептоспир с наиболее выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, относящихся к серогруппам Pomona, Tarassovi, Icterohaemorrhagiae, Canikola, Grippotyphosa, Hebdomadis. Выращенные культуры лептоспир сливают в общую емкость, инактивируют, концентрируют, добавляют адъювант. Вакцину проверяют на стерильность, безвредность и актив­ность (на кроликах).

Поливалентную вакцину против лептоспироза сельскохозяй­ственных и промысловых животных готовят из 7. 10-дневной культуры лептоспир, консервированных 5%-м раствором карбо­ловой кислоты до конечного содержания фенола в вакцине 0,5 %. Вакцину контролируют на стерильность, безвредность и активность (на кроликах).

Поливалентную сыворотку против лептоспироза сельскохо­зяйственных и промысловых животных получают методом ги­периммунизации волов-продуцентов. Антигены для гипериммунизации готовят из производственных штаммов шести серогрупп. Сыворотку консервируют 5%-м раствором фенола, прове­ряют на стерильность, безвредность (на белых мышах и морских свинках) и активность (в реакции микроагглютинации в разведе­ниях от 1:1000 до 1 : 100 000).

Антигены для диагностики лептоспироза реакцией макроаг­глютинации готовят из эталонных штаммов лептоспир. Выра­щенные культуры инактивируют формалином, концентрируют, расфасовывают по ампулам и подвергают сублимационному вы­сушиванию. Антигены контролируют на растворимость в физио­логическом растворе, на концентрацию. Активность антигена проверяют в РА на стекле с гомологичной лептоспирозной аг­глютинирующей сывороткой.

Групповые агглютинирующие лептоспирозные сыворотки предназначены для определения серогрупповой принадлежности лептоспир, выделенных из патологического материала, а также лептоспир, используемых в качестве антигенов в реакции микро­агглютинации при серологической диагностике лептоспироза.

Кампилобактериоз (вибриоз). Хроническое заболевание круп­ного рогатого скота, овец, свиней, которое проявляется аборта­ми, задержанием последа, временным бесплодием, вагинитами, метритами, рождением нежизнеспособного потомства. У кур возбудитель вызывает падеж цыплят, снижение яйценоскости несушек и прироста массы у бройлеров, у людей — гастроэнтери­ты, бактериемию, кожные поражения.

Возбудитель кампилобактериоза — бактерии семейства Spirillaceae, род Campylobacter. Основные виды: С. fetus (подвиды С. fetus venerealis и С. fetus fetus), С. jejuni, С. sputorum (подвиды С. sputorum sputorum, С. sputorum bubulus, С. sputorum faecalis) и не­патогенный С. coli (табл. 33). С. fetus sb. fetus вызывает аборты у овец, крупного рогатого скота. С.fetus sb. veneralis — патогенен для крупного рогатого скота. С. jejuni вызывает аборты у овец, энтериты у телят, ягнят и других животных. С. mucosalis патоге­нен для свиней, его выделяют от животных с признаками некро­тического энтерита, локального илеита.

Лабораторная диагностика кампилобактериоза основана на ре­зультатах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии, выделение чистой культуры посе­вом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным, серологичес­ким свойствам.

Материал для исследования. В лабораторию направляют абор­тированный плод (целиком с плодными оболочками или от круп­ных плодов голову, желудок, легкие, печень); плаценту; слизь из шейки матки, взятую стерильно в первые 3. 4 дня после аборта или в период охоты; от быков-производителей — препуциальную слизь и секрет придаточных половых желез; от убитых с диагнос­тической целью животных — матку, влагалище, лимфоузлы тазо­вой области.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Представите­ли рода Campylobacter — грамотрицательные, полиморфные, тон­кие палочки, изогнутые в виде «крыла чайки», запятой, спирали с одним или несколькими завитками или S-образные. Средние размеры (0,5. 8) х (0,2. 0,8) мкм. Подвижны за счет одного по­лярного жгутика на одном или обоих концах клетки, движение винтообразное; спор и капсул не образуют (рис. 111).

В мазках из патологического материала кампилобактерии об­наруживают в виде «крыла чайки», запятой или S-образной фор­мы; от животных, подвергавшихся лечению, — в виде длинных спирилл, малоизвитых нитей и мелких кокковидных форм.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбуди­тель — микроаэрофил, температурный оптимум 37. 38 °С. Для получения культуры кампилобактерии используют полужидкие и плотные питательные среды: плотный 2. 3%-й МППА и полу­жидкий 0,2%-й мясо-печеночный пептонный агар (ПЖА), среду Китта—Тароцци без масла, агар Мартена, сафранино-железо-новобиоциновую (СЖН) среду. Для обогащения в питательные сре­ды добавляют 5. 10 % дефибринированной крови крупного рога­того скота, овец, кроликов или сыворотку крови лошади. Куль­тивируют в течение 6. 10 сут в микроаэрофильных условиях при замене 10. 15% воздуха оксидом углерода (IV). Контаминиро­ванный материал высевают на среду СЖН: полужидкий агар — 985 мл, 2%-й раствор сульфата железа — 5 мл, 0,5%-й водный ра­створ сафранина Т — 5 мл и 0,2%-й водный раствор новобиоци-на — 5 мл. Среду фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки и автоклавируют при 115°С 25 мин. Готовая к ис­пользованию среда должна быть розового цвета, рН 6,8. При культивировании на данной среде кампилобактерии ее цвет не изменяется, другой микрофлоры — приобретает ярко-желтую окраску.

Каждую пробу высевают на несколько чашек Петри, растирая шпателем по поверхности среды. Выросшие колонии пересевают на полужидкий кровяной, сывороточный агар или среду Китта— Тароцци для получения чистой культуры.

При первичном выделении на плотной среде кампилобакте­рии образуют через 3. 4 сут колонии: гладкие, бесцветные, диа­метром 1 мм или шероховатые, непрозрачные, белые или кремовые до 2 мм в диаметре, могут быть плоские, серые или свет­ло-коричневые с неровными краями, редко растут в виде тон­кого налета. На кровяном агаре гемолиза не дают. При росте на сывороточном бульоне дают слабое помутнение, иногда с обра­зованием незначительного рыхлого осадка, на полужидком ага­ре растут в виде серовато-голубого диска около поверхности среды.

У выделенных культур кампилобактерии изучают фермента­тивную активность, ростовые потребности и на основании полу­ченных данных идентифицируют их на уровне вида, подвида, биовара (см. табл. 33).

Для серологической идентификации кампилобактерии выпус­кают агглютинирующие и люминесцирующие сыворотки против С. fetus subsp. fetus (так называемый Первый тип), С. fetus subsp. venerealis (Второй тип), С. sputorum subsp. bubulus (Третий тип).

Для ориентировочной идентификации выделенных культур ставят РА на стекле, используя указанные сыворотки, разведен­ные 1:50.

Для окончательной серологической идентификации кампило­бактерии ставят пробирочную РА: готовят последовательные раз­ведения каждой из трех моноспецифических сывороток в 3%-м растворе хлорида натрия, содержащем 0,3 % формалина, — 1 : 25, 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200. Затем в каждую пробирку с указанными раз­ведениями моноспецифических сывороток добавляют по 0,5 мл исследуемой суспензии вибрионов (концентрация 1 • 10 9 ).

После внесения компонентов пробирки тщательно встряхива­ют и помещают в термостат при 37 ºС до следующего дня. Затем их выдерживают З. 4ч при комнатной температуре и учитывают результаты реакции.

При положительной реакции с моноспецифической сыворот­кой одного типа и отрицательной— с моноспецифическими сы­воротками остальных двух типов исследуемый штамм относят к тому типу, с которым получен положительный результат.

При получении положительной реакции с двумя моноспеци­фическими сыворотками (что может быть при выделении ати­пичных или диссоциированных штаммов) опыт повторяют с обеими моноспецифическими сыворотками, агглютинировавшими исследуемую суспензию вибрионов, применяя более высокие разведения, чтобы определить титр каждой сыворотки. Типовую принадлежность исследуемого штамма устанавливают по той мо­носпецифической сыворотке, которая агглютинирует микробную суспензию в более высоком титре.

Для идентификации возбудителей кампилобактериоза в реак­ции иммунофлуоресценции используют как чистые, так и сме­шанные культуры, выращенные на общепринятых питательных средах.

Биопроба. Нативным материалом или выделенной культурой заражают беременных морских свинок внутрибрюшинно или во влагалище с последующим исследованием абортированных плодов. Если в течение 10. 12 сут аборта не наступает, морских сви­нок убивают и исследуют содержимое полости матки и плоды. При необходимости биопробу ставят на беременных телках и ов­цах, заражая их подкожно или перорально. Животные абортиру­ют, при отсутствии аборта их убивают с диагностической целью.

Серологическая диагностика кампилобакте­риоза у коров основана на результатах реакции агглютинации с вагинальной слизью (РАВС), а у овец — РА с сывороткой крови.

Слизь берут марлевым тампоном, который помещают в про­бирку с 5 мл формалинизированного 3%-го раствора хлорида на­трия. Выдерживают при температуре 1. 4°С 12. 14ч. Тампон от­жимают, жидкость центрифугируют при 2500. 3000 мин -1 30 мин.

После центрифугирования реакцию ставят с экстрактом ваги­нальной слизи в четырех разведениях (табл. 34). Для приготовле­ния кампилобактериозного антигена исходную концентрирован­ную суспензию бактерий разводят физиологическим раствором, содержащим 0,3 % формалина, в соотношении 1 : 10.

Наряду с исследуемыми пробами материала ставят контроли антигена: 1) контроль антигена (проверка самоагглютинации): в пробирку наливают 0,5 мл антигена в рабочем разведении и до­бавляют 0,5 мл 3%-го формалинизированного раствора хлорида натрия; 2) контроль активности антигена: в каждую пробирку с разведенной агглютинирующей кампилобактериозной сывороткой Первого типа добавляют по 0,5 мл антигена; 3) контроль спе­цифичности антигена: в две пробирки, содержащие по 0,5 мл нормальной сыворотки в разведениях 1 : 100 и 1 : 200, добавляют по 0,5 мл антигена. Все пробирки встряхивают и далее поступают с ними так же, как с опытными.

Вначале учитывают результаты контроля антигена. Отрица­тельная реакция в первом и третьем контролях при положитель­ной во втором свидетельствует о правильности постановки реак­ции.

Учет результатов: 1) положительная — реакция хорошо выра­жена (на три-четыре креста) во всех пробирках или только в 1-й и 2-й; 2) сомнительная — агглютинация на один-два креста в 1-й и во 2-й пробирках; 3) отрицательная — отсутствие агглютинации во всех пробирках.

У больных овец для исследования берут сыворотку крови, раз­водят ее в 100, 200 и 400 раз. Результат считают положительным, если исследуемая сыворотка дает положительную реакцию агглютинации в разведении 1 : 200 и выше на четыре или три креста, со­мнительным — на четыре или три креста в разведении 1 :100 либо на два или один крест в разведении 1:200, отрицательным — если агглютинация отсутствует или ее оценивают не выше чем на два или один крест в разведении 1 : 100. Сыворотку овец, вакциниро­ванных против кампилобактериоза, серологически не исследуют.

Кроме реакции агглютинации сыворотку животных можно ис­следовать в РСК, реакции иммунофлуоресценции или реакции иммунной сорбции антител, меченных ферментами. Разработа­ны экспериментальные партии диагностикумов для выявления антител в РНГА, пригодные для диагностики кампилобактериозов животных и человека.

Биопрепараты. Эмульсинвакцина инактивированная против кампилобактериоза овец.

Кампилобактериозные агглютинирующие сыворотки готовят методом гипериммунизации кроликов суспензией живых микро­бов кампилобактерии. Полученные сыворотки после адсорбции групповых антител проверяют на активность, специфичность и стерильность.

Кампилобактериозный антиген представляет собой инактивированную 0,3%-м раствором формалина суспензию кампилобак­терии Первого типа (концентрация микробных клеток 10 10 /мл). Предназначен для диагностики кампилобактериоза у крупного рогатого скота.

Дизентерия свиней. Инфекционная болезнь. Характеризуется геморрагическим поносом и некротическим поражением толсто­го отдела-кишечника. Восприимчивы свиньи всех возрастов, но чаще болеет молодняк в возрасте 1. 6мес.

Возбудитель дизентерии свиней — спирохета Serpulina hyodysenteriae, род Serpulina.

Лабораторная диагностика дизентерии свиней основана на ре­зультатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии (основной метод), а также выделе­ние чистой культуры посевом на питательные среды и идентифи­кацию возбудителя по культурально-морфологическим и фер­ментативным свойствам.

Материал для исследования. Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют фекалии, для посмертной — слизистую оболочку большой ободочной кишки, которую соскабливают после удаления из кишечника содержимого и промывания водой. От трупов материал берут не позднее чем через 2 ч после гибели животного, материал должен быть исследован в течение 2. 4 ч, а при хранении на холоде — 6. 8 ч.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Поскольку культивирование возбудителя весьма трудоемко, микроскопичес­кое исследование — это основной метод диагностики, доступный практическим лабораториям. Поступивший материал исследуют методом темнопольной, фазово-контрастной или обычной све­товой микроскопии.

При темнопольной микроскопии препарат «раздавленная капля» исследуют в водной иммерсии с объективом х 40 и окуля­рами х 7 или х 10. Возбудитель в этом случае виден как спирале­видная клетка с 3. 12 правильными витками размером (7. 9) х (0,3. 0,4) мкм, движущаяся змеевидно-поступательно. При температуре 22 °С наблюдают изгибание и скользящее дви­жение клетки, а при 37. 42 ºС клетка движется поступательно. У большинства больных дизентерией свиней в препарате «раздав­ленная капля» в одном поле зрения обнаруживают 5. 10 спиро­хет и более. В окрашенных по Граму препаратах видны грамотрицательные извитые клетки со строением, типичным для спи­рохет. Клетки возбудителя хорошо окрашиваются по Романовс­кому—Гимзе, фуксином Пфейффера. Сходные по морфологии с Serpulina hyodysenteriae вибрионы, обитающие в кишечнике, от­личаются тем, что их клетка в 2. 4 раза толще, с тупыми конца­ми, движение вращательное вокруг длинной оси.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбуди­тель—строгий анаэроб, температурный оптимум 36. 38 ºС, при 25 и 30 °С не растет, рН 7,0. 7,2. Для первичной изоляции ис­пользуют селективные среды, например следующие.

Кровяной агар со спектомицином: к перевару Хоттингера до­бавляют 0,001 % резазурина (индикатор ОКВП), 0,5 % хлорида на­трия, 0,25 % глюкозы, 1 % пептона, 2 % агара, кипятят, пропуска­ют через среду азот или оксид углерода (IV) в течение 10. 15 мин, устанавливают рН 7,0. 7,2, вносят 0,05 % гидрохлорида цистеина. Среду автоклавируют при 110º С 30 мин, охлаждают до 40. 45°С, пропуская при этом через среду стерильный обескислороженный газ, после чего вносят 10% дефибринированной крови барана (или крупного рогатого скота) и 400 мкг/мл спектомицина. Среду разливают в атмосфере оксида углерода (IV).

Культивируют также в жидкой или полужидкой среде, содер­жащей сердечно-мозговую вытяжку и 10 % эмбриональной теля­чьей или кроличьей сыворотки. На кровяном агаре через 48. 96ч инкубирования при 38 °С вырастают плоские просвечивающие колонии диаметром 0,5. 3 мм с зоной бета-гемолиза. В полужид­ком сывороточном агаре возбудитель растет в виде беловатого диффузного облачка ближе к поверхности среды.

После изучения морфологии и культуральных свойств у выде­ленных бактерий исследуют ферментативную активность. Пато­генные для свиней культуры гидролизуют эскулин, не ферменти­руют фруктозу, утилизируют пируват, при сбраживании глюкозы образуют водород, углекислоту, ацетат, бутират; нитрат не вос­станавливают; растут на средах, содержащих 6,5 % хлорида на­трия, но не растут на средах с 1 % глицина.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Из чистой культуры лептоспир приготовить препараты «раз­давленная капля» и изучить их методом темнопольной микро­скопии.

2. Поставить РМА с культурой лептоспир и двумя сыворотка­ми различных антигенных групп в пробирках или на пластинах, учесть результат реакции, начиная с наибольшего разведения сыворотки. Из пробирки (лунки) каждого разведения сыворотки приготовить препарат «раздавленная капля» и изучить методом темнопольной микроскопии.

3. Окрасить мазки с кампилобактериями по Граму, промикроскопировать, зарисовать.

4. Изучить характер роста кампилобактерии на питательных средах и сделать заключение о морфологических и тинкториаль-ных свойствах возбудителя.

1. В чем заключаются особенности микроскопирования лептоспир?

2. Каковы морфологические и культуральные свойства лептоспир?

3. Каковы правила взятия патологического материала для исследования на лептоспироз?

4. Какие методы применяют для серологической диагностики лептоспироза?

5. Как ставят биопробу при лептоспирозе?

6. Каковы морфологические и тинкториальные свойства возбудителя кампилобактериоза?

7. В чем состоит серологическая диагностика кампилобактериоза?

8. Каковы морфологические особенности возбудителя дизентерии свиней?

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Да какие ж вы математики, если запаролиться нормально не можете. 8471 — | 7352 — или читать все.

193.124.117.139 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

источник

  • Главная
  • «ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, ДИАГНОСТИКА И ПРОФИЛАКТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЮДЕЙ ЛЕПТОСПИРОЗАМИ. 3.1. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 3.1.1128-02» (утв. Главным государственным санитарным врачом 03.07.2002)
Артикул Наименование услуг Цена, руб. Доступность экспресс Ед. измер. Материалы Заказать
017 Лептоспироз (ПЦР real time) 600 p (Время исполнения до 72 часов) 1 исслед. P U C
Наименование документ «ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, ДИАГНОСТИКА И ПРОФИЛАКТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЮДЕЙ ЛЕПТОСПИРОЗАМИ. 3.1. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 3.1.1128-02» (утв. Главным государственным санитарным врачом 03.07.2002)
Вид документа методические указания
Принявший орган главный государственный санитарный врач рф, минздрав рф
Номер документа МУ 3.1.1128-02
Дата принятия 01.01.1970
Дата редакции 03.07.2002
Дата регистрации в Минюсте 01.01.1970
Статус действует
Публикация
  • М., Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава РФ, 2002
Навигатор Примечания

6.2. Методы лабораторной диагностики лептоспирозов

Все больные с клиническим диагнозом «лептоспироз» или подозреваемые в заражении этой инфекцией в обязательном порядке должны быть обследованы лабораторными методами в соответствии с действующими рекомендациями. В связи с тем, что клиническая дифференциальная диагностика лептоспирозов представляет значительные трудности из-за полиморфизма клинической картины, результаты лабораторного обследования являются решающими для подтверждения лептоспирозной этиологии заболевания. Кроме того, установление серогруппы лептоспир, вызывавших заболевание, важно для проведения эпидемиологического обследования и целенаправленного поиска источника инфекции.

Современная лабораторная диагностика лептоспирозов основана на комплексе микробиологических и иммунологических методов, которые используются в различных комбинациях в зависимости от фазы заболевания и диагностических возможностей лаборатории.

Материалом для исследования являются кровь, моча, спинномозговая жидкость (СМЖ) больного, а при летальных исходах — паренхиматозные органы, грудной и брюшной транссудат.

В период лептоспиремии (1-я неделя болезни) для обнаружения лептоспир можно использовать микроскопию цитратной крови, посев крови, определение специфической ДНК лептоспир в крови методом ПЦР и заражение лабораторных животных.

С конца 1-й, начала 2-й недели в крови больных появляются специфические антитела, которые можно определить с помощью серологических реакций: микроагглютинации лептоспир (РМА), макроагглютинации на стекле (РА), иммуноферментного анализа и других методов.

Начиная со 2-й недели исследуют ликвор, с 3-й недели — мочу. В случае летальных исходов — паренхиматозные органы на присутствие лептоспир (микроскопия, посев, ПЦР, биопробы).

Лептоспиры плохо воспринимают окраску, поэтому все наблюдения проводят с живыми возбудителями в темном поле зрения микроскопа. С этой целью используют конденсор темного поля (например, ОИ-13) и осветитель ОИ-19 или другой системы.

Для выявления лептоспир методом микроскопии готовят препараты «раздавленная капля»: небольшую каплю исследуемого материала наносят пастеровской пипеткой на предметное стекло толщиной не более 1,0 — 1,1 мм и накрывают покровным стеклом толщиной 0,2 мм. На верхнюю линзу конденсора микроскопа помещают каплю дистиллированной воды.

Ввиду значительной величины микроба для исследования пользуются сухими системами: объектив — X40, окуляр — X10. Методом микроскопии исследуют цитратную кровь, мочу или ликвор больного, а также ткань паренхиматозных органов трупа.

Для приготовления цитратной крови смешивают 2 объема крови и один объем 1,5%-ного раствора лимоннокислого натрия; смесь отстаивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Микроскопируют надосадочную жидкость. Более эффективна подготовка материала способом двойного центрифугирования. На первом этапе проводят осаждение эритроцитов при 3000 об./мин. в течение 15 мин. На втором этапе полученную надосадочную жидкость центрифугируют 30 мин. при 10000 об./мин. Полученный осадок микроскопируют. Метод микроскопии цитратной крови — простой и доступный метод ранней диагностики лептоспироза. Однако следует помнить, что ввиду его

6 низкой чувствительности (10 клеток/мл) и кратковременности периода лептоспиремии (около 1 недели) отрицательные результаты микроскопии цитратной крови не дают основания для исключения диагноза лептоспироз. На фоне антибиотикотерапии диагностическая эффективность микроскопического метода резко снижается. Для подтверждения диагноза и определения серогруппы возбудителя кроме микроскопии необходимо проводить серологические и бактериологические исследования. Мочу (средняя порция) и ликвор исследуют в нативном состоянии или методом центрифугирования.

Микроскопия мочи используется также с целью прижизненного обследования животных (в т.ч. свиней, собак и др.) на лептоспироносительство.

Ткань паренхиматозных органов (печень, почки и др.) забирают пастеровской пипеткой и смешивают на предметном стекле с каплей физиологического раствора. Через 2 — 3 мин. частицы ткани удаляют, каплю накрывают покровным стеклом и тотчас микроскопируют. Взвесь не должна быть слишком густой. При исследовании почек взвесь готовят из коркового слоя органа, где локализуются лептоспиры.

Сходным образом готовят препараты для микроскопии из почек грызунов и других животных при их исследовании на лептоспироносительство.

При микроскопических исследованиях следует учитывать следующие возможные ошибки:

— наличие в препарате образований (псевдоспирохет), по морфологии отдаленно напоминающих лептоспир, — нитей фибрина, стромы эритроцитов и т.д. От лептоспир их отличает отсутствие концевых крючков и активной подвижности;

— наличие в препарате других извитых форм микроорганизмов, например спирилл, особенно часто обнаруживаемых при исследовании несвежего патологического материала;

— дефекты покровного стекла при неправильной настройке микроскопа могут быть ошибочно приняты за лептоспиры;

— плохое освещение препарата: при правильном освещении всегда видны пассивно или активно двигающиеся частицы.

Значительно реже для обнаружения лептоспир в органах и тканях используют окраску мазков-отпечатков по Романовскому-Гимза, импрегнацию серебром гистологических срезов по Вартину-Стерри. С этой же целью можно также использовать метод иммунофлуоресценции и полимеразную цепную реакцию.

Принцип метода. В основе метода ПЦР лежит многократное копирование (амплификация) специфического фрагмента ДНК-мишени, который является маркерным для данного вида. Такое копирование осуществляется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой в присутствии дезоксирибонуклеозид-трифосфатов (дНТФ) и синтетических олигонуклеотидных затравок синтеза ДНК, называемых праймерами. Праймеры комплементарны концевым последовательностям ДНК специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента

n по формуле 2 , где n — число циклов амплификации.

Каждый цикл состоит из трех этапов, каждому из которых соответствует определенный температурный режим.

1) Расплетение двойной спирали ДНК (денатурация ДНК) происходит при 93 — 95 °C.

2) Присоединение (отжиг) праймеров происходит комплементарно при температуре, специфической для данной пары праймеров.

3) Синтез новых цепей ДНК протекает при 72 °C путем удлинения праймера в направлении 5′ — 3′. В результате 30 — 35 циклов амплификации синтезируется 10 копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном геле.

Необходимое оборудование и реактивы

1. Микропипетки полуавтоматические на 1 — 10, 5 — 40, 40 — 200, 200 — 1000 мкл.

2. Микроцентрифуга на 8 — 12 тыс. об./мин. для пробирок объемом 1,5 и 0,5 мл.

3. Прибор для горизонтального электрофореза.

4. Программируемый термостат (ДНК-амплификатор).

5. Термостат на 45 — 55 °C для пробирок объемом 1,5 мл.

6. Ультрафиолетовый трансиллюминатор.

7. СВЧ-печь или водяная баня на 95 — 100 °C.

8. Встряхиватель для микропробирок (типа «Вортекс»).

9. Тест-системы для определения ДНК Leptospira interrogans методом ПЦР.

Техника обработки клинического материала и проведения анализа изложены в инструкциях по применению амплификационных тест-систем фирмы-изготовителя.

В качестве исследуемого клинического материала используют кровь, сыворотку крови, СМЖ, мочу.

ПЦР-анализ характеризуется высокой специфичностью, чувствительностью (от 10 до 1000 клеток в пробе) и высокой диагностической эффективностью на первой неделе заболевания (начиная с первых суток), даже на фоне антибиотикотерапии. Поэтому его можно рекомендовать как метод ранней экспресс-диагностики лептоспирозов. При тяжелом течении инфекции на фоне отсроченного синтеза специфических антител ПЦР может быть отнесена к методам выбора для быстрого лабораторного подтверждения клинического диагноза.

Вместе с тем отрицательный результат ПЦР-анализа не должен быть основанием для прекращения диагностического поиска, т.к. день начала болезни не всегда точно известен. Диагностическая чувствительность лабораторного анализа при лептоспирозах может быть значительно повышена за счет параллельного использования серологического теста (РМА) и ПЦР вне зависимости от фазы заболевания.

Бактериологическим методом исследуют тот же материал и в те же сроки, что и при использовании метода микроскопии. Лептоспиры относятся к медленнорастущим микроорганизмам, поэтому выделение культуры имеет значение только для ретроспективного подтверждения клинического диагноза «лептоспироз» и более детальной расшифровки этиологии случая или вспышки.

Исследуемый материал от больного — кровь, мочу, СМЖ в количестве 5 капель засевают в 3 — 5 пробирок с питательной средой или стерильной дистиллированной водой, желательно у постели больного.

При посеве из органов трупа человека или павшего сельскохозяйственного животного (почек, печени) после вскрытия брюшной полости во избежание загрязнения посевов шпателем осторожно прижигают поверхность органа. Затем в этом месте производят прокол пастеровской пипеткой на глубину 0,25 — 0,50 см и забирают межтканевую жидкость с элементами ткани, которые с соблюдением всех правил асептики переносят в пробирку или ампулу с питательной средой.

Трупы грызунов в связи с быстрым развитием трупного обсеменения исследуют в первые часы (не позднее 12 ч в зависимости от температуры воздуха) после гибели зверька. Грызунов вскрывают при строгом соблюдении асептики. Шкурку зверька смачивают 5%-ной спиртовой настойкой йода. Стерильными инструментами производят вскрытие брюшной полости. Почку извлекают и помещают в стерильную чашку Петри. Затем небольшие кусочки ткани почки, взятые пастеровской пипеткой, засевают на питательную среду. Инструменты в процессе вскрытия обжигаются.

Посевы следует производить в несколько (3 — 5) пробирок или ампул со средой, которые затем помещают в термостат и культивируют при температуре 28 — 30 °C.

Для культивирования лептоспир используют жидкие сывороточные питательные среды, основным компонентом которых является сыворотка кролика или барана (Терских, Фервоорта-Вольфа и др.), а также полусинтетические твин-альбуминовые среды.

Среда Терских. Наиболее простой и оптимальной для практического использования является фосфатно-сывороточная среда Терских. Для приготовления 1 л основы этой среды к 100 мл фосфатного буфера (pH = 7,2) добавляют 900 мл дистиллированной воды. Основу дважды фильтруют через двуслойный бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют в автоклаве при 120 °C в течение 20 мин.; пробирки с выпавшим после автоклавирования кристаллическим или аморфным осадком выбраковывают.

В серии пробирок с прозрачным содержимым выборочно проверяют pH. Для посевов используют среду с pH 7,2 — 7,6. В каждую пробирку добавляют в стерильных условиях инактивированную в течение 30 мин. при температуре 56 °C нормальную кроличью сыворотку в количестве 0,5 мл (10 капель на 5 мл среды). Приготовленная питательная среда может быть использована только после 2-кратного прогревания в водяной бане при 56 °C в течение 1 ч. После каждого прогревания среда контролируется на стерильность (при 37 °C в течение суток).

В основу среды Фервоорта-Вольфа помимо компонентов, входящих в среду Терских, добавляют пептон (1 г на 1 л основы) и NaCl (0,5 г на 1 л основы).

Основные растворы. Растворяют следующие ингредиенты (в 100 мл дистиллированной воды каждый): NH4Cl — 25 г; ZnSO4 x 7H2O — 0,4 г; MgCl2 x 6H2O и CaCl2 x 2H2O по 1,5 г каждый; FeSO4 x 7H2O — 0,5 г; пируват натрия — 10,0 г; глицерин — 10,0 г; твин-80 — 10,0 г; тиамин HCl — 0,5 г и цианкобаламин — 0,02 г. Раствор FeSO4 должен быть свежеприготовленным и прозрачным.

Растворяют 10 г бычьего сывороточного альбумина (V фракция) в 50 мл дистиллированной воды, размешивают на магнитной мешалке, добавляя следующие растворы: CaCl2 — MgCl2 — 1 мл; FeSO4 — 10 мл; цианкобаламин — 1 мл; твин-80 — 12,5 мл. Доводят PH до 7,4 и добавляют дистиллированную воду до конечного объема 100 мл. Альбуминовую добавку стерилизуют фильтрацией.

Для приготовления основы среды к 996 мл дистиллированной воды добавляют: Na2HPO4 (обезвоженный) — 1 г; K2HPO4 (обезвоженный) — 0,3 г и NaCl — 1 г. Затем добавляют следующие растворы: NH4Cl — 1 мл; тиамин — 1 мл; пируват натрия — 1,0 мл и глицерин — 1 мл. PH основы среды доводят до 7,4, а затем стерилизуют автоклавированием при 121 °C в течение 20 мин.

Для приготовления жидкой твин-альбуминовой среды 1 объем альбуминовой добавки смешивают с 9 объемами основы среды при соблюдении асептики.

Селективные среды. В качестве селективных могут быть использованы все перечисленные выше жидкие питательные среды после добавления в них 5-фторурацила в концентрации 100 мкг/мл.

Обработка посуды. При культивировании лептоспир следует пользоваться посудой из нейтрального или химического стекла. Обработка новой или бывшей в употреблении посуды производится в посудомоечной машине с использованием специальных детергентов или ручным способом. Процесс ручной обработки пробирок состоит из следующих этапов:

— погружение на 24 ч в 1 — 2%-ный раствор соляной кислоты;

— многократное (12 — 15 раз) промывание в проточной водопроводной воде;

— обработка ершами в горячем мыльном растворе;

— повторное многократное (12 — 15 раз) промывание в проточной водопроводной воде;

— погружение в дистиллированную воду на 24 ч;

Контроль роста культуры. Лептоспиры размножаются в питательной среде, не изменяя ее внешнего вида. Среда остается прозрачной или слегка опалесцирующей в течение всего периода наблюдения. Поэтому для выявления роста лептоспир через 10 дней от момента посева из каждой пробирки или ампулы готовят «раздавленную каплю» и микроскопируют в темном поле.

При обнаружении лептоспир в пробирках их содержимое засевают по 0,5 мл (10 капель) в три пробирки с 5 мл свежей питательной среды в каждой. Посевы помещают в термостат на 7 — 10 дней при температуре 28 — 30 °C.

В случае получения хорошего роста (50 — 100 лептоспир в поле зрения при увеличении x 400) культуры используют как рабочие музейные штаммы (для последующей идентификации) и составляют на них паспорт.

Пробирки, где рост лептоспир не выявлен, вновь помещают в термостат и микроскопируют через каждые 10 дней. При отсутствии роста в течение трех месяцев посевы считают отрицательными.

Рост лептоспир в жидких питательных средах контролируют микроскопией, а также макроскопически — просмотром пробирок с культурами в луче света от осветителя. При осторожном встряхивании в питательной среде четко просматриваются опалесцирующие «муаровые» волны, образуемые выросшей культурой.

При выращивании клеток в пробирках с полужидкой средой (0,2% агара) на 1 — 3 см ниже ее поверхности образуются характерные плоские диски роста (феномен Дингера) или отдельные диффузно расположенные колонии. На 1%-ной агаровой среде в чашках Петри лептоспиры образуют субповерхностные колонии.

Штаммы хранят в соответствии с инструкцией хранения патогенных микробов при комнатной температуре и пересевают один раз в месяц.

Аналогичным способом контролируют рост культур диагностических штаммов, предназначенных для серологических исследований.

Хранение культур лептоспир. Штаммы лептоспир, постоянно поддерживаемые в лаборатории, можно хранить в пробирках под вазелиновым маслом или в запаянных ампулах. Лептоспиры консервируют после выращивания в сывороточной среде до максимального накопления. В пробирку на культуру наслаивают 0,25 мл или 5 капель стерильного вазелинового масла или культуру разливают в стерильные ампулы (1 — 5 мл) из нейтрального стекла и запаивают. Хранят пробирки и ампулы в темном месте при комнатной температуре. В таких условиях лептоспиры можно хранить без пересевов в течение шести месяцев. Для длительного хранения штаммов используют также полужидкие среды, содержащие 0,2% агара.

При необходимости длительного сохранения лептоспир их помещают в паровую (-168 °C) или жидкую фазу (-196 °C) жидкого азота. Предварительно культуру с добавленным стерильным глицерином в конечной концентрации 5 — 10% охлаждают со скоростью 35 или 60 об./мин. (от 0 до 130 °C).

Рабочие музейные штаммы можно хранить и при -70 °C. В этом случае нет необходимости добавлять глицерин в среду.

Дифференциация патогенных лептоспир от сапрофитных проводится по результатам биопробы и культурально-биохимическим тестам. Из них наиболее простыми являются выращивание культур при температуре 13 °C или в присутствии 8-азагуанина в концентрации 225 мкг/мл. В отличие от патогенных сапрофитные лептоспиры в этих условиях хорошо размножаются.

Биологический метод в диагностике лептоспирозов используется редко. Заражение животных подозрительным на наличие лептоспир материалом можно использовать с целью:

— выделения культур лептоспир из контаминированного посторонней микрофлорой материала (ткани органов, моча, вода открытых водоемов, почва и т.д.);

— очистки культур патогенных лептоспир от посторонней микрофлоры;

— определения вирулентности штаммов лептоспир;

— исследования воды открытых водоемов на наличие патогенных лептоспир.

Универсальной лабораторной модели для воспроизведения заболеваний различными сероварами лептоспир не существует.

Оптимальной моделью для воспроизведения иктерогеморрагического лептоспироза служат морские свинки массой 150 — 200 г, у которых заболевание протекает в первые дни с подъемом температуры до 40 — 41° и резким падением веса. На 5 — 10-й день после инфицирования высоковирулентным штаммом появляется желтушная окраска склер, видимых слизистых оболочек и кожи. Животные погибают через 12 — 48 ч после появления желтухи при явлении гипотермии. На вскрытии обнаруживается увеличение почек и геморрагии во внутренних органах, коже и подкожной клетчатке. Особенно типичны крупноточечные кровоизлияния в легочной ткани на общем ишемическом фоне («крылья бабочки»).

К лептоспирам других серологических групп морские свинки менее восприимчивы и чувствительны.

Более универсальная модель для воспроизведения экспериментального лептоспироза, вызванного возбудителями различных сероваров, — золотистые хомячки массой 25 — 40 г. Исследуемый материал вводят животным внутрибрюшинно, подкожно, внутривенно, через скарифицированную кожу и слизистые оболочки.

В случае появления клинической картины или гибели животных в острой фазе после аутопсии производят посев из внутренних органов (печени, почек). За животными, не погибшими в первые дни от инфекции, наблюдают в течение месяца. По истечении этого срока их умерщвляют (с учетом требований биоэтики) и производят посевы из коркового слоя почек; из сердца берут кровь (нативную или на фильтровальную бумагу) для исследования на наличие специфических антител с помощью реакции микроагглютинации лептоспир (РМА).

Исследование воды на наличие патогенных лептоспир. Золотистым хомячкам или молодым морским свинкам вводят внутрибрюшинно соответственно 1,0, 10 и 10 мл пробы. Предварительно пробы воды (50,0 мл) можно центрифугировать (в течение 20 мин. при 10000 об./мин.). Полученным осадком заражают животных (вводят 2 — 3 мл). Наблюдение за животными и исследование их органов на наличие лептоспир проводят, как описано выше. Ввиду отсутствия лабораторных животных, восприимчивых ко всем эпидемически значимым сероварам лептоспир, а также их низкой концентрации в пробах выделение возбудителей из воды открытых водоемов удается с трудом и требует больших затрат времени и средств. Отрицательные результаты исследования проб не являются основанием для исключения воды как фактора передачи возбудителя инфекции.

Серологические исследования — основа лабораторной диагностики лептоспирозов. В мировой практике «золотым стандартом» остается реакция микроагглютинации лептоспир (РМА), отличающаяся высокой чувствительностью и специфичностью. Кроме того, РМА позволяет определить серогруппу возбудителя, что важно для последующего проведения эпидобследования.

С целью серологического скрининга и ранней диагностики лептоспирозов используются также более простые тесты (реакция слайд-агглютинации, иммуноферментный анализ и др.) с родоспецифическими антигенами лептоспир.

Агглютинины в сыворотке крови больных лептоспирозом обнаруживаются в низких разведениях (1:20) начиная с 4-го, но чаще на 7 — 8-й день болезни. Титры антител достигают максимума, как правило, на 14 — 17-й день, а затем постепенно снижаются. Однако у некоторых больных, например при тяжелом клиническом течении лептоспирозной инфекции, особенно на фоне интенсивной антибиотикотерапии, наблюдается иммуносупрессия (серогенативные случаи) или отсроченный синтез специфических антител, которые появляются лишь спустя 2 — 3 месяца от начала болезни.

Это важное обстоятельство необходимо учитывать при оценке результатов лабораторной диагностики спорадических случаев лептоспирозов (особенно иктерогеморрагического), когда выявляются в основном клинически тяжелые случаи. Агглютинины в сыворотке крови переболевших лептоспирозом обнаруживаются в течение 3 — 5 лет и даже в более отдаленные сроки после перенесенного заболевания, что используется для ретроспективной диагностики и изучения иммунологической структуры населения.

В случаях спорадических заболеваний сыворотку больных необходимо исследовать в динамике не менее двух раз: первый — при поступлении больного в стационар (даже если это первый день болезни), второй — через 5 — 7 дней. При необходимости исследование можно повторить на 3 — 4 неделе болезни. Нарастание титров антител даже в невысоких разведениях (1-е отр. и 2-е — 1:20) является абсолютным доказательством наличия заболевания.

У больных с типичной клиникой лептоспироза, характерным эпиданамнезом, но отрицательными результатами серологического исследования его следует повторить перед выпиской из стационара, а иногда, особенно при наличии поздних осложнений, в процессе диспансерного наблюдения за реконвалесцентом в течение 3 — 6 месяцев.

При вспышке лептоспироза достаточно однократного исследования. При этом подтверждением лептоспирозной этиологии вспышки служит выявление у больных и переболевших антител в титрах от 1:100 и выше (соответственно срокам болезни).

Техника постановки РМА при лептоспирозе. Для постановки РМА используют живые культуры лептоспир 6 — 14-дневного возраста плотностью не менее 5 x 10(7) — 10(8) клеток/мл (50 — 100 лептоспир в поле зрения микроскопа при увеличении в x 400), с хорошей подвижностью клеток, без спонтанной агглютинации и посторонних примесей (осадок, контаминация посторонней микрофлорой). Каждую сыворотку исследуют со всеми референтными штаммами, представляющими серогруппы патогенных лептоспир, циркулирующих в данной местности. Для диагностики лептоспироза на территории Российской Федерации рекомендован стандартный набор диагностических штаммов лептоспир (табл. 2).

НАБОР ЭТАЛОННЫХ ШТАММОВ ЛЕПТОСПИР ДЛЯ РМА, РЕКОМЕНДУЕМЫЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ НА ЛЕПТОСПИРОЗ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

N Серогруппа Серовар Эталонный штамм
1 Icterohaemorrhagiae copenhageni M20
2 3 Javanica Poi hanka Poi Hanka
4 Canicola canicola Hond Utrecht IV (Каширский)
5 Autumnalis autumnalis Akiyami A
6 Australis australis Ballico
7 8 Pomona Pomona mozdok Pomona П.О.5621
9 Grippotyphosa grippotyphosa Moskva V
10 11 Sejroe saxkoebing wolffi Mus 24 3705
12 Bataviae djatzi HS26
13 Tarassovi tarassovi Перепелицин

Циркуляция лептоспир серовара hanka установлена только в природных очагах Приморского края, поэтому соответствующий штамм рекомендован для включения в диагностическую панель только на этой территории.

В скобках указан отечественный аналог.

Международный набор референс-штаммов, рекомендуемый для использования в специализированных лабораториях лептоспирозов, дополнительно содержит штаммы серогрупп лептоспир, ранее не выделявшихся на территории России (табл. 3).

МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАБОР РЕФЕРЕНС-ШТАММОВ ЛЕПТОСПИР ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РМА

N Серогруппа Серовар Наименование штамма
1 Australis Australis Ballico
2 Autumnalis Autumnalis Akiyami A
3 Ballum Castellonis Castellon3
4 Bataviae Bataviae Van Tienen
5 Canicola Canicola Hond Utrecht IV
6 Celledoni Celledoni Celledoni
7 Cynopteri Cynopteri 3522C
8 Djasiman Djasiman Djasiman
9 Grippotyphosa Grippotyphosa Moskva V
10 Hebdomadis Hebdomadis Hebdomadis
11 Icterohaemorrhagiae Copenhageni M20
12 Javanica Javanica Veldrat Bataviae 46
13 Lousiana Lousiana LSU 1945
14 Manhao Manhao4 Lil30
15 Mini Mini Sari
16 Panama Panama CZ214
17 Pomona Pomona Pomona
18 Pyrogenes Pyrogenes Salinem
19 Ranarum Ranarum ICF
20 Sarmin Sarmin Sarmin
21 22 23 Sejroe Sakkoebing sejroe wolffi Mus 24 M84 3705
24 Shermani Shermani 1342K
25 Tarassovi Tarassovi Perepelicin

При серологическом исследовании используют нативную сыворотку, консервированную (например, мертиолятом натрия в разведении 1:10000) или без консерванта. В РМА можно также исследовать пробы крови больных людей или животных, высушенные на фильтровальной бумаге. В этом случае кровь в количестве 2 капель (каждая размером 15 — 20 мм) наносят на фильтровальную бумагу и высушивают на воздухе. Для постановки реакции эти участки фильтровальной бумаги вырезают, разрезают и опускают на дно пробирки. В пробирку добавляют 10 капель физиологического раствора и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Полученный раствор служит основным разведением 1:10, из которого готовят последующие разведения. Исследовать сухие капли необходимо в срок, не превышающий одного месяца с момента взятия крови, при условии хранения их при комнатной температуре, и в течение 6 месяцев — в запаянном полиэтиленовом пакете в холодильнике при 4 °C.

Для постановки РМА сыворотку больного исследуют одновременно в двух разведениях 1:10 и 1:100 (при смешивании с культурой 1:20 — 1:200), чтобы исключить феномен прозоны. В случае положительной реакции определяют конечный титр сыворотки.

При вскрытии трупов грызунов кровь забирают из сердца с помощью пастеровской пипетки. Сыворотки грызунов исследуют сначала в одном разведении 1:10 (с культурой 1:20) и титруют с двукратным шагом, если реакция положительная.

Разведенная сыворотка и живая культура лептоспир из диагностического набора штаммов смешиваются в равных объемах (по 0,1 мл) в лунках полистироловых планшет.

В качестве контроля используют смесь равных объемов физиологического раствора и культуры лептоспир. Планшеты встряхивают и оставляют на 30 мин. при комнатной температуре, после чего проводят окончательный учет реакции в препаратах «раздавленная капля» под микроскопом в темном поле зрения (при увеличении x 200 или x 400). Вследствие добавления к испытуемой сыворотке равного объема живой культуры лептоспир разведение сыворотки удваивается.

При массовых серологических исследованиях, особенно сывороток животных, РМА удобно ставить на предметном стекле, на котором смешивают по 1 капле разведенной сыворотки и культуры диагностических штаммов лептоспир.

Смесь накрывают покровным стеклом и после 15-минутной экспозиции при комнатной температуре проводят учет реакции под микроскопом. На каждом стекле можно поставить три реакции.

Агглютинация проявляется в форме склеивания лептоспир и образования своеобразных конгломератов в виде «паучков», «бантиков», «кос».

Учет реакции проводят визуально по условной системе оценок трех крестов.

Контроль: агглютинация отсутствует, все клетки лептоспир находятся в свободном состоянии;

+ — примерно 1/3 лептоспир (по сравнению с контролем) агглютинированы;

++ — от 1/3 до 2/3 лептоспир агглютинированы;

+++ — агглютинированы почти все или все лептоспиры.

При исследовании сывороток крови больных и переболевших людей и анализе результатов серологических исследований примерно в 60% испытуемых образцов, особенно на 1 — 2 неделе заболевания, наблюдаются межгрупповые реакции, затрудняющие установление этиологического агента.

Например, исследуемая сыворотка больного агглютинировала штамм М-20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae) до разведения 1:200, штамм Pomona (серогруппа Pomona) до 1:1600 и штамм Perepelicin (серогруппа Tarassovi) до 1:100. Следует заключить: лептоспироз, обусловленный возбудителем серогруппы Pomona. Если же сыворотки больных реагируют только с одним из диагностических штаммов, также ставят серогрупповой диагноз. Например, в сыворотке больного обнаруживают антитела к штамму Moskva V в разведении 1:800. Диагноз: лептоспироз, вызванный лептоспирами серогруппы Grippotyphosa.

В ряде случаев в первые дни болезни титр антител к неспецифическому возбудителю превышает таковой к этиологическому агенту заболевания (парадоксальные реакции), но на более поздних сроках выявляются только специфические антитела к возбудителю болезни. Например, при лептоспирозе, вызываемом лептоспирами серогруппы Pomona, в первые дни болезни часто обнаруживаются антитела только к лептоспирам Australis, титр которых быстро снижается. Исследование парных сывороток помогает установить серогруппу возбудителя.

Для суждения об истинной роли той или иной серогруппы лептоспир в качестве этиологического агента у конкретного больного иногда прибегают к определению класса антител. При этом исходят из того, что антитела класса IgG отличаются большей специфичностью, чем IgM, и в 85% случаев реагируют только с гомологичным антигеном.

Реакция макроагглютинации на стекле (слайд-агглютинации).

Реакцию макроагглютинации (РА) на стекле используют для обнаружения антител к лептоспирам различных сероваров и серогрупп в сыворотке крови больных лептоспирозом, используя родоспецифические антигены (например, БАСА). Обычно РА используется для предварительного тестирования сывороток больных с подозрением на лептоспирозную инфекцию и массового скрининга. Техника постановки реакции проста, поэтому она может быть использована в лабораториях любого уровня оснащенности, в т.ч. и в клинических.

1. На чистое предметное стекло автоматической пипеткой наносят 10 мкл испытуемой сыворотки, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:1, и 10 мкл слайд-антигена (после встряхивания виалы). Сыворотку и антиген смешивают бактериологической петлей.

2. Спустя 2 — 4 мин. в проходящем свете осветителя ОИ-19 или с помощью вогнутого зеркала проводят оценку реакции: при положительном результате наблюдается образование четко видимых агглютинатов при одновременном просветлении реакционной смеси.

3. Если реакция агглютинации на стекле положительна или сомнительна, то сыворотку рекомендуется исследовать дополнительно в РМА.

1. Положительная контрольная сыворотка, которая дает четкую агглютинацию со слайд-антигеном в реакции макроагглютинации при постановке указанным методом.

2. Контроль антигена — слайд-антиген смешивается с физиологическим раствором в указанных выше соотношениях.

Примечание. Испытуемые сыворотки должны быть свободны от контаминации и консервантов. Инактивация сывороток не обязательна.

Выделенные на местах штаммы лептоспир идентифицируются до серогруппы с помощью набора диагностических агглютинирующих сывороток.

Идентификацию выделенных штаммов проводят с помощью перекрестной РМА. Для этого необходимо располагать гипериммунными специфическими сыворотками против испытуемого и эталонных штаммов лептоспир. Их перечень соответствует списку диагностических штаммов.

Штаммы относят к одной серогруппе, если титры РМА изучаемого штамма с референс-антисывороткой и референс-штамма с антисывороткой к изучаемому штамму превышают 10%. Серогруппы не имеют официального таксономического статуса. Поэтому следующим этапом идентификации является определение серовара лептоспир (основной таксон).

После выяснения серогрупповой принадлежности штамма исследования проводят в перекрестной РМА, но уже со штаммами, представляющими все серовары серогруппы, к которой выделенный штамм проявил наибольшее сродство.

Эталонные штаммы и антисыворотки к ним, прореагировавшие хотя бы с одной стороны на 10% и более, отбирают для сравнения их с опытным штаммом в перекрестных реакциях абсорбции.

Идентификацию штаммов лептоспир на уровне серогруппы, серовара и субсеровара можно проводить также в РМА с панелями моноклональных антител.

Генетические методы видовой и внутривидовой идентификации лептоспир пока находятся в стадии разработки и не могут быть рекомендованы для практического использования.

В связи с тем, что методы внутривидовой идентификации лептоспир достаточно сложны и трудоемки, выделенные от людей животных или объектов внешней среды изоляты следует направлять для идентификации в Сотрудничающий Центр ВОЗ и Минздрава России по лептоспирозам (на базе лаборатории лептоспирозов ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).

источник

Читайте также:  Отличие анализа мужской мочи от женской