Анализ лейкоцитов в камере горяева

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

Смесители для эритроцитов и лейкоцитов.
Пробирки типа серологических.
Пипетки на 1 и 5 мл.
Капилляры к гемометру Сали.
Стеклянные палочки.
Глазные пипетки.
Счетные камеры Горяева со шлифованными стеклами к ним.
Микроскопы.
Колбочки с чистой водой.
Поваренная соль.
Сулема.
Сернокислый натрий.
Ледяная уксусная кислота.
96° этиловый спирт.
Генцианвиолет (метиленовая синька).
Набор для взятия крови из пальца.

Для подсчета количества эритроцитов и лейкоцитов необходимы следующие реактивы:

3% раствор хлористого натрия (NaCl) : 3 г хлористого натрия помещают в колбочку на 100 мл и доливают дистиллированной водой до метки 100 мл.
Реактив Гайема: к 0,5 г сулемы, 1 г хлористого и 5 г сернокислого натрия приливают 200 мл дистиллированной воды. Оба реактива сохраняют эритроциты.
3% раствор уксусной кислоты — 3 мл ледяной уксусной кислоты помещают в цилиндр на 100 мл и доливают дистиллированной водой до метки. Реактив подкрашивают 1% водным раствором генцианвиолета из расчета 5-6 капель краски на 10 мл 3% уксусной кислоты.

Кровь для подсчета эритроцитов и лейкоцитов берут в специальные смесители или в пробирки.
На чистый и сухой смеситель для эритроцитов надевают резиновую трубочку со стеклянным мундштуком, после чего в него насасывают кровь, без пузырьков воздуха, точно до метки 0,5, затем этим же смесителем набирают 3% раствор хлористого натрия или реактив Гайема точно до метки 101, не допуская появления пузырьков воздуха. При этом кровь разводится в 200 раз. Со смесителя снимают резиновую трубочку, захватывают его между пальцами, несколько раз встряхивают, прокалывают им бумажку, на которой указана фамилия больного, и кладут его на стол в горизонтальном положении.

В чистый сухой смеситель для лейкоцитов таким же способом, как и в смеситель для эритроцитов, насасывают кровь до метки 0,5, после чего тем же смесителем набирают 3% раствор уксусной кислоты до метки 11. При этом кровь разводится в 20 раз. Затем со смесителя снимают резиновую трубочку, несколько раз встряхивают его, прокалывают им бумажку, на которой указана фамилия больного, и кладут на стол в горизонтальном положении.

Для каждого взятия крови берут две нумерованные пробирки, серологическую и агглютинационную. В серологическую пробирку помещают 4 мл 3% раствора хлористого натрия или реактива Гайема, а в агглютинационную — 0,4 мл 3 % раствора уксусной кислоты. В каждую пробирку вносят по 0,02 мл крови, взятой капилляром от гемометра, и тотчас же смешивают содержимое пробирок, вращая их между ладонями.

В серологической пробирке (для эритроцитов) получают разведение крови в 200 раз, а в агглютинационной (для лейкоцитов) — в 20 раз.

Количество эритроцитов и лейкоцитов подсчитывают в специальных счетных камерах. Для этой цели пользуются счетной камерой Горяева, которая представляет собой стекло с нанесенными на него двумя сетками. Сетки отделены одна от другой углублениями и делятся разграничительными линиями на 225 квадратов. Площадь сетки 9 мм2, высота, создающаяся при притирании шлифованного покровного стекла в камере, 0,1 мм, объем 0,9 мм3. Перед заполнением камеры кровью ее моют водой и насухо вытирают.

К сухой поверхности камеры притирают шлифованное покровное стекло, плавно продвигая его по ней взад и вперед до появления цветных колец Ньютона в местах соприкосновения покровного стекла со стеклом камеры. Затем кровь в смесителе встряхивают в течение 1-2 минут, после чего из смесителя выпускают на ватку 1-2 капли крови, следующую каплю помещают перед шлифованным покровным стеклом. При нанесении капли крови надо следить за тем, чтобы в пространство над сеткой камеры не попал воздух и чтобы не было избытка жидкости. Одну сетку заполняют для подсчета эритроцитов, вторую — для подсчета лейкоцитов.

Для заполнения камеры Горяева кровью, взятой по способу Н. М. Николаева (пробирочный метод), поступают следующим образом. К счетной камере притирают шлифованное стекло. Из каждой пробирки, предварительно встряхнув ее, с помощью стеклянной палочки с оплавленным концом берут по одной капле жидкости и заполняют ими раздельно обе сетки камеры, для чего каплю помещают перед щелью, образующейся между шлифованным стеклом и счетной камерой, в результате чего жидкость заполняет пространство над сетками.

Количество эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева подсчитывают с помощью микроскопа. Для этого заполненную разведенной кровью камеру Горяева помещают на предметный столик микроскопа и под малым увеличением (окуляр 15 X или 10Х, объектив 8Х), с опущенным конденсором находят сетку камеры. К подсчету форменных элементов приступают через 2-3 минуты после заполнения камеры кровью.

Эритроциты подсчитывают в пяти квадратах, каждый из которых разделен на 16 маленьких квадратиков. Подсчет начинают с левого верхнего квадрата, а затем продвигают камеру по диагонали сверху вниз. Во избежание повторного подсчета одних и тех же эритроцитов руководствуются следующим правилом: все эритроциты внутри квадратика и на разграничительных линиях подсчитывают только тогда, когда они большей своей половиной заходят внутрь квадратика; клетки, пересеченные разграничительной чертой пополам, подсчитывают лишь на двух сторонах из четырех сторон квадрата (на левой и верхней); клетки, выходящие большей своей половиной за пределы разграничительных линий, совсем не считают.
Результаты подсчета эритроцитов по каждому из пяти больших квадратов записывают и суммируют. Для расчета количества эритроцитов пользуются следующей формулой:

где х — количество эритроцитов в 1 мм3 крови; а — сумма эритроцитов, подсчитанных в пяти квадратах; б — разведение крови в 200 раз; в — количество сосчитанных маленьких квадратиков — 80.

Для упрощения расчета к количеству подсчитанных эритроцитов приписывают четыре нуля.
В норме количество эритроцитов от 4 500 000 до 5 000 000 в 1 мм3 крови.

Лейкоциты подсчитывают в 100 больших квадратах. При подсчете их руководствуются теми же правилами, которые указаны для эритроцитов, а затем производят расчет по приведенной выше формуле, в которой цифра разведения равна 20, а количество подсчитанных квадратов — 1600.
Для простоты расчета количество подсчитанных лейкоцитов умножают на 50 или делят на 2 и приписывают два пуля.
В норме количество лейкоцитов от 5000 до 8000 в 1 мм3 крови.

Чистка смесителей. После подсчета лейкоцитов смесители моют следующим образом: резиновой грушей удаляют остатки крови, после чего их многократно промывают дистиллированной водой, спиртом и просушивают эфиром или в сушильном шкафу. Показателем чистоты смесителей служит свободное передвижение бусинки при встряхивании смесителя.

В последнее время для подсчета эритроцитов и лейкоцитов пользуются целоскопом отечественного производства СФЭК-62, который позволяет быстро и точно определить количество форменных элементов в 1 мм3 крови.
Техника его использования подробно изложена в инструкции, приложенной к прибору.

Цветной показатель выражает среднее содержание гемоглобина в одном эритроците. В норме цветной коэффициент равняется 1,0 при 100% гемоглобина и 5 000 000 эритроцитов в 1 мм3 крови. Его рассчитывают исходя из следующей пропорции: найденное количество гемоглобина (в единицах) так относится к его нормальному количеству, как найденное количество эритроцитов к их нормальному числу.

Например, если найденный гемоглобин равен 88 ед., а количество эритроцитов 4 8000 000 в 1 мм3, то цветной показатель равен 0,91.

Практически легче рассчитать цветной показатель упрощенным способом: путем умножения найденного количества гемоглобина на 5 и деления полученного произведения на первые три цифры подсчитанных эритроцитов.

При количестве эритроцитов меньше 1 000 000 делить надо на две первые цифры подсчитанного числа эритроцитов. Цветной показатель в норме равен 0,9-1,1.

В последнее время наряду с цветным показателем рассчитывают более достоверную абсолютную величину — содержание гемоглобина в одном эритроците — СГЭ. При расчете этого показателя весовое количество гемоглобина выражают в очень мелких единицах — микромикрограммах (мкмкг), или, что правильнее — пикограммах (пг).
СГЭ получают умножением количества гемоглобина в грамм-процентах на 10 и делением на число эритроцитов в миллионах.

источник

Камера Горяева – оптическое устройство для подсчета клеток или иных соизмеримых с ними частиц в заданном объеме жидкости. Состоит из толстого предметного стекла, имеющего прямоугольное углубление (камеру) с нанесенной микроскопической сеткой и тонкого покровного стекла. Камера разработана профессором Казанского университета Горяевым Н.К. Благодаря увеличенному объему сетки отличается большей точностью подсчета, по сравнению с другими камерами (Тома, Цейса, Тюрка, Бюркера).

Технические характеристики камеры Горяева

Размеры малого квадрата камеры Горяева 0,05×0,05 мм
Размеры большого квадрата камеры Горяева 0,2×0,2 мм
Глубина камеры 0,1 мм
Объем жидкости под 1 малым квадратом 0,00025 мм3 (мкл) = 1/4000 мм3 (мкл)
Объем жидкости под 1 большим квадратом 0,004 мм3 (мкл) = 1/250 мм3 (мкл)
Объем камеры Горяева 0,9 мм3 (мкл)

Описание сетки камеры Горяева

Сетка камеры Горяева состоит из 225 больших квадратов, из которых 25 разделены на 16 малых квадратов.

Рис 1. Сетка камеры Горяева

Рис 2. Большой (1) и малый (2) квадраты сетки камеры Горяева

Рис 3. 225 больших квадратов сетки камеры Горяева

Рис 4. 100 больших квадратов сетки камеры Горяева

Рис 5. Большой квадрат камеры Горяева разделенный на 16 малых квадратов.

Обслуживание камеры Горяева

Между работой камера должна храниться в сухом месте. После работы камера дезинфицируется погружением на 30 минут в 70% раствор этилового спирта, или на 60 минут в 4% раствор формалина, после чего камера промывается дистиллированной водой и протирается мягкой салфеткой.

Правило подсчета клеток в квадрате (правило Егорова)

В квадрате считаются клетки, лежащие внутри его, а также касающиеся левой и верхней границ. Клетки, касающиеся правой и нижней границ при подсчете не учитываются.

Методика подсчета лейкоцитов в камере Горяева

Развести образец исследуемой крови в 20 раз 3–5% раствором уксусной кислоты с метиленовым синим (например, 20 мкл крови и 380 мкл р-ра уксусной к-ты). Камеру и покровное стекло насухо протереть марлей. Недопускается использование для протирки ватных тампонов из-за остающихся на стекле волокон. Аккуратно притереть покровное стекло к камере, слегка надавливая на него до появления цветных колец Ньютона. Заполнить камеру разведенной кровью и выдержать 1 минуту для прекращения движения клеток. При малом увеличении (окуляр ×10, объектив ×8) посчитать лейкоциты в 100 больших квадратах. Расчет числа лейкоцитов осуществляют, исходя из разведения крови (20) и числа больших квадратов (100), по формуле: X = (a×250×20) / 100, где Х – число лейкоцитов в 1 мкл крови; а – число лейкоцитов, посчитанных в 100 больших квадратах камеры Горяева. Практически, после сокращений в формуле, количество посчитанных лейкоцитов умножают на 50.

Методика подсчета эритроцитов в камере Горяева

Развести образец исследуемой крови в 200 раз в 0,9% растворе NaCl или растворе Гайема (берется 20 мкл крови и 4 мл раствора). Камеру и покровное стекло насухо протереть марлей. Недопускается использование для протирки ватных тампонов из-за остающихся на стекле волокон. Аккуратно притереть покровное стекло к камере, слегка надавливая на него до появления цветных колец Ньютона. Заполнить камеру разведенной кровью и выдержать 1 минуту для прекращения движения клеток. При малом увеличении (окуляр ×10, объектив ×8) посчитать эритроциты в 5 больших квадратах разделенных на 16 малых (т.е. в 80 малых квадратах). Рекомендуется считать клетки в квадратах, расположенных по диагонали. Расчет числа эритроцитов осуществляют, исходя из разведения крови (200) и числа малых квадратов (80), по формуле: X = (a×4000×200) / 80, где Х – число эритроцитов в 1 мкл крови; а – число эритроцитов, посчитанных в 80 малых квадратах камеры Горяева. Практически, после сокращений в формуле, количество посчитанных эритроцитов умножают на 10 000.

источник

ПРОГРАММА ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ НА ЗАНЯТИИ.

Тема 3. Исследование защитных свойств крови. функции лейкоцитов. Понятие про иммунитет, его виды.

Мотивационная характеристика темы.Знание защитных свойств крови, функций лейкоцитов необходимо для понимания механизмов иммунологических реакций в изменяющихся условиях окружающей среды, обеспечивающих нормальный уровень метаболических процессов в тканях.

Цели занятия: знать – 1) свойства и функции лейкоцитов; 2) физиологические механизмы, лежащие в основе методов исследования количества и функций лейкоцитов.

ВОПРОСЫ ДЛЯ УСТНОГО И ТЕСТОВОГО КОНТРОЛЯ:

1. Лейкоциты, их виды, строение.

2. Функции разных видов лейкоцитов.

3. Количество лейкоцитов в крови, его изменения при разных физиологических состояниях организма.

4. Лейкоцитоз, виды. Отличия физиологического лейкоцитоза от патологического. Лейкопения.

5. Лейкоцитарная формула, ее возможные изменения.

6. Лейкопоэз, регуляция количества лейкоцитов в крови.

7. Иммунитет, его виды и значение.

8. Неспецифический иммунитет, его механизмы.

9. Роль тимуса, лимфатических узлов и селезенки в обеспечении неспецифического и специфического иммунитета.

ВОПРОСЫ ДЛЯ ПИСЬМЕННОГО ОТВЕТА:

1. Нарисуйте строение различных видов лейкоцитов .

2. Опишите структурные и функциональные различия разных видов лейкоцитов

3. Опишите, что такое лейкоцитоз и лейкопения.

4. Опишите различия между физиологическим и патологическим лейкоцитозом

5. Опишите виды иммунитета и укажите роль отдельных форм лейкоцитов в иммунитете.

6. Опишите механизмы специфического и неспецифического иммунитета.

7. Опишите возрастные изменения иммунитета.

1. Определить количество лейкоцитов в литре крови с помощью счетной камеры.

2. Посчитать лейкоцитарную формулу в мазке крови и дать заключение.

Для работы необходимы: скарификаторы, ватные шарики, спирт, эфир, счетная камера Горяева, смеситель (меланжер) для подсчета лейкоцитов, 5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим, микроскоп. Объект исследования–человек.

Проведение работы: Счетную камеру помещают под микроскопом и рассматривают сетку Горяева вначале при малом, а затем при большом увеличении. Накрывают камеру покровным стеклом, притирая его края к стеклу камеры до появления радужных колец Ньютона. Оставив камеру под микроскопом, прокалывают палец ранее описанным методом. Первую выступившую каплю крови из пальца стирают ватным тампоном. Во вторую каплю погружают кончик смесителя для лейкоцито, держат его вертикально и набирают кровь до отметки 1, следя, чтобы в капилляр не попали пузырьки воздуха. Обтирают конец капилляра фильтровальной бумагой и быстро, пока кровь не свернулась, переносят его в чашку с 5% раствором уксусной кислоты, продолжая держать смеситель вертикально. Набирают раствор до метки 11 (т.е. разводят кровь в 10 раз), после чего смеситель переводят в горизонтальное положение и кладут на стол.

Для подсчета лейкоцитов берут заполненный меланжер, зажимая нижний конец пальцем, снимают резиновую грушу и, зажав оба конца смесителя третьим и первым пальцами, в течение 1 мин перемешивают кровь. При этом эритроциты разрушаются и в поле зрения остаются только лейкоциты, точнее их ядра. Т.к. уксусная кислота подкрашена метиденовым синим, ядра лейкоцитов становятся видны отчетливее. Выпускают из смесителя на вату три капли, а четвертую наносят на среднюю площадку камеры у края покровного стекла. Капиллярными силами капля сама втягивается в покровное стекло и заполняет камеру. Излишек раствора крови стекает в желобок. Если на сетку попал воздух или на боковых площадках оказался излишек раствора, камеру следует промыть дистиллированной водой, высушить и заполнить снова. Заполненную камеру ставят под микроскоп и, если форменные элементы расположены равномерно (что является показателем хорошего перемешивания крови), приступают к подсчету. Подсчитывают число лейкоцитов в 25 больших квадратах (разделенных на 400 маленьких). Подсчет ведут в пределах маленького квадрата по рядам (от верхнего до нижнего). Во избежание двукратного подсчета клеток, лежащих на границе между малыми квадратами, применяют правило Егорова: « к данному квадрату относятся эритроциты, лежащие как внутри квадрата, так и на его левой и верхней границах; эритроциты, лежащие на правой и нижней границах, к данному квадрату не относятся». Подсчитав сумму лейкоцитов в 25 больших квадратах (что составляет 400 маленьких), находят среднее арифметическое число лейкоцитов в одном маленьком квадрате. Зная, что объем пространства камеры над одним маленьким квадратом равен 1/4000 мм 3 , умножают найденное число на 4000. Получают число лейкоцитов в 1 мм 3 разведенной крови. Умножив на величину разведения (10), получают количество лейкоцитов в 1 мм 3 цельной крови. Таким образом, формула для вычисления количества лейкоцитов следующая: Х = (Л х 4000 х 10)/400, где х – искомое числолейкоцитов в 1мм 3 цельной крови, Л – сумма лейкоцитов в 400 маленьких квадратах, 400 – число маленьких квадратов, в которых произведен подсчет, 10- разбавление крови. Затем полученное число лейкоцитов записывают в пересчете на 1 л крови, т.е. число тысяч лейкоцитов, найденных в 1 мм 3 , умножают на 10 9 .

Оформление результатов и их оценка: Записать, сколько лейкоцитов содержится в 1 л исследуемой крови. Сравнить полученные результаты с нормой. У взрослых этот показатель составляет 6-8 тыс в 1мм 3 или (6,0 — 9,0) х10 9 .

Дата добавления: 2014-11-28 ; Просмотров: 3161 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник

Подсчет лейкоцитов в камере Горяева – это один из способов определения их количества в крови пациента. Число лейкоцитов зависит от множества факторов, к которым следует отнести скорость образования, выделение из костного мозга, уничтожение. На все перечисленные процессы оказывают непосредственное влияние физиологические факторы. Поэтому постоянная смена числа лейкоцитов у здорового человека возможна. Особенно это видно, если сравнивать результаты утренних и вечерних анализов.

Данный пробирочный метод состоит из следующих этапов:

Пробирка заполняется уксусной кислотой с тиазиновым красителем на 0,4 мл. С помощью капиллярной пипетки берется 20 мкл свежей крови и выдувается в эту же пробирку. Полученная смесь тщательно смешивается.
Тонкая стеклянная пластинка, находящаяся в камере, тщательно вытирается, после чего образуются радужные разводы.
Далее берется капля полученного раствора из крови с уксусной кислотой и подносится к краю пластинки.
Когда камера будет заполнена, ее не беспокоят в течение одной минуты, чтобы белые клетки крови начали оседать.
При малом увеличении производится подсчет лейкоцитов.

Чтобы получить верные результаты, используют специальную формулу для подсчета количества лейкоцитов в 1 мкл крови. Нормой считается показатель от 4 до 9 на 10 л.

Если получился результат, превышающий данную отметку, то пациенту ставится диагноз — лейкоцитоз. Если наблюдается снижение – лейкопения. Но это в теории, на деле нужно смотреть и на другие показатели, чтобы точно определить заболевание.

Для подсчета лейкоцитов используют три вида формул:

N = m x 4000 x 20/(64 x 16) = m x 78.13 ≈ m x 78

N = m x 4000 x 20 / (169 x 16) ≈ m x 29.6

N = m x 4000 x 20 / (100 x 16) ≈ m x 50.

Камера Горяева – это прибор, который может наиболее точно подсчитать число лейкоцитов, а также других подобных частиц. В ее состав входит специальное толстое стекло с прямоугольной камерой. На ней расположена микроскопическая сетка и тоненькое оптическое стекло.

Этот аппарат разрабатывал известный профессор Горяев Николай Константинович, который трудился в Казанском университете. Его специфическая сетка давала наиболее точные результаты, чем камеры других известных ученых.

Что касается обслуживания камеры, то здесь тоже существуют свои нюансы. В перерывах от работы камера Горяева должна находиться в сухой зоне. Когда работа завершена, ее нужно обработать. Для этого аппарат погружают в этиловый спирт (70%) на полчаса. Другой вариант очистки – это раствор формалина (4%) на один час. Завершающим этапом становится промывка камеры Горяева дистиллированной водой и протирка мягкой тканью.

Предположить, что у пациента диагноз лейкопения, можно также с помощью камеры Горяева. Ее делят на органическую и функциональную.

К функциональным отклонениям относят:

заболевания, носящие вирусную или бактериальную этиологию (кишечные инфекции, гепатит А и другое);
реакция на некоторые медикаменты;
при сильной нагрузке на мышцы, стрессы, диеты;
при неправильном хранении крови.

К органическим причинам можно отнести:

панмиелофтиз;
лейкоз;
болезнь Ходжкина;
ревматическая болезнь;
облучение ионами;
агранулоцитоз.

Лейкоцитозом организм отвечает в том случае, когда на него оказывают влияние эндогенные и экзогенные факторы. На практике выделяют физиологическую, а также патологическую формы болезней.

К физиологическим причинам можно отнести:

переваривание пищи – в этот период значение лейкоцитов резко растет, но через три часа все приходит в норму;
стресс, нервы, физический труд, переохлаждение или перегрев, беременность с третьего месяца, менструация.

К патологическим причинам относят:

рак крови;
попадание в организм некоторых инфекций, а также воспаление (сепсис);
радиация, отравления организма различными ядами, в том числе насекомых;
действие некоторых лекарственных препаратов (нейромедиаторы, биогенный амин, стероидные гормоны и другое);
некроз тканей, серьезные болезни сердца, гангрены, почечная кома;
обильные кровотечения (получение серьезных ран, операции в гинекологии и так далее).

источник

Оборудование: микроскоп, камера Горяева, пипетка, капилляр от гемометра Сали, пробирка с резиновой крышкой.

Реагенты: жидкость Тюрка (100 мл 5%-го р-ра уксусной к-ты и 1 мл 1%-го р-ра генциан фиолетового или метиленового синего), спирт, иммерсионное масло.

Камера Горяева – толстое предметное стекло с четырьмя желобами в средней части, между которыми находятся три узкие площадки, средняя из которых ниже боковых на 0,1 мм и разделена пополам поперечным желобком. По обе стороны от этого желобка расположены сетки, нанесенные на стекло. Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, из которых 25 расчерчены вертикальными и горизонтальными линиями на 16 малых квадратов. Подсчет лейкоцитов ведут в счетной камере Горяева под малым увеличением микроскопа в 100 неразграфленных больших квадратах. Большой квадрат равен 16 малым, что соответствует 100 х 16 = 1600 малым квадратам. Единицей отсчета является маленький квадрат. Его сторона равна 1/20 мм, площадь 1/20*1/20=1/400 мм 2 . Объем крови, помещающейся над маленьким квадратом, равен 1/400 мм 2 *1/10 мм=1/4000 мм 3 (1/10 мм – высота слоя крови). из 225 больших квадратов

Ход работы. Покровное стекло притереть к камере Горяева до появления радужных колец.

Установить увеличение микроскопа в 280 раз (окуляр на 7, объектив на 40). Поставить камеру на предметный столик микроскопа, найти сетки, рассмотреть.

Пипеткой взять 0,4 мл жидкости Тюрка (5%-ый раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим) и влить в пробирку.

Набрать кровь в капилляр от гемометра Сали до отметки (0,02 мл); кончик капилляра вытереть ватой; опустить капилляр в пробирку с жидкостью Тюрка; выдуть кровь в пробирку; промыть капилляр, дважды выдувая этот раствор разбавителя. Пробирку закрыть резиновой пробкой, перемешать содержимое. Набрать содержимое пробирки в капилляр. Каплю из капилляра выпустить на среднюю пластинку под притертое покровное стекло к камере Горяева (пузырьки воздуха не должны попасть под покровное стекло). Оставить на 1 мин., чтобы осели клетки крови.

Подсчитать количество лейкоцитов в 100 больших квадратах (или 1600 малых квадратах). Учитывают клетки, находящиеся внутри каждого малого квадрата, на левых и верхних сторонах каждого квадратика. Не считают на нижних и правых сторонах квадрата, т.к. их число учитывается при подсчете лейкоцитов следующего квадрата.

Рассчитать содержание лейкоцитов в 1 м 3 крови. Для этого использовать формулу:

А – количество лейкоцитов в 100 больших квадратах,

4000 – коэффициент для приведения объема к 1 мм 3 (1/4000 мм 3 – объем одного маленького квадрата),

20 – коэффициент разведения крови объемом 0,02 мл,

1600 – количество маленьких квадратов.

Практически для получения действительного содержания лейкоцитов в 1 мкл крови достаточно полученное при подсчете число разделить пополам и приписать 2 нуля (или подсчитанное число клеток крови разделить на 50), ошибка метода составляет ± 7%.

Например, подсчитано 160 лейкоцитов, тогда в абсолютных единицах получаем 8 000 клеток в 1 мкл крови. Для пересчета количества клеток в 1 л (система единиц СИ) необходимо результат умножить на 10 6 , т.е. 8 000*10 6 = 9*10 9 /л.

Оформление работы. Записать или зарисовать последовательность счета клеток в камере Горяева. Подсчитать количество клеток, записать.

Работа 5. Приготовление мазков крови, окрашивание по Романовскому-Гимзе

Оборудование:обезжиренные предметные и шлифовальные стекла, вата, пинцет, пипетка на 10 мл, глазные пипетки, ванночки размером с предметное стекло, карандаш.

Реагенты: кровь рыбы, 70 % этиловый спирт,

В основе методики лежит способность смеси основных (азур II) и кислых красителей (водорастворимый желтый эозин) окрашивать элементы клеток крови в разные цвета и оттенки. Окрашиватся ацидофильные образования в различные оттенки красного цвета, базофильные — в цвета от пурпурного до синего.

Ход работы. Обезжирить предметные стекла

Предметное стекло взять в левую руку между большим и указательным пальцами за короткие грани.

Каплю крови (величиной с зерном пшена) нанести на правый конец стекла (предметным стеклом, углом шлифовального стекла, пипеткой). Капля должна быть такого размера, чтобы конец мазка, приготовленного из нее, не доходил на 1 см до края стекла.

Шлифовальное стекло ставят под углом 45º к основному стеклу у правого края предметного стекла, надвигают на каплю крови так, чтобы у нижнего ребра шлифовального стекла равномерно распределилась капля крови. Распределяют справа налево каплю крови по предметному стеклу равномерно, быстро. Мазок должен быть тонким, ровным, желтоватым, просвечивающимся и отливать должен цветами радуги при просмотре на свет.

А – неравномерный мазок на плохо обезжиренном стекле; Б – короткий мазок; В – длинный и неравномерный мазок; Г – толстый в начале мазок; Д – правильный мазок.

Рисунок 2. Качество приготовленного мазка.

Высушить мазок быстро (под лампой, в термостате, высоко над спиртовкой).

Промаркировать простым карандашом.

Фиксировать в закрытой кювете в этиловом спирте 5 мин., высушить на воздухе.

На дно ч.Петри налить готовую краску Романовского, препарат уложить мазком вниз в краску, закрыть крышкой от ч.Петри (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). Мазки окрашивать 20 — 25 минут во влажной камере в термостате при 37 °C.

После окрашивания мазки промыть в проточной воде, сушить на воздухе и исследовать при масляной иммерсии.

Оформление работы. Записать последовательность методики окрашивания.

Последнее изменение этой страницы: 2016-06-23; Нарушение авторского права страницы

источник

Камера Горяева — небольшое приспособление, необходимое для подсчета форменных элементов, полученных из биологических жидкостей человека. Оптическое приспособление выглядит, как стекло, внутрь которого помещается небольшое количество исследуемого материала. Оно широко используется для лабораторных методов исследования в медицинских учреждениях. Осуществляют подсчет лейкоцитов в камере Горяева по методике Нечипоренко, Амбурже.

Устройство представлено толстым стеклом, внутри которого имеется углубление. На нем нанесена сетка, видимая только под микроскопом, по которой врач-лаборант подсчитывает клетки. Сверху камеры помещаются предметные стекла таким образом, чтобы исследуемый материал сдавливался с двух сторон.

Камера Горяева производится в 2 вариантах:

двухсеточная (состоит из 2 камер);
четырехсеточная (состоит из 4 камер).

Цена приспособления зависит от его качества. Производитель должен отшлифовать стекло, правильно нанести сетку с помощью лазера или вакуумного напыления.

Сетка Горяева состоит из 225 квадратов. Они бывают большими и малыми. Врач перемещает микроскоп над ними слева направо, вниз, затем справа налево, пока все поля не закончатся.

Чтобы приспособление показывало верные результаты, за ним необходимо ухаживать. Камеру необходимо тщательно протирать перед применением. Для этого используют бинт, который смачивают в спирте. Стерилизующая жидкость должна быть качественная, чтобы на поверхности стекла не осталось осадка. Стекло готово к работе, если на нем появились радужные кольца на обеих поверхностях.

Важно! Нельзя использовать для протирания камеры вату, так как она содержит волокна, которые могут остаться на поверхности стекла, что затруднит исследование.

Камера Горяева идёт в стандартной комплектации, с покровными стеклами. Если они отсутствуют или сломались, возможно использование обычных стекол, соответствующих по размеру.

Во время работы с камерой и предметными стеклами врач-лаборант должен надевать перчатки. Это предотвращает попадание отпечатков пальцев, которые будут мешать в работе с микроскопом.

После завершения работы камера должна быть продезинфицирована. Для этого ее погружают целиком в раствор этилового спирта. Время дезинфекции составляет 30 минут. Если используется другой стерилизатор, время удлиняется до 1 часа. После завершения данного этапа устройство обрабатывают водой и протирают насухо.

Для подсчета лейкоцитов с помощью камеры Горяева необходимо подготовить образец крови и само приспособление. Для этого выполняются следующий пункты:

разведение биологической жидкости раствором уксусной кислоты с метиленовым синим в пропорции 1:20;
стекло протирают спиртом и сухой марлевой салфеткой до появления специфических колец, при этом важно не повредить поверхность;
пустое стекло предварительно просматривают под микроскопом, чтобы предотвратить попадание инородных предметов;
полученную разведенную кровь добавляют на углубление камеры с помощью стеклянной палочки;
жидкость должна распределится равномерно, для этого выжидают 1-2 минуты после ее нанесения;
на предметное стекло направляют микроскоп, подсчитывают все лейкоциты;
полученную цифру вставляют в формулу, которая подсчитывает общее количество лейкоцитов в объёме жидкости.

Внимание! Если в жидкость попал воздух, подсчет лейкоцитов невозможен. Камеру промывают дистиллированной водой, наливают разведенную кровь повторно.

Подсчет лейкоцитов в камере Горяева с уксусной кислотой уничтожает все эритроциты, а метиленовый синий дает окрашивание белых кровяных телец.

При получении данных пациентами или врачом следует учитывать, что метод не является достаточно точным. Лаборант может ошибиться в подсчете, пропустить некоторые клетки. Более информативные данные получают при подсчете лейкоцитов с помощью полуавтоматических анализаторов, которые в точности измеряют число клеток в 1 мл биологической жидкости.

Подсчет клеток осуществляет, учитывая что кровь разводилась в 20 раз, клетки считались в 100 квадратах. Поэтому используют следующую формулу:

L=(a×250×20)×10 6 /100

L – обозначение лейкоцитов, которые необходимо рассчитать;
a – количество подсчитанных лейкоцитов;
250 – число, при умножении на которое получается количество клеток на 1 мкл крови, так как объём большого квадрата составляет 1/250 мкл;
20 – разведение материала при подсчете лейкоцитов в камере Горяева;
100 – число больших квадратов;
10 6 – число мкл в 1 квадрате.

Подробно о том, как правильно подсчитать лимфоциты.

По формуле выводится количество лейкоцитов на 1 литр крови. У здорового человека это число составляет 4-9×10 9 /л. Показатели могут варьировать в норме, слега выходя за пределы значений, в зависимости от следующих факторов:

возраст;
прием пищи;
время суток;
состояние организма.

Если после подсчета формулы, показатель резко возрастает или снижается, исследования проводят повторно. После подтверждения результата бланк анализа передают пациенту или врачу.

Повышение лейкоцитов происходит при:

инфекционных, вирусных, грибковых заболеваниях (это означает, что организм борется с болезнью);
злокачественных и доброкачественных новообразованиях, которые приводят к резкому увеличению количества форменных элементов крови.

Снижение количества лейкоцитов появляется при нарушениях иммунной системы. Возможны следующие состояния:

врожденный или приобретенный иммунодефицит;
патологические состояния красного костного мозга, приводящие к снижению продукции форменных элементов крови.

С помощью камеры Горяева исследуется осадок урины. Для этого биологическую жидкость оставляют на некоторое время в пробирке. Форменные элементы, другие вещества осаждаются на дно пробирки. С помощью стеклянной палочки берётся небольшое количество мочи с осадком, добавляется в полость камеры.

Дальнейшие подсчеты аналогичны методу исследования крови. Определяется количество клеток в 100 квадратах, полученный результат подставляется в формулу.

Методика подсчета лейкоцитов в моче с помощью камеры Горяева является недостаточно точной, так как возможны следующие нарушения:

ошибка в подсчете;
забор недостаточного количества осадка;
нахождение большего количества лейкоцитов в другой части мочи.

Поэтому при спорных результатах врачи рекомендуют пройти исследование урины с помощью полуавтоматических анализаторов. Но при подсчете лейкоцитов с помощью камеры Горяева возможно обнаружение врачом лаборантом дополнительных образований:

Полуавтоматический анализатор выявляет только заданный параметр.

В норме лейкоциты не должны находиться в урине. Возможно незначительное их количество, которое отличается по полу:

3 клеток у мужчин;
5 клеток у женщин.

Если количество показателей повышено, это означает, что образовался воспалительный процесс в одном из отделов мочевыделительного пути.

Камера Горяева — устройство, которое используется в медицинских учреждениях. Метод не даёт стопроцентной гарантии полученных результатов. Но врач может с помощью микроскопа найти другие клетки или образования, которые помогут поставить диагноз.

Екатерина Беликова, врач лабораторной диагностики, специально для Mirmam.pro

источник

Камера Горяева представляет из себя простое устройство для визуального подсчета форменных элементов крови под микроскопическим увеличением. Оно сконструировано на основе предметного стекла, имеющего специальные углубления для номинального объема крови, а также покровного стекла с нанесенной сеткой.

Различают несколько конструкций камеры Горяева в зависимости от количества камер (углублений для заполнения кровью), чаще всего в лабораториях применяются двухкамерные или четырехкамерные модели. Над каждой из камер находится специальная счетная сетка, нанесенная на покровное стекло методом лазерной гравировки либо при помощи микронапыления краски.

Приспособление сконструировано таким образом, что все имеющиеся камеры имеют равный объем, который указан в технической документации модели, их глубина и размеры секторов покровной сетки также стандартны. Это делает возможным переводить после подсчета форменных элементов их суммарные значения в единицы концентрации заданных клеток в объеме крови.

Покровное стекло имеет гравировку в виде сетки, большие квадраты которой имеют величину стороны в 1 мм. Чаще всего таких квадратов 9 над каждой счетной камерой, они расположены так, что образуют три столбца по три квадрата в каждом. Те большие квадраты, что располагаются по периферии, разделены на 16 квадратов поменьше, длина и ширина которых равны 0,2 мм. Стандартная глубина камеры под этими квадратами позволяет легко подсчитывать количество клеток в единицах объема, он равен для них 0,1 мм 3 или 10 -4 мл.

Большой квадрат, расположенный посередине, имеет дополнительные разделяющие линии, они нанесены так, что делят каждый из 16 средних квадратов еще на 16 самых маленьких. Их сторона равна 0,05 мм.

Подсчет форменных элементов крови ведется под микроскопом с применением соответствующего увеличения, чаще всего используется окуляр х10. Подсчитывают число клеток в тех больших квадратах, что разделены на 16 средних, начинают считать от верхнего левого и двигаются вниз направо, захватывая при подсчете 5 больших квадратов.

Для того, чтобы верно определить количество клеток в заданном объеме крови, необходимо исключить повторный подсчет тех форменных элементов, что располагаются на границах или узлах сетки. Такая ошибка привела бы к увеличению подсчитываемого показателя, для ее устранения было сформулировано правило Егорова. Оно гласит, что к данному квадрату относятся те элементы, что лежат в его пределах, не касаясь нанесенных линий, а также те клетки, что располагаются на верхней и левой сторонах квадрата. Те клетки, что «касаются» нижней или правой стороны, при подсчете учитываться не должны.

Для подсчета лейкоцитов в крови в современных клинических лабораториях чаще всего используются специальные автоматические анализаторы, методика подсчета при помощи камеры Горяева относится к редко применяемым из-за своей трудоемкости и низкой скорости анализа. Для того, чтобы верно определить концентрацию отдельных видов лейкоцитов, требуется врач лабораторной диагностики или фельдшер-лаборант, владеющий навыками работы с микроскопом.

Для подсчета отдельных видов лейкоцитов кровь разводят в несколько раз слабым раствором уксусной кислоты, при этом образцы без лейкоцитоза, как правило, следует разводить не менее чем в 20 раз, в случаях выраженного увеличения количества белых кровяных телец может потребоваться большее разведение. Для контрастирования изображения применяют окрашивание метиленовой синью.

После заполнения камер исследуемым объемом крови сверху накладывается покровное стекло сеткой и производится ее притирка, в ходе которой должны полностью исчезнуть пузыри воздуха между двумя стеклами. Заполненная камера помещается под микроскоп, причем целесообразно оставить ее неподвижной на 1-2 минуты для того, чтобы форменные элементы полностью прекратили движение и осели.

После этого на среднем увеличении (окуляр не менее чем х10) проводится подсчет отдельных видов лейкоцитов в не менее чем 100 квадратах. Для перевода получившегося числа в объемные значения необходимо умножить его на разведение (как правило, в 20 раз) и на количество квадратов, участвовавших в подсчете (чаще всего 100). Полученное число дает представление о количестве лейкоцитов в 1 мкл крови.

Исследуемую кровь разводят при помощи физиологического раствора минимум в 100 раз для того, чтобы стал возможен визуальный подсчет красных кровяных телец. При недостаточном разведении в камерах образуется двойной слой форменных элементов крови, что делает невозможным их определение. После наложения покровного стекла и притирки проводят микроскопирование препарата при увеличении окуляром х10. Подсчет ведется во всех 5 больших квадратах, разделенных линиями на 16 секторов. Расчет объемных значений проводят при помощи умножения полученного числа эритроцитов на степень разведения (чаще в 100 или 200 раз) и на 4000, затем проводят деление полученного числа на 80 (количество малых квадратов при подсчете). Полученное число характеризует количество эритроцитов в 1 мкл крови.

источник

Камера Горяева – это приспособление для измерения числа клеток и частиц в определённом объёме жидкости (кровь, моча), состоящее из специального толстого предметного и покровного стёкла.

Предметное стекло имеет углубленную площадку посередине, на которую нанесена сетка из 225 больших квадратов. Из этих квадратов 25 равномерно разделены на 16 меньших квадратов. Благодаря такому объёму сетки подсчёт выполняется точнее, нежели в других ручных счётных устройствах.

После использования инструмента предметное стекло дезинфицируют путём погружения в 4% раствор формалина на час или в 70% раствор этилового спирта на полчаса. После этого камеру тщательно промывают дистиллированной водой. Излишек жидкости убирают мягкой салфеткой. Стоит обратить внимание на то, что камеру нельзя протирать ватным тампоном из-за цепляющихся к ней волокон. Хранится стекло в сухом месте.

Во время использования камеры в подсчитываются те ФЭ, которые располагаются внутри квадрата сетки и на верхней и левой линии его периметра. При этом частицы, касающиеся правой и нижней линии периметра во время расчёта данной клетки не включаются.

Подсчёт количества лейкоцитов начинается с разведения крови в 3-5% растворе этановой кислоты с метиловой синью в 20 раз. Рабочий материал перед применением протирают марлей насухо.

Покровное стекло нужно протереть до возникновения цветных колец Ньютона. Далее, камеру заполняют разведённой кровью, при этом первые две капли выпускают на фильтровальную бумагу. Жидкость попадает в камеру благодаря капиллярному свойству воды. Важно проследить, чтобы в желобки при заполнении ничего не затекало. Если это произошло, жидкость аккуратно убирают фильтровальной бумагой. Затем оставляют сетку в покое на минуту, ожидая, пока ФЭ остановят своё движение.

Подсчёт лейкоцитов осуществляется в пределах ста больших квадратов при малом увеличении, то есть при окуляре 10х и объективе 8х, по правилу Егорова. Полученная цифра используется в формуле.

Х = (n × 250 × 20) / 100 или Х = n × 50

n – число, полученное в результате подсчёта в камере.

Количество лейкоцитов определяют, принимая во внимание число больших квадратов сетки – 100 и разведение крови – 20.

Как происходит подсчет лейкоцитов

Норма лейкоцитов у людей составляет 4,0 – 9,0 × 10⁹/л. Или, по-другому, в 1 кубическом мм крови располагается примерно 6000 белых кровяных клеток.

На отклонения от нормы могут влиять внешние физиологические факторы:

приём пищи перед сдачей крови;
стресс;
беременность или менструация у женщин;
переохлаждение или перегрев;
большая физическая нагрузка перед сдачей анализов.

Если количество белых кровяных клеток превышает 9,0 × 10⁹/л (повышены лейкоциты), такое состояние называется лейкоцитозом. Подобную картину можно увидеть при злокачественных заболеваниях крови, инфекциях, поражениях радиацией и отравлениях.

Лекарственные препараты тоже способны увеличить количество лейкоцитов. Некроз тканей, обильные кровотечения, в том числе в результате операций, почечная кома, болезни сердца – всё это может привести лейкоцитозу.

Падение количества лейкоцитов ниже 3,9 × 10⁹/л называется лейкопенией. Однако у некоторых людей фиксируется постоянное число лейкоцитов в количестве 3,5 × 10⁹/л. Принято считать, что у таких людей сохраняется резерв этих клеток в тканях в 50 раз больше, нежели в крови. Еще встречается функциональная лейкопения после введения анальгетиков, сульфаниламидов и других лекарственных препаратов, после долгой мышечной работы, в результате поражения инфекциями и вирусами (тиф, грипп, корь).

Все виды лейкоцитов составляют лейкоцитарную формулу. По ней можно выявить определённые патологии. Нормы формулы меняются в зависимости от возраста и периода жизни человека. Сдвиг хорошо заметен у женщин во время беременности или после родов.

Применяются разные способы подсчёта соотношения видов этих клеток, но все они связаны с тем, что более тяжелые клетки (базофилы, например) располагаются ближе к краю мазка, а лимфоциты, как легкие клетки, остаются в середине.

Метод Филипченко. В данном способе подсчёт осуществляется по поперечной прямой границы одного конца к другому. Мазок при этом мысленно разделяют на три части.
Метод Шиллинга. Лейкоциты подсчитывают в четырех участках мазка.

Полученные данные записываются в таблицу. Индивидуально количество каждого вида белых клеток крови высчитывается по формулам. Отмечаются те элементы, которые попали в поле зрения. Счёт ведётся до того, момента, пока сумма всех подсчитанных клеток не составит 100.

В моче подсчитывается количество лейкоцитов в камере Горяева по Нечипоренко. Этот анализ нужен для мониторинга заболеваний почек. Периодическое исследование мочи помогает проследить за правильностью лечения и эффективностью назначенной терапии.

В изучение идёт только первая утренняя моча в середине мочеиспускания. Для пациента важно следовать основным правилам сбора этого биоматериала. Специальной дополнительной подготовки для исследования не требуется.

10 мл свежесобранной мочи центрифугируют в течение трёх минут при 2,5 тыс. оборотов в минуту. Перед этим необходимо проследить, чтобы моча, во избежание частичного распада клеток, имела слабокислую реакцию.

При помощи пипетки с узким оттянутым концом убирают верхний слой. В пробирке оставляют от 0,5 мл мочи до 1 мл в зависимости от объёма осадка.

Осадок аккуратно перемешивают с надосадочной жидкостью. Полученным раствором заполняют счётную камеру Горяева по схожему принципу, что используется при подсчёте ФЭ крови. Камеру оставляют в покое от 3 до 5 минут.

Лейкоциты необходимо подсчитать в больших квадратах по всей сетке с окуляром 7х и объективом 40х.

Полученная цифра используется в формуле:

Х = (а/0,9) × (1000/V)

Х – число лейкоцитов в 1 мл мочи.

а – подсчитанное количество, делённое на объём камеры в 1 мкл осадка мочи.

v – Количество мочи, взятой для исследования.

Это важно! Норма лейкоцитов: в 1 мл мочи не более 2 × 10³ белых кровяных клеток.

источник

Данный пробирочный метод состоит из следующих этапов:

Пробирка заполняется уксусной кислотой с тиазиновым красителем на 0,4 мл. С помощью капиллярной пипетки берется 20 мкл свежей крови и выдувается в эту же пробирку. Полученная смесь тщательно смешивается.
Тонкая стеклянная пластинка, находящаяся в камере, тщательно вытирается, после чего образуются радужные разводы.
Далее берется капля полученного раствора из крови с уксусной кислотой и подносится к краю пластинки.
Когда камера будет заполнена, ее не беспокоят в течение одной минуты, чтобы белые клетки крови начали оседать.
При малом увеличении производится подсчет лейкоцитов.

Для подсчета лейкоцитов используют три вида формул:

N = m x 4000 x 20/(64 x 16) = m x 78.13 ≈ m x 78

N = m x 4000 x 20 / (169 x 16) ≈ m x 29.6

N = m x 4000 x 20 / (100 x 16) ≈ m x 50.

К функциональным отклонениям относят:

заболевания, носящие вирусную или бактериальную этиологию (кишечные инфекции, гепатит А и другое);
реакция на некоторые медикаменты;
при сильной нагрузке на мышцы, стрессы, диеты;
при неправильном хранении крови.

К органическим причинам можно отнести:

панмиелофтиз;
лейкоз;
болезнь Ходжкина;
ревматическая болезнь;
облучение ионами;
агранулоцитоз.

Лейкоцитозом организм отвечает в том случае, когда на него оказывают влияние эндогенные и экзогенные факторы. На практике выделяют физиологическую, а также патологическую формы болезней.

К физиологическим причинам можно отнести:

переваривание пищи – в этот период значение лейкоцитов резко растет, но через три часа все приходит в норму;
стресс, нервы, физический труд, переохлаждение или перегрев, беременность с третьего месяца, менструация.

К патологическим причинам относят:

рак крови;
попадание в организм некоторых инфекций, а также воспаление (сепсис);
радиация, отравления организма различными ядами, в том числе насекомых;
действие некоторых лекарственных препаратов (нейромедиаторы, биогенный амин, стероидные гормоны и другое);
некроз тканей, серьезные болезни сердца, гангрены, почечная кома;
обильные кровотечения (получение серьезных ран, операции в гинекологии и так далее).

источник

Сегодня камера Горяева является одним из самых используемых приспособлений в лабораторной диагностике. С ее помощью можно подсчитать количество тех или иных кровяных клеток. Как известно, анализ крови крайне важен для процесса диагностики и лечения почти каждого заболевания.

Столь известное и полезное приспособление было разработано и предложено русским врачом Н. К. Горяевым. Камера Горяева, по сути, представляет собой специфическое предметное стекло с нанесенной на него микроскопической сеткой.

Для чего используется эта камера? В первую очередь с ее помощью определяют количество кровяных клеток, в частности лейкоцитов и эритроцитов. Кстати, с ее же помощью можно определить увеличение используемого микроскопа. Формула для этого выглядит следующим образом:

Kg — это увеличение микроскопа;
m2 — положение правой границы клетки камеры Горяева;
m1 — положение левой границы;
а — размер одной клетки, который является стандартным и составляет 0,05 мм;
N — это количество клеток между измеряемыми границами камеры.

Камера Горяева представляет собой не что инное, как предметное стекло (но намного толще обычного), разделенное поперечными бороздами на три части. Средняя часть стекла содержит специальную сетку для подсчета. Крайние же части камеры служат для притирания покровного стекла — таким образом, по центру создается закрытая камера с капиллярными пространствами по бокам, через которые она и заполняется жидкостью.

Что же касается сетки, то камера Горяева разделена на 225 больших квадратов равных размеров — расположены они в пятнадцать рядов. 25 больших квадратов дополнительно разделены на меньшие, по 16 в каждом. Длина каждой стороны этого маленького квадратика составляет 0,05 мм.

Безусловно, в данном случае огромное значение имеет техника проведения лабораторного исследования. Конечно же, все поверхности камеры Горяева должны быть чистыми и сухими. После этого покровное стекло притирают так, чтобы можно было увидеть характерные радужные кольца. Крайне важно, чтобы в камере не было пузырьков воздуха, так как это может исказить результаты анализа.

Естественно, для того чтобы подсчитать количество форменных элементов, для каждой разновидности кровяных клеток используются разные реактивы. Например, для подсчета эритроцитов используется 0,9% раствор натрия хлорида. В пробирке нужно смешать 8 мл раствора соли и 0,02 мл крови. Так, лаборант разбавляет кровь в 400 раз. Иногда разведение может быть большим.

Для того чтобы подсчитать количество лейкоцитов, нужно смешать 0,4 мл уксусной кислоты (берут 3% или 5% раствор) и 0,02 мл крови.

После того как компоненты перемешаются в пробирке, с помощью специальной пипетки набирают небольшое количество смеси и аккуратно заполняют камеру для счета (как правило, одной или двух капель будет вполне достаточно).

Подсчет эритроцитов в камере Горяева осуществляется в пяти больших квадратах, что равно восьмидесяти малым. Для того чтобы избежать ошибки из-за неравномерного распределения образцов крови, выбирают квадраты, расположенные по диагонали. Отдельное внимание обращают на клетки, расположенные по краям, — здесь считают эритроциты на левой и верхней стенках, но не берут во внимание те, которые расположены на нижней и правой линиях.

Для того чтобы определить количество эритроцитов в миллилитре крови, число клеток в пяти больших квадратах умножают на 20 000 (при разведении в 400 раз).

Лейкоциты в камере Горяева считают по-другому. Здесь нужно вычислить количество элементов по меньшей мере в сотне больших квадратов. Полученное количество делят на 1600, после чего умножают на 4000, а затем на 20 (степень разведения).

источник

Определение количества лейкоцитов. Методика подсчета лейкоцитов в камере горяева, нормы показателей и отклонения

Метод подсчета в камере. Взятие и разведение крови производят пробирочным методом. В пробирку (лучше видалевскую) вносят 0,4 мл разводящей жидкости и 0,02 мл капиллярной крови. Полученное разведение практически считается равным 1: 20. В качестве разводящей жидкости обычно употребляют 3-5%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенной метиленовым синим (уксусная кислота лизирует эритроциты, метиленовый синий окрашивает ядра лейкоцитов). Перед заполнением камеры Горяева пробирку с разведенной кровью тщательно встряхивают. Камеру заполняют так же, как для подсчета эритроцитов.

Лейкоцитов гораздо меньше, чем эритроцитов (1-2 на большой квадрат), поэтому для точности подсчет производят в 100 больших квадратах (неразграфленных). Расчет: в 100 больших квадратах (1600 малых) сосчитано а лейкоцитов. Помня, что объем малого квадрата равен 1/4000 мм3, а кровь разведена в 20 раз, рассчитывают количество лейкоцитов в 1 мкл крови: 4000 ґ 20 и делят на 1600 = а х 1/2. Практически для получения действительного содержания лейкоцитов в 1 мкл крови достаточно полученное при подсчете число разделить пополам и приписать 2 нуля.

В среднем ошибка метода составляет ± 7%.

Более точным (ошибка 2-3%) и совершенным является подсчет лейкоцитов с помощью электронных аппаратов. Подсчет лейкоцитов в счетчиках частиц производят по тому же принципу, что и эритроцитов. Предварительно кровь разводят и смешивают с каким-либо лизирующим эритроциты реактивом. В автоанализаторе “Техникон” в качестве такового применяют раствор уксусной кислоты, в аппаратах “Культер” и “Целлоскоп” — сапонин или сапоглобин, которые добавляют разведенными (1: 500, 1: 700) в изотоническом растворе хлорида натрия (6 капель на 20 мл разведения).

Подсчет лейкоцитарной формулы крови производят в окрашенных мазках периферической крови. Считать лучше ближе к концу мазка в самом тонком месте, не менее 200 клеток (исключение составляют выраженные лейкопении), а затем выводят процентное соотношение отдельных видов лейкоцитов. Подсчет рекомендуется производить в одном порядке: половину клеток считать в верхней, половину — в нижней части мазка, не заходя на самый край и середину, по зигзагу (3-4 поля зрения вдоль мазка, 3-4 поля под прямым углом к середине мазка, затем 3-4 поля в сторону параллельно краю, вновь под прямым углом вверх и так далее в одну сторону).

Тщательно вымытым и обезжиренным предметным стеклом (его краем) прикасаются к капле крови на месте укола. Мазок делают шлифовальным стеклом, поставив его под углом в 45° к предметному стеклу впереди капли. Подведя стекло к этой капле, ждут, пока кровь расплывется вдоль его ребра, затем быстрым легким движением проводят шлифовальное стекло вперед, не отрывая от предметного раньше, чем иссякнет вся капля.

Правильно сделанный мазок имеет желтоватый цвет (тонкий), не достигает краев стекла и заканчивается в виде следа (усов).

Окрашивание сухих мазков производят после предварительной фиксации. Лучшая фиксация достигается в абсолютном метиленовом спирте (3-5 мин) или в смеси Никифорова из равных частей абсолютного этилового спирта и эфира (30 мин).

К основным гематологическим краскам относят метиленовый синий и его производное — азур I (метиленовый азуровый) и азур II (смесь равных частей азура I и метиленового синего), к кислым — водорастворимый желтый эозин.

● Окраска по Романовскому-Гимзе. Краска Романовского-Гимзе (заводского приготовления) имеет следующий состав: азур II — 3 г, водорастворимый желтый эозин — 0,8 г, метиловый спирт — 250 мл и глицерин — 250 мл.

Рабочий раствор краски приготавливают из расчета 1,5-2 капли готовой краски на 1 мл дистиллированной воды. Краску наливают на мазок возможно более высоким слоем; длительность окраски — 30-35 мин. По истечении этого срока мазки промывают водой и высушивают на воздухе. При этом способе удается хорошо дифференцировать ядро, но гораздо хуже — нейтрофильную зернистость цитоплазмы, поэтому его широко используют для окраски мазка периферической крови.

● Комбинированная окраска Мая-Грюнвальда-Романовского-Гимзе по Паппенгейму. На фиксированный мазок наливают пипеткой готовый краситель — фиксатор Мая-Грюнвальда, представляющий собой раствор эозинметиленового синего в метиленовом спирте, на 3 мин. Через 3 мин к покрывающей раствор краске добавляют равное количество дистиллированной воды и продолжают окрашивание еще 1 мин. После этого краску смывают и мазок высушивают на воздухе. Затем высушенный мазок докрашивают свежеприготовленным водным раствором краски Романовского в течение 8-15 мин. Этот метод считается наилучшим, особенно для окраски мазков костно-мозговых пунктатов.

Увеличение числа лейкоцитов в периферической крови выше нормального уровня называют лейкоцитозом, уменьшение — лейкопенией. Лейкоцитоз (лейкопения) редко характеризуется пропорциональным увеличением (уменьшением) числа лейкоцитов всех видов, например лейкоцитоз при сгущении крови. В большинстве случаев имеется увеличение числа (уменьшение) какого-либо одного типа клеток. Увеличение или уменьшение числа отдельных видов лейкоцитов в крови может быть относительным или абсолютным в зависимости от общего содержания лейкоцитов — нормального, повышенного или пониженного. Изменение числа, соотношения отдельных форм и морфологии лейкоцитов зависит от вида и вирулентности возбудителя, характера, течения и распространенности патологического процесса, индивидуальной реакции организма.

Тщательно перемешивают содержимое пробирки и замечают время – 20

минут.

Набирают смесь крови с цитратом в капилляр Панченкова без пузырьков воздуха до метки «0» и ставят капилляр в штатив Панченкова на 1 час.

4. Проведение исследований

Через 20 минут колориметрируют смесь крови с трансформирующим раствором на ФЭКе или МИНИГЕМе.

При использовании ФЭКа концентрацию гемоглобина определяют по калибровочному графику.
Готовят к работе счетную камеру – притирают к камере Горяева покровное стекло так, чтобы появились радужные кольца.
Тщательно встряхивают пробирку с кровью, разведенной уксусной кислотой.
Заполняют камеру Горяева смесью крови и уксусной кислоты.
Оставляют камеру в горизонтальном положении на 1 минуту для оседания лейкоцитов.
Готовят микроскоп к работе: настраивают свет, конденсор опускают.
Подсчитывают под микроскопом (окуляр 10х или 15х, объектив 8х) лейкоциты в 100 больших не разграфленных квадратах.
По формуле определяют количество лейкоцитов в 1л крови.
Через 1 час снимают показания СОЭ.

Задания для самостоятельной работы

1. Законспектировать алгоритм проведения укороченного анализа крови.

2. Оборудовать рабочее место для исследования.

3. Провести укороченный анализ крови.

4. Оформить результаты исследования в виде таблицы:

5. Оценить результаты исследования.

представления : диагностическое значение количества эритроцитов в крови;

знания: морфология и функции эритроцитов, количество эритроцитов в крови в норме и при патологии;

умения: определение количества эритроцитов в крови.

^ ФАКТОРЫ ПРЕАНАЛИТИЧЕСКОГО ЭТАПА,

ВЛИЯЮЩИЕ НА КОЛИЧЕСТВО ЭРИТРОЦИТОВ В КРОВИ

Количество эритроцитов в крови снижается при положении обследуемого лежа, после еды (на 10%), при беременности, в пожилом возрасте, при употреблении в пищу бобовых, алкоголя, лечении антибиотиками, сульфаниламидами, анальгетиками.
Физиологическое повышение количества эритроцитов в крови отмечается у женщин после 60 лет (на 8-9%), с 7.00 до 17.00 (на 5%), у курящих.

Принцип. Подсчитывают эритроциты под микроскопом в определенном объеме счетной камеры при постоянном разведении крови.

0,9% раствор хлорида натрия (физиологический раствор).

Специальное оборудование: микроскоп, счетная камера Горяева.

В чистую сухую пробирку с помощью мерной пипетки или автоматического дозатора наливают точно 4мл физиологического раствора.
Вносят 0,02мл (капилляр Сали) крови в физраствор, промывают им капилляр 2-3 раза.
Перемешивают содержимое пробирки. При этом получается разведение крови в 200 раз.
Оставляют до момента счета, но не более 2-3 часов. При подозрении на анемию подсчет проводят тотчас же после взятия крови, так как эритроциты при некоторых видах анемий быстро разрушаются.
Подготавливают к работе камеру Горяева.
Ещё раз тщательно перемешивают содержимое пробирки и заполняют этой смесью камеру Горяева с помощью пастеровской пипетки или стеклянной палочки с оплавленным концом.
Оставляют заполненную счетную камеру на 1 минуту в горизонтальном положении для оседания эритроцитов.
Подсчитывают эритроциты в 5 больших квадратах, разграфленных каждый на 16 малых квадратов и расположенных по диагонали сетки Горяева (см. рис. 3). Таким образом, считают эритроциты в 80 малых квадратах. Счет начинают с левого верхнего угла сетки и ведут при условиях: конденсор опущен, окуляр 10х или 15х, объектив 8х.
При подсчете эритроцитов руководствуются теми же правилами, что и при подсчете лейкоцитов, то есть считают все клетки, находящиеся внутри квадрата и на разграничительных линиях, если они большей частью заходят внутрь квадрата. Клетки же, пересеченные разграничительной линией точно пополам, подсчитывают лишь на двух сторонах квадрата (например, левой и верхней) – см. рис. 2.

Количество эритроцитов в 1мкл крови рассчитывают по формуле

— количество эритроцитов в 1мкл крови;

а — количество эритроцитов, подсчитанных в 80 малых квадратах

4000 – коэффициент перевода объема на 1мкл (объём одного малого квадрата равен

мкл);

80 – количество сосчитанных малых квадратов.

Чтобы перевести содержание эритроцитов в единицы СИ (1л крови), следует количество эритроцитов в миллионах умножить на 10 12 .

Практически для определения содержания эритроцитов в 1л крови необходимо количество эритроцитов, подсчитанное в 5 больших квадратах, разделить на 100 (то есть перенести запятую на 2 знака влево) и умножить на 10 12 .

Пример. В пяти больших квадратах камеры Горяева подсчитано 440 эритроцитов.

Принцип метода состоит в подсчете эритроцитов в камере Горяева. Для уменьшения концентрации форменных элементов и создания удобной для подсчета их концентрации кровь предварительно разводится стандартным образом.

Пипеткой отмерьте 4 мл разводящего раствора (3,5% раствор NaCl) и вылейте в сухую пробирку. Капилляр Сали обработайте раствором цитрата натрия.

Из прокола пальца (работа № 1) выпустите свежую каплю крови, приставьте к ней кончик капилляра Сали и наполните его до отметки 0,02. Это соответствует объему 0, 02 мл или 20 мкл. Вытрите кончик капилляра и выпустите кровь в пробирку с разводящим раствором. Полученное таким образом разведение крови — 1:200.

После тщательного перемешивания раствора крови небольшой каплей заполните подготовленную — с притертым стеклом камеру Горяева. Камеру перед заполнением промойте водой и насухо вытрите. На участок камеры, где нанесены сетки, уложите обезжиренное покровное стекло, при этом нижняя поверхность камеры должна находиться на третьих пальцах обеих рук, двумя вторыми пальцами придерживайте ее спереди. Двумя пальцами притрите покровное стекло, плавно продвигая его по поверхности прямоугольных пластинок до появления цветных колец Ньютона в местах соприкосновения покровного стекла с поверхностью пластинок камеры.

Каплю исследуемой жидкости пипеткой поместите перед щелью, образованной покровным стеклом и пластинкой камеры Горяева с нанесенной сеткой. Капля должна заполнить камеру самотеком (под действием капиллярных сил). Следите, чтобы в пространстве над сеткой не было пузырьков воздуха и избытка жидкости.

До начала подсчета оставьте счетную камеру на 1 — 2 мин для осаждения форменных элементов. Камеру положите на столик микроскопа и настройте его на малое увеличение (объектив 8 — 9, окуляр 10 или 15). Подсчет производите при несколько опущенном конденсоре. Хорошую контрастность обеспечивает фазово-контрастное устройство. Эритроциты считайте в пяти больших квадратах, состоящих из 16 малых (5  16 = 80 малых), расположенных по диагонали. Для записи результатов рекомендуется предварительно расчертить на листе 5 больших квадратов, разлинованных 4х4 и записывать найденное число эритроцитов в каждую клеточку. При подсчете необходимо помнить правило буквы «Г».

Подсчитав число эритроцитов в 80 маленьких квадратах (N) рассчитывают число клеток в 1 мкл (мм 3) крови (X). Для этого учитывается разведение в 200 раз, объем камеры над одним маленьким квадратиком 1/4000 мкл и то, что клетки подсчитывались в 80 таких квадратах. Таким образом, формула для вычисления количества эритроцитов следующая:

Полученное количество эритроцитов можно также выразить в количестве на 1л крови (умножением полученного количества на 10 6), что является стандартной размерностью этого показателя.

Рекомендации по оформлению протокола работы. Выводы делаются исходя из того, что в норме количество эритроцитов должно составлять: 3,6-4,5 х 10 12 кл/л для женщин; 4,5 — 5 х 10 12 кл/л — для мужчин. После небольшой нагрузки – 5 — 5,5 х 10 12 кл/л.

Сразу после рождения количество эритроцитов составляет около 6,0 х 10 12 кл/л (колебания в пределах 5,4 — 7,2 х 10 12 кл/л). С конца первых — начала вторых суток жизни обычно происходит снижение числа эритроцитов в крови, наиболее выраженное на 5 — 7-й день. Минимального значения этот показатель достигает к 2 — 3 мес, а затем несколько увеличивается и в дальнейшем (с 5 — 6-го месяца) поддерживается на уровне взрослых.

Если количество эритроцитов выше нормы, то это явление называется эритроцитоз , а если меньше, то эритропения или анемия . Увеличение количества эритроцитов в крови (эритроцитоз) встречается при гемоконцентрации (ложный эритроцитоз), а также при усилении эритропоэза на фоне неизменной интенсивности гемолиза (истинный эритроцитоз). Уменьшение количества эритроцитов в крови может наблюдаться при гемодилюции (ложная эритропения).

Лабораторная камера Горяева , названная в честь русского врача, профессора Казанского университета Горяева Н.К., является специальным монолитным предметным стеклом, предназначенным для подсчета количества клеток в заданном объеме жидкости. Кроме того, используя камеру Горяева можно определить увеличение микроскопа. Камеры Горяева широко применяются в области клинических и биомедицинских исследований.

Популярные области применение камеры Горяева:

Подсчет форменных элементов крови
- Подсчет эритроцитов
- Подсчет лейкоцитов
- Подсчет ретикулоцитов
- И т.п.
Подсчет форменных элементов мочи
Исследование эякулята – оценка количественных и качественных параметров сперматозодиов
Вычисление концентрации спор в вакцине
Подсчет ооцист в препарате
И т.п.

Камеры Горяева выпускаются в двух модификациях: двухсеточные (двухкамерные) и четырехсеточные (четырехкамерные). В определении цены камеры Горяева важную роль играет качество шлифовки стекла, метод нанесения сетки – лазерная гравировка или же вакуумное напыление.

Что собой представляет камера Горяева? Камера Горяева есть не что иное, как прозрачное монолитное предметное стекло поперечными прорезями и нанесенной специальным образом микроскопической сеткой. В случае двухкамерной камеры Горяева мы имеем четыре прорези, образующие три поперечно расположенных площадки, при этом средняя площадка разделена продольной прорезью на две одинаковых камеры, на каждой из поверхности площадки которых нанесена сетка. В случае же четырехкамерной камеры Горяева мы получаем предметное стекло с пятью прорезями, образующих четыре площадки, при этом две внутренние дополнительно разделены продольной прорезью для получения четырех камер с нанесенной микроскопической сеткой на поверхности площадок.

Рассмотрим более подробно особенности сетки . Специальная сетка наносится на внутренние площадки, расположенные ниже соседних боковых площадок на 0.1мм. Боковые площадки предназначены для притирания покровного стекла до появления Ньютоновских колец. Как правило, используют специальное покровное стекло для камеры Горяева с закругленными краями. После притирания покровного стекла создается камера, закрытая с двух боковых сторон, а с двух других остаются щели (так называемые, капиллярные пространства), через которые и заполняют камеру. Что конкретно представляет собой сетка? Микроскопическая сетка камеры Горяева расчерчена на большие и маленькие квадраты, сгруппированные различными способами. Сетка Горяева содержит 225 больших квадратов (15 рядов по 15 больших квадратов в каждом), разграфленных вертикально, горизонтально, крест-накрест и неразграфленных. При этом размеры малых делений клетки сетки составляют 0.05мм, а больших – 0.2мм. Важно, что малый квадрат со стороной 0.05мм во всех сетках является постоянной величиной. Не трудно рассчитать, что площадь малого квадрата равна 0.0025 мм2, а большого квадрата – 0.04мм2. Тогда получаем, что объем жидкости над квадратом, образованным большими делениями сетки Горяева, составляет 0.004 микролитра.

Подсчитав количество форменных элементов (ФЭ) над большим квадратом, можно подсчитать плотность данного типа клеток в суспензии по формуле:

где X — количество ФЭ/мл, M- количество ФЭ над большим квадратом.

При работе с камерой Горяева важно следить, чтобы ее рабочие поверхности оставались сухими и чистыми. Кроме того, при подсчете форменных элементов нельзя допускать наличие воздушных пузырей на сетке камеры, так как они могут мешать точности подсчета.

После работы с камерами Горяева следует выполнить их дезинфекцию одним из допустимых способов:

Погружение в 70%-ный раствор этилового спирта на 30 минут
Погружение в 4%-ный раствор формалина на 60 минут при комнатной температуре.

Приведем примеры применения камеры Горяева и некоторые формулы.

Прежде чем приступить к проведению лабораторных исследований, рекомендуется тщательно протереть камеру Горяева небольшим кусочком чистого бинта, слегка смоченного в спирте. Мы не советуем использовать для этих целей вату, так как она может оставить волокна. Таким же образом следует обработать и покровное стекло для камеры Горяева. Учтите, что при использовании низкокачественного спирта на поверхностях может образоваться осадок, тем или иным образом мешающий проведению исследований. Чтобы избежать появления связанных с этим явлением нежелательных эффектов, рекомендуется дополнительно протереть камеру и покровное стекло чистым марлевым шариком без спирта. Притирание покровного стекла к камере должно быть выполнено очень тщательно до появления на месте контакта радужных колец (так называемых, цветных колец Ньютона) с обоих краев. Для лучшего притирания можно воспользоваться одной хитростью и слегка выдохнуть воздух на камеру и покровное стекло, так чтобы небольшое количество влаги сконденсировалось на поверхностях стекол, что обеспечит лучший контакт.

При отсутствии специальных покровных стекол, прилагающихся к камере Горяева, можно использовать обычные стандартные покровные стекла.

Помимо целевого использования камеры Горяева для подсчета форменных элементов крови и т.п., данное стекло может расцениваться как своеобразный эталон для определения увеличения микроскопа. Для этого следует воспользоваться следующей формулой:

где X – это увеличение микроскопа; p1 – положение левой границы клетки камеры Горяева; p2 – положение правой границы клетки или группы клеток; N – количество клеток между измеряемыми границами; a — размер клетки камеры Горяева (равен 0,05 мм).

Камера Горяева также используется для подсчёта количества клеток в культуре.

Для подсчета клеточных элементов в жидкостях, содержащих их в меньших концентрациях, используются аналогичные по конструкции камеры Фукса-Розенталя и Нажотта , имеющие большую глубину – 0.2 мм и 0.5 мм соответственно. Эти же камеры используются в альгологии для количественного учета фитопланктона. Часто камера Фукса-Розенталя используется для подсчета форменных элементов спинномозговой жидкости. В отличие от камеры Горяева, большие квадраты сетки Фукс-Розенталя не разграфлены и сгруппированы по 16 квадратов, причем каждая такая группа ограничена тройными линиями.

Наиболее часто камеры Горяева используются именно для определения форменных элементов крови при проведении лабораторных исследований. Так для подсчета эритроцитов кровь необходимо развести в 200 раз, лейкоцитов – в 20 раз. Количество форменных элементов (ФЭ) в 1мкл крови определяют по формуле:

где N – искомое количество ФЭ в 1 мкл крови; m – число ФЭ в определенном количестве малых квадратов; q – количество малых квадратов сетки камеры Горяева, в которых подсчитывались ФЭ, s – степень разведения крови.

Для подсчета эритроцитов используются 5 больших или 80 малых квадратов сетки, расположенных по диагонали. Таким образом, получаем следующую формулу:

Для подсчета лейкоцитов можно использовать один из трех методов:

1. Лейкоциты считают в 64 больших (пустых) квадратах

2. Лейкоциты считают по всей сетке в 169 больших квадратах (рекомендуется для образцов крови с выраженной лейкопенией)

3. Лейкоциты считают в 100 больших квадратах (64 пустых + 36 разграфленных квадратов по периметру сетки)

Таблица нормальных значений:

Для определения ФЭ в мочевом осадке при анализах мочи по Нечипоренко, Аддис-Каковскому, Амбурже осуществляется по всей сетке Горяева и рассчитывается по формуле:

где N – число ФЭ в 1 мкл осадка; m – число ФЭ, подсчитанных по всей сетке; 0.676 – объем камеры Горяева (мкл)

Х = (n × 250 × 20) / 100 или Х = n × 50

n – число, полученное в результате подсчёта в камере.

Как происходит подсчет лейкоцитов

На отклонения от нормы могут влиять внешние физиологические факторы:

приём пищи перед сдачей крови;
стресс;
беременность или менструация у женщин;
переохлаждение или перегрев;

Лекарственные препараты тоже способны увеличить количество лейкоцитов. Некроз тканей, обильные кровотечения, в том числе в результате операций, почечная кома, болезни сердца – всё это может привести лейкоцитозу.

Метод Филипченко. В данном способе подсчёт осуществляется по поперечной прямой границы одного конца к другому. Мазок при этом мысленно разделяют на три части.
Метод Шиллинга. Лейкоциты подсчитывают в четырех участках мазка.

Полученная цифра используется в формуле:

Х – число лейкоцитов в 1 мл мочи.

а – подсчитанное количество, делённое на объём камеры в 1 мкл осадка мочи.

v – Количество мочи, взятой для исследования.

Это важно! Норма лейкоцитов: в 1 мл мочи не более 2 × 10³ белых кровяных клеток.

источник