Меню Рубрики

Методы качественного и количественного анализа гормонов

Количественный анализ выражается последовательностью экспериментальных методов, определяющих в образце исследуемого материала содержание (концентрации) отдельных составляющих и примесей. Его задача – определить количественное соотношение химсоединений, ионов, элементов, составляющих образцы исследуемых веществ.

Качественный и количественный анализ являются разделами аналитической химии. В частности, последний решает различные вопросы современной науки и производства. Этой методикой определяют оптимальные условия проведения химико-технологических процессов, контролируют качество сырья, степень чистоты готовой продукции, в том числе и лекарственных препаратов, устанавливают содержание компонентов в смесях, связь между свойствами веществ.

Методы количественного анализа подразделяют на:

  • физические;
  • химические (классические);
  • физико-химические.

Базируется на применении различных видов реакций, количественно происходящих в растворах, газах, телах и т. д. Количественный химический анализ подразделяют на:

  • Гравиметрический (весовой). Заключается в точном (строгом) определении массы анализируемого компонента в исследуемом веществе.
  • Титриметрический (объемный). Количественный состав исследуемой пробы определяют путем строгих измерений объема реагента известной концентрации (титранта), который взаимодействует в эквивалентных количествах с определяемым веществом.
  • Газовый анализ. Базируется на измерении объема газа, который образуется или поглощается в результате химической реакции.

Химический количественный анализ веществ считается классическим. Это наиболее разработанный метод анализа, который продолжает развиваться. Он точен, прост в исполнении, не требует спецаппаратуры. Но применение его иногда сопряжено с некоторыми трудностями при исследовании сложных смесей и сравнительно небольшой чертой чувствительности.

Это количественный анализ, базирующийся на измерении величин физических параметров исследуемых веществ или растворов, которые являются функцией их количественного состава. Подразделяется на:

  • Рефрактометрию (измерение величин показателя преломления).
  • Поляриметрию (измерение величин оптического вращения).
  • Флуориметрию (определение интенсивности флуоресценции) и другие

Физическим методам присущи экспрессность, низкий предел определения, объективность результатов, возможность автоматизации процесса. Но они не всегда специфичны, так как на физическую величину влияет не только концентрация исследуемого вещества, но и присутствие других веществ и примесей. Их применение часто требует использования сложной аппаратуры.

Задачи количественного анализа – измерение величин физических параметров исследуемой системы, которые появляются или изменяются в результате проведения химических реакций. Эти методы характеризуются низким пределом обнаружения и скоростью исполнения, требуют применения определенных приборов.

Это старейшая и наиболее разработанная технология количественного анализа. По сути, аналитическая химия началась с гравиметрии. Комплекс действий позволяет точно измерять массу определяемого компонента, отделенного от других компонентов проверяемой системы в постоянной форме химического элемента.

Гравиметрия является фармакопейным методом, который отличается высокой точностью и воспроизводимостью результатов, простотой исполнения, однако трудоемок. Включает приемы:

  • осаждения;
  • отгонки;
  • выделения;
  • электрогравиметрию;
  • термогравиметрические методы.

Количественный анализ осаждения основан на химической реакции определяемого компонента с реагентом-осадителем с образованием малорастворимого соединения, которое отделяют, затем промывают и прокаливают (высушивают). На финише выделенный компонент взвешивают.

Например, при гравиметрическом определении ионов Ва 2+ в растворах солей как осадитель используют серную кислоту. В результате реакции образуется белый кристаллический осадок BaSO4 (осажденная форма). После прожарки этого осадка формируется так называемая гравиметрическая форма, полностью совпадающая с осажденной формой.

При определении ионов Са 2+ осадителем может быть оксалатная кислота. После аналитической обработки осадка осажденная форма (СаС2О4) превращается в гравиметрическую форму (СаО). Таким образом, осажденная форма может как совпадать, так и отличаться от гравиметрической формы по химической формуле.

Аналитическая химия требует высокоточных измерений. В гравиметрическом методе анализа используют особо точные весы как основной прибор.

  • Взвешивания при требуемой точности ±0,01 г проводят на аптечных (ручных) или технохимических весах.
  • Взвешивания при требуемой точности ±0,0001 г осуществляют на аналитических весах.
  • При точности ±0,00001 г – на микротерезах.

Осуществляя количественный анализ, определение массы вещества на технохимических или технических весах проводят следующим образом: исследуемый предмет помещают на левую чашу весов, а уравновешивающие грузики – на правую. Процесс взвешивания заканчивают при установлении стрелки весов в среднем положении.

В процессе взвешивания на аптечных весах центральное кольцо удерживают левой рукой, локтем опираясь на лабораторный стол. Затухание коромысла во время взвешивания может быть ускорено легким прикосновением дна чаши весов к поверхности стола.

Аналитические весы монтируют в отдельных отведенных лабораторных помещениях (весовых комнатах) на специальных монолитных полках-подставках. Для предотвращения влияния колебаний воздуха, пыли и влаги весы защищают специальными стеклянными футлярами. Во время работы с аналитическими весами следует придерживаться следующих требований и правил:

  • перед каждым взвешиванием проверяют состояние весов и устанавливают нулевую точку;
  • взвешиваемые вещества помещают в тару (бюкс, часовое стекло, тигель, пробирку);
  • температуру веществ, подлежащих взвешиванию, доводят до температуры весов в весовой комнате в течение 20 минут;
  • весы не следует нагружать сверх установленных предельных нагрузок.

Гравиметрический качественный и количественный анализ включают следующие этапы:

  • расчета масс навески анализируемой пробы и объема осадителя;
  • взвешивания и растворения навески;
  • осаждения (получение осажденной формы определяемого компонента);
  • удаления осадков из маточного раствора;
  • промывания осадка;
  • высушивания или прокаливания осадка до постоянной массы;
  • взвешивания гравиметрической формы;
  • вычисления результатов анализа.

При выборе осадителя – основы количественного анализа – учитывают возможное содержание анализируемого компонента в пробе. Для увеличения полноты удаления осадка используют умеренный избыток осадителя. Используемый осадитель должен обладать:

  • специфичностью, селективностью относительно определяемого иона;
  • летучестью, легко удаляться при высушивании или прокаливании гравиметрической формы.

Среди неорганических осадителей наиболее распространены растворы: HCL; Н2SO4; H3PO4; NaOH; AgNO3; BaCL2 и другие. Среди органических осадителей предпочтение отдается растворам диацетилдиоксима, 8-гидроксихинолина, оксалатной кислоте и другим, образующим с ионами металлов внутрикомплексные устойчивые соединения, обладающие преимуществами:

  • Комплексные соединения с металлами, как правило, имеют незначительную растворимость в воде, обеспечивая полноту осаждения ионов металла.
  • Адсорбционная способность внутрикомплексных осадков (молекулярная кристаллическая решетка) ниже адсорбционной способности неорганических осадков с ионным строением, что дает возможность получить чистый осадок.
  • Возможность селективного или специфического осаждения ионов металла в присутствии других катионов.
  • Благодаря относительно большой молекулярной массе гравиметрических форм уменьшается относительная ошибка определения (в противовес использованию неорганических осадителей с небольшой молярной массой).

Это важнейший этап характеристики количественного анализа. При получении осажденной формы необходимо минимизировать расходы за счет растворимости осадка в маточном растворе, уменьшить процессы адсорбции, окклюзии, соосаждения. Требуется получить достаточно крупные частицы осадка, не проходящие через фильтрационные поры.

Требования к осажденной форме:

  • Компонент, который определяют, должен количественно переходить в осадок и соответствовать значению Ks≥10 -8 .
  • Осадок не должен содержать посторонних примесей и быть устойчивым относительно внешней среды.
  • Осажденная форма должна как можно полнее превращаться в гравиметрическую при высушивании или прокаливании исследуемого вещества.
  • Агрегатное состояние осадка должно соответствовать условиям его фильтрации и промывки.
  • Предпочтение отдают кристаллическим осадком, содержащим крупные частицы, имеющим меньшую абсорбционную способность. Они легче фильтруются, не забивая поры фильтра.

Условия получения оптимального кристаллического осадка:

  • Осаждения проводят в разбавленном растворе исследуемого вещества разведенным раствором осадителя.
  • Добавляют раствор осадителя медленно, каплями, при осторожном перемешивании.
  • Осаждения проводят в горячем растворе исследуемого вещества горячим растворителем.
  • Иногда осаждения проводят при наличии соединений (например, небольшого количества кислоты), которые незначительно повышают растворимость осадка, но не образуют с ним растворимых комплексных соединений.
  • Осадок оставляют в исходном растворе на некоторое время, в течение которого происходит «вызревание осадка».
  • В случаях, когда осажденная форма образуется в виде аморфного осадка, его пытаются получить гуще для упрощения фильтрации.

Условия получения оптимального аморфного осадка:

  • К горячему концентрированному раствору исследуемого вещества добавляют концентрированный горячий раствор осадителя, что способствует коагуляции частиц. Осадок становится гуще.
  • Добавляют осадитель быстро.
  • При необходимости в исследуемый раствор вводят коагулянт – электролит.

Методы количественного анализа включают такой важный этап, как фильтрация. Фильтрование и промывание осадков проводят, используя или стеклянные фильтры, или бумажные, не содержащие золы. Бумажные фильтры различны по плотности и размерам пор. Плотные фильтры маркируются голубой лентой, менее плотные – черной и красной. Диаметр бумажных фильтров, не содержащих золы, 6-11 см. Перед фильтрацией сливают прозрачный раствор, находящийся над осадком.

Количественный анализ может осуществляться методом электрогравиметрии. Исследуемый препарат удаляют (чаще всего из растворов) в процессе электролиза на одном из электродов. После окончания реакции электрод промывают, высушивают и взвешивают. По увеличению массы электрода определяют массу вещества, образовавшегося на электроде. Так анализируют сплав золота и меди. После отделения золота в растворе определяют ионы меди, скапливаемые на электроде.

Осуществляется измерением массы вещества во время его непрерывного нагрева в определенном интервале температур. Изменения фиксируются специальным устройством – дериватографом. Оно оборудовано термотерезами непрерывного взвешивания, электрической печью для нагрева исследуемого образца, термопарой для измерения температур, эталоном и самописцем непрерывного действия. Изменение массы образца автоматически фиксируется в виде термогравиграмы (дериватограмы) – кривой изменения массы, построенной в координатах:

  • время (или температура);
  • потеря массы.

Результаты количественного анализа должны быть точными, правильными и воспроизводимыми. С этой целью используют соответствующие аналитические реакции или физические свойства вещества, правильно выполняют все аналитические операции и применяют надежные способы измерения результатов анализа. Во время выполнения любого количественного определения обязательно должна проводиться оценка достоверности результатов.

источник

Анализа (химические, физико-химические, физические и биологические).

Требования, предъявляемые к реакциям в количественном анализе. Роль

И значение количественного анализа в фармации

Количественный анализ — совокупность методов аналитической химии для определения количества (содержания) элементов (ионов), радикалов, функциональных групп, соединений или фаз в анализируемом объекте.

Цели количественного анализа

Количественный анализ позволяет установить элементный и молекулярный состав исследуемого объекта или содержание отдельных его компонентов.

В зависимости от объекта исследования различают неорганический и органический анализ. В свою очередь их разделяют на элементный анализ, задача которого — установить, в каком количестве содержатся элементы (ионы) в анализируемом объекте, на молекулярный и функциональный анализы, дающие ответ о количественном содержании радикалов, соединений, а также функциональных групп атомов в анализируемом объекте.

Наряду с качественным анализом Количественный анализ является одним из основных разделов аналитической химии. По количеству вещества, взятого для анализа, различают макро-, полумикро-, микро- и ульт-рамикрометодыКоличественный анализ В макрометодах масса пробы составляет обычно >100 мг, объём раствора > 10 мл; в ультрамикрометодах — соответственно 1—10 -1 мг и 10 -3 —10 -6 мл . В зависимости от объекта исследования различают неорганический и органический. Количественный анализ, разделяемый, в свою очередь, на элементный, функциональный и молекулярный анализ. Элементный анализ позволяет установить содержание элементов (ионов), функциональный анализ — содержание функциональных (реакционноспособных) атомов и групп в анализируемом объекте. Молекулярный Количественный анализ предусматривает анализ индивидуальных химических соединений, характеризующихся определенной молекулярной массой. Важное значение имеет так называемый фазовый анализ — совокупность методов разделения и анализа отдельных структурных (фазовых) составляющих гетерогенных систем. Помимо специфичности и чувствительности важная характеристика методов Количественный анализ — точность, то есть значение относительной ошибки определения; точность и чувствительность в Количественный анализ выражают в процентах.

К классическим химическим методам Количественный анализ относятся: гравиметрический анализ, основанный на точном измерении массы определяемого вещества, и объёмный анализ. Последний включает титриметрический объёмный анализ — методы измерения объёма раствора реагента, израсходованного на реакцию с анализируемым веществом, и газовый объёмный анализ — методы измерения объёма анализируемых газообразных продуктов.
Наряду с классическими химическими методами широко распространены физические и физико-химические (инструментальные) методы Количественный анализ, основанные на измерении оптических, электрических, адсорбционных, каталитических и других характеристик анализируемых веществ, зависящих от их количества (концентрации). Обычно эти методы делят на следующие группы: электрохимические (кондуктометрия, полярография, потенциометрия и др.); спектральные или оптические (эмиссионный и абсорбционный спектральный анализ, фотометрия, колориметрия, нефелометрия, люминесцентный анализ и др.); рентгеновские (абсорбционный и эмиссионный рентгеноспектральный анализ, рентгенофазовый анализ и др.); хроматографический (жидкостная, газовая, газо-жидкостная хроматография и др.); радиометрические (активационный анализ и др.); масс-спектрометрические. Перечисленные методы, уступая химическим в точности, существенно превосходят их по чувствительности, избирательности, скорости выполнения. Точность химических методов Количественный анализ находится обычно в пределах 0,005—0,1%; ошибки определения инструментальными методами составляют 5—10%, а иногда и значительно больше.

ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Химические методы количественного химического анализа – основаны на принципе проведения химической реакции с определяемым компонентом анализируемой пробы.

Химические методы химического анализа подразделяют на титриметрический, гравиметрический и волюмометрический методы.

1) методы титриметрии:

Титриметрический анализ (титрование) — методы количественного анализа в аналитической и фармацевтической химии, основанные на измерении объёма раствора реактива точно известной концентрации, расходуемого для реакции с определяемым веществом. Титрование — процесс определения титра исследуемого вещества. Титрование производят с помощью бюретки, заполненной титрантом до нулевой отметки. Титровать, начиная от других отметок, не рекомендуется, так как шкала бюретки может быть неравномерной. Заполнение бюреток рабочим раствором производят через воронку или с помощью специальных приспособлений, если бюретка полуавтоматическая. Конечную точку титрования (точку эквивалентности) определяют индикаторами или физико-химическими методами (по электропроводности, светопропусканию, потенциалу индикаторного электрода и т. д.). По количеству пошедшего на титрование рабочего раствора рассчитывают результаты анализа.

источник

Выделение и качественный анализ гормонов производят многими методами.

Их подразделяют на четыре основные группы: биологические, химические, иммунологические и методы сатур анионного анализа. Классификация методов определения гормонов в значительной мере условна, так как многие из них являются комбинированными.

Биологические методы определения гормонов базируются на учете специфичности их влияния при тестировании на лабораторных животных или in vitro. Эффект действия гормонов оценивается по изменению массы органов, их гистологического строения, физиологических, биохимических и других показателей. Например, активность андрогенов определяют по изменениям массы гребня у кастрированных петухов, эстрогенов — по изменениям вагинального эпителия у овариоэктомированных мышей, прогестерона — по сохранению беременности у крольчих и т. п. Распространенным является метод суммарного определения действия гонадотропинов (ФСГ и ЛГ) по увеличению массы матки у неполовозрелых мышей. Применяют и другие методы, в которых учитывается увеличение массы яичников у неполовозрелых крыс, овуляция у крольчих и т. д. Определение гонадотропного гормона в СЖК осуществляют на самцах лягушек. Общую активность гонадотропина выражают в мышиных или крысиных единицах по минимальной дозе, которая вызывает на 50% увеличение матки инфантильных мышей или крыс, и сравнивают с международным стандартом. Согласно международному стандарту фоллитропную активность СЖК определяют по увеличению массы яичников у инфантильных крыс, а лютропную — по уменьшению количества аскорбиновой кислоты в яичниках.

Для учета эффекта действия тиротропина (ТТГ) применяют гравиметрический метод, основанный на определении изменения массы щитовидной железы. Более чувствительным является гистологический метод оценки по изменениям высоты клеток тиреоидного эпителия, размеров фолликулов и состояния коллоида. Биологическую активность пролактина определяют по увеличению зобной железы голубя и т. д.

Методы определения гормонов in vitro зачастую более чувствительны и экономичнее других биологических методов. Поэтому, в последние годы тестирование активности гормонов, особенно гормонов гипофиза и гипоталамуса, производится in vitro в биологических средах (тканях, гомогенатах, клеточных суспензиях), с последующим определением их содержания флюориметрическим или радиоиммунологическим методами.

Химические и физико-химические методы количественного анализа гормонов в биологических жидкостях и тканях получили широкое распространение. Большинство химических методов определения гормонов основано на использовании реакций, с помощью которых выявляют и учитывают особенности их химической структуры. Очень часто определение содержания гормонов возможно лишь после их предварительного извлечения и очистки, которые достигаются экстракцией, ультрацентрифугированием, хроматографией, осаждением белков и т. д. Для разделения смеси белковых гормонов часто применяют электрофорез в полиакриламидном геле. Под действием электрического поля заряженные молекулы гормонов перемещаются в геле. При этом поры геля выполняют функцию «молекулярного сита».

Эффективным методом очистки белковых и пептидных гормонов является ионно-обменная хроматография с применением специальных смол и других компонентов. Для разделения катехоламинов и стероидных гормонов применяют адсорбционную (молекулярную) колоночную хроматографию. Чаще всего в различных методах хроматографии используют растворители с определенной полярностью, которые под действием капиллярных сил обеспечивают перемещение в слое сорбента исследуемых гормонов. В последние годы для количественного анализа стероидных гормонов применяют газожидкостную хроматографию. Через колонку газового хроматографа, заполненную гранулами адсорбента с растворителем, с помощью газа-носителя (аргон, водород, азот) продувают нагретую в испарительной камере исследуемую смесь. Выход гормонов из колонки в потоке газа регистрируется детектором. Для газо-жидкостной хроматохрафии требуется предварительная очистка экстрактов стероидов и их разделение с помощью тонкослойной и других видов хроматографии.

Значительная часть химических методов основана на применении колориметрического и флюоресцентного анализов, которые особенно широко используются для определения содержания стероидов. Поглощение света растворами исследуемых гормонов находится в прямой зависимости от их концентрации. Чувствительность флюориметрических методов определения гормонов в 10—20 раз выше чувствительности спектрофотометрии. В последние годы химические и биологические методы определения гормонов частично вытесняются радиоиммунологическими методами, которые оказались менее громоздкими, более чувствительными и специфичными.

Иммунологические методы основаны на способности белковых и полипептидных гормонов индуцировать выработку антител при гетероиммунизации. Для иммунологического тестирования гормонов применяют реакции связывания комплемента, преципитации и торможения пассивной гемагглютинации. В связи с наличием иммунологической специфичности белковых гормонов иммунологические методы, разработанные для гормонов одного вида животных, как правило, не могут использоваться для определения тех же гормонов у других видов животных.

В основе методов сатурационного или радиолигандного анализа лежит конкурентное взаимодействие молекул гормона и специфических антител или другого связывающего белка. При введении в систему для тестирования меченого лиганда — гормона, маркированного радиоактивным изотопом или конъюгированного с каким-либо ферментом, происходит насыщение (сатурация) связывающего белка. При последующем добавлении немеченного гормона (антигена) часть молекул лиганда вытесняется из комплекса с белком. Содержание исследуемого гормона методами сатурационного анализа определяют по калибровочной кривой для различных концентраций стандарта. В методах сатурационного анализа используют специфические белки, обладающие высоким сродством к соответствующим гормонам. С учетом применения специфических белков (антитела, рецепторные белки тканей, транспортные белки плазмы крови) различают следующие методы: радиоиммунологические (ферментноиммунологические), радиолигандно-рецепторные (радиорецепторные) и конкурентного связывания с белками плазмы.

Чувствительность иммунологических методов при применении специфических антител к гормону, меченных радиоактивным изотопом, значительно увеличивается. В связи с этим их выделяют в отдельную группу и называют радиоиммунологическими. Эти методы основаны на свойствах немеченного антигена вытеснять меченный антиген из соответствующего комплекса антиген — антитело. В последние годы, в основном в медицине, радиоиммунологические методы широко применяются для определения инсулина, глюкагона, соматотропина, гонадотропинов (ФСГ, ЛГ) и других гормонов.

Для анализа белковых гормонов перспективен ферментноиммунологический метод. В сравнении с радиоиммунологическим он имеет преимущества, так как в данном случае не требуются радиоактивные изотопы, а гормоны, меченные ферментами, имеют более высокую устойчивость при хранении. Применяемые меченные йодом-125 гормоны можно использовать только в течение 20 дней, с условием их хранения при температуре —20° С, а меченные ферментами гормоны при стерильном приготовлении не теряют активности в течение 6 мес. Ферментоиммунологический метод в настоящее время успешно применяется для определения гипофизарных гормонов в крови молодняка крупного рогатого скота.

В последние годы получили применение радиорецепторные методы, которые дают возможность определить содержание активной части гормонов, в то время как радиоиммунологическими методами определяют только их общее содержание. Клеточные рецепторы приготовляют из матки кроликов, крыс или овец — для определения эстрогенов, из молочной железы кроликов — для определения ЛТГ и СТГ и т. д. Радиорецепторные методы разработаны и используются для определения эстрогенов, АКТГ, пролактина и других гормонов.

Читайте также:  Список анализов на женские гормоны

Методы конкурентного связывания с белками плазмы базируются на избирательном сродстве их с соответствующими гормонами и широко применяются для определения количества стероидных и тиреоидных гормонов.

В настоящее время разработаны и широко применяются высокоэффективные радиобиологические методы определения ТТГ-активности, основанные на измерении накопления и выделения радиоактивного йода в щитовидной железе после введения ТТГ и измерении радиоактивности крови и ее сыворотки. Концентрация ТТГ определяется в нанограммах в I мл сыворотки (нг/мл). Для функциональной характеристики щитовидной железы определяется количество свободного тироксина и трийодтиронина в сыворотке крови с помощью радиоиммунологических и других методов. Однако в связи с их трудоемкостью часто используют метод определения в сыворотке (плазме) связанного с белком йода (СБИ), так как основная часть СБИ сыворотки крови принадлежит тиреоидным гормонам. Для определения активности щитовидной железы применяют также пробы поглощения индикаторных доз радиоактивного йода.

Важным условием оценки методов определения гормонов является адекватность их показателей с фактическим содержанием гормонов в организме. Определение содержания белковых, полипептидных гормонов и производных аминокислот в гипофизе, щитовидной и других железах должно осуществляться с учетом концентрации гормонов в инкретирующих органах и в крови, так как синтез, депонирование и инкреция упомянутых гормонов регулируются разными механизмами. Синтезирующиеся в надпочечниках и гонадах стероидные гормоны не депонируются, содержание этих гормонов в железах адекватно отражает их биосинтез и инкрецию. Методы прямого определения гормонообразования в соответствующих органах имеют преимущества, однако для исследований чаще применяют более доступные косвенные методы определения гормонов и их метаболитов в крови и моче.

Для более полной характеристики функциональной деятельности эндокринных желез, некоторые авторы рекомендуют применять комплексную оценку с учетом их функциональной активности, состояния механизмов регуляции и интенсивности инактивации и выделения гормонов из организма. Гормональный статус у сельскохозяйственных животных необходимо определять с учетом их вида, породы, типов конституции, продуктивности, возраста, пола, условий кормления и содержания. Это важно для более эффективного применения гормонов и их аналогов в различных областях животноводства и ветеринарии.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

источник

Качественный и количественный анализ являются предметом аналитической химии. Аналитическая химия занимается исследованием экспериментальных методов определения состава веществ. Определение состава веществ включает выявление природы компонентов, из которых состоит исследуемое вещество, и установление количественных соотношений этих компонентов.

Сначала устанавливают качественный состав исследуемого объекта, т.е. решают вопрос, из чего он состоит, а затем приступают к определению количественного состава, т.е. узнают, в каких количественных соотношениях обнаруженные составные части находятся в объекте исследования.

Качественный анализ вещества можно проводить химическими, физическими, физико-химическими методами.

Химические методы анализаоснованы на применении характерных химических реакций для установления состава анализируемого вещества.

Химический анализ вещества проводят двумя способами: «сухим путем» или «мокрым путем». Анализ сухим путем — это химические реакции, происходящие с веществами при накаливании, сплавлении и окрашивании пламени.

Анализ мокрым способом — это химические реакции, протекающие в растворах электролитов. Анализируемое вещество предварительно растворяют в воде или других растворителях. В зависимости от массы или объема взятого для анализа вещества, от применяемой техники различают макро-, полумикро- и микрометоды.

Макрометод. Для проведения анализа берут 1-2 мл раствора, содержащего не менее 0,1 г вещества, и добавляют не менее 1 мл раствора реактива. Реакции проводят в пробирке, осадок отделяют фильтрованием. Осадок на фильтре промывают от примесей.

Полумикрометод. Для анализа берут в 10-20 раз меньше вещества (до 0,01 г). Так как в этом методе работают с малыми количествами вещества, то пользуются микропробирками, часовыми или предметными стеклами. Для отделения осадка от раствора применяют центрифугирование.

Микрометод. При выполнении анализа данным методом берут одну-две капли раствора, а сухого вещества — в пределах 0,001г. Характерные реакции проводят на часовом стекле или фарфоровой пластинке.

При проведении анализа пользуются следующими операциями: нагревание и выпаривание, осаждение, центрифугирование, проверка полноты осаждения, отделение раствора (центрифуга) от осадка, промывание и растворение осадка.

Нагревание растворов можно вести непосредственно пламенем газовой горелки, на асбестовой сетке или водяной бане. Небольшое количество раствора нагревают до температуры, не превышающей 100°С, на водяной бане, вода в которой должна кипеть равномерно.

Для концентрирования растворов применяют водяную баню. Выпаривание раствора до сухого остатка проводят в фарфоровых чашках или тиглях, нагревая их на асбестовой сетке. Если сухой остаток после выпаривания необходимо прокалить для удаления летучих солей, то тигель ставят на фарфоровый треугольник и нагревают пламенем газовой горелки.

Осаждение. Реакцию осаждения проводят в конических колбах или цилиндрической пробирках. В исследуемый раствор приливают пипеткой реактив-осадитель. Осадитель берут в избытке. Смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой и потирают о внутренние стенки пробирки, это ускоряет процесс образования осадка. Осаждение часто ведут из горячих растворов.

Центрифугирование. Осадок отделяют от раствора центрифугированием, используя ручную или электрическую центрифугу. Пробирку с раствором и осадком помещают в гильзу. Центрифуга должна быть загружена равномерно. При быстром вращении центробежная сила отбрасывает частицы осадка на дно и уплотняет его, а раствор (центрифугат) становится прозрачным. Время вращения составляет от 30 с до нескольких минут.

Проверка полноты осаждения. Пробирку осторожно вынимают из центрифуги и добавляют по стенке 1-2 капли реактива-осадителя к прозрачному раствору. Если раствор не мутнеет, значит осаждение полное. Если же наблюдается помутнение раствора, то в пробирку еще добавляют осадитель, содержимое перемешивают, нагревают и вновь центрифугируют, затем повторяют проверку полноты осаждения.

Отделение раствора (центрифугата) от осадка. Убедившись в полноте осаждения, отделяют раствор от осадка. Раствор от осадка отделяют капельной пипеткой. Пипетку закрывают указательным пальцем и осторожно вынимают из пробирки. Если отобранный раствор необходим для анализа, то его переносят в чистую пробирку. Для полного отделения операцию повторяют несколько раз. При центрифугировании осадок может плотно осесть на дно пробирки, тогда раствор отделяют декантацией (осторожно сливают).

Промывание осадка. Осадок (если он исследуется) необходимо хорошо отмыть; для этого приливают промывную жидкость, чаще всего дистиллированную воду. Содержимое тщательно перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют, затем промывную жидкость отделяют. Иногда в работе эту операцию повторяют 2-3 раза.

Растворение осадка. Для растворения осадка в пробирку добавляют растворитель, помешивая стеклянной палочкой. Нередко растворение осадка ведут при нагревании на водяной бане.

Для определения количественного состава вещества или продукта используются реакции нейтрализации, осаждения, окисления — восстановления, комплексообразования. Количество вещества можно определить по его массе или объему раствора, затраченного на взаимодействие с ним, а также по показателю преломления раствора, его электрической проводимости или интенсивности окраски и т.п.

По количеству взятого для исследования вещества аналитические методы количественного анализа классифицируются следующим образом: макроанализ — 1-10 г твердого вещества, 10-100 мл анализируемого раствора; полумикроанализ — 0,05-0,5 твердого вещества, 1-10 мл анализируемого раствора; микроанализ — 0,001-1-10- 4 г твердого вещества, 0,1-1*10- 4 мл анализируемогораствора. В товароведной практике часто пользуются гравиметрическим (весовым) и титриметрическим (объемным) методами.

Гравиметрический (весовой) анализ — один из методов количественного анализа, который позволяет определять состав анализируемого вещества путем измерения массы. Измерение массы (взвешивание) выполняется на аналитических весах с точностью 0,0002 г. Этот метод часто используется в пищевых лабораториях для определения влажности, зольности, содержания отдельных элементов или соединений. Анализ может быть выполнен одним из следующих способов.

1. Определяемую составную часть количественно (полностью, насколько это возможно) выделяют из исследуемого вещества и взвешивают. Так определяют зольность продуктов. Взвешенный на аналитических весах исходный продукт (навеску) сжигают, полученную золу доводят до постоянной массы (прокаливают до тех пор, пока не перестанет изменяться масса) и взвешивают.

Зольность продукта х (%) рассчитывают по формуле

,

где В — масса прокаленной золы, г;

А — исходная навеска продукта, г.

2. Из навески исходного вещества полностью удаляют определяемую составную часть и остаток взвешивают. Так определяют влажность продуктов, при этом навеску исходного вещества высушивают в сушильном шкафу до постоянной массы.

Влажность продукта х (%) рассчитывают по формуле

где А – исходная навеска продукта, г;

В – масса навески после высушивания, г.

Объемный анализ — метод количественного анализа, где искомое вещество определяют по объему реактива с точно известной концентрацией, затраченному на реакцию с этим веществом.

При определении объемным методом к известному объему раствора определяемого вещества малыми порциями (по каплям) добавляют реактив с точно известной концентрацией до тех пор, пока его количество не будет эквивалентно количеству определяемого вещества. Раствор реактива с точно известной концентрацией называется титрованным, рабочим или стандартным раствором.

Процесс медленного прибавления титрованного раствора к раствору определяемого вещества называется титрованием. Момент, когда количество титрованного раствора будет эквивалентно количеству определяемого вещества, называется точкой эквивалентности или теоретической точкой конца титрования. Для определения точки эквивалентности пользуются индикаторами, которые вблизи ее претерпевают видимые изменения, выражающиеся в изменении цвета раствора, появлении помутнения или выпадении осадка.

Важнейшие условия для правильного проведения объемно-аналитических определений: 1) возможность точного измерения объемов растворов; 2) наличие стандартных растворов с точно известной концентрацией; 3) возможность точного определения момента окончания реакции (правильный выбор индикатора).

В зависимости от того, на какой реакции основано определение, различают следующие разновидности объемного метода:

· метод окисления — восстановления

· метод осаждения и комплексообразования.

В основе метода нейтрализации лежит реакция взаимодействия ионов Н + и ОН — . Метод применяется для определения кислот, оснований и солей (которые реагируют с кислотами или основаниями) в растворе. Для определения кислот используют титрованные растворы щелочей КОН или NаОН, для определения оснований — растворы кислот НС1, Н2SO4.

Для определения содержания, например, кислоты в растворе точно отмеренный пипеткой объем раствора кислоты в присутствии индикатора титруют раствором щелочи точно известной концентрации. Точку эквивалентности определяют по изменению цвета индикатора. По объему щелочи, израсходованной на титрование, вычисляют содержание кислоты в растворе.

Метод окисления — восстановления основан на окислительно-восстановительных реакциях, происходящих между стандартным раствором и определяемым веществом. Если стандартный раствор содержит окислитель (восстановитель), то определяемое вещество должно содержать соответственно восстановитель (окислитель). Метод окисления-восстановления подразделяется, в зависимости от используемого стандартного раствора на метод перманганатометрии, метод иодометрии и др.

В основе метода осаждения лежат реакции, сопровождающиеся выпадением осадка. В отличие от гравиметрического метода обработку осадка здесь не производят, массу исследуемого вещества определяют по объему реактива, израсходованному на реакцию осаждения.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Для студента самое главное не сдать экзамен, а вовремя вспомнить про него. 9954 — | 7469 — или читать все.

источник

До 60-х годов прошлого столетия об активности большинства гормонов, особенно белково-пептидной природы судили путем использования биологических методов – по выраженности того или иного эффекта после введения гормона. В 1960г. R. Yalow (Р. Ялоу) и S. Berson (С. Берсон) впервые предложили радиоиммунологический анализ (РИА) для определения инсулина в крови человека. Открытие данного принципа положило начало бурному развитию разработок методов количественного определения гормонов в анализируемых пробах.

К основным преимуществам радиоиммунологического анализа относятся: высокая чувствительность – способность определять минимальные количества вещества, приблизительно равные 10 -14 – 10 -15 моль/л, специфичность, надежность, точность и др.

В основе РИА лежит принцип использования радиоактивной метки для детекции специфических комплексов (антиген-антитело), образующихся в результате иммунологической реакции с исследуемым веществом. При этом происходит конкурентное взаимодействие двух антигенов: немеченого, представляющего собой определяемый гормон, и меченого аналога этого гормона с включенной радиоактивной меткой. Связывающий агент – соответствующее тело, вступает в равноправное взаимодействие как с искомым гормоном, так и с его меченым аналогом. Связывающий агент обладает ограниченной, строго заданной емкостью, и он не может образовывать комплекс сразу со всем количеством меченного и немеченого гормонов. По закону действующих масс происходит связывание гормонов в количествах, пропорциональных их исходным концентрациям:

аГ * аГ * — Ат

Ат

аГ аГ – Ат

аГ * — гормон-антиген с радиометкой

аГ – гормон-антиген искомый, или определяемый

Ат – связующий агент (антитело).

При этом, чем выше содержание искомого (определяемого) гормона в пробе, тем меньшая часть его радиоактивно меченого аналога свяжется с антителом. Следовательно, зная количество связующего агента и меченого гормона, концентрации которых являются величиной заданной, можно рассчитать концентрацию искомого гормона.

В настоящее время разработаны также такие виды радиоиммунологического анализа как иммунорадиометрический, радиорецепторный.

Однако РИА имеет ряд недостатков, в том числе метод требует специального оснащения лабораторий для работы с радиоактивным материалом. Поэтому в начале 1970-х годов было предложено в качестве нерадиоактивного индикатора ферментная метка, когда гормон (антиген) или связующий агент (антитело) химически прочно соединен с ферментом. При этом ферментативная активность впоследствии после соответствующей обработки пропорциональна количеству определяемого гормона. В последние годы для определения гормонов используется иммунологическая реакция, где в качестве субстрата присоединяются люминофоры – вещества, светящиеся в ультрафиолете (метод иммунохемилюминесцентного анализа). Уровень свечения измеряется на специальных приборах люминометрах.

Для успешного усвоения темы выполните следующие задания:

№ п/п Задание Методические указания к выполнению задания
1. Изучите гормоны гипоталамуса и гипофиза. 1. Объясните, почему гипоталамус выполняет роль вегетативного центра нервно-рефлекторной и эндокринной регуляции обмена веществ. 2. Охарактеризуйте структуру и роль гормонов гипоталамуса: релизинг-гормонов, статинов и нейрогормонов (вазопрессина, окситоцита) 3. Почему вазопрессин получил название «антидиуретический гормон»? Каковы причины и проявления несахарного диабета? 4. Разберите структуру и биологическую роль соматотропина, фолликустимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, пролактита, тиротропина, кортикотропина. 5. Охарактеризуйте основы автономной саморегуляции систем – гипоталамо-гипофизарно-гонадной, гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной и гипоталамо-гипофизарно-кортикоидной оси.
2. Изучите йодированные гормоны щитовидной железы. 1. Напишите основные этапы биосинтеза йодированных гормонов щитовидной железы. 2. Отметьте особенности транспорта в крови и взаимодействия с рецепторами тироксина и трийодтиронина. 3. Рассмотрите основные физиологические эффекты тиреоидных гормонов, влияние на энергетический обмен, обмен углеводов, липидов и белков. 4. Охарактеризуйте заболевания, связанные с гипер- и гипопродукцией тироксина и трийодтиронина.
3. Изучите пептидные гормоны, регулирующие кальций-фосфорный обмен. 1. Опишите структуру и метаболические функции в костной ткани, почках и тонком кишечнике кальцитонина щитовидной железы. 2. Опишите структуру и влияние на кальций-фосфорный обмен паратгормона.
4. Изучите инсулин поджелудочной железы. 1. Охарактеризуйте особенности структуры и биосинтеза инсулина. Перечислите стимулы, регулирующие инкрецию инсулина. 2. Обратите внимание на рецептор инсулина, обладающего каталитической активностью. 3. Отметьте влияние инсулина на ключевые регуляторные ферменты гликолиза, гликогенеза, апотомического окисления, цикла трикарбоновых кислот, липогенеза, трансляции белка. 4. Выпишите схему молекулярного механизма внутриклеточной передачи гормонального сигнала инсулина.
5. Изучите нарушения обмена веществ при сахарном диабете. 1. Перечислите формы сахарного диабета. Чем они отличаются? 2. Выпишите основные биохимические проявления сахарного диабета: а) б) в) и т.д. 3. Объясните, почему при сахарном диабете нарушается использование глюкозы крови. Укажите ферментативные блоки гликолиза, гликогенеза, пентозофосфатного окисления. 4. Ответьте, почему при сахарном диабете снижается интенсивность цикла трикарбоновых кислот, усиливается глюконеогенез. 5. Напишите реакцию гликозилирования белков при сахарном диабете. 6. Изучите причины, механизмы и последствия усиления при сахарном диабете липолиза и β-окисления жирных кислот. 7. Каковы нарушения использования ацетил-КоА при сахарном диабете? Объясните причину кетонемии и кетонурии при сахарном диабете. 8. Объясните, почему недостаточность инсулина приводит к нарушению биосинтеза нуклеиновых кислот и белка, к усилению протеолиза тканевых белков и катаболизма аминокислот. 9. Дайте определение понятиям «сахарная кривая», почечный «сахарный порог».
6. Изучите структуру и влияние на обмен веществ глюкогона. 1. Опишите структуру и метаболическое влияние глюкогона на обмен углеводов и нейтрального жира. 2. Представьте схему внутриклеточного механизма передачи гормонального сигнала глюкогона на обмен гликогена и нейтрального жира.
7. Изучите гормоны мозгового слоя надпочечников. 1. Напишите химизм реакций биосинтеза норадреналина и адреналина из тирозина. 2. Перечислите физиологические эффекты адреналина и норадреналина: а) 1) б) 2) в) и др. 3) и т.д. 3. Перечислите биохимические эффекты адреналина в печени, мышечной ткани и жировой ткани. 4. Представьте схему аденилатциклазного пути мобилизации гликогена и нейтрального жира при взаимодействии адреналина с β-рецепторами.
8. Изучите пептидные гормоны, регулирующие кальций-фосфорный обмен. 3. Опишите структуру и метаболические функции в костной ткани, почках и тонком кишечнике кальцитонина щитовидной железы. 4. Опишите структуру и влияние на кальций-фосфорный обмен паратгормона.

Подготовьте к занятию протокол лабораторных работ, выписав кратко принцип метода, технику проведения качественных реакций и количественной оценки гормона на практическом занятии, оставляя место для расчетов и резюме.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Понятие, назначение, характерные особенности синтеза стероидных гормонов. Основы химии андрогенных и эстрогенных гормонов. Характеристика фотоколориметрического метода и метода УФ-спектрофотометрии для количественного определения стероидных гормонов.

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

  • Введение
  • Глава 1. Стероидные гормоны. Общая характеристика
  • Глава 2. Основы химии стероидных гормонов
  • 2.1 Андрогенные гормоны
  • 2.2 Эстрогенные гормоны
  • 2.3 Гестагенные гормоны
  • Глава 3. Физико-химические методы анализа препаратов стероидных гормонов
  • 3.1 Методы УФ-спектрофотометрии, основанные на собственном поглощении
  • 3.2 УФ-спектрофотометрические и колориметрические методы, основанные на химических реакциях
  • 3.3 Инфракрасная спектрофотометрия
  • 3.4 ЯМР-спектроскопия
  • 3.5 Колоночная хроматография

3.6 Методы ТСХ, УФ- спектрофотометрии и фотоколориметрии в фармакопейном анализе лекарственных средств

Стероидные гормоны (СГ) — группа физиологически активных веществ (половые гормоны, кортикостероиды и др.), регулирующих процессы жизнедеятельности у животных и человека.

СГ — один из главных классов гормональных соединений всех видов позвоночных и многих видов беспозвоночных животных. Они являются регуляторами фундаментальных процессов жизнедеятельности многоклеточного организма — координированного роста, дифференцировки, размножения, адаптации, поведения.

У позвоночных стероидные гормоны синтезируются из холестерина в коре надпочечников, клетках Лейдига семенников, в фолликулах и желтом теле яичников, а также в плаценте.

Характерная особенность синтеза СГ — ряд последовательно протекающих процессов гидроксилирования молекул стероидов, происходящих в митохондриях и микросомах.

Они содержатся в составе липидных капель в цитоплазме в свободном виде. В связи с высокой липофильностью стероидные гормоны относительно легко диффундируют через плазматические мембраны в кровь, а затем проникают в клетки-мишени.

Действие стероидных гормонов на клетки-мишени осуществляется, главным образом, на уровне регуляции транскрипции генов. Оно опосредуется образованием комплекса гормона со специфическим регуляторным белком — рецептором, узнающим определенные участки ДНК в генах, регулируемых данным гормоном.

Таким образом, рецепторы всех стероидных гормонов — лиганд-зависимые факторы транскрипции. Для них характерно значительное сходство аминокислотных последовательностей, идентичная доменная структура и сходный механизм действия. Данные вещества являются очень важной частью в организме, так как выполняют множество функций. Одной из наиболее важной функцией, является регуляция периода беременности у женщин, а так же регуляция углеводного и водно-солевого обмена в организме. У мужчин, благодаря стероидам происходят такие процессы как: эякуляции и сперматогенез.

Данные вещества участвуют во многих процессах в организме. С каждым годом, в медицине, обнаруживаются функции, за которые отвечают СГ. Многогранность в функциональности этих гормонов объясняется тем, что это результат взаимодействия данных гормонов со многими различными рецепторами в организме.

Читайте также:  Список анализов на гормоны у мужчин

О том, что при помощи СГ можно лечить различного рода недуги, поведал всему миру всем известный ученый Джеймс Райт. Именно он стал первым человеком, который начал изучать воздействие определенного количества этих препаратов на организм при наличии у человека того или иного заболевания.

Вследствие своей многофункциональности, использование их в медицине в качестве средств лечения каких либо заболеваний очень широко. Они по-разному используются в медицине — в первую очередь, как противовоспалительные и противозачаточные средства.

К гормонам коркового слоя надпочечников относятся такие гормоны как кортикостероиды: гидрокортизон, кортизон, кортикостерон, преднизолон, прегнан.

К половым гормонам мужчин относятся: андростерон, тестостерон, метилтестостерон.

К женским половым гормонам относятся: эстрон, эстрадиол, эстриол, этинилэстрадиол.

В данный момент существует множество препаратов СГ, поэтому анализ их качества является весьма актуальной проблемой.

Цель: Дать обзор физико-химических методов качественного и количественного определения стероидов. Основной упор делается на обзор методов количественного определения всех важных групп стероидов.

1. Рассмотреть методы идентификации стероидных гормонов.

2. Определение стероидов физико-химическими методами в фармакопейном анализе ЛС.

Глава 1. Стероидные гормоны. Общая характеристика

Стероидные гормоны являются производными ряда углеводородов, главным образом, прегнана, антростана, эстрана:

Они сходны между собой по химической структуре. Отличие от андростана состоит в том, что прегнан имеет в структуре этильный радикал, а эстран — ароматическое ядро и у него отсутствует одна метильная группа.

Основой структуры является циклопентанпергидрофенантрен:

Метильные группы, присоединенные к стероидному циклу в положении 10 и 13, называются ангулярными. Радикал R и атомы водорода (в положении 8, 9, 14) ориентированы в пространстве в цис- или транс-положении. Условно принято считать, что ангулярные метильные группы расположены над плоскостью чертежа (это обозначают сплошной линией). Если другие заместители находятся в цис-положении, т. е. в одной плоскости с ангулярными группами (в-конфигурация), то их также обозначают сплошной линией, а если в транс-положении (б-конфигурация), то пунктирной линией.

К числу производных прегнана относятся кортикостероиды и гестагенные гормоны, производными андростана являются андрогенные гормоны, а эстрана — эстрогенные гормоны.

· гестагенные гормоны (гормоны желтого тела) и их синтетические аналоги: прогестерон, прегнин, норэтистерон (норколут), медроксипрогестерона ацетат (депо-провера);

· кортикостероиды: дезоксикортона ацетат (дезоксикортикостерона ацетат), кортизона ацетат, гидрокортизон, преднизолон, фторзамещенные вещества (дексаметазон и др.).

· Андрогенные гормоны и полусинтетические производные, обладающие анаболическим действием (анаболические стероиды): тестостерона пропионат, метилтестостерон, метандиенон (метандростенолон), метандриол (метиландростендиол), нандролона фенилпропионат (феноболин),нандролона деканоат (ретаболил), ципротерона ацетат (андрокур), пипекурония бромид.

· эстрогенные гормоны: этинилэстрадиол, эфиры эстрадиола.[8]

Глава 2. Основы химии стероидных гормонов

Андрогенные гормоны вырабатываются мужскими половыми железами (тестикулами) в период половой зрелости.

В химическом отношении эти вещества являются производными андростана:

Белые с желтоватым оттенком мелкокристаллические порошки, не растворимые в воде, растворимы в спирте, хлороформе и маслах.

Химические свойства и методы анализа

1. Для идентификации веществ используют общегрупповую реакцию на стероидный цикл с кислотой серной концентрированной: метилтестостерон и метиландростендиол образуют желто-оранжевое окрашивание с характерной флуоресценцией, метандростенолон — красное окрашивание.

2. Для обнаружения кетогруппы в 3 положении (тестостерона пропионат, метилтестостерон, метандростенолон) проводят общие реакции образования оксимов, гидразонов, изоникотиноилгидразонов, фенилгидразонов:

3) Спиртовые группы (тестостерона в 17в положении, метилтестостерона в 17в положении, метандростендиола — 3в, 17вположении, метандростенолона в17в положении) обуславливают реакции образования сложных эфиров, которые имеют характерные температуры плавления:

4) Тестостерона пропионат можно идентифицировать по сложноэфирной группировке:

а) по реакции гидролиза с последующей проверкой температуры плавления выделяющегося тестостерона (Т. пл. 150-156 о С):

б) по гидроксамовой реакции:

Андрогенные и анаболические стероидные препараты хранят по списку Б, в хорошо укупоренной таре, предохраняя от действия света и влаги.

стероидный гормон фотоколориметрический

Эстрогенные гормоны вырабатываются в фолликулах.

Они являются производными эстрана (кольцо А — ароматическое):

Известны три природных эстрогенных гормона:

Одним из основных эстрогенов является эстрадиол. Эстрадиол имеет два гидроксила: в 3-м положении — фенольный и в 17-м положении — спиртовой. В качества лекарственного средства применяется эстрадиола дипропионат. В этой форме вещество более устойчиво и оказывает пролонгированное действие.

Наряду с этим препаратом применяется синтетический аналог с этинильной группой (не гормон, но обладает эстрогенной активностью) — этинилэстрадиол. Выпускается в таблетках по 0,00001 и 0,00005 г. Применяется при гипофункции яичников как средство заместительной терапии, а также входит в состав оральных контрацептивных средств (вместе с гестагенами).

Белые, слегка желтоватого цвета мелкокристаллические порошки, очень малорастворимые в воде, растворимы в спирте и в щелочах, так как являются фенолами. За счет ароматического кольца А поглощают в УФ-области спектра (max = 280 нм).

Химические свойства и методы анализа

Подлинность вещества устанавливается общей цветной реакцией на стероидный цикл с конц. H2SO4: этинилэстрадиол дает оранжево-красную окраску с желтовато-зеленой флуоресценцией; местранол — кроваво-красное окрашивание с аналогичной флуоресценцией.

Эстрадиола дипропионат под действием конц. H2SO4 гидролизуется с образованием пропионовой кислоты. Последующее нагревание в присутствии этанола ведет к образованию этилового эфира пропионовой кислоты, имеющего характерный запах:

Ароматическое кольцо А в стероидном цикле имеет фенольный гидроксил и его можно идентифицировать по реакциям:

а) электрофильного замещения (бромирование, нитрование, образование азокрасителя, ауринового красителя). Например, азокраситель получают путем сочетания фенола с солью диазония (получают из сульфаниловой кислоты) в щелочной среде. Образуется раствор темно-красного цвета.

Эта реакция применяется для количественного определения этинилэстрадиола в таблетках:

С реактивом Марки (формальдегид в конц. серной кислоте) образуется ауриновый краситель, окрашенный в малиновый или фиолетовый цвет;

б) по реакции солеобразования и комплексообразования с солями тяжелых металлов, например с FeCl3;

в) образования сложных эфиров, например, с бензоилхлоридом, которые имеют характерную температуру плавления:

Эстрадиола дипропионат идентифицируют по образованию эстрадиола (Т.пл. 173-179 о С) после щелочного гидролиза с последующей очисткой его от примесей.

Для идентификации используют ИК- и УФ-спектры лекарственных веществ стероидной природы.

Для доказательства этинильной группы в структуре этинилэстрадиола применяется реакция с AgNO3. Этинилэстрадиол количественно определяют методом косвенной нейтрализации, также как прегнин.

Список Б. Этинилэстрадиол хранят в хорошо укупоренных банках оранжевого стекла, а эстрадиола дипропионат в сухом, защищенном от света месте.

В основе химического строения лежит углеводород прегнан (С = 21):

В ГФ включены препараты естественного гормона прогестерона и его полусинтетического аналога прегнина. Прогестерон может быть получен из гормонов желтого тела свиней и полусинтетическим способом из саласодина как промежуточный продукт синтеза кортизона.

Белые с желтоватым оттенком мелкокристаллические порошки, практически нерастворимые в воде, растворимы в маслах и хлороформе. Оба вещества имеют общий хромофор: карбонильная группа в 3-м положении и двойная связь в положении 4-5. За счет этого хромофора они поглощают в УФ-области спектра и имеют max = 240 нм + 2 нм.

Метод УФ-спектрофотометрии применяется для оценки качества лекарственных веществ по величине удельного показателя поглощения (Е 1% 1см), в частности для количественного определения веществ относительно стандартных образцов.

Прогестерон и прегнин обладают оптической активностью, так как содержат центры хиральности. В оценке качества предусмотрено определение удельного вращения.

Химические свойства и методы анализа

1. Концентрированная кислота серная является общим внутригрупповым специфическим реактивом, подтверждающим наличие стероидного цикла. При взаимодействии с ней образуются окрашенные в желтый (прогестерон) или малиновый (прегнин) цвет флуоресцирующие растворы. Специфичность данной реакции низкая. Для более надежной идентификации веществ применяют ИК-спектроскопию.

2. Гестагенные гормоны содержат в 3-м положении карбонильную группу, поэтому способны к взаимодействию с аминопроизводными, образуя окрашенные продукты или продукты с характерными температурами плавления (подлинность).

Эти продукты могут служить гравиметрической формой для количественного определения (прогестерон в масляном растворе).

Реакцию образования оксима ГФ рекомендует для испытания подлинности прегнина (Т.пл. — 226-232 о С):

Прогестерон и прегнин отличаются по заместителям в 17-ом положении. Прогестерон содержит ацетильный фрагмент. При нагревании с иодом в щелочной среде образуется желтый осадок с характерным запахом: — иодоформ (СНI3).

Для прегнина отличительной особенностью строения является наличие этинильной группы (остаток ацетилена), который сохраняет кислотные свойства и взаимодействует с серебра нитратом:

Кислота азотная выделяется в количестве, эквивалентном прегнину, что может использоваться для количественного алкалиметрического определения:

Лекарственные вещества светочувствительны, поэтому их хранят в темном месте в хорошо укупоренной таре, по списку Б.

Прогестерон и прегнин применяют в качестве гестагенных препаратов при нарушениях функции яичников, связанных с недостаточностью желтого тела.

Прогестерон назначают в виде 1% или 2,5%-ных растворах в масле для инъекций. Прегнин в 5-6 раз менее активен, чем прогестерон, но, в отличие от него, сохраняет активность при пероральном введении, особенно при подъязычном применении.[10]

Глава 3. Физико-химические методы анализа препаратов стероидных гормонов

Физико-химические методы широко используются на всех этапах фармакопейного анализа лекарственных веществ группы, в частности, для подтверждения подлинности производных циклопентанпергидрофенантрена (стероидных гормонов). Современная НД широко использует метод ИК-спектроскопии, позволяющий дать объективную оценку подлинности сложных по химической структуре лекарственных веществ группы. Полученный ИК-спектр препарата, снятый в вазелиновом масле или после прессования в таблетках с бромидом калия сравнивают с ИК-спектром ГСО, полученным в тех же условиях, или с рисунком ИК-спектра, прилагаемым к ФС. Таким образом, подтверждают подлинность большинства стероидных гормонов.

Помимо ИК-спектроскопии для установления подлинности и проведения испытаний на посторонние примеси ФС рекомендуют метод ТСХ и ВЭЖХ.

С помощью хроматографии в тонком слое определяют подлинность и доброкачественность лекарственных средств в случае присутствия в них близких по структуре посторонних примесей, являющихся полупродуктами или побочными продуктами синтеза.

Так, метод ТСХ рекомендован ФС для испытания подлинности тестостерона пропионата путем сравнения с ГСО. Методом ТСХ подтверждают подлинность ретаболила, дексаметазона, прогестерона, медроксипрогестерона ацетата в их лекарственных формах — идентификацию проводят по величине Rf в сравнении со стандартным образцом.

Методом ТСХ на пластинах Силуфол, Сорбфил, Кизельгель и других устанавливают во всех лекарственных веществах наличие примесей посторонних стероидов. При проведении подобных испытаний на пластину помимо исследуемого раствора наносят стандартные образцы, содержащие различные количества стероидов, примеси которых подлежат определению. Состав элюента нормируется частными ФС на препараты. Обнаружение зон примесей обычно проводят в УФ-свете с длиной волны 254 и 365 нм. В некоторых случаях зоны обнаруживают специальными реагентами: фосфорномолибденовой кислотой (при определении примесей в кортикостероидах, феноболине); толуолсульфоновой кислотой (примеси в андрокуре) и т.д. При проведении подобных определений стандарты примесей наносят количественно, чтобы было возможно сделать заключение о наличии примесей в испытуемом препарате и об их содержании. Суммарное содержание примесей в каждом конкретном препарате нормируется частной ФС, но, как правило, оно не должно превышать 2-4 %.

Для количественного определения стероидных гормонов ФС рекомендуют метод УФ-спектрофотометрии. Все изучаемые природные гормоны и их синтетические аналоги из группы кортикостероидов, гестагенных и андрогенных гормонов обладают свойством селективного поглощения УФ-излучения при 238-2422 нм, обусловленного наличием в структуре их молекул 4-3-оксогруппы. Максимум поглощения эстрогенных гормонов за счет ароматического кольца наблюдается при 280 нм. В качестве растворителей для стероидных гормонов чаще всего применяют 95 % этиловый или метиловый спирт, для эстрогенов — раствор натрия гидроксида.

Подлинность лекарственных средств группы устанавливают по наличию характерного максимума поглощения в УФ-спектре при указанной в ФС длине волны. Метод неспецифичен и его обычно сочетают с ТСХ-определениями.

Расчет количественного содержания лекарственного вещества выполняют по удельному показателю поглощения или сравнением с оптической плотностью ГСО. Расчет количественного содержания индивидуального вещества в процентах или граммах проводится по формулам (1-3).

где: Ах — оптическая плотность исследуемого раствора,

W — объем мерной колбы, используемой для приготовления раствора, мл;

V — объем аликвоты исходного раствора, мл;

а — навеска анализируемого образца, взятая для приготовления исходного раствора,

где Р — в зависимости от вида лекарственной формы, общий объем, общая масса ЛФ или средняя масса таблетки, капсулы и т.д.

где: А и Аст — соответственно оптическая плотность анализируемого и стандартного раствора;

W — объем мерной колбы, используемой для приготовления раствора, мл;

V — объем аликвоты, взятый для приготовления фотометрируемого раствора, мл.

Условия спектрофотометрического определения некоторых лекарственных веществ из группы стероидных гормонов приведены в таблице 1.

Определение количественного содержания стероидных соединений может быть также выполнено фотоколориметрически. Предварительно на определяемое вещество действуют одним из реагентов, используемых в качественном анализе и позволяющих получить растворимый продукт взаимодействия с устойчивой окраской.

Таблица 1. Спектральная характеристика лекарственных веществ

Максимум поглощения, лmaxнм.

Удельный показатель поглощения

3.1 Методы УФ-спектрофотометрии, основанные на собственном поглощении

Наиболее характерными стероидными гормонами, которые обладают собственным поглощением, используемым в количественном анализе, являются б,в-ненасыщенные кетоны, сопряженные диены и соединения, содержащие фенольное кольцо А.

Наиболее часто встречающиеся сопряженные кетогруппы — это Д 4 -3-кето- и Д 1,4 -3-кетогруппы с максимумом поглощения в этанольной среде соответственно при 240 и 244 нм и молярным коэффициентом поглощения примерно 17000. На рис.1 представлены два характерных спектра поглощения, а также спектр менее важного Д 4 ‘ 6 -3-кетопроизводного.

Как показано на рис.1, спектры Д 4 -3-кето- и Д 1,4 -3-кетостероидов имеют большое сходство; единственное существенное их отличие состоит в наличии плеча в спектре последнего в области 266 нм. Это позволяет проводить их одновременное определение в соизмеримых количествах в бинарных смесях методом отношений оптических плотностей. Менее сложный случай представляет одновременное определение Д 4,6- 3-кето-и Д 4,6 -3-кетостероидов по их поглощению при 238 и 280 нм. При больших длинах волн можно определять следовые количества продуктов разложения типа Д 4,6 -3-кетосоединений в спиронолактонах.

Рис.1. УФ — Спектры ненасыщенных 3 — кетостероидов в метаноле

Помимо простых случаев анализа промышленных кетостероидов в массе продукта непосредственное спектрофотометрическое измерение возможно только при анализе некоторых не слишком сложных лекарственных дозированных форм (см. различные фармакопеи), проб воздуха и т. п. Однако, как правило, спектрофотометрическое определение осложняется мешающим влиянием сопутствующих компонентов или основы образца. В таких случаях следует пользоваться методами измерения при разных длинах волн, избирательной экстракцией, хроматографическими методами разделения или, возможно, методом с применением борогидрида натрия.

Спектрофотометрические методы имеют еще большее значение после проведения предварительного хроматографического разделения. Спектрофотометрия в УФ-области — идеальный способ контроля за выходом конъюгатов кетостероидов при элюировании и для их определения после разделения на хроматографической колонке. Реже спектрофотометрические методы определения применяются после разделения методом тонкослойной хроматографии и элюирования пятна; в этих случаях обычно проводят колориметрическое измерение.

Для определения Д 4 — и Д 1,4 -З-кетостероидов в растворах при ферментации, масляных препаратах для инъекций, мазях [1] и низкодозированных таблетках [2] Гёрёг предложил дифференциальный спектрофотометрический метод, основанный на восстановлении этих производных борогидридами щелочных металлов до соответствующих спектрально неактивных 3-оксипроизводных.

Если в кювету сравнения поместить раствор восстановленного Д 4 -3-кетостероида (1 мг кетостероида и 0,1 г борогидрида натрия растворяют в 10 мл метанола и через 15 мин разбавляют метанолом до 100 мл), а в рабочую кювету — раствор не восстановленного соединения с той же концентрацией, то разность оптических плотностей при 240 нм отвечает содержанию ненасыщенного кетона. Конечно, этот метод дает приемлемые результаты, только если сопутствующие компоненты и неизвестные примеси, дающие фоновое излучение, не реагируют с борогидридом натрия и, следовательно, дифференциальный спектр смеси при длинах волн выше 230 нм идентичен истинному спектру чистого кетостероида. Это иллюстрируется рис. 1, на котором представлены спектры метанольного экстракта масляного препарата для инъекций, содержащего прогестерон и бензоат эстрадиола; кривая 1 — это суммарный спектр двух стероидов, бензилового спирта (в качестве стабилизирующего агента) и небольшого количества масла, соэкстрагирующего с исследуемыми компонентами. Кривая 2 представляет дифференциальный спектр, почти идентичный спектру прогестерона, что указывает на устранение влияния поглощения всех других компонентов.

Рис. 3. УФ — спектры метанольных экстрактов масляных препаратов для инъекций, содержащих прогестерон и бензоат эстрадиола

Спектрально неактивные в этой области Д 5(10) -3-кетоны спектрофотометрически можно определять, измеряя поглощение соответствующего Д 4 -3-кетона, поскольку первые можно легко перевести в последний путем кислотного или щелочного катализа [реакция (4)]. Определение норэтинодрела обычно проводят после выдерживания реакционной смеси в течение 1 ч или кипячения в течение 5 мин с 0,5 М соляной кислотой. Каталитическое действие гидроксид-иона в этой реакции примерно в 300 раз эффективнее, чем иона водорода. Поэтому при комнатной температуре даже при 0,01 М концентрации гидроксида натрия в течение 1 ч происходит количественное превращение, что позволяет проводить избирательное определение норэтинодрела в отдельных противозачаточных таблетках методом дифференциальной спектрофотометрии.

Как видно из рис.4, незамещенные 3-алкоксипроизводные (енольная форма простых эфиров) и 3-ацилоксипроизводные (енольная форма сложных эфиров) обладают высоким светопоглощением.

Поскольку все они являются производными Д 4 -3-кетонов [реакция (5)], а последние в свою очередь — продуктами разложения енольных простых и сложных эфиров, Д 4 -3-кетоны могут оказаться потенциальными примесями. Это осложняет определение енольных форм эфиров, потому что все эти соединения имеют весьма схожие спектры (см. рис. 2 и 3).

Рис. 6. УФ — Спектры 3,5 — диенов в метаноле

Как видно из реакции (5), Д 4 -3-окси-, а также ацилоксипроизводные можно превратить в 3,5-диены путем катализируемого кислотами удаления воды или карбоновых кислот, и, следовательно, по поглощению образующихся 3,5-диенов можно определить эти спектрально-неактивные производные. Используя соляную кислоту в качестве катализатора, можно определить диацетат этинодиола даже в отдельных таблетках [2].

Из 3-б-эпимеров вода удаляется примерно в пять раз быстрее, чем из Зв-эпимеров.

На рис. 7 представлены четыре характеристических спектра эстрогенов, содержащих фенольное кольцо А (в форме свободного фенола, фенолят-иона, простого эфира и сложного эфира). Эти спектры очень характеристичны, но из-за несколько низкой интенсивности поглощения к использованию УФ-спектрофотометрии для количественных определений нужно подходить с большой осторожностью, поскольку возможности непосредственного измерения без предварительного разделения или введения поправки на поглощение фона очень ограниченны.

Рис. 7. УФ-Спектры стероидов, содержащих фенольное кольцо А [(растворитель — смесь метанола с водой (4:1)]

Приведем один из многочисленных примеров, когда УФ-спектрофотометрию использовали для количественного определения после хроматографического разделения. Так, Шрёдер и др. проводили разделение эстрона, эстрадиола, эквилина и эквиленина на пластинке, покрытой силикагелем, после кислотного гидролиза их сульфатов и экстракции свободного фенола хлороформом. Первые три соединения экстрагируют 1 %-ным водным раствором гидроксида натрия и измеряют поглощение их ионных форм при 296 нм, а присутствующий в низких концентрациях эквиленин экстрагируют метанолом и измеряют его поглощение при 231 нм, когда чувствительность измерения намного выше.

В некоторых методиках, предложенных для определения эстрогенов, проблемы, связанные с поглощением фона, были решены с привлечением химических или математических методов. В большинстве из них описывается определение малых количеств эстрогенов в присутствии больших количеств кетостероидов, когда малоинтенсивные полосы кетостероидов, обусловленные п—р-переходами, мешают определению. Для анализа противозачаточных таблеток, в которых соотношение кетостероидов и эстрогенов не очень велико, достаточно использовать один из вариантов метода базисной линии, как это сделали Кий и Шрофф и Гродски. В последней работе авторы повысили избирательность измерения, применив селективную экстракцию эстрогенов метилциклогексаном. Бруннер и Кунц [3] описали метод определения местранола в различных смесях, сочетающий разделение колоночной хроматографией и УФ-спектрофотометрическое измерение с поправкой на поглощение холостого раствора.

Читайте также:  Список анализов на гормоны по циклу

При определении примесей эстрогенов в 19-норстероидах отношение кетостероид/эстроген обычно составляет от 100 до 10000. Столь малые количества эстрогенов нельзя определить даже с помощью метода базисной линии, поскольку поглощение фона больше поглощения определяемых компонентов. Для решения этой проблемы Легран и др. восстанавливали кето-группу кетостероидов борогидридом калия в щелочном растворе метанола, что привело к почти полному устранению поглощения фона. Остаточное поглощение фона можно легко учесть, используя метод базисной линии. Этот метод позволяет определить до 0,01 % эстрогенов в 19-норстероидах. По сути дела тот же метод использован в работе Бестоу и рекомендован Британской фармакопеей [4] для определения местранола в противозачаточных таблетках Гёрёг и Чизер упростили этот метод, заменив борогидрид калия борогидридом натрия и исключив гидроксид натрия, что позволило сократить время реакции с 6,5—18 ч до 15 мин.

Наличие батохромных и гиперхромных сдвигов в спектрах чистых эстрогенов в щелочной среде (около 0,2 М гидроксида натрия; см. рис. 7) открывает новые возможности для их селективного определения.

Селективность и чувствительность измерения поглощения щелочных растворов эстрогенов относительно раствора холостого опыта увеличиваются по сравнению с селективностью и чувствительностью измерения поглощения нейтрального раствора, на чем в фармакологии основано несколько методик определения стероидов.

Избирательность измерения можно увеличить еще больше, поместив в кювету сравнения раствор исследуемого материала в недиссоциированной форме с такой же концентрацией. В этом варианте дифференциального спектрофотометрического метода устраняется мешающее влияние поглощающих неионизированных веществ. Метод, рекомендуемый фармакопеей XX США для определения валерата эстрадиола в масляных препаратах для инъекций в отсутствие кетостероидов, можно использовать для анализа препаратов для инъекций с высоким содержанием стероида (выше 10 мг/мл), если в кювету сравнения помещать кислый (0,02 М), а в рабочую кювету — сильнощелочной (0,6 М) раствор. Гёрёг повысил избирательность этого метода, используя раствор с рН 9 (боратный буфер) в качестве раствора сравнения (фенольная оксигруппа еще не ионизирована), создавая в растворе пробы 0,2 М концентрацию щелочи и предварительно восстанавливая кетостероиды борогидридом натрия. В этом варианте удалось полностью устранить мешающее влияние примесей, поглощение которых изменяется как в интервалах рН 2—9, так и при концентрации щелочи 0,2—0,6 М; окисление Д 4 -3-кетонов кислородом воздуха в щелочной среде также не оказывает мешающего влияния. Измерение разности оптических плотностей при 300 нм позволяет проводить количественный анализ низкодозированных препаратов для инъекций даже в присутствии больших количеств кетостероидов.

При помощи дифференциального спектрофотометрического метода, проводимого в щелочной среде, можно определять свободные эстрогены и их сложные эфиры (последние в щелочной среде быстро гидролизуются). Простые эфиры, конечно, не вступают в реакцию, но их фенольные производные реакционноспособны, что позволяет селективно определять их примеси.

Как видно из уравнения (8), в метанольной среде в присутствии соляной кислоты 10в-окси-4-ен-3-кетоны (примеси 19-нор-4-ен-3-кетонов) можно количественно перевести в соответствующее фенольное производное простого эфира. С помощью этой реакции и вышеупомянутого спектрофотометрического метода определения стероидов фенольного типа Гёрёг определил следовые количества таких веществ.

3.2 УФ-спектрофотометрические и колориметрические методы, основанные на химических реакциях

В ранний период развития химии стероидов (до распространения хроматографических методов, особенно газовой хроматографии) они (вместе с флуориметрией) были единственными достаточно чувствительными и селективными методами определения стероидов. С введением в аналитическую химию стероидов более селективных и чувствительных газохроматографических, радиоаналитических и других методов значение колориметрических методов несколько упало, но они до сих пор главенствуют в фармацевтическом анализе стероидов и сохраняют до некоторой степени свое значение в биоклиническом анализе.

Большинство статей по применению колориметрических методов анализа половых гормонов посвящено определению соединений, содержащих кетогруппы или фенольное кольцо А.[7]

Некоторые (амины, гидразины и производные гидразидов) из реагентов, используемых для колориметрического определения кетостероидов, содержат —NH2-гpyппy, реагирующую с карбонильной группой с образованием продуктов конденсации типа =C=N—.

Другая часть колориметрических методов основана на реакциях активной метиленовой группы, расположенной рядом с кетогруппой, с реагентами типа ароматических ди- и тринитропроизводных (диэтилоксалата, 2,6-ди-трет-бутил-n-крезола и т. п.).

Имеется еще несколько реагентов, используемых в других (иногда не совсем ясных) реакциях.

Здесь будут обсуждаться только два важнейших метода: метод с использованием гидразида изоникотиновой кислоты (ГИН) и метод Циммермана (с использованием 1,3-динитробензола).

При обработке ненасыщенных кетостероидов с помощью ГИН Эрколи и др. наблюдали возникновение желтой окраски, которую Умбергер использовал в аналитических целях. Этот метод основан на реакции конденсации между кетогруппой и гидразидной группой реагента (0,05 %) в метаноле, содержащем 0,007 М соляной кислоты.

Максимум поглощения протонированной желтой формы продукта конденсации 4 -3-кетостероидов лежит около 380 нм (11000—12000). При комнатной температуре реакция заканчивается через 20 мин. Более низкой реакционной способностью обладают Д 1,4 -З-кетоны. По методике Рида и Уолтерса необходимо нагревание в течение 1 ч при 50 °С. Как сообщали Кавина и др., другая возможность заключается в использовании более концентрированного реагента (0,8 %-ный ГИН примерно в 0,1 М соляной кислоте) при комнатной температуре и продолжительности реакции 2—3 ч. Максимум поглощения Д 4 ‘ 6 -3-кетонов и Д 1 ‘ 4 -3-кетонов находится между 405 и 415 нм, молярный коэффициент поглощения равен 16 500—18 500. Различие в реакционной способности Д 4 -3-кето- и Д 1,4 -3-кетостероидов позволяет проводить обнаружение и даже полуколичественное определение первых в присутствии последних.

Преимущество метода с использованием ГИН заключается в том, что окраска мало зависит от замены растворителя. Введение этанола или еще лучше хлороформа в реакционную смесь позволяет без затруднений анализировать масляные препараты для инъекций без предварительной экстракции. Лишь в случае низкодозированных препаратов для инъекций рекомендуется хроматографическое отделение кетостероидов от масла на колонке, заполненной флорисилом.

Помимо анализа различных препаратов для инъекций метод с использованием ГИН был с успехом применен Bу для определения прогестинов в противозачаточных таблетках. Недавно описана методика анализа отдельной таблетки, согласно которой для отделения прогестина от основы таблетки целесообразно хроматографирование на микроколонке; таким образом можно свести к минимуму объем элюента (хлороформа), что позволяет определить в одной таблетке до 0,35 мг норэтистерона.

Метод с использованием ГИН легко поддается автоматизации; эта возможность была реализована для анализа таблеток и препаратов для инъекций [5].

ГИН-Метод в настоящее время является самым распространенным стандартным методом определения кетостероидов в готовых лекарственных формах. Помимо анализа готовых лекарственных форм он применяется и для анализа стероидов в массе фабричного продукта. Для решения более сложных задач (разделение и количественная оценка содержания компонентов в смесях или получение достоверных данных в присутствии продуктов разложения) его часто применяют в сочетании с бумажной, колоночной и тонкослойной хроматографией и элюированием пятна.

Хотя ГИН-метод находит применение главным образом в фармакологии, Мацуи и Такахаши использовали его для определения кетостероидов в биологических объектах, а именно для контроля за ферментативным превращением тестостерона и его конъюгатов в соответствующие 4,5-дигидропроизводные, не реагирующие с ГИН.

В то время как главной областью применения ГИН-метода является фармацевтический анализ, другой метод, выбранный для подробного обсуждения — реакция Циммермана,— в настоящее время используется почти исключительно в клиническом анализе для определения 17-кетостероидов в моче.

17-Кетостероид реагирует по своей активной метиленовой группе при С-16. Образующийся на первой стадии реакции бесцветный промежуточный продукт дегидрируется под действием 1,3-динитробензола в окрашенный мезомерный анион, изображенный на схеме (10).

Необходимым условием протекания реакции является удобное стерическое расположение кетогруппы по соседству с метиленовой группой. Так, например, 3-кетостероиды (в том числе Д 4 -3-кетостероиды) и 21-незамещенные 20-кетостероиды дают положительную реакцию, тогда как Д 1,4- З-кетостероиды (не имеющие активной метиленовой группы) и стерически экранированные 6-, 7-, 11- и 12-кетостероиды не вступают в нее.

Основные цели оптимизации условий заключаются в стабилизации интенсивности окраски и характера спектра и в повышении чувствительности и правильности метода.

Максимум поглощения дегидроэпиандростерона в различных реакционных условиях находится около 520 нм. Молярный коэффициент поглощения в первоначальной методике (реакция в этаноле в смеси с 1,3-динитробензолом и водным раствором гидроксида калия) составляет около 15 000. Введение пиридина в реакционную смесь его до 21 000. Во многих случаях, даже в современных автоматических методах, приходится использовать условия, при которых чувствительность гораздо ниже.

Основные трудности связаны с тем, что для полного протекания реакции (10) необходима сильнощелочная среда, а в таких условиях окраска недостаточно устойчива. Было предпринято несколько попыток решить эту задачу, в частности используя органические основания типа гидроксида бензилтриметиламмония или соответствующего метоксипроизводного вместо гидроксида калия или экстракцией окрашенного продукта реакции органическими растворителями типа эфира, хлороформа и т. п.

По-видимому, наиболее существенным практическим усовершенствованием реакции Циммермана за последнее время было предложенное Эпштейном и использованное другими авторами введение водных растворов. По методике с использованием водных растворов для приготовления реагента из 1,3-динитробензола в качестве растворителя берут 5 %-ный водный раствор детергента гиамина 1622 (хлорид диизобутилфеноксиэтоксиэтилдиметилбензиламмония). Как только раствор, содержащий пробу, и этот реагент сильно подщелачивают 10 М водным раствором гидроксида калия, быстро развивается окраска по реакции Циммермана и продукт сразу же осаждается из раствора совместно с большей частью избытка реагента, вследствие чего удается избежать его разложения. Реакция протекает 15 мин при комнатной температуре, после чего можно проводить измерения. Для этого мутный раствор разбавляют таким же объемом 2,5%-ного раствора гиамина 1622 с целью солюбилизации осадка или проводят экстракцию окрашенного продукта эфиром из сильнощелочного раствора.

Существенным недостатком всех вариантов метода Циммермана является заметное поглощение холостой пробы и появление фона в спектре, обусловленные присутствием посторонних компонентов. Частично их влияние можно уменьшить, используя особо чистые реагенты и растворители (это не необходимо при проведении водного варианта метода). При анализе биологических объектов помимо фона в спектре следует еще учитывать поглощение матрицы. Поэтому часто прибегают к алгебраическим поправкам. Наиболее известна поправка Аллена, для получения которой измеряют оптическую плотность в максимуме и при двух других длинах волн, а затем по уравнению (11) вычисляют исправленную оптическую плотность для исследуемого и холостого растворов:

где — длина волны в максимуме поглощения, а Д обычно составляет 60 нм.

Фелдкамп и др. тщательно исследовали обоснованность введения такой поправки и пришли к выводу, что ею можно успешно пользоваться, только если спектры стандартного раствора и пробы различаются не очень сильно.

Наконец, остается упомянуть, что оба варианта метода Циммермана, водный и неводный, могут быть автоматизированы.

Методы колориметрического определения эстрогенов, основанных на реакциях фенольного кольца А.

Эти прямые более или менее стехиометрические, но в основном не очень чувствительные методы имеют ограниченное применение, и их практическое значение обычно исчерпывается анализом лекарственных препаратов.

Гораздо большее значение, как в фармацевтике, так и в биомедицине имеют нестехиометрические, но очень чувствительные методики, основанные на реакциях с реагентами, содержащими большие количества сильных кислот, в основном серной кислоты.

Самый простой реагент — это сама серная кислота. Она используется главным образом для идентификации стероидных гормонов (и не только эстрогенов, но и стероидов других классов). Это очень важный способ их качественного анализа, поскольку он часто позволяет обнаруживать большие различия между близкими по структуре стероидами, УФ-спектры которых в этаноле практически не отличаются.

С точки зрения количественного анализа гораздо более важны методы, в которых используется разбавленная серная кислота; в качестве разбавителей обычно применяется этанол или метанол. Главная область применения этих реагентов — фармацевтика, поскольку их высокая чувствительность позволяет проводить анализ низкодозированных таблеток, содержание этинилэстрадиола и местранола в которых нельзя определять менее чувствительными УФ-спектрофотометрическими методами. Серная кислота в сочетании с этанолом была использована рядом авторов для указанной выше цели, а также при контроле ферментации. На рис.12 представлены спектры этинилэстрадиола и норгестрела в смеси серная кислота—этанол в соотношении 65:35 (по объему).

Рис.12. Спектры активных компонентов противозачаточных таблеток в смеси серной кислоты и этанола в соотношении 65:35 (по объему)

Спектры снимали через 20 мин после начала реакции при комнатной температуре; они сохраняются неизменными в течение нескольких часов. Очевидно, различия между спектрами делают возможным одновременное определение обоих стероидов, что было использовано при анализе отдельных противозачаточных таблеток. Вероятно, устойчивость окраски сильно зависит от чистоты этанола и серной кислоты, используемых в анализе.

Вероятно, наиболее широко распространенным реагентом для определения этинилэстрадиола и местранола в таблетках является смесь серная кислота—метанол в соотношении 7:3 (по объему). Этот реагент, обеспечивает устойчивую и очень интенсивную окраску для двух упомянутых выше соединений (макс = 540 нм, =34000) с необычайно высокой избирательностью. Эстрон, эстрадиол и т. п., не содержащие 17-этинильной группы, не дают такой окраски, что указывает на необходимость наличия в молекуле стероида одновременно фенольного кольца А и 17-этинил-17-оксигруппы. В первоначальном варианте методики окраска проявлялась в процессе экстракции эстрогенов и самого реагента из их раствора в петролейном эфире.

Несмотря на удовлетворительные чувствительность и селективность реакции с участием реагентов, содержащих разбавленную этанолом или метанолом серную кислоту, и на простоту методики, в биомедицине гораздо чаще применяются более длительные двухстадийные реакции, обладающие еще большей чувствительностью и селективностью, с участием реагентов, содержащих серную кислоту, воду и добавки. Одно время эти реакции лежали в основе стандартных методик фармацевтического анализа. На первой стадии этих методик, основанных на классической методике Кобера, эстроген нагревают примерно с 65 %-ной (по объему) серной кислотой, содержащей немного фенола, до образования желтого продукта (макс450 — 500 нм). На второй стадии смесь разбавляют водой до 40— 50 %-ной концентрации серной кислоты и снова нагревают. При этом окраска переходит в розовую (505 — 555 нм). Для разных эстрогенов молярный коэффициент поглощения составляет от 40 000 до 50 000.

Вместо самого фенола на первой стадии реакции были опробованы и его производные. Из них в настоящее время повсеместно применяется гидрохинон. Состав реагента Брауна зависит от определяемого эстрогена. Он содержит 2 г гидрохинона на 100 мл разбавленной серной кислоты, 66 %-ной (по объему) для эстрона, 60 %-ной для в-эстрадиола и 76 %-ной для эстриола. Определяемый эстроген обрабатывают 3 мл соответствующего реагента при 100 °С в течение 20 мин, охлаждают, разбавляют водой (0,5 мл в случае эстрона, 0,2 мл в случае в-эстрадиола и 1 мл для эстриола) и нагревают еще 10 мин. По уравнению Аллена, вычисляют исправленную оптическую плотность [см. уравнение (11)]. Длины волн соответственно равны 480, 513 и 546 нм.

3.3 Инфракрасная спектрофотометрия

В классический период развития химии стероидов инфракрасная спектроскопия была наиболее мощным средством установления структуры стероидных соединений и даже в наши дни остается одним из наиболее важных методов в этой области.

Наряду с применением ИК-спектроскопии для идентификации стероидов и установления их структуры этот метод имеет важное значение для распознавания полиморфных модификаций, часто встречающихся у стероидных гормонов.

По сравнению с этими областями ИК-спектрофотометрия как метод количественного анализа стероидов имеет меньшее значение. Тем не менее, по этому вопросу опубликовано большое количество статей, начиная с раннего периода развития анализа стероидов и до последнего времени.

Большим преимуществом ИК-спектрофотометрии по сравнению с УФ-спектрофотометрией является то, что спектры даже в наименьшей степени замещенных производных относительно богаты характерными полосами поглощения, что позволяет анализировать даже сложные смеси стероидов без какого-либо предварительного разделения. Однако метод ИК-спектрофотометрии имеет и определенные недостатки. Чувствительность его чрезвычайно мала: значения молярных коэффициентов поглощения полос, наиболее часто используемых в количественном анализе стероидов, составляют всего 50—300. Кроме того, из-за отсутствия полностью прозрачных растворителей толщина кюветы должна быть гораздо меньше, чем при УФ-спектрофотометрических измерениях (обычно она не превышает 0>5 мм). Это значит, что концентрация измеряемого раствора в большинстве случаев должна составлять несколько процентов.

Другая трудность заключается в том, что оптические плотности, на определении которых основаны количественные измерения, нельзя измерить непосредственно; их можно оценить по спектрам, используя метод базисной линии. Поэтому методы ИК-спектрофотометрии характеризуются меньшей правильностью и более низкой воспроизводимостью, чем методы УФ-спектрофотометрии.

Хотя спектры твердых веществ, полученные методами ИК-спектрофотометрии на таблетках из бромида калия и тонких поверхностных пленках, а также методом инфракрасной отражательной спектроскопии, нашли применение в количественном анализе, в большинстве случаев рекомендуется использовать спектры растворов.

Наиболее употребительным растворителем является хлороформ, однако описано также применение тетрахлорида углерода и дисульфида углерода. В ближней инфракрасной области можно использовать и другие растворители, например пиридин.

ЯМР-Спектроскопия обладает исключительно высокой избирательностью, но очень низкой чувствительностью, поэтому для выполнения определений требуется, по меньшей мере, несколько миллиграммов вещества. Этот недостаток, конечно, не позволяет использовать его в количественном биоклиническом анализе, но не исключает его применения в фармацевтическом анализе стероидов.

Например, Авдович и др. определяли содержание местранола в массе фабричного продукта, регистрируя его спектр в дейтеропиридине (дифенилуксусная кислота применялась в качестве внутреннего стандарта) и измеряя интенсивность линии протонов метокси- и этинильной групп. Та или другая из этих групп отсутствует в потенциальных примесях местранола (эстроне и этинилэстрадиоле), поэтому метод достаточно селективен. Те же авторы предложили определять А 1,4 -3-кетостероиды в лекарственных препаратах по линии С-1 протона.

Описанные выше и аналогичные им методики можно рассматривать в качестве оригинального практического приложения ЯМР-спектроскопии в довольно узкой области анализа стероидов. ЯМР-Спектроскопия никогда не заменит существующие стандартные методы, однако в отдельных случаях уникальная селективность этого метода облегчает решение гораздо более сложных задач.

В качестве примера можно привести методику одновременного определения изомеров эстрадиол-3-метилового эфира, предложенную Хойером.

При гидрировании тем или иным способом 3-метокси-1,3,5(10),8,9-эстра-тетраен-17в-ола(I) по Д 8 -двойной связи продукт реакции может содержать небольшие количества исходного вещества, три изомера метилового эфира эстрадиола [«природного»3-метокси-8бН,9аН-1,3,5(10)-эстратриен-17в-ола(II), 3-метокси-8бН,9бН-1,3,5(10)-эстратриен/17в-ола(III) и 3-метокси-8вН,9вН-1,3,5-(10)-эстратриен-17в-ола(IV)] и 3-метокси-1,3,5(10),6,8(9)-эстрапентаен-17в-ола(V). На химический сдвиг ангулярной 13-метильной группы влияет наличие протонов в положениях 8 и 9, а также их конфигурация; следовательно, возможно одновременное определение этих соединений.

Как видно из табл. 2, химические сдвиги 13-метильных групп соединений I, II, III + IV и V в дейтеробензоле в качестве растворителя достаточно хорошо разрешены (спектры сняты на приборе, работающем на частоте 100 МГц); следовательно, их можно избирательно определить по соответствующей интегральной интенсивности. Что касается соединений III и IV, то можно определить лишь их сумму, но сами изомеры можно разделить методами газовой хроматографии.

Табл. 2. Химические сдвиги 13-метильной группы в спектрах продуктов восстановления 3-метокси-1,3,5 (10),8(9)-эстратетраен-17в-ола в различных растворителях

3.5 Колоночная хроматография

Хотя колоночную хроматографию нельзя рассматривать как прямой метод количественного анализа стероидов.

В большинстве упомянутых публикаций колоночная хроматография использована для определения стероидов в сложных биологических объектах, но она широко применяется и для разделения стероидов в лекарственных препаратах.

Поскольку стероиды — это соединения средней полярности, для их разделения применяется широкий круг адсорбентов и систем растворителей.

источник