Гепатит а методом твердофазного иммуноферментного анализа

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ, ИФА (Enzyme immunoassay) — метод выявления антигенов и антител, основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску. Основой проведения любого варианта ИФА служит определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями.

Для определения антигенов и антител применяются твердофазный (гетерогенный) вариант иммуноферментного анализа. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции.

Иммуноферментный анализ по сравнению с другими методами детекции антигенов и антител обладает следующими преимуществами:

— высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл. Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;

возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;

— стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более);

— простотой проведения реакции;

— наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета;

— возможностью автоматизации всех этапов реакции

— относительно низкой стоимостью диагностических наборов.

Вышеперечисленные преимущества определили широкое применение ИФА во всех областях медицины, в том числе и при диагностике, профилактике и изучении вирусных гепатитов . Диагностические препараты для ИФА, предназначенные для выявления большинства серологических маркеров инфицирования вирусами гепатитов А, В, С и D выпускаются различными предприятиями и фирмами как у нас в стране, так и за рубежом.

В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических препаратов используют полистироловые 96-ти луночные планшеты или полистироловые шарики [фирмы “ДИА-плюс”, “Рош” (“ROCHE”), “ЭББОТТ” (“АВВОТТ”)]. Основные требования, предъявляемые к твердой фазе при проведении ИФА, включают: устойчивость к растворам, используемым в реакции;

наличие высокой специфической емкости, т. е. способности сорбировать на своей поверхности антитела или антигены в количествах, необходимых для проведения реакции в сочетании с как можно меньшей неспецифической сорбцией белков из исследуемых образцов и коньюгатов.

Наиболее распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция, когда часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также образования водородных связей присоединяется к поверхности твердой фазы.

В настоящее время разработаны различные варианты твердофазного иммуноферментного анализа, и практически все они были апробированы или применены для выявления маркеров инфицирования вирусами гепатитов А, В, С, D и Е. Наиболее простой схемой проведения ИФА является “сэндвич”-метод. Общая схема проведения метода заключается в следующем (рис. 20 ). На твердой фазе адсорбированы антитела к исследуемому антигену После инкубации исследуемого материала и образования комплекса антитело — антиген проводится удаление несвязавшихся компонентов, добавляется коньюгат, т. е. антитела к искомому антигену, меченые ферментом. По завершении инкубации с последующим удалением непрореагировавшего коньюгата промывкой образуется комплекс, в котором антиген как бы заключен между двумя слоями антител. Наличие меченных ферментом антител определяется при помощи соответствующего субстрата. “Сэндвич”-метод используется для выявления HBsAg, HBeAg, антигена вируса гепатита А. Для ускорения “сэндвич”-метода, применяется его модификация — “одностадийный сэндвич-метод”, при которой добавление исследуемого материала и коньюгата проводится одновременно. Так, для выявления HBsAg фирма “ДИАплюс” предлагает эту схему проведения реакции. При использовании диагностических наборов ИФА, основанных на этой схеме проведения реакции, необходимо помнить, что в исследуемом образце не должно быть веществ, ингибирующих активность фермента, т. н. ферментных ядов, (например, азида натрия, применяемого в качестве консерванта). Одной из особенностей этого метода является снижение оптической плотности ферментативной реакции с образцами, имеющими крайне высокую концентрацию исследуемого антигена за счет образования комплекса HBsAg и коньюгата в растворе. Однако тщательный подбор концентрации меченых антител в коньюгате представляемого диагностического набора устраняет возможность получения ложнонегативных результатов с образцами, имеющими высокую концентрацию HBsAg.

Для выявления антител к различным антигенам вирусов гепатитов А, В, С и D применяются разнообразные варианты постановки ИФА, основными из которых являются:

Метод с использованием меченых вторичных антител (антител против иммуноглобулинов человека) и иммобилизированных антигенов на твердой фазе. Метод применяется для определения антител к вирусу гепатита С. Общая схема проведения реакции заключается в следующем (рис. 21): на твердой фазе иммобилизуют антиген, после инкубации исследуемого материала и удаления несвязавшихся компонентов добавляют меченые ферментом антитела к иммуноглобулинам человека класса IgG, которые взаимодействуют с Fc-фрагментом анти-ВГС. После проведения субстрат-ферментативной реакции проводят учет полученных результатов. При наличии антител уровень оптической плотности прошедшей реакции превосходит показатели отрицательных образцов. Для уменьшения возможных неспецифических реакций вводится специальный коэффициент, указанный в наставлениях, прилагаемых к диагностическим наборам.

Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованного на твердой фазе антигена. Метод используется для выявления анти-HBs в диагностическом наборе “AUSAB” EIA фирмы “ЭББОТТ”. Общая схема проведения реакции заключается в следующем (рис. 22): на полистироловом шарике адсорбирован HBsAg субтипа ad и ау, после инкубации с исследуемым материалом и удаления непрореагировавших компонентов добавляется HBsAg, меченный ферментом, который взамодействует со свободными центрами связывания антител к HBsAg, провзаимодействовавшими с антигеном, сорбированным на твердой фазе. При наличии антител в исследуемой пробе уровень оптической плотности прошедшей реакции превосходит показатели отрицательных контрольных образцов.

Метод с использованием меченых и иммобилизованных антител, а также стандартного антигена. Этот вариант метода применяют для выявления анти-HBs и анти-НВе с диагностикумами фирмы (“ДИАплюс”). Общая схема проведения реакции заключается в следующем (рис. 23 ): на первом этапе реакции исследуемый образец смешивают с раствором, содержащим фиксированное количество антигена. После завершения инкубации добавляют шарик с сорбированными на нем антителами и коньюгат. После удаления непрореагировавших компонентов реакции проводится ферментативная реакция, интенсивность которой обратно пропорциональна содержанию исследуемых антител в образце. Вариантом этой схемы может служить определение анти-НВе и анти-дельта с диагностикумами фирмы “ЭББОТТ”, когда компоненты реакции добавляются последовательно.

Метод с использованием меченых антител и иммобилизованного антигена (конкурентный метод). Данная схема широко применяется для выявления анти-HBs, анти-НВс и анти-ВГА. Общая схема проведения реакции заключается в следующем (рис. 24): к антигену, иммобилизованному на твердой фазе одновременно добавляют исследуемый материал и коньюгат. При проведении реакции меченые и исследуемые антитела конкурируют за активные центры антигена, иммобилизованного на твердой фазе. После завершения инкубации и удаления не прореагировавших компонентов проводится ферментативная реакция, результаты которой обратно пропорциональны количеству антител в исследуемом образце. При использовании набора фирмы (“ДИАплюс”) при выявлении анти-HBs, в случае наличия HBsAg уровень ферментативной реакции будет превосходить результаты реакции в негативных образцах, что позволяет косвенно судить о наличии антигена.

Метод выявления антител класса IgM — многослойный “сэндвич” метод. Этот метод применяется для выявления анти-НВс IgM и анти-ВГА IgM. Общая схема проведения реакции заключается в следующем (рис. 25): на твердой фазе адсорбированы антитела к мю-цепям иммуноглобулинов класса М, которые взаимодействуют с антителами класса IgM, находящимися в исследуемой сыворотке. После удаления непрореагировавших компонентов добавляется стандартное количество антигена, антитела против которого определяются. Удалив непрореагировавшие компоненты реакции, добавляют меченые антитела, реагирующие с антигеном. Также, как и в обычном “сэндвич”-методе, чем больше количество антител, тем интенсивней ферментативная реакция. Для уменьшения ложнопозитивных результатов исследование сывороток крови проводится после их разведения в 1000 раз.

Вышеперечисленные схемы проведения реакций по определению антигенов и антител не исчерпывают всего многообразия вариантов проведения иммуноферментной реакции. Разработаны варианты ИФА с использованием авидин-биотиновой системы, систем усиления ферментативной реакции, проведения реакции на фильтрах и т. д.

Для ферментативной метки антигенов или антител могут быть применены разнообразные ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфотаза, бета-галактозидаза и т. д. Во всех коммерческих тест-системах используется пероксидаза хрена, выбор которой определяется ее высокой удельной каталитической активностью, доступностью, стабильностью, простотой детекции. В качестве субстратного реагента наиболее часто применяется орто-фенилендиамин (ОФД) с перекисью водорода, продукт окисления которого регистрируется фотометрически. Для остановки ферментативной реакции применяют “стоп реагент”, который добавляют во все исследуемые и контрольные пробы в равных количествах. Наиболее часто в качестве “стоп реагента” применяют серную кислоту. Учет результатов проводят спектрофотометрически при длине волны 490 нм.

Одним из наиболее важных вопросов при проведении иммуноферментного теста является вопрос о специфичности результатов. Для подтверждения позитивных результатов при выявлении HBsAg применяется подтверждающий или конфирмационный тест. Четкое соблюдение всех параметров, указанных в наставлениях к диагностическим наборам для иммуноферментного анализа, позволяет избежать ложнопозитивных и ложнонегативных результатов, связанных с работой оператора.

Рис. 20. Схема проведения иммуноферментного анализа (“Сэндвич”-метод)

Рис. 21. Схема проведения иммуноферментного анализа с использованием меченых вторичных антител

Рис. 22. Схема проведения иммуноферментного анализа с использованием меченого антигена и иммобилизованного на твердой фазе антигена

Рис. 23. Схема проведения иммуноферментного анализа с использованием меченых и иммобилизованных антител и стандартного антигена

Рис. 24. Схема проведения иммуноферментного анализа с использованием меченого и иммобилизованного антигена — конкурентный метод

Рис. 25 . Схема проведения иммуноферментного анализа. “Сэндвич”-метод определения антител класса IgM

источник

Установление HBsAg в пятнах крови на вещественных доказательствах методом твердофазного иммуноферментного анализа. Методические рекомендации

Заведующая судебно-биологическая отделением ГБУЗ СК БСМЭ кандидат медицинских наук Е.А. Первушина; заведующий отделением судебно-биологических экспертиз ФГБУ РЦСМЭ Минздравсоцразвития России, кандидат медицинских наук А.А. Гусаров; начальник ГБУЗ СК БСМЭ кандидат медицинских наук А.В. Копылов; заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики ИПДО ГБОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, профессор Ю.В. Первушин; ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики ИПДО ГБОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, кандидат медицинских наук С.Ш. Рогова.

• Е.Х. Баринов — зав. учебной частью кафедры судебной медицины и права ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития РФ , к.м.н., доцент, профессор РАЕ
• В.А. Калянов — и.о. завкафедрой судебной медицины ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития РФ

Рекомендовано к изданию Ученым советом ФГБУ «РЦСМЭ» Минздравсоцразвития России (протокол № 2 от 29.03.2012г.).

библиографическое описание:
Установление HBsAg в пятнах крови на вещественных доказательствах методом твердофазного иммуноферментного анализа. Методические рекомендации / Первушина Е.А., Гусаров А.А., Копылов А.В., Первушин Ю.В., Рогова С.Ш. — 2012.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
«РОССИЙСКИЙ ЦЕНТР СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

125284 Москва, ул. Поликарпова, д. 12/13;

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ «БЮРО СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ»

355000, Ставрополь, ул. Дзержинского, 70.

«Утверждаю»
И.о. директора ФГБУ «РЦСМЭ» Минздравсоцразвития России,
доктор медицинских наук
А.В. Ковалев

Установление HBsAg в пятнах крови на вещественных доказательствах методом твердофазного иммуноферментного анализа

В настоящее время, благодаря развитию иммуногенетики, гематологии, биохимии и ряда других теоретических дисцип­лин, судебно-медицинская экспертиза крови получила возмож­ность пополнить систему признаков, используемых для решения задач идентификации личности. В связи с этим перспективно использование маркеров, приобретенных организмом в процессе жизни (антигенов, антител). В качестве одного из них может быть использован сывороточный антиген гепатита В (HBsAg).

В России в последние годы заболеваемость гепатитом В имеет устойчивую тенденцию к росту как по количеству забо­левших, так и выявленных носителей. Заболеваемость острым гепатитом В (регистрируются практически только желтушные формы заболевания) в последние 20 лет возросла более чем в три раза, достигнув в 1997 году 36,3 на 100 тыс. населения. Для сравнения показатели заболеваемости гепатитом В в странах Скандинавии, Ирландии и Великобритании менее 1, а в Герма­нии, Франции, Италии — 3-5 на 100 тыс. Средний уровень носительства вируса гепатита В в нашей стране составляет 2,7%. По данным Госкомсанэпиднадзора, только за последние 2 года чис­ло заболевших острой формой гепатита В составило 105128 че­ловек, было зарегистрировано 247245 новых вирусоносителей, большинство из которых имеет серьезную патологию печени.

Развитие методов иммуноферментного анализа определило возможность установления HBsAg не только в жидкой крови, но и в пятнах крови на вещественных доказательствах. Нами был разработана новая медицинская технология для опре­деления HBsAg в пятнах крови методом твердофазного имму­ноферментного анализа с использованием отечественного набо­ра реагентов производства НПО «Диагностические системы». Принцип метода заключается в том, что в результате количест­венного твердофазного ИФА образуется специфический иммун­ный комплекс, состоящий из иммобилизованных на поверхно­сти лунок полистирольного планшета антител к HBsAg, содер­жащегося в исследуемом материале HBsAg и антител, меченых пероксидазой хрена. Данный комплекс выявляется посредством окраски с помощью раствора тетраметилбензидина, после чего в лунки полистирольного планшета вносят стоп-реагент. Регист­рация результатов реакции осуществляется фотометрически на регистрирующем приборе при длине волны 450 нм с последую­щим вычислением критической оптической плотности.

Аналогов данного метода по выявлению HBsAg в пятнах крови за рубежом не имеется.

Показания к использованию

В связи с тем, что HBsAg в крови практически здоровых людей встречается сравнительно редко (1-4%), его можно отне­сти к числу «особых примет» — признаков, индивидуализирующих личность. Эта особенность HBsAg при использовании в практике судебно-медицинской экспертизы позволяет конкрети­зировать происхождение крови на вещественных доказательст­вах от лиц, проходящих по делу и ограничить число подозре­ваемых при обработке следственных версий.

Используют оборудование и реактивы, стандартные для судебно-биологических отделений бюро судебно-медицинской экспертизы, а также:

Набор реагентов дли иммуноферментного определения поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотке крови человека «ДС-ИФА-Н BsAg-0,01» НПО «Диагностические системы» по ТУ 9398-091-05941003-2006 (Паспорт 2198, регистрационное удостоверение ФСР № 2006/03019), используемый в клинической практике для установления инфицирования вирусом гепатита В.

Промыватель (вошер от англ. wash — мыть) медицинский микропланшетный фирмы «Sanofi Dagnostics Pasteur» PW40 (Регистрационное удостоверение МЗ РФ №2003/211 от 28.02.2003 г.); ридер (от англ. read — читать, считывать) «Sanofi Dagnostics Pasteur» PR2100 (Регистрационное удостоверение МЗ РФ №2003/211 от 28.02.2003 г.) и инкубатор для микропланшет IPS-2 той же фирмы (Регистрационное удостоверение МЗ РФ №2003/211 от 28.02.2003 г.).

Ридер (от англ. read — читать, считывать) фотометр для микропланшетов «Zemfira» фирмы «Bio-RAD Laboratories. Inc., США» с принадлежностями (Регистрационное удостоверение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития ФС №2006/1979 от 12.12.2006 г.).

После установления наличия и видовой принадлежности крови вырезают фрагмент из объекта размерами 0,5×0,5 см, либо несколько вырезок из участка размерами 10×10 см (в зависимости от тактики экспертного исследования, характера и величины следов. Исследуемый материал заливают минимальным необходимым (без избытка) объемом физиологического раствора. Экстрагируют при температуре 4° С от 18 до 24 часов. Возможно использование приготовленной ранее для установления наличия и видовой принадлежности крови вытяжки из следов крови.

Данный метод реализовывался в следующей последова­тельности действий (рис. 1):

• — промывание перед использованием полистиролового планшета фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с рН 7,2-7,4 3 раза на вошере (либо вручную) и полное удаление жидкости;
• — внесение в лунки полистиролового планшета по 100 мкл исследуемых и контрольных (отрицательной, положительной, слабоположительной) проб;
• — инкубация в течение 30 минут в термостате при температуре +42±0,5°С;
• — не удаляя содержимого лунок, внесение в лунки полистиролового планшета по 50 мкл рабочего раствора конъюгата-1 (моноклональные антитела к HBsAg, конъюгированные с биотином);
• — инкубация в течение 40 минут на термостатируемом шейкере при температуре +42°С (интенсивность перемешивания 500 об/мин);
• — не удаляя содержимого лунок, внесение в лунки полистиролового планшета по 50 мкл рабочего раствора конъюгата-2 (стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена);
• — инкубация в течение 20 минут на термостатируемом шейкере при температуре +42°С (интенсивность перемешивания 500 об/мин);
• — промывание фосфатно-солевым буфером (ФСБ) 7 раз на вошере (либо вручную) и полное удаление жидкости;
• — внесение в лунки полистиролового планшета по 150 мкл субстратной смеси (готовится непосредственно перед использованием путем разведения тетраметилбензидина (ТМБ), который представляет собой бесцветную жидкость на основе стабилизированного буферного раствора, содержащего 3,3 г, 5,5 г — тетраметилбензидина гидрохлорида, субстратным буферным раствором — цитратным буфером, содержащим раствор перекиси водорода);
• — инкубация 25 минут при температуре от +18°С до +24°С в защищенном от света месте;
• — внесение в лунки полистиролового планшета по 50 мкл стоп-реагента (1Н соляная кислота);
• — регистрация результатов реакции фотометрически на ридере при длине волны 450 нм с введением результатов в компьютер;
• — распечатка результатов с помощью принтера.

Компьютерную программу для ридера (программное обеспечение продается вместе с прибором, под каждый тест-набор пользователь сам или с помощью инженера-программиста составляет программу, исходя из инструкции к нему) следует написать так, чтобы отсечка шла от критической оптической плотности. Реакцию следует учитывать, если значение оптической плотности в лунках с положительным контролем не менее 0,6, а среднее значение в лунках с отрицательным контролем — не более 0,12.

Положительными считаются образцы со значениями оп­тической плотности, равными или превышающими критическую оптическую плотность, которая рассчитывается по формуле:

где 0,06 — коэффициент, определяемый методом стати­стической обработки результатов постановки ИФА на предприятии-изготовителе.

Контрольный слабоположительный образец, содержащий HBsAg в концентрации 0,02±0,01 МЕ/мл, должен давать положительную реакцию.

Исследуемые образцы расцениваются как отрицательные, если ОП образца ОП крит.

Эффективность использования метода заключается, прежде всего, в повышении качества судебно-медицинских экспертиз вещественных доказательств. Так, выявление в следах крови НЬ8А§ позволяет значительно повысить дифференцирующие возможности экспертизы.

Метод апробирован на заведомых образцах крови от 100 но­сителей HBsAg, высушенных на марле, при этом было исследовано около 500 объектов. Чувствительность реакции обнаружения HBsAg — 4×10 6 мл крови, при этом ложноположительных и ложно-отрицательных результатов зарегистрировано не было. HBsAg был обнаружен во всех исследованных пятнах крови, независимо от давности их образования. HBsAg не был обнаружен в пятнах крови лиц контрольной группы, а также в вытяжках из предмета-носителя.

Метод обладает рядом существенных преимуществ:

1. Высокая чувствительность и специфичность в сочетании с объективной регистрацией и возможностью компьютерной обработки результатов. Документирование результатов ИФА в табличной форме позволяет дополнительно иллюстрировать заключения экспертов.
2. Высокая воспроизводимость.
3. Воздействие на кровь высокой температуры, прямых солнечных лучей, нахождение крови на снегу и почве, гемолиз не отражаются на результатах обнаружения НВsАg.

Посмертная диагностика малярии (случай из экспертной практики) / Яценко Д.С., Чернецова Е.П., Гаджиева Т.Ю. // Медицинская экспертиза и право. — 2010. — №4. — С. 48-50.

Миокардиты Коксаки-B — вирусной этиологии как причина скоропостижной смерти детей раннего возраста / Гедыгушева Н.П. // Матер. IV Всеросс. съезда судебных медиков: тезисы докладов. — Владимир, 1996. — №2. — С. 25-26.

источник

В диагностике вирусных болезней человека и животных широко применяют методы, основанные на использовании ферментов в качестве метки антигенов и антител. Это группа методов носит название иммуноферментного анализа.

ИФА применяют в двух вариантах: гистохимическом и твердофазном.

Гистохимический вариант ИФА, или иммунопероксидазную реакцию, используют редко. Он аналогичен методу иммунофлуоресценции, но отличается тем, что для постановки реакции используют антитела, меченные не флуорохромом, а ферментом.

Для метки антител обычно применяют ферменты: пероксидазу хрена (чаще), щелочную фосфатазу, галактозидазу и др.

Таким образом, в комплекс антиген + антитело включаются антитела, меченные ферментом, и для обнаружения этого комплекса вносят субстрат (фермент-чувствительное вещество), которое под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт ферментативной реакции, хорошо видимый в световом микроскопе.

В качестве субстрата используют ортофенилендиамин, 5-аминосалициловую кислоту или бензидин. К ним добавляют пероксид водорода (Н₂O₂).

Материалом для выявления вирусных антигенов при этом варианте могут быть: мазки; отпечатки различных органов; парафиновые срезы; культуры клеток. При этом можно использовать как прямой, так и непрямой метод.

Прямой метод. На фиксированный препарат наносят конъюгат (антитела к предполагаемому вирусу, меченные ферментом), выдерживают при 37 °С в течение 1—2 ч во влажной камере, затем препарат отмывают физиологическим раствором от несвязанного конъюгата, подсушивают на воздухе, наносят несколько капель раствора субстрата, инкубируют 5— 10 мин и промывают физиологическим раствором. Затем споласкивают дистиллированной водой, и результат учитывают с помощью светового микроскопа. В положительных случаях, т. е. при наличии антигена в исследуемом материале, видны или диффузное желто-коричневое окрашивание, или гранулы коричнево-черного цвета. В контрольных препаратах окрашивания не обнаруживают.

Непрямой метод. На фиксированный препарат наносят специфическую к предполагаемому вирусу сыворотку, выдерживают при 37 °С в течение 1—2 ч во влажной камере, промывают физиологическим раствором, подсушивают на воздухе и наносят меченную ферментом антивидовую сыворотку, выдерживают при 37 °С 1—6 ч. Далее следует процедура, как в прямом методе.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ТФИФА, РЭМА — реакция энзиммеченых антител, ELISA — enzyme-linked immunosorbent assay) в последние годы широко используют в биологии, в том числе и в вирусологии. Характерная особенность метода в том, что один из компонентов реакции (антиген или антитело) фиксируют на твердом носителе. В качестве носителей используют полистироловые микропанели, шарики, палочки и др.

Этим методом можно обнаружить и идентифицировать антиген, а также выявить антитела и определить их титр в сыворотках крови.

Существует много вариантов метода. Наиболее часто для обнаружения антигенов используют прямой метод («сандвич»-метод). Для этого специфические к предполагаемому антигену антитела фиксируют в лунках микропанелей, в которые вносят исследуемый антиген и выдерживают при 37 °С 1—2 ч. Затем микропанели промывают буферным раствором и вносят в лунки меченные ферментом к предполагаемому антигену антитела, выдерживают при 37 °С 1—2 ч, промывают микропанели, вносят раствор субстрата и выдерживают 5—30 мин. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты и учитывают визуально по разности в окраске опытных и контрольных образцов или при помощи спектрофотометрии. Положительные образцы имеют окраску от желтой до оранжево-коричневой.

Обнаружение и определение титра антител проводят непрямым твердофазным методом.

В крупных диагностических лабораториях применяют полностью автоматизированные установки для проведения твердофазного ИФА, позволяющие анализировать от 1000 до 4000 проб ежедневно.

Достоинства ИФА: высокая чувствительность; специфичность; простота техники постановки; требуется минимальное количество компонентов; не требуется специальных приборов; оценку можно проводить визуально; возможность автоматизации, что позволяет его применять для массовых исследований; исследуемые сыворотки не требуют предварительной обработки. Это — экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

источник

Способ комплексной диагностики инфекционных заболеваний человека путем твердофазного иммуноферментного анализа

Владельцы патента RU 2488832:

Изобретение относится к комплексному иммуноферментному анализу. Способ включает иммобилизацию на рабочей поверхности иммуносорбента нескольких различных белков в виде смеси, которые могут связывать маркеры соответствующих им нескольких разных инфекционных заболеваний, а выявляют маркеры, по меньшей мере, одного инфекционного заболевания, связавшиеся при инкубации с рабочей поверхностью иммуносорбента в форме иммунных комплексов, причем названные маркеры выявляют путем измерения суммарной ферментативной активности иммуносорбента. Способ прост в исполнении, не требует специального оборудования и позволяет многократно сократить время и трудозатраты на проведение комплексной диагностики инфекционных заболеваний. 11 з.п. ф-лы, 1 пр., 2 табл.

Изобретение относится к способам комплексной скрининговой диагностики инфекционных заболеваний человека путем анализа сыворотки или плазмы крови, и может использоваться в медицине для выявления различных заболеваний.

Известны способы диагностики заболеваний путем выявления маркеров инфекционных агентов, либо маркеров начавшегося инфекционного процесса в физиологических жидкостях пациентов. Причем исследование биологических проб для выявления заболеваний проводят отдельно для каждого заболевания.

Например, диагностику осуществляют путем выявления ДНК или РНК инфекционного агента в физиологических жидкостях человека, в том числе в сыворотке крови, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) или методом обратной транскрипции — полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). При этом практикуется предварительное пулирование образцов сыворотки или плазмы крови доноров для первичного скрининга методом ПЦР или ОТ-ПЦР. Для одновременной диагностики некоторых инфекционных заболеваний существует метод мультиплексного ПЦР или ОТ-ПЦР в реальном времени.

Существующая практика выявления заболеваний включает проведение скринингового (первичного) и подтверждающего тестирования сыворотки или плазмы крови методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и его модификации и/или методом иммунного блоттинга. Точные алгоритмы проведения скрининга и подтверждающего тестирования закреплены в нормативных актах для медицинских учреждений и соответствующих методических рекомендациях, которые определяются типом заболевания и локальными правовыми актами.

В настоящее время в широкой практике серологических скрининговых исследований методы одновременной (объединенной в одном анализе) серологической диагностики инфекционных заболеваний не применяются. При проведении серологических скрининговых тестов для каждого инфекционного заболевания отдельно определяют наличие в сыворотке или плазме крови антител или антигенов, специфичных по отношению к определенному инфекционному агенту, для чего необходимо провести несколько отдельных процедур анализа.

В то же время, например, выполнение анализов крови на наличие в ней инфекционных маркеров вируса гепатита В, вируса гепатита С, вируса иммунодефицита человека 1-го и 2-го типов и сифилиса является обязательным для всех доноров крови и органов в России, США и многих других странах. Кроме того, в связи с широким распространением названных инфекций такие анализы в настоящее время являются наиболее востребованными и распространенными. Наличие положительного результата по любому из серологических маркеров заболевания ВИЧ, Гепатитом В или С, сифилисом — является абсолютным противопоказанием для донорства крови, т.е. образец донорской крови, содержащий хотя бы один из названных маркеров безусловно бракуется. Таким образом, на стадии первичного скринига пациентов или доноров, целесообразно проводить один анализ, сразу на несколько маркеров разных инфекционных заболеваний, вместо нескольких независимых исследований отдельно для каждой инфекции. Все существующие подходы мультиплексной серологической диагностики в настоящее время требуют специального дорогостоящего оборудования и не применяются. Также, имеются большие сложности на пути создания объединенных диагностических систем из-за необходимости сложной оптимизации и настройки компонентов такой системы для одновременной работы в условиях объединенного метода. В настоящий момент на рынке таких продуктов не существует.

Известны способы диагностики путем выявления в сыворотке или плазме крови специфических иммуноглобулинов против антигенов инфекционных агентов или самих антигенов инфекционных агентов методом ИФА. Например, известно применение иммуноферментной тест-системы для идентификации спектра антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) первого и второго типов, первого типа группы О и выявления антигена к вирусу иммунодефицита человека первого типа р24, которая включает иммуносорбент на основе антигенов вируса иммунодефицита человека представляющих собой gp41 (env ВИЧ-1 и ВИЧ-2 группы О), gp120 (env), р24 (gag), р31 (pol), gp36 (env ВИЧ-2), антител к антигену ВИЧ 1 р24, и детектирующие реагенты, при этом вышеперечисленные антигены ВИЧ и антитела ВИЧ сорбированы в разных лунках планшетов для иммуноферментного анализа, и для сорбции используют 96-луночные полистироловые разборные или неразборные планшеты [Патент РФ №2283497, МПК G01N 33/543, G01N 15/48]. При этом белки, несущие антигенные детерминанты инфекционных агентов, и/или иммуноглобулины, специфичные к маркерам одного определенного заболевания, иммобилизуют на твердой поверхности в лунках планшета. В названные лунки планшета затем вносят клинический образец сыворотки или плазмы крови. После этого, иммунохимически определяют антитела или антигены, связавшиеся с белками на твердой фазе. К его недостаткам относится необходимость отдельного проведения анализа для выявления маркеров каждого инфекционного процесса.

Известен способ иммунохимического анализа, включающий инкубацию стрипа (пластиковой подложки) с фиксированным антигеном в разведении анализируемой сыворотки, отмывку стрипа, инкубацию стрипа в растворе конъюгата вторичных антител с ферментной меткой, отмывку стрипа, инкубацию стрипа в растворе субстрата для проявления метки, отмывку стрипа, визуальный учет результатов, в котором анализ выполняется с использованием изделия, представляющего собой стрип в виде гребенки с сорбционно фиксированным на ограниченном участке его поверхности антигеном и блокированными природными или синтетическими полимерами, свободными от антигена участками, с зубцами шириной 5-12 мм, на каждый из которых в виде отдельных пятен нанесены все используемые в анализе антигены, способные эффективно связывать специфические антитела в одинаковых условиях анализа [Патент РФ №2242762, МПК G01N 33/53]. Способ позволяет одновременно определять несколько видов различных по специфичности антител.

Этот способ является ближайшим аналогом предлагаемого и принят за прототип изобретения.

Прототип обладает рядом недостатков. Так, при диагностике необходимо проводить анализы отдельно по каждому инфекционному заболеванию, что требует существенного времени и трудозатрат. Результаты анализа учитывают визуально. Технологическую платформу этого способа невозможно напрямую интегрировать в стандартные производственные циклы производителей диагностики, а для конечных пользователей он непривычен.

Вместе с тем, как уже было упомянуто выше, например, выполнение анализов на наличие инфекционных маркеров, например, вируса гепатита В, вируса гепатита С, вируса иммунодефицита человека 1-го и 2-го типов и сифилиса является обязательным для всех доноров крови и органов. Такие анализы являются наиболее востребованными и распространенными. Поэтому насущным требованием времени является сокращение времени на проведение анализов и снижение их сложности.

Изобретение решает задачу создания такого способа проведения комплексной серологической диагностики, который позволял бы многократно сократить время и трудозатраты на проведение комплексной серологической диагностики инфекционных заболеваний, был бы простым в исполнении, не требовал дополнительного специального оборудования и был привычным для конечных пользователей.

Поставленная задача решается тем, что предлагается способ комплексной диагностики инфекционных заболеваний человека, включающий иммобилизацию на рабочей поверхности иммуносорбента по меньшей мере пары различающихся между собой белков, каждый из которых способен связывать специфичные ему маркеры соответствующего инфекционного заболевания, введение рабочей поверхности иммуносорбента в контакт с исследуемым образцом сыворотки или плазмы крови, инкубацию, последующую обработку рабочей поверхности иммуносорбента растворами коньюгатов белков, содержащих соответствующие ферментативные метки, и выявление маркеров инфекционных заболеваний, связавшихся при инкубации с рабочей поверхностью иммуносорбента в форме иммунных комплексов, в котором белки иммобилизуют на рабочей поверхности иммуносорбента в форме их смеси, а выявляют маркеры, по меньшей мере, одного инфекционного заболевания, связавшиеся при инкубации с рабочей поверхностью иммуносорбента в форме иммунных комплексов, причем названные маркеры выявляют путем измерения суммарной ферментативной активности иммуносорбента.

Инфекционными заболеваниями могут быть заболевания из ряда: вирусный гепатит В, вирусный гепатит C, ВИЧ-инфекция и сифилис.

Для диагностики гепатита B, на рабочую поверхность иммуносорбента иммобилизуют иммуноглобулины, способные специфично связываться с антигеном HBsAg и/или белки, несущие антигенные детерминанты вируса гепатита В, по меньшей мере, входящие в состав его белковых структур HBcoreAg и/или HBeAg.

Для диагностики гепатита C, на рабочую поверхность иммуносорбента иммобилизуют иммуноглобулины, специфичные к антигену нуклеокапсида Core названного гепатита C и/или белки, несущие антигенные детерминанты названного вируса гепатита C, по меньшей мере, входящие в состав его белковых структур Core и/или NS3 и/или NS4 и/или NS5.

Для диагностики сифилиса, на рабочую поверхность иммуносорбента иммобилизую белки, несущие антигенные детерминанты бактерии Treponema Pallidum, по меньшей мере, входящие в состав ее белковых структур р17 и/или р47.

Перед инкубацией, сыворотку или плазму крови целесообразно разбавлять каким-либо водным буферным раствором с коэффициентом разбавления 1-100.

При инкубации сыворотку или плазму крови и/или растворы коньюгатов целесообразно активно перемешивать и термостатировать в диапазоне температур 18-44°C.

Для выявления связавшихся с рабочей поверхностью иммуносорбента иммунных комплексов преимущественно используют коньюгаты белков и/или иммуноглобулинов с меткой биотина и/или с пероксидазой хрена и/или с щелочной фосфатазой, при этом названные белки и/или иммуноглобулины несут антигенные детерминанты и/или способны специфически связывать антигены соответствующих инфекционных заболеваний.

Для выявления связавшихся с рабочей поверхностью иммуносорбента иммунных комплексов, содержащих в своем составе метку биотина, используют коньюгат белка авидина или стрептавидина или их модификаций с ферментом пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза.

Связавшиеся с рабочей поверхностью иммуносорбента иммунные комплексы, содержащие пероксидазу хрена или щелочную фосфатазу, в основном выявляют по изменению оптической плотности или хемилюминесценции раствора, контактирующего с рабочей поверхностью иммуносорбента.

Рабочая поверхность иммуносорбента может быть поверхностью полимерных или минеральных или композитных микросфер, диаметром 50 нанометров — 20 микрометров.

Способ базируется на том, что результаты анализа не дискриминированы относительно того, какие из определяемых маркеров инфекционных заболеваний были выявлены в образце, а сами результаты анализа являются качественными.

Способ осуществляют следующим образом.

Для проведения анализа готовят иммуносорбент, которым является твердая фаза, с иммобилизованными белками, несущими антигенные детерминанты инфекционных агентов или иммуноглобулины, специфичные к антигенам инфекционных агентов.

Например, иммуносорбент представляется стандартным полистирольным планшетом с 96 лунками, сгруппированными в ряды. Каждая лунка вмещает обычно до 0,4 мл жидкости.

Сначала в лунки вносят белки, которые будут связывать маркеры инфекционных заболеваний в виде смеси различающихся между собой белков, которые могут связывать маркеры соответствующих им нескольких разных инфекционных заболеваний. В результате они все сорбируются на поверхности лунок случайным образом.

Маркеры инфекционных заболеваний это: антитела, которые организм вырабатывает в ответ на инфекцию, антигены (как правило это тоже белки) самих вирусов или бактерий, т.е. их непосредственные структурные компоненты в крови.

Далее в планшет вносят образцы, например, сыворотки крови и коньюгаты, содержащие ферментативные метки. В результате разнообразнх процедур маркеры инфекционных заболеваний оказываются связанными с поверхностью ИС вместе с коньюгатами и ферментативными метками.

В качестве ферментативных меток обычно используют пероксидазу из корней обычного хрена, или щелочную фосвфатау животного происхождения

Для того, чтобы определить, есть или нет в образце маркеры, нужно измерить ферментативную активность поверхности ИС, т.к. в случае наличия маркеров, она будет высокая, а в случае отсутствия — низкая.

Для измерения оптической плотности в лунки вносят раствор субстрата, например для пероксидазы хрена — это перекись водорода, фермент активно разрушает перекись и продукты этой реакции приводят к вторичным химическим реакциям, а именно -изменению цвета раствора, либо появлению хемилюминесценции. Изменение цвета раствора происходит из-за наличия в нем, вместе с субстратом, химических веществ, способных к изменению цвета в результате химических превращений. Их общее название — Хромоген. Хромогенов существует много, и они могут давать разные цвета. Хемилюминесценция возникает в случае наличия вместо хромогена веществ, способных в результате окислительно-восстановительных реакции испускать кванты света, например, к таким веществам можно отнести люминол и его аналоги.

Измерение интенсивности окрашивания раствора производится приборами — спектрофотометрами, которые пропускают через лунку с раствором субстрата-хромогена (снизу-вверх) луч света определенной длинны волны, специально подобранной под используемый хромоген. Спектрофотометры снабжены несколькими оптическими фильтрами, и могут проводить измерения на разных длинах волн. Если хромоген изменил цвет, то луч света от спектрофотометра при прохождении через лунку — поглощается хромогеном, а если хромоген не изменился в результате реакции — то луч не поглощается раствором. Прибор сравнивает интенсивность поданного пучка света с прошедшим через лунку пучком света. Если поглощения много — то результат положительный. Если мало — то отрицательный. Статистически выбирают «критическое значение» оптической плотности, при котором результат считается положительным.

Измерение интенсивности хемилюминесценции производится приборами — люминометрами, способными регистрировать интенсивность излучения света в лунках планшета. В основе работы люминометра лежит фотоэлектронные умножители на основе, например, полупроводниковых фотодиодов или CCD-матриц. Прибор измеряет интенсивность поданного света, идущего из лунок планшета в результате реакций, катализируемых ферментом на поверхности иммуносорбента, и сравнивает данные с контрольным значением. Если интенсивность излучения высокая — то результат положительный, если низкая — то отрицательный. Статистически выбирают «критическое значение» интенсивности излучения, при котором результат считается положительным.

Иммобилизация белков на поверхности твердой фазы может быть осуществлена, например, химически с образованием ковалентных связей между амино- карбокси- или сульфгидрильной группой белка и материалом поверхности, например с образованием пептидной связи между карбокси-группой белка и аминогруппой поверхности. Иммобилизация белков может производиться пассивно, например, за счет гидрофобных и/или ионных взаимодействий материала твердой фазы с иммобилизуемым белком. Также, для иммобилизации могут быть использованы другие вспомогательные белки, обладающие афинностью к иммобилизуемым белкам, например протеин А, протеин G или антивидовые иммуноглобулины могут быть использованы как промежуточные соединения для иммобилизации иммуноглобулинов, специфичных, например, к антигену р24 ВИЧ или HBsAg гепатита В.

Твердой фазой для проведения анализа может являться любая полимерная, минеральная или композитная подложка, например полистирольный иммунологический планшет, а так же полимерные, композитные или силикатные микросферы, в том числе микросферы с суперпарамагнитными свойствами.

Для диагностики гепатита В на твердой фазе иммобилизуют иммуноглобулины, специфичные к антигену HBsAg названного гепатита В и/или белки, несущие антигенные детерминанты вируса гепатита В, как минимум входящие в состав его белковых структур: HBcoreAg и/или HBeAg.

Для диагностики гепатита С на твердой фазе иммобилизуют иммуноглобулины, специфичные к антигену Core названного гепатита С и/или белки, несущие антигенные детерминанты названного вируса гепатита С, как минимум входящие в состав его белковых структур: Core и/или NS3 и/или NS4 и/или NS5.

Для диагностики ВИЧ-инфекции на твердой фазе иммобилизуют иммуноглобулины, специфичные к антигену нуклеокапсида р24 названного вируса иммунодефицита человека и/или белки, несущие антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 1-го типа, по крайней мере, входящие в состав его белковых структур: gp41.

Для диагностики ВИЧ-инфекции 2-го типа на поверхности микрочастиц иммобилизуют белки, несущие антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 2-го типа, по крайней мере, входящие в состав его белковой структуры gp36.

Для диагностики сифилиса на поверхности микрочастиц иммобилизуют белки, несущие антигенные детерминанты бактерии Treponema Pallidum, по крайней мере, входящие в состав ее белковых структур р17 и/или р47.

Перечисленные выше белки могут быть иммобилизованы на поверхность твердой фазы в любых сочетаниях.

Композиция названных белков на твердой фазе не ограничена по числу выявляемых маркеров инфекционных заболеваний человека, однако должна включать и обеспечивать выявление маркеров инфекционного процесса по, как минимум, любым из двух следующих инфекций одновременно: ВИЧ, гепатит В, гепатит С, сифилис.

Иммуносорбент с иммобилизованными на твердой фазе названными белками инкубируют в контакте с исследуемым образцом сыворотки или плазмы крови человека.

Целесообразно проводит инкубацию образца и твердой фазы при температуре от 18 до 44 градусов Цельсия в течение не менее 15 минут.

Целесообразно сыворотку или плазму исследуемой крови разбавлять в рабочей смеси во время анализа с коэффициентом разбавления от 1 до 100.

Для сокращения времени инкубирования, целесообразно рабочую смесь во время инкубирования постоянно перемешивать.

Во время инкубации, присутствующие в исследуемом образце специфические иммуноглобулины связываются с соответствующими им антигенами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы иммуносорбента с образованием иммунных комплексов. Аналогично, свободные антигены инфекционных агентов, при их наличии в исследуемом образце, также могут связаться с соответствующими специфическими иммуноглобулинами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы иммуносорбента с образованием иммунных комплексов. В случае, если специфические иммуноглобулины и антигены инфекционных агентов в образце отсутствуют, то иммунные комплексы не образуются. Связавшиеся с поверхностью иммуносорбента аналиты образуют соответствующие иммунные комплексы типа антиген-иммуноглобулин или иммуноглобулин-антиген.

Целесообразно разделить процедуру анализа на от 2 до 4 стадий инкубации с промежуточными промывками твердой фазы от несвязавшихся компонентов исследуемого образца и коньюгатов.

Для выявления связавшихся с твердой фазой иммунных комплексов, целесообразно использовать биотинилированные иммуноглобулины против антигена нуклеокапсида р24 ВИЧ; и/или биотинилированные иммуноглобулины против антигена HBsAg гепатита B; и/или биотинилированные белки, несущие антигенные детерминанты вируса гепатита B, по крайней мере входящие в состав его белковых структур HBcoreAg и/или HBeAg; и/или биотинилированные белки, несущие антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 1-го типа, по крайней мере, входящие в состав его белковой структуры gp41; и/или биотинилированные белки, несущие антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 2-го типа, по крайней мере, входящие в состав его белковой структуры gp36; и/или биотинилированные белки, несущие антигенные детерминанты бактерии Treponema Pallidum, по крайней мере, входящие в состав ее белковых структур р17 и/или р47; и/или биотинилированные иммуноглобулины, специфичные к антигену нуклеокапсида Core названного гепатита С; и/или биотинилированные белки, несущие антигенные детерминанты названного вируса гепатита С, по крайней мере, входящие в состав его белковых структур Core и/или NS3 и/или NS4 и/или NS5.

Во время инкубации твердой фазы, образца и коньюгатов, на твердой фазе иммуносорбента названные биотинилированные белки образуют иммунные комплексы типа «антиген — атитело — биотинилированный антиген» и/или «иммуноглобулин — антиген — биотинилированный иммуноглобулин».

Для выявления связанных с твердой фазой биотинилированных иммуноглобулинов и/или антигенов целесообразно использовать коньюгат белка авидина или стрептавидина с ферментативной меткой, например пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой.

Названные биотинилированные иммуноглобулины или антигены могут быть заменены на соответствующие прямые коньюгаты этих иммуноглобулинов или антигенов с пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой, например, коньюгат пероксидазы хрена с белками, несущими антигенные детерминанты бактерии Treponema Pallidum, входящие в состав ее белковых структур р17 и/или р47, или, например, коньюгат пероксидазы хрена с белками несущими антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 1-го и 2-го типа, входящими в состав его белковых структур gp41 и gp36.

Комбинации и наименования используемых антигенов и/или иммуноглобулинов на твердой фазе или в составе коньюгатов могут быть дополнены и другими антигенными детерминантами ифекционных агентов и/или специфическими к их антигенам иммуноглобулинами, не являющихся основными и достаточными для диагностики на основании общепринятой мировой практики производства, например в композицию на твердой фазе могут быть введены белки, несущие антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 1-го типа, входящие в состав его белковой структуры gp120, и/или белки, несущие антигенные детерминанты бактерии Treponema Pallidum, входящие в состав ее белковых структуры tmpA.

Введение в композицию твердой фазы или коньюгатов других белков, дополняющих спектр определяемых маркеров, расширение спектра исследуемых инфекционных заболеваний в анализе, а также изменения в процедуре анализа не изменяют суть настоящего изобретения.

Наличие содержания любого из названных маркеров инфекционных заболеваний определяется по наличию и интенсивности ферментативной активности, связанной с твердой фазой в составе иммунных комплексов по окончанию всех инкубации и финальной отмывки твердой фазы.

Ферментативная активность пероксидазы и/или щелочной фосфатазы определяется либо калориметрическими методами по изменению оптической плотности раствора хромогена, например 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина, или при помощи измерения хемилюминесценции таких соединений как, например люминол или его аналогов.

Интенсивность нарастания оптической плотности раствора хромогена или интенсивность хемилюминесценции напрямую связана с концентрацией специфических аналитов-маркеров инфекционных процессов в исследуемом образце.

Положительный результат такого анализа не дискриминирован, т.е. положительный результат говорит о том, что исследуемый образец является положительным, то есть содержит, по крайней мере, один из исследуемых маркеров названных инфекционных заболеваний. Для подтверждения и дискриминации положительного результата могут потребоваться дополнительные исследования образца. Но, например, для принятия решения о донорстве крови, результат этого теста является достаточным.

Отрицательные результаты такого анализа могут говорить об отсутствии детектируемых количеств любого из исследуемых маркеров названных инфекционных заболеваний.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет одновременно выполнять комплексную скрининговую диагностику различных инфекционных заболеваний человека, например, гепатита В, гепатита С, ВИЧ-инфекции, сифилиса, но не ограничено только ими. Способ позволяет кратно сократить стоимость, время и трудозатраты на проведение анализов. Способ может быть полностью автоматизирован.

Комплексная серологическая диагностика ВИЧ инфекции, гепатита В и сифилиса путем твердофазного иммуноферментного анализа.

Стадия 1. Подготовка твердой фазы иммуносорбента.

Растворяют в 50 мМ карбонатном буфере в деионизованной воде, pH 10, следующие белки: иммуноглобулины класса IgG против антигена р24 ВИЧ в концентрации 2 мкг/мл, иммуноглобулины класса IgG против антигена HBsAg в концентрации 3 мкг/мл, рекомбинантный белок массой 40 кДа, содержащий антигенные детерминанты белка gp41 ВИЧ 1-го типа в концентрации 1 мкг/мл, рекомбинантный антиген молекулярной массой 30 кДа, содержащий антигенные детерминанты белка gp36 ВИЧ 2-го типа в концентрации 0,5 мкг/мл, рекомбинантный антиген, содержащий антигенные детерминанты белка р17 и р47 бактерии Treponema Pallidum в концинтрациях 1 мкг/мл каждый. Концентрации белков могут быть изменены в зависимости от типа и качества сырья, молекулярной массы белков, или изменения требований к анализу. Перемешивают полученный раствор белков и внесят в лунки стандартного полистирольного 96-луночного планшета в количестве 200 мкл раствора в каждую лунку. Инкубируют планшет при температуре 15-28°С в течение 16 часов. По окончании инкубации раствор удаляют и заполняют лунки раствором 0,1% казеината натрия и 1% сахарозы в деионизованной воде в количестве 200 мкл в каждую лунку. Инкубируют планшет 2 часа, после чего жидкость из лунок тщательно удаляют, планшет высушивают на столе.

Стадия 2. Подготовка рабочих растворов.

Готовят раствор для разведения коньюгатов №1, для этого в деионизованной воде растворяют 100 мМ трис-гидроксиметил-аминометан, 100 мМ NaCL, 1% TritonX100, 1,5 М мочевину, 30 мМ EDTA,

Готовят рабочий раствор коньюгатов №1, для этого в раствор для разведения коньюгатов №1 вносят коньюгаты: биотинилированные иммуноглобулины против антигена нуклеокапсида р24 ВИЧ в концентрации 0,1 мкг/мл; биотинилированные иммуноглобулины против антигена HBsAg гепатита В в концентрации 0,1 мкг/мл; биотинилированный белок с молекулярной массой 40 кДа, несущий антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 1-го типа, входящие в состав его белковой структуры gp41 в концентрации 0,05 мкг/мл; биотинилированный белок молекулярной массой 4 кДа, несущий антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 2-го типа, входящие в состав его белковой структуры gp36 в концентрации 0,01 мкг/мл. Концентрации коньюгатов белков с биотином могут быть изменены в широком диапазоне значений в зависимости от молекулярной массы белков и качества сырья.

Готовят раствор для разведения коньюгатов №2, для этого растворяют в деионизованной воде 100 мМ трис-гидроксиметил-аминометан, 100 мМ NaCL, 0,1% TritonX100, 0,25% казеината натрия, довести pH раствора до 8.0 при помощи концентрированной соляной кислоты.

Готовят рабочий раствор для разведения коньюгатов №2, для чего в раствор для разведения коньюгатов №2 вносят коньюгаты: коньюгат рекомбинантных белков, несущих антигенные детерминанты бактерии Treponema Pallidum, входящие в состав ее белковых структур р17 и/или р47, с пероксидазой хрена в концентрации 5 мкг/мл; коньюгат пероксидазы хрена со стрептавидином в концентрации 0,5 мкг мл/мл.

Готовят промывочный раствор, для чего в деионизованной воде растворить 10 мМ фосфат натрия однозамещенный, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин 20, доводят pH раствора до 7,0-7,5.

Готовят раствор субстрата, для чего в 50 мМ фосфат-цитратном буфере, pH 5.0-6.0 растворяют гидроперит до 0,2(±0,1) грамм на литр.

Готовят раствор концентрата хромогена, для чего растворяют 0,5 грамма 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина в 100 мл диметилсульфоксиде.

Готовят рабочий раствор хромогена, для чего вносят 400 мкл раствора концентрата хромогена в 12 мл раствора субстрата.

Готовят стоп реагент, для чего растворяют 50 мл концентрированной серной кислоты в одном литре деионизованной воды.

Стадия 3. Проведение анализа.

В лунки планшета вносят по 150 мкл исследуемых сывороток или плазмы крови человека, а так же положительные и отрицательные контрольные образцы: в лунку А1 вносят образец сыворотки крови человека, содержащий антитела к антигенам ВИЧ 1-го типа; в лунку В1 вносят образец сыворотки крови человека, содержащий антитела к антигенам ВИЧ 2-го типа, в лунку С1 вносят образец сыворотки крови человека; содержащий антитела к антигенам Treponema Pallidum, в лунку D1 вносят образец сыворотки крови человека, содержащий свободный антиген р24 ВИЧ в концентрации 20 пикограмм в миллилитре; в лунку Е1 вносят образец сыворотки крови человека, содержащий свободный антиген HBsAg гепатита В в концентрации 100 пикограмм в миллилитре; в лунку F1 вносят образец сыворотки крови человека, одновременно содержащий свободный антиген р24 ВИЧ в концентрации 20 пикограмм в миллилитре и антиген HBsAg гепатита В в концентрации 100 пикограмм в миллилитре; в лунку G1 вносят образец сыворотки крови человека, одновременно содержащий антитела к антигенам ВИЧ 1-го типа и антитела к антигенам Treponema Pallidum; в лунку HI вносят образец, содержащий одновременно свободный антиген р24 ВИЧ в концентрации 20 пикограмм в миллилитре, антиген HBsAg гепатита В в концентрации 100 пикограмм в миллилитре, антитела к антигенам ВИЧ 1-го типа и антитела к антигенам Treponema Pallidum; в лунки с А2 по Н3 вносят исследуемые неизвестные образцы (образец №1-16); в лунки с А4 по С4 вносят контрольный отрицательный образец; в лунки с D4 до H12 вносят образцы здоровых доноров.

Схема постановки приведена ниже:

Готовят рабочий раствор коньюгатов №1 и вносят его по 50 мкл в каждую лунку планшета. Помещают планшет в термошейкер с частотой вращения 500-800 оборотов в минуту при температуре 37°С. Инкубируют планшет 60 минут. Удаляют содержимое лунок планшета, промывают лунки планшета от несвязавшихся с твердой фазой реагентов промывочным раствором не менее 5 раз, полностью наполняя и опорожняя лунки планшета. По завершению промывки, вносят в лунки планшета по 200 мкл свежеприготовленного рабочего раствора коньюгатов №2. Помещают планшет в термошейкер с частотой вращения 500-800 оборотов в минуту при температуре 37°С. Инкубируют планшет 20 минут. Удаляют содержимое лунок планшета, промывают лунки планшета от несвязавшихся с твердой фазой реагентов промывочным раствором не менее 5 раз, полностью наполняя и опорожняя лунки планшета. Вносят в лунки планшета свежеприготовленный рабочий раствор хромогена. Инкубируют планшет 15 минут при температуре +37°С в термостате. Вносят в лунки планшета по 50 мкл стоп реагента. Измеряют оптическую плотность раствора в лунках планшета на автоматическом планшетном спектрофотометре, на длине волны 450 нм с референс-фильтром на 620 нм, калибровку нуля осуществляют по воздуху. Анализируют результаты.

Стадия 4. Представление и анализ результатов.

Результаты анализа представлены в виде следующей таблицы в соответствии со схемой внесения исследуемых образцов, данные приведены в виде оптической плотности:

Для интерпретации результатов определяют критическое значение оптической плотности ОП критическая, которая равна среднему значению оптической плотности отрицательного контрольного образца, увеличенному на величину К, по формуле:

где (ОПК-ср.) — среднее значение оптической плотности отрицательного контрольного образца по трем (двум) лункам, (К) — статистически установленная величина, зависящая от характеристик метода и требований к специфичности анализа. Исследуемый образец расценивается как положительный, т.е. содержащий по крайней мере антитела к ВИЧ-1, и/или к ВИЧ-2, и/или антиген р24 ВИЧ-1, и/или антиген HBsAg вируса гепатита В, и/или антитела к антигенам Treponema Pallidum, если ОП образца больше или равна ОПкрит. Исследуемую сыворотку расценивают как отрицательную, т.е. не содержащую названных маркеров инфекционных заболеваний, если ОП сыворотки ниже ОПкрит. Отрицательные результаты анализа не гарантируют отсутствие инфекционного процесса, а лишь указывают на отсутствие достаточных для выявления настоящим методом количеств маркеров инфекционных заболеваний в образце.

Например, если положить К, равным 0,1 оптических единиц, тогда ОПкрит = 0,15 оптических единиц. Таким образом, все контрольные образцы, с заведомо известным содержанием маркеров инфекционных заболеваний определены как положительные, при этом, из результатов видно, что в образцах, содержащих несколько инфекционных маркеров, сигнал по каждому из маркеров суммируется. Исследуемые неизвестные образцы №5, 6, 13, 14 и 15, содержат как минимум один из маркеров ВИЧ инфекции и/или гепатита В и/или сифилиса или комбинацию из любых двух. Образцы №1-4, 7-12 и 16 определены как отрицательные. Специфичность анализа определяется как процент ложноположительных результатов, получаемых при помощи метода на заведомо отрицательных образцах. В настоящем примере, все отрицательные образцы здоровых доноров определены как отрицательные, таким образом, специфичность метода можно принять за 100%, однако более точные значения этого параметра требуют изучения большего количества отрицательных образцов и статистической обработки данных.

Для выяснения того, какой маркер, или сочетание маркеров инфекционных заболеваний послужило причиной положительного результата образцов №5, 6, 13, 14 и 15, необходимо проводить отдельный анализ по каждому из маркеров, например тест на антитела к антигенам ВИЧ, или тест на антиген HBsAg гепатита В, или тест на антитела к антигенам Treponema Pallidum.

1. Способ комплексной диагностики инфекционных заболеваний человека, таких как вирусный гепатит В, вирусный гепатит С, ВИЧ-инфекция и сифилис, включающий иммобилизацию на рабочей поверхности иммуносорбента нескольких различных белков, каждый из которых способен связывать специфичные ему маркеры соответствующего инфекционного заболевания, введение рабочей поверхности иммуносорбента в контакт с исследуемым образцом сыворотки или плазмы крови, инкубацию, последующую обработку рабочей поверхности иммуносорбента растворами конъюгатов белков, содержащих соответствующие ферментативные метки, и выявление маркеров инфекционных заболеваний, связавшихся во время инкубации с рабочей поверхностью иммуносорбента в форме иммунных комплексов, отличающийся тем, что белки иммобилизуют в виде смеси различающихся между собой белков, которые могут связывать маркеры соответствующих им нескольких разных инфекционных заболеваний, а выявляют маркеры, по меньшей мере, одного инфекционного заболевания, связавшиеся при инкубации с рабочей поверхностью иммуносорбента в форме иммунных комплексов, причем названные маркеры выявляют путем измерения суммарной ферментативной активности иммуносорбента.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что инфекционными заболеваниями являются заболевания из ряда: вирусный гепатит В, вирусный гепатит С, ВИЧ-инфекция и сифилис.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что для диагностики гепатита В на рабочую поверхность иммуносорбента иммобилизуют иммуноглобулины, способные специфично связываться с антигеном HBsAg, и/или белки, несущие антигенные детерминанты вируса гепатита В, по меньшей мере, входящие в состав его белковых структур HBcoreAg и/или HBeAg.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что для диагностики гепатита С на рабочую поверхность иммуносорбента иммобилизуют иммуноглобулины, специфичные к антигену нуклеокапсида Core названного гепатита С, и/или белки, несущие антигенные детерминанты названного вируса гепатита С, по меньшей мере, входящие в состав его белковых структур Core, и/или NS3, и/или NS4, и/или NS5.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что для диагностики сифилиса на рабочую поверхность иммуносорбента иммобилизуют белки, несущие антигенные детерминанты бактерии Treponema Pallidum, по меньшей мере, входящие в состав ее белковых структур р17 и/или р47.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед инкубацией сыворотку или плазму крови разбавляют водным буферным раствором с коэффициентом разбавления 1-100.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что при инкубации сыворотку или плазму крови и/или растворы конъюгатов активно перемешивают и термостатируют в диапазоне температур от 18 до 44°С.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выявления связавшихся с рабочей поверхностью иммуносорбента иммунных комплексов используют конъюгаты белков и/или иммуноглобулинов с меткой биотина, и/или с пероксидазой хрена, и/или с щелочной фосфатазой, при этом указанные белки и/или иммуноглобулины несут антигенные детерминанты и/или способны специфически связывать антигены соответствующих инфекционных заболеваний.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что для выявления связавшихся с рабочей поверхностью иммуносорбента иммунных комплексов, содержащих в своем составе метку биотина, используют конъюгат белка авидина, или стрептавидина, или их модификации с ферментом пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза.

10. Способ по п.8, отличающийся тем, что связавшиеся с рабочей поверхностью иммуносорбента иммунные комплексы, содержащие пероксидазу хрена или щелочную фосфатазу, выявляют по изменению оптической плотности или хемилюминесценции раствора, контактирующего с твердой фазой иммуносорбента.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что рабочая поверхность иммуносорбента является поверхностью полимерных, или минеральных, или композитных микросфер диаметром 50 нм — 20 мкм.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что результаты анализа не дискриминированы относительно того, какие из определяемых маркеров инфекционных заболеваний были выявлены в образце, а сами результаты анализа являются качественными.

источник