Меню Рубрики

Рентгеноструктурный анализ метод определения белка

В природе встречается примерно 10 12 различных белков, выполняющих самые разнообразные функции. Это и белки-ферменты, катализирующие биохимические процессы в живой клетке; и белки-переносчики, позволяющие другим молекулам проходить через ядерные или клеточные мембраны или перемещаться между клетками всего организма; и иммуноглобулярные белки, отличающиеся высокой специфичностью взаимодействия с антигенами, что приводит к активации сигнальных путей, обеспечивающих иммунный ответ клеток. Это лишь несколько примеров уникальных свойств белковых молекул. По образному выражению Фрэнсиса Крика, белки важны прежде всего потому, что они могут выполнять самые разнообразные функции, причем с необыкновенной легкостью и изяществом.

При всем своем структурном и функциональном многообразии все природные белки построены из 20 аминокислот, соединенных в соответствии с кодом белкового синтеза. В зависимости от последовательности аминокислотных остатков в полипептидной цепи формируется определенная стабильная трехмерная структура белка, определяющая его структурные и функциональные свойства. Например, для каждого фермента характерна вполне определенная конформация активного центра, обеспечивающего специфическое взаимодействие с молекулами субстратов и осуществляющего каталитический акт. Причем для эффективного образования фермент-субстратного комплекса большое значение имеет не только геометрическое соответствие (комплементарность) молекул фермента и субстрата, но и образование водородных связей, электростатические и гидрофобные взаимодействия между атомами активного центра фермента и молекулы субстрата. Таким образом, любая белковая молекула характеризуется уникальностью структуры, которая определяет уникальность ее функции.

Выяснение пространственной организации белков – одно из основных направлений современной биохимии. Во многих случаях знание структуры белка и его комплекса с ингибиторами является решающим фактором при создании лекарственных препаратов.

Одним из важнейших экспериментальных методов, позволяющих с атомарной точностью узнать, что представляет собой трехмерная структура белка, т.е. определить пространственные координаты всех атомов исследуемого объекта, является рентгеноструктурный, или кристаллографический, анализ. Зная положение каждого атома, можно вычислить межатомные расстояния, валентные углы, углы вращения вокруг связей, распределение поверхностного заряда и другие детали молекулярной геометрии. Эти данные нужны химикам, биохимикам и биологам, изучающим зависимости между структурными характеристиками и функциональными свойствами, а также специалистам, занимающимся изучением электронной структуры молекул и молекулярных взаимодействий. Особое место рентгеноструктурного анализа среди других экспериментальных методов отражает тот факт, что с момента открытия рентгеновских лучей в 1901 г. по настоящее время работы в этой области 12 раз отмечались Нобелевскими премиями.

Применение рентгеноструктурного анализа для исследования сложноорганизованных биологических объектов началось после 1953 г., когда сотрудник Кавендишской лаборатории Кембриджского университета Макс Перутц нашел способ определения структуры крупных молекул, таких как миоглобин и гемоглобин. С тех пор рентгеноструктурный анализ молекул белка помогает нам понять химию биологических реакций. На сегодняшний день известны структуры около 15 тыс. белков и их комплексов с биологически важными молекулами.

Рентгеновские лучи являются электромагнитными волнами с длинами в диапазоне 0,01–10 нм. С коротковолновой стороны они соседствуют с -лучами (длины волн менее 0,1 нм), с длинноволновой – с ультрафиолетовыми (длины волн примерно 10–380 нм).

Для проведения рентгеновского эксперимента необходимо монохроматическое рентгеновское излучение (т.е. строго определенной длины волны). Для этой цели используются различные фильтры и монохроматоры.

Обычно, когда человек слышит о рентгеновском исследовании, он вспоминает рентгеновский кабинет в поликлинике. На самом деле рентгеноструктурный анализ не имеет ничего общего с медицинскими исследованиями. Медицинская рентгеноскопия основана на различии в степени поглощения рентгеновских лучей разными тканями, а рентгеновская кристаллография – на рассеянии рентгеновских лучей электронами атомов. Если в медицине мы получаем рентгеновский снимок исследуемого объекта, то в рентгеновской кристаллографии снимки не содержат никакого изображения чего бы то ни было.

Как же ставится рентгеновский эксперимент? Принципиальная схема проста (рис. 1): исследуемый объект помещают в пучок рентгеновских лучей и измеряют интенсивность рассеянного в различных направлениях излучения. Самый простой способ – поместить на пути пучка лучей фотопленку и по степени потемнения пятна после проявления судить об интенсивности рассеяния в этом направлении. Конечно, на сегодняшний день существуют и более совершенные методы, но сейчас это не важно. В данном случае важно то, что мы смотрим не на интенсивность лучей, прошедших сквозь объект, а на интенсивность лучей, возникших там, где их вроде бы и не должно было быть.

Итак, на входе мы имеем неизвестный объект, на выходе – набор интенсивностей рассеянных в различных направлениях лучей, или дифракционную картину. Теперь необходимо связать полученную в эксперименте информацию с атомной структурой исследуемого объекта. Перечислим основные положения, на которых строится простейшая математическая модель рассеяния рентгеновских лучей:

1) пучок рентгеновских лучей является плоской монохроматической электромагнитной волной;
2) под воздействием этой электромагнитной волны каждый электрон приходит в движение, которое может быть описано уравнениями для свободных зарядов;
3) движущийся электрон является, в свою очередь, источником новой рассеянной сферической электромагнитной волны, распространяющейся во всех направлениях;
4) эти новые волны суммируются и определяют интенсивность излучения в интересующем нас направлении.

Такая модель называется кинематической теорией рассеяния. Ее основной недочет заключается в том, что на электрон действует не только первичный пучок, но и рассеянные волны, и их влияние может изменять характер его движения. Попытка учесть эти поправки делается в более изощренной динамической теории рассеяния, однако для практических приложений более простая кинематическая теория рассеяния оказывается, как правило, вполне достаточной.

Метод рентгеноструктурного анализа основан на дифракции рентгеновских лучей на кристаллической решетке и поэтому применим только к веществам в кристаллическом состоянии. Это связано с тем, что для регистрации дифракционной картины рассеяния необходимо иметь достаточное количество рассеивающих электронов. Но если образец состоит из большого числа произвольно ориентированных идентичных молекул (раствор), то картина рассеяния будет определяться какими-то усредненными по всевозможным ориентациям характеристиками и вряд ли позволит получить детальную информацию об атомной структуре. Другое дело, если большое количество одинаковых молекул ориентированы одинаково. Такую возможность дают нам кристаллические образцы.

Говоря простыми словами (и не вдаваясь в сложные математические формулировки), кристалл – это такой образец исследуемого вещества, в котором много (

10 12 ) идентичных молекул находятся в одинаковой ориентации и их центры образуют правильную трехмерную решетку.

Основная особенность структуры каждого кристалла состоит в том, что он построен из регулярно расположенных в пространстве отдельных атомов или групп атомов. Если каждую повторяющуюся структурную единицу заменить точкой, или узлом, то получится трехмерная кристаллическая решетка (рис. 2). Решетку можно представить себе как систему одинаковых параллелепипедов. Каждый такой параллелепипед носит название «элементарная ячейка кристалла» и описывается шестью параметрами: длинами ребер (a, b, c) и углами между ними (, , ).

Одна из основных претензий к методу рентгеноструктурного анализа с самого начала исследования структур белков – это то, что в жизни белки находятся в растворе, а при исследовании мы их кристаллизуем. Возникает логичный вопрос: не происходит ли принципиальных искажений структуры молекул белка при кристаллизации? Принято считать, что сильных искажений все-таки не происходит. Доводы в пользу такой позиции следующие.

Во-первых, ряд белков сохраняют ферментативную активность и в закристаллизованном состоянии, т.е. структура изменяется не настолько, чтобы белок стал «неработоспособен». Другое соображение: в кристаллах биомакромолекул значительный объем (от 30 до 80%) занимает растворитель, т.е. упаковка молекул белка в кристалле не плотная и вряд ли вызывает существенные искажения. Некоторые искажения в свободных петлях возможны, но структура активного центра сохраняется. Еще одно подтверждение: альтернативное определение структур некоторых белков методом двумерного ядерного магнитного резонанса не дало существенных расхождений со структурами, расшифрованными рентгеновскими методами.

Монохроматическое рентгеновское излучение, проходя через кристалл, рассеивается в основном на электронных оболочках периодически повторяющихся атомов и образует дифракционную картину, или рентгенограмму (рис. 3). Поэтому экспериментальные рентгеновские данные позволяют судить об особенностях расположения электронов в элементарных кристаллических ячейках. Электрон обладает волновыми свойствами, и его положение в пространстве характеризуется не точными координатами, а функцией распределения электронной плотности (r), которая дает среднее по времени число электронов, приходящееся на 1 3 (кубический ангстрем). На основании этой функции можно судить о расположении атомов в элементарных ячейках, т.к. каждому атому соответствует сгусток электронной плотности определенной величины. Таким образом, при обработке данных рентгеновского эксперимента нужно решить две задачи.

1. Из данных рентгенограммы получить карту распределения электронной плотности (r) в кристалле исследуемого объекта. На этом этапе возникает принципиальная трудность (о которой речь пойдет ниже), связанная с невозможностью получить из эксперимента всю информацию, необходимую для восстановления исследуемой структуры. Для получения недостающей части информации используют различные обходные пути. Но универсального пути нет, и в каждом случае исследователь выбирает наиболее подходящий, основываясь на своем опыте и интуиции.

2. На основании карты распределения электронной плотности (r) определить положения атомов в исследуемом объекте. Для решения этой задачи структура многократно подвергается программной обработке и ручной доводке для достижения наилучшего совпадения с электронной плотностью.

С этого этапа начинаются практически все экспериментальные исследования белковых структур. Для получения нужного белка используют различные биохимические методы. Последовательность операций по выделению белков обычно сводится к измельчению биологического материала (гомогенизация), извлечению из него белков, а точнее – переводу белков в растворенное состояние (экстракция) и выделению исследуемого белка из смеси других белков, т.е. очистке и получению индивидуального белка. На этом этапе наибольшая сложность заключается в наработке достаточного для эксперимента количества чистого белка.

Получение кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа, зачастую процесс трудоемкий и далеко не тривиальный, особенно для сложных соединений, таких как белки и нуклеиновые кислоты. Наличие пересыщенного раствора – необходимое условие кристаллизации. Для получения такого раствора используют различные способы. Один из них заключается в постепенном удалении растворителя обычным испарением, что приводит к росту концентрации вещества в растворе, который в какой-то момент становится пересыщенным. Другой способ связан с использованием зависимости растворимости от температуры. Например, если растворимость с увеличением температуры повышается, можно приготовить насыщенный раствор при более высокой температуре, а затем медленно охладить его. Благодаря понижению растворимости в процессе охлаждения получается пересыщенный раствор. Третий способ связан с введением в раствор какого-либо вещества, вызывающего понижение растворимости. В качестве таких веществ используют либо соли, либо органические растворители. Кроме того, растворимость белков и нуклеиновых кислот сильно зависит от pH раствора, это тоже можно использовать для получения пересыщенных растворов.

На практике все намного сложнее. До сих пор не существует универсальных способов подбора оптимальных условий кристаллизации. Для каждого конкретного белка исследователь ищет эти условия, меняя тип буфера, значения pH, температуры, концентрации самого белка, осаждающей соли и т.д. В этой работе важно найти такие условия, при которых получится именно кристалл, а не выпадет соль. Поэтому выращивание биологических кристаллов не только научное направление, но и искусство. Иногда, чтобы заставить белок кристаллизоваться, его центрифугируют или даже отправляют в невесомость.

Выбор кристаллов для рентгеновского эксперимента проводят с помощью микроскопа. Для этой цели особенно полезен поляризационный микроскоп, позволяющий с помощью поляризационного света установить наличие дефектов в кристалле. Оптимальными считаются монокристаллы с размером каждой из сторон 0,2–0,6 мм. Кристаллы должны быть без дефектов и, по возможности, с хорошей огранкой. Наличие дефектов приводит к ошибкам при экспериментальном измерении дифракционной картины и, как следствие, к неточности (а часто и к невозможности) расшифровки кристаллической структуры. При повышении сложности исследуемого объекта требования к качеству кристаллов повышаются. Как выглядят кристаллы белков, показано на рис. 4.

Рис. 4. Кристаллы белков: а – кристаллы зеленого флуоресцентного белка zGFP506; б – кристаллы мутанта белка zGFP506 с аминокислотной заменой N66D

К сожалению, далеко не всегда удается получить кристалл изучаемого белка, поэтому этот этап является главным ограничением метода рентгеноструктурного анализа белков.

В качестве источника рентгеновских лучей в настоящее время стараются использовать синхротронный ускоритель. Это довольно дорогое сооружение. Лабораторные рентгеновские установки тоже используются, но синхротронное излучение имеет существенные преимущества.

Во-первых, это мощность пучка. Здесь два плюса. Первый понятен – сокращается время эксперимента. Второй – биологические кристаллы имеют тенденцию разрушаться под действием рентгеновского излучения. Процесс разрушения занимает определенное время, и если пучок мощный, то можно успеть зарегистрировать нужную картину, пока кристалл не разрушился.

Во-вторых, это возможность получить желаемую длину волны. Рентгеновские трубки дают мощный пучок только фиксированной длины волны (обычно около 1,57), в то время как при проведении эксперимента зачастую необходимо иметь возможность выбора длины волны. Это позволяет сделать синхротрон.

Обработка результатов рентгеновского эксперимента базируется на мощном математическом аппарате, который здесь мы рассматривать не будем. Когда монохроматический рентгеновский луч падает на определенным образом ориентированный кристалл, то рассеяние происходит в дискретных направлениях, определяемых кристаллической решеткой. Дифракционная картина, возникающая на пленке детектора (рис. 3), представляет собой набор пятен, или рефлексов. Измерив интенсивность рефлексов, можно получить значения модулей т.н. структурных факторов (комплексных чисел), описывающих распределение электронной плотности в кристалле (r). Но чтобы однозначно определить (r), нужно знать еще и соответствующие значения фаз этих факторов, информация о которых не содержится в дифракционной картине. Если для какого-либо кристалла фазы определены, то расчет положений атомов этого кристалла не составляет принципиальных трудностей.

Читайте также:  Анализ на аллерген яичного белка

Таким образом, центральная проблема метода рентгеноструктурного анализа, называемая фазовой проблемой, заключается в невозможности получения всех необходимых для расчета данных непосредственно из эксперимента.

Общего решения фазовой проблемы на сегодня не существует. Каждый случай требует специального подхода. Здесь важно понимать, что новая информация не берется ниоткуда. Для того чтобы получить значения фаз, мы должны либо сделать какие-то новые предположения о структуре и особенностях объекта, либо провести новые эксперименты. Ниже приведены основные подходы к решению «фазовой проблемы», применяемые в белковой кристаллографии.

Изоморфное замещение

Можно попытаться внедрить в молекулы кристалла некую метку – один или несколько тяжелых атомов (например, ионы тяжелых металлов), которые могут быть либо добавлены к нативной структуре, либо могут замещать часть ее атомов (рис. 5).

Под изоморфным внедрением тяжелых атомов подразумевается, что они присоединяются к каждому экземпляру молекулы в одном и том же месте, и структура молекулы белка при этом не изменяется. Затем, проведя дополнительно рентгеновский эксперимент с таким модифицированным соединением и определив изменения интенсивностей рефлексов по сравнению с нативным белком, можно получить дополнительную информацию о значениях фаз. Трудность этого метода заключается в том, что не всегда удается получить хорошее изоморфное производное, а также в необходимости проведения дополнительного рентгеновского эксперимента.

Метод изоморфного замещения является основным методом решения фазовой проблемы при определении структуры биологических макромолекул. Сам этот метод возник достаточно давно, но именно при работе с белками он приобрел исключительно важную роль. Причин этому две:

1) долгое время он являлся единственным методом, позволяющим решать фазовую проблему для белков;

2) именно для белков удается «достаточно просто» получать изоморфные производные. Последнее связано с тем, что кристаллы белка довольно рыхлые – в них от 30 до 70% объема занято растворителем, т.е. в кристаллах есть «пустоты», куда могут поместиться дополнительные атомы.

Использование эффекта аномального рассеяния

Этот метод основан на варьировании длины волны падающего на кристалл рентгеновского излучения вблизи значений, при которых наблюдается эффект резонанса (и соответствующее аномальное рассеяние) для нескольких «специальных» атомов, содержащихся в структуре макромолекулы. Если аномально рассеивающих атомов в белке нет, иногда можно попытаться присоединить их химическим путем. Дифракционные картины получают для нескольких значений длины волны падающего луча и на основании анализа разностей интенсивностей соответствующих рефлексов оценивают значения фаз.

Успех метода аномального рассеяния, как и изоморфного замещения, во многом зависит от возможности экспериментального получения производных с требуемыми свойствами.

Упомянутые два способа отвечают попытке решить фазовую проблему за счет дополнительной информации, получаемой из дополнительных экспериментов. Следующий способ применяют в ситуации, когда нам известна структура близкого (гомологичного) белка.

Метод молекулярного замещения

В биологии распространена ситуация, когда существуют ряды объектов, похожих друг на друга, т.е. имеющих структурную гомологию. Такой гомологией могут обладать, например, белки одного типа, выделенные из разных организмов. В этом случае можно надеяться, что фазы структурных факторов, рассчитанные по известной атомной модели гомологичного белка, будут достаточно хорошим начальным приближением к значениям неизвестных фаз, отвечающих исследуемому объекту. Комбинируя их далее с измеренными в эксперименте модулями структурных факторов для исследуемого объекта, мы можем получить хорошее приближение к искомому распределению электронной плотности.

Однако для того чтобы надеяться на успех на этом пути, надо, как минимум, для начала «разместить» известный гомологичный объект на том же месте и в той же ориентации, что и исследуемый белок. Процедуру создания такого «компьютерного гибрида», в котором внутри элементарной ячейки кристалла одного белка размещается молекула другого, называют методом молекулярного замещения. Судить о том, насколько полученное размещение близко к действительности, можно, сравнивая рассчитанные по модели модули структурных факторов с величинами, полученными в эксперименте. Разумеется, такое замещение – всего лишь умозрительная процедура, и никакого химического замещения не происходит.

«Прямые» методы

В отличие от предыдущих подходов, эти методы опираются не на дополнительный эксперимент или информацию о структуре гомологичного объекта, а на почти философскую идею об атомности изучаемого объекта. Под «прямыми» методами в кристаллографии понимаются стратегии определения структур, использующие в качестве стартовой информации только набор интенсивностей рефлексов, полученный в рентгеновском эксперименте. Для определения фаз структурных факторов в них используют вероятностный подход. «Прямые» методы более объективны в том смысле, что они зависят только от применения математических соотношений.

На основе «прямых» методов определяют структуры большинства низкомолекулярных соединений. Эти методы не требуют ни дополнительных экспериментов, ни тонкой биохимической работы по получению изоморфных производных, ни наличия известных гомологичных структур, но к сожалению, пока не применимы к структурам белков из-за принципиальных ограничений на количество атомов исследуемой структуры.

Если известны и модуль, и фаза структурных факторов, то мы можем восстановить распределение (r), рассчитав обратное преобразование Фурье. Это не сложная с современной точки зрения вычислительная задача, и этот шаг выделяется потому, что он подводит итог важного этапа работ. Мы, наконец, получаем возможность «взглянуть» на интересующий нас объект. И по тому, насколько «четким» получилось изображение, – судить об успешности всех предыдущих этапов работы. А в случае неудачи – повторить все сначала.

Следующий этап заключается в построении приближенной атомной модели по рассчитанным картам распределения электронной плотности. Эта работа требует максимального использования интеллекта человека и осуществляется квалифицированными специалистами.

С помощью специальных компьютерных программ, исследователь вручную вписывает атомы белковой структуры в полученную на предыдущем этапе карту электронной плотности (рис. 6).

источник

1895 год оказался исключительно важным сперва для науки, а вскоре и для всего мира – именно тогда впервые открыли рентгеновские лучи, без которых сегодня нашу жизнь представить очень сложно. Слово страшное, все его боятся: это изучение, которое убивает! А после катастроф на АЭС и вовсе кровь в жилах стынет. Впрочем, про трагедии наслышаны все, а вот о пользе, которую это открытие дало людям, знают немногие. И речь идет не только лишь о специальных снимках – едва ли единственном эффективном методе выявления многих патологий. Еще одна область применения лучей – рентгеноструктурный анализ металлов, белков, иных соединений.

Рентгеновские лучи – электромагнитные колебания. Отличительная особенность – маленькая длина, сопоставимая с атомными габаритами. Источник излучения – быстрые электроны, влияющие на атомную структуру. В настоящее время излучение нашло себе применение в научно-техническом секторе.

Особенности лучей выявили в 1912 в ходе испытаний, проводимых немецкими учеными Книппингом, Фридрихом, Лауэ. При обследовании атомной решетки был установлен факт дифракции. Если сформировать узкий лучевой пучок и направить его на кристалл, обеспечив ему неподвижность, можно получить фракционную картинку на фотографической пластинке, размещенной позади кристалла. Отражение, полученное таким образом, представляло собой упорядоченную систему пятен, каждое из которых было следом определённого луча, рассеявшегося под влиянием кристалла. Изображение было решено назвать лауэграммой. Она легла в основу рентгеноструктурного анализа кристаллов, развивающегося и совершенствующегося в современности.

Применённый в биологии рентгеноструктурный анализ позволил проникнуть в тайную суть жизни. Впрочем, стоит отметить, что фундаментом для всего выступила квантовая физика – именно она дает обоснование явлениям, которые мы сейчас познаем с помощью рентгеновских лучей. Известно, что окружающее пространство, тела, предметы сформированы молекулами, атомами, сложенными в разные систематизированные, упорядоченные структуры. Выявление особенностей конкретного вещества может быть проведено только экспериментальным путем. В наши дни применение рентгеноструктурного анализа – эффективный, точный, современный способ определения атомного строения.

Для получения полезной информации необходимо использовать экспериментальные установки, где «работать» заставляют волны, чья длина – десять в минус десятой степени (!) метра. Именно таков масштаб расстояний на атомарном уровне. Для обывателя, далекого от физики, даже представить себе столь крошечные величины не представляется возможным – но ученые не просто смогли их разглядеть, но и проанализировали, заставили работать и производить еще больше информации, необходимой человечеству для познания окружающего мира и законов его построения.

Эксперименты 1912 года позволили сформулировать основные принципы рентгеноструктурного анализа, так как ученые получили эффективный метод выявления положения молекул, атомов внутри кристалла. Со временем также удалось собрать информацию о внутреннем строении молекул. Новые сведения быстро привлекли внимание самых светлых умов того времени, и за работу над еще только развивающимся рентгеноструктурным анализом взялись два британских ученых, отец и сын Брэгги. Именно они создали метод, благодаря которому человечество получило возможность очень точно определять молекулярную, минеральную структуру.

Со временем в фокусе внимания ученых оказывались все более сложные объекты, но рентгеноструктурный анализ показал себя на удивление универсальным. Постепенно очередь дошла до живых молекул. Сложно вообразить, насколько значим в настоящее время метод рентгеноструктурного анализа в биологии. Практически сразу ученые столкнулись со многочисленными сложностями, и в первую очередь – проблемой выделения кристаллов. Одна молекула – это несколько десятков тысяч атомов, что давало на снимке столь запутанное изображение, что восстановление координат не представлялось возможным. Но это только поначалу: годы шли, метод совершенствовался, в настоящее время эта задача уже решена.

Наиболее значимые исследования, связанные с этой тематикой, были организованы в Кавендишской лаборатории. Руководил ими уже упомянутый выше британец Брэгг. В качестве технического задания сформулировали задачу выявления белкового пространственного строения. Такая цель была закономерной: в середине прошлого столетия бытовало мнение, что самая важная для живого мира молекула – это белок. Для объяснения идеи аргументом был факт химических реакций, провоцируемых в клетке – ферментами, стимулирующими их, бывают только белки. Из этого ученые сделали закономерный вывод, что белок представляет собой основной строительный материал живой клетки, и освоение всех особенностей его структуры дало бы ответ на любые вопросы, связанные с фактом жизни. А изучить строение должен был помочь метод рентгеноструктурного анализа.

Итак, в центре внимания оказался сложный полимер – белок, звенья которого – мономеры, остатки аминокислот. Исследования показали, что таковые всегда линейны, а структура постоянна при повышении температур даже до того уровня, когда биологическая активность полностью угнетается. На основании полученных сведений стало ясно, что только остатки аминокислот в правильной последовательности еще не могут обеспечить возможность жизни, нужна также правильная компоновка групп в пространстве.

Примененный в лабораторных условиях рентгеноструктурный анализ помог решить поставленную перед учеными задачу. Успех пришел в середине пятидесятых, а первооткрывателями стали Перуц, Кендрю. Благодаря им в настоящее время мир знает, что белок имеет трехмерную структуру. Не менее важна и прочая информация, полученная разными учеными в ходе исследований и испытаний в попытке достичь поставленной цели. Многие данные, полученные в то время, в будущем помогли избежать ошибок и сделать более простым рентгеноструктурный анализ клетки.

В настоящее время посредством разработанной технологии можно изучить атом любого вещества и определить все специфические особенности элементарной ячейки, включая расположение в пространстве, форму, габариты. Рентгеноструктурный анализ позволяет выявить кристаллическую группу симметрии. В наши дни этот способ определения структуры вещества распространён шире любых других, что обусловлено его относительно низкой стоимостью, простотой реализации.

Это понятие – одно из ключевых для теории рентгеноструктурного анализа. Принято говорить о двух типах: характеристическом, тормозном излучении. Тормозное обусловлено соответствующим движением электронов. Спровоцировать в лабораторных условиях это явление можно, если активировать антикатод установки. Ученый получает доступ к ограниченному широкому спектру. Каким образом будет расположена граница, от вещества не зависит, это полностью обусловлено энергетическими запасами направленных электронов. Тормозной спектр становится интенсивнее, если направленные частицы легче, а возбуждение электронов позволяет добиться очень высоких величин.

Используемое в методе рентгеноструктурного анализа характеристическое излучение сопровождается перемещением электронов. Расположенная на внутреннем атомном слое частица выбивается, с внешнего слоя заряженная частица переходит внутрь, весь процесс сопровождается определённой характеристикой – специфическим спектром, который во многом сходен с присущими газообразным веществам. Принципиальное отличие этих спектров — в зависимости (или ее отсутствии в случае рентгеновского изучения) от элемента, провоцирующего образование явления.

Как показали испытания, проведенные с использованием различных соединений, рентгеноструктурный анализ в некоторой степени определяется его особенностью, отраженной через порядковый номер менделеевской таблицы: чем это значение больше, тем сильнее смещение к коротковолновому спектру. В 1913 было доказано: извлеченный из значения частоты квадратный корень линейно привязан к атомарному номеру. В будущем эта закономерность использовалась для обоснования менделеевской таблицы.

Следует учитывать, что разные элементы обладают разным спектром. При этом не наблюдается зависимости от возбуждаемости для испускания рентгеновского свечения в свободной форме, соединении с другими химическими элементами. На основании данных стало возможным проводить рентгеноструктурный анализ применительно к сложноструктурированных объектам. Выявленные спецификации стали базовыми для определения специфичности аналитического метода, сегодня обширно применяются.

В настоящее время эту методику анализа классифицируют как химический раздел, применимый для анализа вещественного состава. Интенсивность излучения определяется числом атомов, задействованных в процессе. Возбуждение провоцируется электронной бомбардировкой, облучением. В первом случае говорят о прямом возбуждении, при воздействии рентгеновских лучей – флуоресцентном (вторичном). Квант первичной радиации должен иметь энергетические запасы, превышающие расходы на выбивание электрона с занимаемой им позиции. Бомбардировка становится причиной специфического спектра и излучения – непрерывного, с высокой интенсивностью. Если предполагается вторичное возбуждение, тогда результат содержит линейчатый спектр.

Читайте также:  Анализ количества белка в организме

Первичная возбуждаемость сопровождается нагревом субстанции. Флуоресцентное не провоцирует такого эффекта. При первичном методе веществом наполняют трубку, где создается высокий вакуум, а для флуоресцентной методологии необходимо расположить объект на пути рентгеновского излучения. Условие вакуума здесь не играет роли. Это довольно удобно: исследовав один объект, можно убрать образец и поместить следующий, процедура простая и практически не требует времени. В то же время вторичное излучение по интенсивности в тысячи раз слабее в сравнении с первичным методом. Тем не менее метод рентгеноструктурного анализа клетки обычно производится с применением именно вторичного, флуоресцентного излучения, предполагающего наличие быстрых электронов.

Для проведения анализа необходимо иметь в своем распоряжении специальный прибор. Полнопрофильный рентгеноструктурный анализ реализуется при помощи дифрактометра. Существует также флуоресцентный спектрометр. Этот прибор сформирован тремя ключевыми узлами: трубкой, анализатором, детектором. Первая является источником излучения, влияющего на флуоресцентный спектр исследуемого материала. Анализатор необходим, чтобы получить спектр. Детектор передает информацию об интенсивности, следующий шаг – фиксация результатов эксперимента.

На практике довольно часто используется такой спектрометр: излучающий источник, детектор расположены на специализированной окружности, центральное место принадлежит способному вращаться вокруг собственной оси кристаллу. Фактически ось пронизывает центр окружности.

Как можно заключить из доступной для широкого круга лиц информации, в настоящее время методы, программы полнопрофильного рентгеноструктурного анализа труднодоступны, поэтому реальное широкое применение на практике не получили. Отмечается, что гораздо более актуальный вариант – это метод отражения, изобретённый Иоганном, Иогансоном и Капицей. Предполагается применение специализированного спектрометра. Альтернативный вариант – технология, авторами которой выступаю Коуш, Дю-Монд. Этот вариант именуется «на прохождение».

Указанные широко используемые в настоящее время методики бывают с одним либо многочисленными каналами. Многоканальные квантометры, аутрометры – это эффективный метод выявления многочисленных элементов. Сама работа, связанная с анализом, при применении такой технологии автоматизируется до высокого уровня. Преимущественно приборы оснащены трубками, устройствами, благодаря которым становится достижима повышенная стабилизационная степень интенсивности изучения. Спектрометр использует волны из диапазона, определённого анализатором. Для его плоскостей характерно некоторое конкретное расстояние, и невозможно отражение таких лучей, длина которых вдвое или больше, нежели межплоскостное анализатора.

В настоящее время используются самые разные элементы в качестве кристаллов. Наибольшее распространение получили слюда, гипс, кварц. Детекторами выступают гейгеровские счетчики, а также специализированные кристаллические, пропорциональные. В последнее время все активнее используются так называемые квантовые сцинтилляционные счётчики.

Из объектов, которые исследуются разными приборами, довольно часто внимание научных сотрудников привлекают ферриты висмута. Полнопрофильный рентгеноструктурный анализ BiFeO3 уже не раз становился главной темой научных работ в области химии, предполагается, что некоторые аспекты еще только предстоит открыть.

Рентгеноспектральный анализ позволяет определять, как много в некотором соединении содержится целевого элемента, вызывающего интерес исследователя. Допускается исследовать сложные составы, сплавы, металлы. Нередко таким образом анализируют керамические, цементные соединения, пластмассовые. Можно исследовать даже пыль либо абразивные компоненты. Химтехнологии дают доступ к широкому спектру разнообразных продуктов, изучить особенности которых можно, прибегнув к рентгеновскому излучению. Самые актуальные области применения анализа – геология, металлургия, где аппаратура используется с целью выявления микроскопических, макроскопических компонентов.

Не всегда стандартная установка для рентгеноспектрального анализа позволяет получить необходимые сведения относительно исследуемого объекта. Для увеличения показателей чувствительности применимой методики допускается комбинирование нескольких вариантов подходов: радиометрия прекрасно сочетается с химическими способами. Наибольшая чувствительность определяется атомным номером вещества, которое предстоит выявить, а также средним номером образца. Если речь идет о легких элементах, задача считается довольно простой. Точность – 2-5 % (относительных), вес – считанные грамы, длительность – до двух часов, но иногда необходимо всего лишь несколько минут. А вот сложной считается задача, если речь идет о мягком спектре, небольшом Z.

Одно из очень важных направлений использования описываемой методики – анализ белков. Как выше было указано, для получения точной информации об исследуемом объекте его необходимо изучать в виде кристалла, но в нормальном состоянии белковая молекула не имеет такой формы. Для проведения анализа необходимо преобразование.

Почти любое исследование белка в рамках эксперимента предполагает биохимическую методику добычи исходного вещества. Биологический материал измельчают, переводят белок в растворенное состояние и из общей смеси выделяют необходимый объект, который и будут дальше исследовать. Во многом результативность мероприятия зависит от качества выделения белка.

Чтобы можно был прибегнуть к анализу с использованием рентгеновского излучения, необходимо сформировать кристаллы. Если соединение сложное, рабочий процесс затягивается надолго. Как правило, в качестве исходного состава применяют насыщенный раствор, который затем обрабатывают, и жидкость испаряется. Второй вариант предполагает температурное влияние. Получаемые в итоге компоненты можно исследовать в специальной установке.

источник

РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ — метод определения структуры объектов, основанный на физическом явлении рассеяния (дифракции) электромагнитного излучения в изучаемом веществе. С помощью Р. а. получены фундаментальные данные о строении вирусов, различных белков, включая многие ферменты, о молекулярных основах заболеваний крови, в частности серповидно-клеточной анемии и т. д. Р. а. находит все большее применение в медико-биологических исследованиях.

Возможность получения информации о структуре и степень ее детальности (так наз. разрешение) определяется степенью структурной упорядоченности объекта и длиной волны используемого излучения (см. Излучение).

Если рассеивающие центры расположены в плоскостях, разделенных расстоянием d, а длина волны падающего рентгеновского излучения X, то направления преимущественного рассеяния зададутся углами v согласно условию Брэгга — Вульфа:

где n — целое число. Малая длина волны рентгеновских лучей (порядка 0,1 нм) соответствует масштабам периодичностей в кристаллах большинства молекул (единицы или десятки нанометров). Поэтому с помощью Р. а. определяются как характер периодичностей в кристаллах (см.) и волокнах, так и структура самих молекул (см.), расположенных друг относительно друга с этими периодичностями.

Первый этап Р. а. состоит в получении картины дифракции: распределения рассеянных лучей в пространстве и их интенсивности.

Картина дифракции регистрируется либо на фотопленку (рентгенограмма, рентгенография), либо счетчиком ионизирующего излучения (дифрактометрия). В случае волокнистых структур (коллаген, мышца, молекула ДНК) полезная информация заключена также в геометрии рентгенограммы, характеризующей периодичности внутри самой фибриллярной молекулы (рис. 1).

Эксперименты по дифракции рентгеновских лучей на различных биомембранах позволили получить профили их электронной плотности и размеры отдельных элементов мембран (толщину, ширину гидрофобной зоны, асимметрию), в частности мембран миелина, фоторецепторных мембран. Ведутся рентгеноструктурные исследования молекулярных механизмов сокращения мышечного волокна, получены атомные структуры витаминов, многих лекарственных веществ.

Крупным успехом явилось установление с помощью Р. а. структуры молекул нуклеиновых кислот и многих белков. Основной метод расшифровки структуры макромолекул — метод изоморфного замещения (см. Изомерия), суть к-рого заключается в получении идентичных кристаллов одного и того же белка, различающихся введением в одно из положений тяжелой, т. е. сильно рассеивающей группы. По изменению интенсивностей рассеяния за счет тяжелой группы можно восстановить расположение атомов по отношению к этой группе и друг к другу. Для расчетов необходимо применение электронной вычислительной машины (см.).

Установлена атомная структура более 100 белков. На рис. 2 показана рентгенограмма кристалла белка. Видны периодичности малого масштаба (в пределах 0,2 нм), отражающие упаковку молекул белка в надмолекулярные агрегаты. Имея модель атомной структуры белка, можно локализовать активный центр, понять работу фермента, найти пути химического воздействия с целью изменения его функциональной активности. Данные по структуре групп белков, близких по функциям, позволяют выявить разницу в строении и связать ее с функциональными отличиями. Так, исследование группы миоглобин-гемоглобиновых белков позволило понять на молекулярном уровне ряд заболеваний крови, в частности заболевание серповидно-клеточной анемией.

Проводятся исключительно сложные рентгеноструктурные исследования кристаллов вирусов, что позволило выявить закономерности укладки полипептидных цепей в субъединицах оболочки. Полученные результаты могут, по-видимому, помочь найти пути медикаментозного воздействия на сами вирусы, а значит, и способствовать излечиванию многих вирусных заболеваний.

Библиография: Бландел Т. и Джонсон Л. Кристаллография белка, пер. с англ., М., 1979; Вайнштейн Б. К. Дифракция рентгеновых лучей на цепных молекулах, М., 1963; И о с т X. Физиология клетки, пер. с англ., с. 19 и др., М., 1975; М а р ш е л л Э. Биофизическая химия, пер. с англ., т. 2, с. 749, М., 1981; Современная кристаллография, под ред. Б. К. Вайнштейна и др., т. 1—4, М., 1981.

источник

Третичная структура белков. Представление об изучении пространственного строения пептидов и белков методами рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса.

Полипептидная цепь, содержащая определенное число участков вторичной структуры, обычно укладывается в пространстве в относительно компактную систему, в которой элементы вторичной структуры взаимодействуют между собой и с участками неупорядоченной структуры, образуя глобулу (глобулярные белки) или достаточно вытянутое волокно (фибриллярные белки). В этих случаях принято говорить о формировании третичной структуры. Для многих белков третичная структура эквивалентна полной пространственной структуре. Каждый белок обладает своей уникальной пространственной структурой.

Главным методом, с помощью которого в настоящее время определяется третичная структура белка, является рентгеноструктурный анализ кристаллических образцов. Рентгеноструктурный анализ сегодня является самым точным и мощным методом расшифровки пространственного строения белков (нередко разрешение достигает 0,15 — 0,2 нм). Этим методом к настоящему времени расшифровано строение более 200 белков.

Метод основан на дифракции рентгеновских лучей на периодической решетке, создаваемой упорядоченно расположенными атомами кристалла. В большинстве случаев самым трудным является получение кристалла биополимера требуемого размера и качества. Необходимым условием является использование излучения с длиной волны, соизмеримой с межатомными расстояниями в кристалле. Поэтому основное применение для решения такого рода задач нашли рентгеновские дифрактометры. В аппаратах этого типа пучок рентгеновского излучения рассеивается на атомах кристаллической решетки, создавая интерференционную картину. В некоторых направлениях происходит гашение волнового сигнала, в некоторых — усиление, создающее интенсивное рентгеновское пятно. Рассеянное излучение может быть зарегистрировано либо с помощью фотопленки, чувствительной к рентгеновскому излучению, либо с помощью счетчиков рентгеновского излучения. Изменяя направление падающего излучения, можно получить информацию обо всех возможных вариантах интерференционной картины. Обычно направление излучения варьируют, вращая кристалл. Измеряемыми параметрами являются координаты реплик и интенсивность рассеянного излучения. Соответствующий математический аппарат и программное компьютерное обеспечение позволяют перейти от дифракционных реплик к координатам атомов. Все полученные к настоящему времени структуры хранятся в международной базе данных белковых структур Protein Data Bank (PDB), к которой имеется свободный доступ. Рассеяние рентгеновского излучения происходит за счет его взаимодействия с нековалентными внутренними электронами атомов вещества. Поэтому часто в исследуемый объект вводят атомы тяжелых элементов, проводя так называемое изоморфное замещение. Если тяжелый атом обладает значительной электронной плотностью, изменение дифракционной картины будет существенным. По этой причине рентгеноструктурный анализ не дает информацию о положении протонов или атомов водорода. Достижение высокой (0,2 нм) и низкой (0,5 нм) плотности разрешения зависит от многих факторов, таких как качество кристалла и степень упорядоченности молекул в кристаллической упаковке. Большую роль играет точность измерения интенсивности излучения. В белках существуют области с высокой подвижностью, такой, что даже при полной кристаллизации не происходит «замораживания» структуры. Эти области в рентгеноструктурном анализе проявляются как участки с пониженным разрешением. Для характеристики разрешения вводится так называемый В-фактор, который позволяет идентифицировать области высокой подвижности. Ограничение рентгеноструктурного анализа связано с тем, что структурная информация может быть получена только для кристаллического вещества. В кристалле белка молекулы плотно упакованы; состояние кристалла характеризуется большими концентрациями компонентов. Это может повлиять на качество результатов рентгеноструктурного анализа биополимерных молекул. В течение долгого времени шла дискуссия о том, можно ли на основе рентгеноструктурных данных делать вывод о строении молекул белка в растворе. Пришли к мнению, что искажения, которые вносит кристаллизация, относительно невелики, и можно считать, что рентгеноструктурный анализ дает адекватную атомарную структуру белка.

ЯМР-спектроскопия — спектроскопический метод исследования химических объектов, использующий явление ядерного магнитного резонанса. Образец вещества для ЯМР помещается в тонкостенную стеклянную трубку (ампулу). Когда ее помещают в магнитное поле, ЯМР активные ядра (такие как 1 H или 13 C) поглощают электромагнитную энергию. Резонансная частота, энергия абсорбции и интенсивность испущенного сигнала пропорциональны силе магнитного поля. Большинство последних инноваций в ЯМР спектроскопии сделаны в так называемой ЯМР спектроскопии белков, которая становится очень важной техникой в современной биологии и медицине. Общей задачей является получение 3-мерной структуры белка в высоком разрешении, подобно изображениям получаемым в рентгеновской кристаллографии. Из-за присутствия большего числа атомов в белковой молекулы в сравнении с простым органическим соединением, базовый 1 H спектр переполнен перекрывающимися сигналами, поэтому прямой анализ спектра становится невозможным. Поэтому были разработаны многомерные техники, чтобы решить эту проблему. Чтобы улучшить результаты этих экспериментов применяют метод меченых атомов, используя 13 С или 15 N. Таким образом становится возможным получить 3D-спектр белкового образца.

Читайте также:  Анализ на белки теплового шока

Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) при использовании современных подходов позволяет полностью расшифровать пространственное строение пептида или небольшого белка с молекулярной массой до 10 000 — 15 000. Конечно, необходимыми условиями являются наличие хорошей приборной базы (прибор с рабочей частотой для протонов 300 — 500 МГц), правильная стратегия исследования применительно к конкретному объекту и достаточное количество вещества (

1 мкмоль пептида или белка).

Важнейшим этапом является отнесение сигналов в спектре ‘Н-ЯМР. Сначала анализируются двумерные спектры, например COSY (корреляционная спектроскопия химических сдвигов, COSY), которые содержат всю информацию о спин-спиновых взаимодействиях (передаваемых через химические связи) между протонами молекулы. Эффективность такого взаимодействия протонов, характеризуемая константой спин- спинового взаимодействия, быстро падает с увеличением числа разделяющих их ковалентных связей и обычно становится ненаблюдаемой уже для четырех связей. Поэтому сигналы протонов аминокислотных остатков можно классифицировать по типам спиновых систем в зависимости от числа атомов водорода при углеродных

атомах Сα, Сβ, Сγи т. д. Затем анализируются двумерные спектры ядерного эффекта

Оверхаузера (сокращенно NOESY), которые содержат всю информацию о диполь- дипольных взаимодействиях между пространственно сближенными протонами молекулы. Величина ядерного эффекта Оверхаузера обратно пропорциональна шестой степени расстояния между ядрами и для пептидов и для небольших белков становится

пренебрежимо малой при расстояниях ^ 0,4 — 0,5 нм. Основываясь на известной аминокислотной последовательности белка или пептида, спиновые системы протонов (отнесенные к определенным типам аминокислотных остатков) «соединяют» между собой, выявляя диполь- дипольные взаимодействия между протоном NH (i + 1)- го остатка и протонами NH, СαН и СβН предыдущего i- ro остатка. Следуя таким образом вдоль полипептидной цепи, получают полное отнесение сигналов в спектре ‘Н- ЯМР

к определенным остаткам аминокислотной последовательности. Одновременно с отнесением сигналов в двумерных спектрах ‘Н- ЯМР получают практически всю необходимую информацию для реконструкции пространственной структуры белка в растворе. Анализ ядерного эффекта Оверхаузера между протонами удаленных по аминокислотной последовательности остатков дает возможность выявить элементы вторичной структуры белка (α-спирали, β-структуры, β-изгибы). Существенное значение имеет обнаружение внутримолекулярных водородных связей, характерных для вторичной структуры белков и пептидов. Для этого изучают скорость обмена атомов водорода группы NH с растворителем (например, дейтерообмен) и таким образом получают

данные об их доступности внешней среде. На заключительном этапе вся совокупность полученных данных (константы спин- спинового взаимодействия, ядерный эффект Оверхаузера, доступность протонов NH внешней среде) анализируется с помощью специальных программ на ЭВМ, учитывающих длины валентных связей, валентные углы, ван- дер- ваальсовы радиусы атомов и т. д. Как правило, при этом удается достаточно точно выяснить конформацию основной полипептидной цепи и наиболее вероятную ориентацию боковых радикалов. Особую ценность представляет информация, получаемая с помощью спектроскопии ЯМР, о динамических характеристиках пространственной структуры молекулы, ее изменениях в результате изменения среды (рН, температура, ионная сила) или взаимодействия с другими молекулами.

Четвертичная структура белков. Примеры гомомерных и гетеромерных белков. Методы исследования четвертичной структуры

Многие белки состоят из субъединиц, одинаковых или различных, образующих трехмерные ассоциаты или более сложные ансамбли. В этом случае принято говорить о четвертичной структуре белков. Специфичность четвертичной структуры данного белка

обусловливается выполняемой им биологической функцией, а взаимодействие субъединиц обеспечивает дополнительный механизм ее регуляции.

Примеры гомомерных белков: глутаминсинтетаза (12 субъединиц образуют два гексагональных кольца), белок оболочки вируса табачной мозаики (2130 субъединиц)б микрофиламенты (актин).

Примеры гетеромерных белков: гемоглобин (α2β2), аспартат-транскарбамоилаза (12 субъединиц — 6 каталитических (С- субъединицы) и 6 регуляторных (R- субъединицы), С- субъединицы объединены в тримеры, расположенные один над другим, а R-субъединицы находятся на периферии молекулы, взаимодействуют друг с другом и с С- субъединицами), ДНК-зависимая РНК-полимераза (2 α, 1 β, 1 β’, 1 δ субъединицы), нуклеосомы (гистоны H2A, H2B, H3, H4), микротрубочки (α и β субъединицы тубулина).

Первый этап исследования четвертичной структуры белка — анализ его субъединичного состава. Для этого необходимо провести диссоциацию белка на отдельные субъединицы, что обычно достигается с помощью гидрохлорида гуанидина, мочевины или додецилсульфата натрия (с добавлением меркаптоэтанола для восстановления дисульфидных связей). Во многих случаях диссоциации способствуют изменение рН среды, добавление соли, замена воды на органические растворители, а также химическая модификация белка. Субстраты, различные метаболиты и кофакторы в разных белках влияют как на ассоциацию, так и диссоциацию субъединиц. Субъединичный состав белка может быть выяснен путем сопоставления его суммарной молекулярной массы с молекулярными массами отдельных субъединиц (установленными с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), а также с числом N- и С- концевых аминокислотных остатков. Другой метод анализа заключается в сравнении числа пептидов (N), ожидаемых на основании данных аминокислотного состава, с числом реально образующихся при том или ином специфическом гидролизе молекулы белка.

Процесс формирования четвертичной структуры белков проходит в соответствии со строгими законами термодинамики. Силы, способствующие ассоциации белка, должны быть скомпенсированы таким образом, чтобы активные группировки, расположенные в

областях, имеющих тенденции к ассоциации, не оставались экспонированными наружу. В белках, построенных из одинаковых субъединиц, последние практически всегда находятся в эквивалентном (или идентичном) окружении. Взаимодействие между комплементарными участками субъединиц в четвертичной структуре осуществляется с помощью ван-дер-ваальсовых сил, ионных и водородных связей. Формирование четвертичной структуры из трех и более субъединиц протекает с промежуточным образованием агрегатов меньшего размера. Агрегация первых мономеров часто облегчает присоединение последующих — в этом смысле образование четвертичной структуры является кооперативным процессом.

Имеется ряд физико- химических методов исследования геометрии субъединиц в белках, обладающих четвертичной структурой. Наиболее информативный среди них — метод рентгеноструктурного анализа. Классическими являются рентгеноструктурные исследо-

вания гемоглобина, проводившиеся в Кембридже М. Перутцем и сотр. в течение 25 лет, начиная с 1937 г. Была установлена субъединичная структура гемоглобина — α2β2. С каждой субъединицей связано по одной гем-группе, атом железа которой может обратимо связывать молекулу О 2 . Контакты образуются преимущественно между α- и β- и в меньшей степени между α—α- и β—β- цепями белка. Большинство контактов возникает за счет взаимодействия гидрофобных боковых цепей аминокислотных остатков, часть из них обусловлена водородными и электростатическими связями.

Электронная микроскопия — информативный метод анализа четвертичной структуры белков, особенно крупных молекул со многими субъединицами. Главные ограничения метода — сравнительная «прозрачность» белков по отношению к пучку электронов и

их недостаточная стабильность в условиях эксперимента. Обычно удается проводить структурный анализ с разрешением до 2 нм, а при соблюдении определенных предосторожностей — до 1 нм.

Совместное использование электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа дало возможность установить четвертичную структуру еще более сложно устроенного фермента — аспартат-транскарбамоилазы E.coli, катализирующего основную реакцию в

биосинтезе пиримидиновых нуклеотидов — образование N- карба-

моиласпарагиновой кислоты из аспарагиновой и карбамоилфосфор-

Для исследования четвертичной структуры белков широко используется химическая модификация, в частности, бифункциональными реагентами. С помощью такого подхода была изучена пространственная структура ДНК- зависимой РНК- полимеразы E.coli.

Проводилась модификация бифункциональными реагентами как самого фермента, так и его комплекса с фрагментами ДНК- матрицы, содержащими промоторные участки. В последнем случае использовались фрагменты ДНК, несущие фоточувствительные группировки (частично депуринизованные или содержащие остатки 5- бромурацила).

Возникает вопрос: почему многие белки состоят из субъединиц? Какие преимущества это дает по сравнению с одной длинной пептидной цепью? Во-первых, наличие субъединичной структуры позволяет «экономить» генетический материал. Для олигомерных белков, состоящих из идентичных субъединиц, резко уменьшается размер структурного гена и соответственно длина матричной РНК. Во- вторых, при сравнительно небольшой величине цепей уменьшается влияние случайных ошибок, которые могут возникнуть в процессе биосинтеза белковых молекул. В- третьих, наличие субъединичной структуры у многих белков позволяет клетке легко регулировать их активность, например, путем смещения равновесия ассоциация — диссоциация в ту или иную сторону. Наконец, субъединичная структура облегчает и ускоряет процесс молекулярной эволюции. Мутации, приводящие лишь к небольшим конформационным изменениям на уровне третичной структуры за счет многократного усиления этих изменений при переходе к четвертичной структуре, могут способствовать появлению у белка новых свойств.

Характерной особенностью белков с четвертичной структурой является их способность к самосборке. Легко происходит, например, самосборка гемоглобина из смеси α- и β- цепей. Таким образом, в аминокислотной последовательности полипептидных цепей олиго-

мерного белка закодированы как бы два уровня информации: один из них определяет трехмерную структуру отдельных полипептидных цепей, а второй, поскольку каждая субъединица содержит специфические участки связывания с другими субъединицами, определяет четвертичную структуру всей многокомпонентной молекулы в целом.

Последнее изменение этой страницы: 2016-08-16; Нарушение авторского права страницы

источник

Деградация по Эдмону

К раствору белка добавляют реактив Эдмона, содержащий фенилизотиоцианат.

Фенилизотиоцианат взаимодействует с альфа-аминогруппой первой (N-концевой) аминокислоты, а затем происходит ее отщепление от полипептидной цепи путем гидролиза:

После этого идентифицируют первую аминокислоту. Затем процесс повторяется.

В настоящее время процесс автоматизирован.

Секвенирование ДНК

Первичная структура любой белковой молекулы напрямую зависит от структуры ДНК-генома. Поэтому сначала выделяют ген, в котором закодирована структура белка. Далее определяют последовательность азотистых оснований в ДНК. Каждая аминокислота в белковой молекуле закодирована сочетанием трех азотистых оснований — триплетом (кодоном) в молекуле ДНК. Например, сочетание трех оснований аденина (ААА) кодирует аминокислоту фенилаланин, а последовательность из трех оснований цитозина – глицин. Это дает возможность получить информацию о первичной структуре белковой молекуле, а, значит, прогнозировать строение всей молекулы в целом, поскольку именно первичная структура определяет строение всех высших уровней организации – и вторичной, и третичной, а, иногда и четвертичной структур.

Для проверки предположений о строении высших структур используется еще один метод:

Рентгеноструктурный анализ

Схема, поясняющая принцип этого метода, представлена на рисунке:

В результате облучения на фотопленке фиксируется карта электронной плотности (похожа на географическую карту). Далее производится компьютерный анализ полученного изображения, в результате чего строится пространственная модель белковой молекулы.

Электронная микроскопия

Может быть использована для выяснения структуры белковых молекул с большой молекулярной массой – от 500.000 до 1.000.000 Да (дальтон). Дальтон (Да) и килодальтон (кДа)– единицы измерения массы белков. 1кДа=10 3 Да. 1 дальтон равен 1/16 массы атома кислорода (кислородная единица массы).

КОНФИГУРАЦИЯ И КОНФОРМАЦИЯ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ

Из всего сказанного можно заключить, что пространственная организация белков очень сложна. В химии существует понятие — пространственная КОНФИГУРАЦИЯ — жестко закрепленное ковалентными связями пространственное взаимное расположение частей молекулы (например: принадлежность к L-ряду стереоизомеров или к D-ряду).

Для белков также используется понятие КОНФОРМАЦИЯ белковой молекулы — определенное, но не застывшее, не неизменное взаимное расположение частей молекулы. Так как конформация белковой молекулы формируется при участии слабых типов связей, то она является подвижной (способной к изменениям), и белок может изменять свою структуру. В зависимости от условий внешней среды молекула может существовать в разных конформационных состояниях, которые легко переходят друг в друга. Энергетически выгодными для реальных условий являются только одно или несколько конформационных состояний, между которыми существует равновесие. Переходы из одного конформационного состояния в другое обеспечивают функционирование белковой молекулы. Это обратимые конформационные изменения (встречаются в организме, например, при проведении нервного импульса, при переносе кислорода гемоглобином). При изменении конформации часть слабых связей разрушается, и образуются новые связи слабого типа.

Взаимодействие белка с каким-нибудь веществом иногда приводит к связыванию молекулы этого вещества молекулой белка. Этот явление известно как «сорбция» (связывание). Обратный же процесс — освобождение другой молекулы от белковой называется «десорбция».

Если для какой-нибудь пары молекул процесс сорбции преобладает над десорбцией, то это уже специфическая сорбция, а вещество, которое сорбируется, называется «лиганд».

1) Лиганд белка-фермента – субстрат.

2) Лиганд траспортного белка – транспортируемое вещество.

3) Лиганд антитела (иммуноглобулина) – антиген.

4) Лиганд рецептора гормона или нейромедиатора – гормон или нейромедиатор.

Белок может изменять свою конформацию не только при взаимодействии с лигандом, но и в результате любого химического взаимодействия. Примером такого взаимодействия может служить присоединение остатка фосфорной кислоты.

В природных условиях белки имеют несколько термодинамически выгодных конформационных состояний. Это нативные состояния (природные). Natura (лат.) – природа.

НАТИВНОСТЬ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ

НАТИВНОСТЬ — это уникальный комплекс физических, физико-химических, химических и биологических свойств белковой молекулы, который принадлежит ей, когда молекула белка находится в естественном, природном (нативном) состоянии.

Например: белок хрусталика глаза — кристаллин — обладает высокой прозрачностью только в нативном состоянии).

ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКА

Для обозначения процесса, при котором нативные свойства белка теряются, используют термин ДЕНАТУРАЦИЯ.

ДЕНАТУРАЦИЯ — это лишение белка его природных, нативных свойств, сопровождающееся разрушением четвертичной (если она была), третичной, а иногда и вторичной структуры белковой молекулы, которое возникает при разрушении дисульфидных и слабых типов связей, участвующих в образовании этих структур. Первичная структура при этом сохраняется, потому что она сформирована прочными ковалентными связями. Разрушение первичной структуры может произойти только в результате гидролиза белковой молекулы длительным кипячением в растворе кислоты или щелочи.

Дата добавления: 2018-11-24 ; просмотров: 570 ; ЗАКАЗАТЬ РАБОТУ

источник