Меню Рубрики

Рефрактометрический метод анализа белка в молоке

Молоко — один из самых ценных продуктов питания человека. Роль молока как полноценного пищевого продукта в поддержании процессов жизнедеятельности организма хорошо известна. Особую ценность представляют белки молока — наиболее важные в биологическом отношении органические вещества. Образующиеся в результате расщепления белков аминокислоты идут на построение клеток организма, ферментов, защитных тел, гормонов и прочее. Некоторые аминокислоты легко образуются в организме из других кислот, но есть и такие, которые должны поступать с пищей. Эти аминокислоты (лизин, триптофан, метионин, фенилаланин, лейцин, изолейцин, треонин, валин) называют незаменимыми. Количество многих незаменимых аминокислот в сывороточных белках молока значительно выше не только по сравнению с белками растительных продуктов, но и с некоторыми белками мяса и рыбы.

Кроме того, казеин и сывороточные белки молока обладают рядом важных функциональных свойств (водосвязывающая, эмульгирующая, пенообразующая способность), позволяющих использовать их концентраты в качестве стабилизаторов, эмульгаторов разнообразных продуктов (мороженое, кремы, пудинги и прочее).

Обычно в молоке контролируют массовую долю белков (общий белок), включающих казеин и сывороточные белки. Реже в молоке определяют только содержание казеина.

Для контроля массовой доли белка в молоке имеется несколько методов. Арбитражным считается сложный химический метод Кьельдаля ГОСТ23327-98 «Молоко. Методы определения общего белка».

Метод Кьельдаля

Метод основан на сжигании органических компонентов пробы молока в колбе Кьельдаля в присутствии серной кислоты; освобождающийся при этом азот определяют титрованием и по его количеству вычисляют содержание белка.

Для проведения измерения в колбу Кьельдаля последовательно помещают несколько стеклянных бусинок или кусочков фарфора, около 10 г сульфата калия, 0,04 г сульфата меди. В бюксу с крышкой отмеривают 5 см³ молока, крышку закрывают и взвешивают. Молоко из бюксы переливают в колбу. Пустую бюксу вновь взвешивают и по разнице между массой бюксы с молоком и массой пустой бюксы вычисляют массу взятого молока. В колбу добавляют 20 см³ серной кислоты, осторожно вливая ее по стенкам колбы, смывая с них капли молока. Колбу закрывают грушеобразной стеклянной пробкой и осторожно круговыми движениями перемешивают содержимое колбы.

Колбу ставят на нагревательный прибор в наклонном положении под углом 45º и осторожно нагревают до тех пор, пока не прекратится пенообразование и содержимое колбы не станет жидким. Затем сжигание продолжают при более интенсивном нагревании. Степень нагревания считают достаточной, когда кипящая кислота конденсируется в середине горловины колбы Кьельдаля.

Время от времени содержимое колбы перемешивают, смывая обуглившиеся частицы со стенок колбы. Нагревание продолжают до тех пор, пока жидкость не станет совершенно прозрачной и практически бесцветной (при применении в качестве катализатора окиси ртути) или слегка голубоватой (при применении в качестве катализатора сульфата меди). После осветления раствора нагревание продолжают в течение 1,5 час., после чего колбе дают остыть до комнатной температуры. Добавляют 150 см³ дистиллированной воды и несколько кусочков свежепрокаленной пемзы, перемешивают и снова охлаждают.

В коническую колбу отмеривают 50 см³ раствора борной кислоты , добавляют 4 капли индикатора и перемешивают.

Коническую колбу соединяют с холодильником с помощью аллонжа и резиновой трубки так, чтобы конец аллонжа был погружен в раствор борной кислоты в конической колбе. Колбу Кьельдаля соединяют с холодильником при помощи каплеуловителя, проходящего через одну пробку с делительной воронкой. Градуированным цилиндром отмеряют 80 см³ раствора гидроксида натрия (реактив 3) (при применении в качестве катализатора красного оксида ртути используют раствор гидроксида натрия, содержащий сульфид натрия) и через делительную (капельную) воронку вносят его в колбу Кьельдаля. Сразу же после выливания раствора кран делительной воронки закрывают для избежания потери образующегося аммиака.

Содержимое колбы Кьельдаля осторожно смешивают круговыми движениями и нагревают до кипения. При этом необходимо избегать пенообразования.

Перегонку продолжают до тех пор, пока жидкость не начнет булькать. При этом регулируют степень нагрева так, чтобы время дистилляции было не менее 20 минут. Убедиться в полноте перегонки аммиака можно путем дополнительной перегонки в новую порцию борной кислоты (20 см³) в течение 5 минут. Окраска раствора борной кислоты должна оставаться без изменений. При перегонке не допускают нагревания раствора борной кислоты в конической колбе. Слишком сильное охлаждение

(ниже 10ºС) также нежелательно, так как оно может вызвать переброс жидкости из конической колбы в колбу Кьельдаля.

Перед окончанием перегонки коническую колбу опускают так, чтобы конец аллонжа был над поверхностью раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2 минут.

После прекращения нагревания отсоединяют аллонж. Внешнюю и внутреннюю поверхности аллонжа ополаскивают небольшим количеством дистиллированной воды, сливая ее в коническую колбу.

Дистиллят титруют раствором соляной кислоты до перехода зеленого цвета в серый. При избытке титранта раствор приобретает фиолетовый цвет.

Параллельно так же, как и основной проводят контрольный опыт, применяя 5 см³ дистиллированной воды место молока. Количество повторностей контрольного опыта должно быть не менее 5.

По объему аммиака, определяемого титрованием кислотой, устанавливают количество общего азота при умножении последнего на принятый коэффициент 6,38 и таким образом находят содержание общего белка в молоке.

Три следующих метода описаны в ГОСТе 25179-90 «Молоко. Методы определения белка».

Рефрактометрический метод

Метод основан на установлении разности показателей преломления луча света после прохождения его через молоко и полученной из него безбелковой сыворотки (для осаждения белков используют раствор хлорида кальция и нагревание пробы).

Массовую долю белков в молоке данным методом определяют на рефрактометре ИРФ-464.

Для измерения в 3 флакона наливают по 5 см³ молока, добавляют по 6 капель раствора хлорида кальция. Флаконы закрывают пробками и перемешивают путем переворачивания флаконов.

Далее флаконы помещают в водяную баню, наливая воду таким образом, чтобы ее максимальный уровень достигал половины высоты флаконов. Баню закрывают, помещают на электроплитку, воду в бане доводят до кипения и кипятят не менее 10 минут. Не открывая бани, горячую воду сливают через отверстие в крышке, наливают в баню холодную воду и выдерживают в ней не менее 2 минут.

Открывают баню, извлекают флаконы и разрушают белковый сгусток путем энергичного встряхивания флаконов.

Флаконы помещают в центрифугу и центрифугируют не менее 10 минут. Образовавшуюся прозрачную сыворотку отбирают пипеткой и наносят на измерительную призму рефрактометра 1-2 капли. Измерительную призму закрывают осветительной.

Наблюдая в окуляр рефрактометра, специальным корректором убирают окрашенность границы света и тени. Для улучшения резкости границы измерение проводят через одну минуту после нанесения сыворотки на призму, так как за это время из пробы удаляется воздух и поверхность осветительной призмы лучше смачивается.

По шкале «Белок» проводят не менее трех наблюдений. Затем сыворотку с призмы рефрактометра удаляют, промывают ее водой и вытирают фильтровальной бумагой.

На измерительную призму помещают две капли исследуемого молока и по шкале «Белок» проводят не менее пяти наблюдений, так как резкость границы света и тени у молока хуже, чем у сыворотки.

Массовую долю белка в молоке Х1 (%) вычисляют по формуле:

где Х2 — среднее арифметическое значение результатов наблюдения по шкале «Белок» для молока (%);

Х3 — среднее арифметическое значение результатов наблюдения по шкале «Белок» для сыворотки (%).

Колориметрический метод

Колориметрический метод основан на способности белков молока при рН ниже изоэлектрической точки связывать кислый краситель, образуя с ним нерастворимый осадок, после удаления которого измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора, которая уменьшается пропорционально массовой доле белка.

Методика определения массовой доли белков в молоке сводится к следующему. В пробирку отмеряют 1 см³ молока, приливают 20 см³ рабочего раствора сине-черного красителя (готовится путем смешивания водного раствора красителя и кислого буферного раствора с добавлением поверхностно-активного вещества) и смесь интенсивно перемешивают. Выпавший осадок центрифугируют или отфильтровывают. Полученный фильтрат разводят в 100 раз и колориметрируют на фотоколориметре КФК-3 при длине волны 500-600 нм в кювете с рабочей длиной 10 мм.

Массовую долю белков в молоке устанавливают в процентах, пользуясь градуировочным графиком. Для построения графика в нескольких пробах молока (с массовой долей белков 2,5-3,5%) определяют содержание белков методом Кьельдаля и оптическую плотность фильтрата, полученного указанным способом.

Метод формольного титрования

Метод применяют при условии согласия с поставщиком.

Метод формольного титрования основан на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбоновых кислот белков раствором гидроксида натрия, количество которого, затраченное на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке. Для проведения подготавливают, согласно инструкции, рН-метр-термометр «Нитрон». Бюретку, вместимостью не менее 5 см 3 с ценой деления не более 0,05 см 3 заполняют раствором гидроксида натрия с молярной концентрацией 0,1 моль/дм 3 . Для определения поправки к результатам измерения массовой доли белка методом формольного титрования проводят одновременное измерение массовой доли белка в одном и том же образце молока методом формольного титрования и по ГОСТ 23327.

В стакан помещают 20 см 3 молока и стержень магнитной мешалки. Стакан устанавливают на магнитную мешалку, включают двигатель мешалки и погружают электроды потенциометрического анализатора в молоко. Титруют раствор гидроксида натрия в стакан с молоком до точки эквивалентности равной 9 единицам рН, подавая раствор по каплям начиная с рН 4 и делают 30-секундную выдержку после достижения точки эквивалентности. Определяют количество раствора щелочи, затраченной на нейтрализацию молока, до внесения формальдегида, и вносят в стакан 5 см 3 формальдегида.

По истечении 2-2,5 минут вновь титруют раствор гидроксида натрия в стакан с молоком до точки эквивалентности равной 9 единицам рН, подавая раствор по каплям начиная с рН равное 4 и деляют 30-секундную выдержку после достижения точки эквивалентности.

Параллельно проводят контрольный опыт по нейтрализации смеси 20 см 3 воды и 5 см 3 раствора формальдегида.

Массовую долю белка Х7 (%) вычисляют по формуле:

где V2 — общее количество раствора, израсходованное на нейтрализацию, см 3 ;

V1 — количество раствора, израсходованное на нейтрализацию до внесения формальдегида (см 3 );

V — количество раствора, израсходованное на контрольный опыт (см 3 );

0,96 — эмпирический коэффициент (%/ см 3 );

Х4 — поправка к результату измерения массовой доли белка (%).

ГДЕ Х5 — среднее арифметическое значение массовой доли белка, полученное по ГОСТ23327 (%);

Х4 — среднее арифметическое значение массовой доли белка, полученное формольным титрованием (%).

Все вышеперечисленные методики определения белка имеют существенные недостатки: длительность определения, использование дорогостоящих реактивов, повышенная опасность для обслуживающего персонала.

Разработанный в последние годы электронный ультразвуковой анализатор молока «Клевер-2» лишен этих недостатков. Без применения химических реактивов прибор измеряет одновременно содержание массовой доли жира, сухого обезжиренного молочного остатка (СОМО), плотность, белок, количество добавленной воды и температуру пробы.

Принцип действия прибора основан на измерении скорости распространения ультразвуковых колебаний в зависимости от температуры и состава молока.

Анализатор молока «Клевер-2» работает следующим образом. В режиме измерения дегазированную пробу молока заливают в пробозаборник прибора, где ее последовательно нагревают до двух заданных температур, при каждой из которой определяют скорость ультразвука. На основе полученных данных микропроцессор автоматических вычисляет массовые доли белка, жира, плотности, СОМО, количество добавленной воды и температуру пробы молока. Полученные значения отображаются на цифровом индикаторе прибора. Процесс измерения полностью автоматизирован.

Прибор прост в обслуживании и портативен. Температура пробы молока может быть от 10º до 30ºС. Время измерения три минуты.

Использование анализатора молока «Клевер-2» позволяет значительно сократить трудовые ресурсы на проведение анализа, исключить приготовление реактивов, характерных для традиционных методов, сократить площади лабораторий.

Анализаторы на основе ультразвукового метода компактны, просты в эксплуатации, имеют умеренную цену и перспективны как на мини-заводах, заводах средней мощности, так и на животноводческих фермах и в фермерских хозяйствах.

источник

78-87%) от всех белков. Основными компонентами казеина являются α s1- , β-, χ-, γ-казеин. Казеины α и β-наиболее чувствительные к ионам Ca, γ-казеин ионами Ca не осаждается, однако γ-казеин содержит чувствительную к сычужному ферменту пептидную связь, образованную остатками фенилаланина и метионина. Казеин, как и любой другой белок, распадается при термической обработке, однако он гораздо более термоустойчив. Для его разрушения необходимо температурное воздействие в 130 градусов Цельсия. Также, казеин образован из большого числа различных аминокислот, объединенных друг с другом в полипептидной цепи, но содержит также множество фосфатных групп, которые и связывают кальций (казеинат кальция, соль кальция)

В молоке казеин находится не в свободном виде, а в виде казеинаткальцийфосфатного комплекса – ККФК. Казеинаткальцийфосфатный комплекс образует мицеллы сферической формы, состоящие из субмицелл. Нативные мицеллы казеина имеют на поверхности общий отрицательный заряд и прочную гидратную оболочку, что в заметной степени обусловливает их устойчивость в молоке. Такой вид казеина иногда именуется как казеиноген.

При прокисании молоко сворачивается, и казеин осаждается в форме творожного сгустка. Свёртывание казеина в молоке протекает под влиянием протеолитических ферментов сычужного сока, кислот, вырабатываемых молочнокислыми бактериями, либо при прямой добавке кислот (технический казеин).

Казеин получают разными способами. Важный фактор, определяющий промышленное получение казеина, является его растворимость в различных растворах. Казеин растворим в разбавленных растворах щелочей и в сильных кислотах, однако нерастворим в разбавленных кислотах, где он выпадает в осадок. Для производства казеина применяется свежее обезжиренное молоко. Удаление жира в молоке происходит с помощью центрифугирования, после чего в него добавляют слабощелочной раствор. Для отделения малейших следов жира снова центрифугируют и приливают разбавленный раствор кислоты, чтобы добиться максимально полного выпадения казеина в осадок. Образовавшийся творожный сгусток промывают для удаления кислоты и высушивают при низкой температуре, поскольку казеин чувствителен к нагреванию.

Существуют четыре основных метода определения массовой доли белка в молоке и молочных продуктах:

– Метод формольного титрования

ГОСТ 25179-2014 устанавливает методы определения массовой доли белка в колориметрическом методе и в методе формольного титрования. ГОСТ 53951-2010, а так же ГОСТ 23327-98 регулируют измерение массовой доли белка по Кьельдалю.

Метод Кьельдаля

Данный метод основывается на сжигании органических компонентов молочной пробы в колбе Кьельдаля с добавлением серной кислоты в присутствии катализатора сульфата меди. Определяют массовую долю азота, который в ходе реакции освобождается. Массовую долю белка находят, умножая полученный результат на соответствующий коэффициент.

Массовую долю азота определяют следующими способами:

Электрохимический.Кулонометрическое титрование аммиака происходит автоматически в минерализованной пробе.

Химический. Раствор подщелачивается, аммиак с водяным паром дистиллируется, с поглощением его раствором борной кислоты и титрованием последнего раствором соляной кислоты. Индикация точки эквивалентности происходит по изменению окраски индикатора или с помощью потенциометрического анализатора.

Читайте также:  Анализ структуры белков методами биоинформатики

Измерения проводится с добавлением, в колбу Кьельдаля, нескольких кусочков фарфора, примерно 10 г. сульфата калия, 0,04 г. сульфата меди. Молочную пробу отмеривают в бюксу с крышкой в количестве 5 см³, крышку закрывают и взвешивают. Перелив молоко из бюксы в колбу, пустую бюксу взвешивают и по разнице определяют массу взятого молока. В колбу с молоком осторожно по стеночкам, тем самым смывая молоко со стенок колбы, добавляют 20 см³ серной кислоты. Колбу закрывают, содержимое с осторожностью перемешивают.

Колбу устанавливают на нагревательный прибор под углом в 45º и осторожно, нагревают до тех пор, пока не прекратится бурное вспенивание и содержимое колбы не станет жидким. Далее процесс продолжают при более интенсивном нагревании. Кипящая кислота должна конденсироваться в середине горловины колбы Кьельдаля. Степень нагревания считается достаточной, когда жидкость становится прозрачной, бесцветной (при применении в качестве катализатора окиси ртути) или слегка голубоватой (при применении в качестве катализатора сульфата меди).

Как только раствор обесцветится, нагревание следует продолжать в течение 1,5 часа. После чего колбе необходимо дать остыть до комнатной температуры. Как только температура достигнет комнатной, доливают 150 см³ дистиллированной воды и вносят несколько кусочков свежепрокаленной пемзы, перемешивают, и снова остужают.

В коническую колбу отмеривают 50 см³ раствора борной кислоты, добавляют 4 капли индикатора и перемешивают.

Коническую колбу с борной кислотой устанавливают под холодильником, и соединяют при помощи аллонжа и резиновой трубки, при условии ,что конец аллонжа должен быть погружен в кислоту. Колбу Кьельдаля соединяют с холодильником при помощи каплеуловителя, проходящего через одну пробку с делительной воронкой. Отмеряют 80 см³ раствора гидроксида натрия и приливают его через делительную воронку в колбу Кьельдаля. Кран делительной воронки закрывают незамедлительно для избегания потери образующегося аммиака. Содержимое колбы Кьельдаля круговыми движениями осторожно смешивают и доводят до кипения. Пенообразования следует избегать.

В холодильнике происходит конденсация паров раствора аммиака, которые попадают в колбу с раствором борной кислоты. Перегонка продолжается пока жидкость не начнет бурлить. Степень нагрева регулируется так, чтобы время дистилляции было не менее 20 минут. Борная кислота в процессе принимает зеленую окраску. Полнота перегонки аммиака проверяется путем дополнительной перегонки в новую порцию борной кислоты (20 см³) в течение 5 минут. Окраска раствора борной кислоты не должна меняться. При перегонке не допускается нагревания раствора борной кислоты. Слишком сильное охлаждение (как правило, ниже 10ºС) недопустимо, оно может вызвать переход жидкости из конической колбы в колбу Кьельдаля. По окончании перегонки аллонж вынимают из раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2 минут. После прекращения нагревания отсоединяют аллонж. Поверхности аллонжа промываются небольшим количеством дистиллированной воды, сливая ее в коническую колбу. Дистиллят титруют раствором соляной кислоты до перехода зеленого цвета в серый. При избытке титранта раствор приобретает фиолетовый цвет.

Параллельно основному проводят контрольный опыт, применяя 5 см³ дистиллированной воды вместо молочной пробы. Контрольный опыт необходимо повторить не менее 5 раз. По объему аммиака, определяемого титрованием, устанавливают количество общего азота. При умножении количества азота на принятый коэффициент 6,38 для молока; 6,25 для молокосодержащих продуктов; 6,28 для сыворотки, таким образом, находят содержание общего белка в молоке.

Колориметрический метод.

Метод основывается на способности белков молока связывать кислый краситель (при рН ниже изоэлектрической точки), образуя с ним нерастворимый осадок, удаляя который измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора.

В пробирку отмеряют 1 см³ молока, приливают 20 см³ рабочего раствора сине-черного красителя, который готовится путем смешивания водного раствора красителя и кислого буферного раствора с добавлением поверхностно-активного вещества (ПАВ). Пробирку закрывают и получившуюся смесь интенсивно перемешивают. Встряхивание не допускается во избежание появления трудноразрушаемой пены. Выпавший осадок центрифугируют 10 минут при 1500 об./мин (20 минут при меньшей частоте вращения в 1000 об./мин.) Далее необходимо отобрать 1 см³ надосадочной жидкости и перенести в мерную колбу №1. Дистиллированной водой доливают до метки 50 см³ и перемешивают. В мерную колбу №2 помещают 1 см³ красителя и так же доливают дистиллированной водой до метки 50 см³. Используя колориметр или спектрофотометр, измеряют оптическую плотность разбавленного раствора красителя (колба №2) по отношению к анализируемой пробе (колба №1). После каждых 24х измерений кювету промывают, специально приготовленным по ГОСТу, буферным раствором.

Массовую долю белка Х4, %, вычисляют по формуле:

где 7,78 — эмпирический коэффициент, %/ед. оптической плотности;

D — измеренная оптическая плотность, ед. оптической плотности;

1,34 — эмпирический коэффициент, %.

Окончательный результат есть среднеарифметическое значение результатов измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака.

Метод формольного титрования.

Этот метод основывается на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбоновых кислот белков раствором гидроксида натрия. Количество гидроксида натрия, затраченного на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке.

В стакан помещают стержень магнитной мешалки и вносят 20 см 3 молочной пробы. Далее стакан устанавливается на магнитной мешалке, двигатель мешалки запускают и в молочную пробу погружают электроды потенциометрического анализатора. Постепенно приливают раствор гидроокиси натрия. При достижении точки эквивалентности (pH = 9, подавая раствор по каплям начиная с рН = 4) и окончании времени выдержки, которая длится 30 сек., определяют количество раствора гидроокиси натрия, израсходованное на нейтрализацию молочной пробы до внесения формальдегида. После в стакан вносят 5 см 3 формальдегида и засекают время. Через 2 — 2,5 мин. продолжают титрование (снова до точки эквивалентности, где рН=9) и по окончании процесса определяют общее количество раствора, использованного для нейтрализации.

Параллельно основному проводится контрольный опыт по нейтрализации смеси 20 см 3 воды и 5 см 3 раствора формальдегида.

Массовую долю белка Х3, %, вычисляют по формуле:

V2– общее количество раствора, израсходованное на нейтрализацию;

V1– количество раствора, израсходованное на нейтрализацию до внесения формальдегида;

V – количество раствора, израсходованное на контрольный опыт;

0,96 – эмпирический коэффициент;

K – поправка к результату измерения массовой доли белка, %.

Окончательный результат есть среднеарифметическое значение результатов измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака.

Рефрактометрический метод

Метод основывается на измерении разности показателей преломления луча света, после прохождения его через молоко и безбелковую молочную сыворотку, полученную из той же молочной пробы. Разность между ними прямо пропорциональна массовой доле белка в молоке.

Навеску 40,0 г хлористого кальция вносят в колбу вместимостью 1000 см 3 , сюда же добавляют 500 см 3 воды и перемешивают до полного растворения осадка. Содержимое колбы нагревают до температуры 20 о С и доводят дистиллированной водой до метки.

Наливают в 3 флакона по 5 см 3 молока, вносят по 6 капель 4%-ного раствора хлористого кальция. Закрывают флаконы пробками, и их содержимое перемешивают, переворачивая флаконы. Далее флаконы помещают в водяную баню, при этом уровень воды в бане должен достигать половины высоты флаконов. Баню закрывают, ставят на электроплитку, доводят содержимое бани до кипения и продолжают кипятить как минимум 10 мин. Сливают горячую воду через отверстия на крышке, не открывая бани, добавляют в баню холодную воду и держат в ней как минимум 2 мин.

Через время баню открывают, достают флаконы и разрушают белковый сгусток, энергично встряхивая флаконы. Флаконы устанавливают в центрифугу и центрифугируют как минимум 10 мин. Получившуюся прозрачную сыворотку отбирают пипеткой и капают на измерительную призму рефрактометра 1-2 капли. Закрывают измерительную призму осветительной. Наблюдая в окуляр рефрактометра, специальным корректором убирают окрашенность границы света и тени. Для того чтобы улучшить резкость границы, измерение проводят через 1 мин после нанесения сыворотки на призму, так как за это время из пробы удаляется воздух и происходит лучшее смачивание поверхности осветительной призмы. Осуществляют по шкале «Белок» как минимум 3 наблюдения. Удаляют сыворотку с поверхности призмы рефрактометра, промывают ее водой и протирают фильтровальной бумагой.

Вносят на измерительную призму 2 капли исследуемого молока и проводят по шкале «Белок» как минимум 5 наблюдений, так как резкость границы света и тени у молока хуже, чем у сыворотки. Вычисляют средние арифметические результаты наблюдений для сыворотки и молока.

Массовую долю белка в молоке X1, %, в процентах вычисляют по формуле:

Х2 — среднее арифметическое значение результатов измерений по шкале «Белок» для молока, %;

ХЗ — среднее арифметическое значение результатов измерений по шкале «Белок» для сыворотки, %.

Предел допустимой погрешности результата измерений составляет ±0,1 % массовой доли белка при доверительной вероятности 0,90 и расхождении между двумя параллельными определениями не более 0,1 % массовой доли белка.

Окончательный результат есть среднеарифметическое значение результатов измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака.

В сыром коровьем молоке согласно ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию» массовая доля белка должна быть в пределах 2,8-3,6%, но не менее 2,8%. Базисная норма массовой доли белка составляет 3,0%.

Сумм Б. Д. Основы коллоидной химии: учебник для студентов хим. и нехим. спец. — М.: Высшая школа, 2010 — 410 с.

Боровская Л.В. Электронный учебно-методический комплекс дисциплины «Физическая и коллоидная химия: учебно-методический комплекс дисциплины» Учебное пособие. ФГУП НТЦ «ИНФОРМРЕГИСТР» Депозитарий электронных изданий. Москва 2010 .

Феноменологическая модель термокислотной коагуляции белков обезжиренного молока / Л.А. Остроумов, А.М. Осинцев, И.А. Смирнова и др. // Техника и технология пищевых производств. – 2011. – № 1. – С. 133–139.

Транспортировка и хранение скоропортящихся пищевых продуктов. Данилин В.Н., Петрашев В.А., Боровская Л.В.// Известия высших учебных заведений. Пищевая технология. 1996. № 1-2. С. 7

Осинцев, А.М. Роль ионов кальция в коллоидной стабильности мицелл казеина / А.М. Осинцев, В.И. Брагинский О.Ю. Лапшакова А.Л. Чеботарев // Техника и технология пищевых производств. – 2009. – № 1. – С. 63–67

Исследование термодинамических свойств белково-полисахаридной системы методом дифференциальной сканирующей калориметрии /Бугаец Н.А., Тамова М.Ю., Боровская Л.В., Миронова О.П. //Известия высших учебных заведений. Пищевая технология Издательство: Кубанский государственный технологический университет .Краснодар, № 5-6,с.112.

источник

Представленный фрагмент произведения размещен по согласованию с распространителем легального контента ООО «ЛитРес» (не более 20% исходного текста). Если вы считаете, что размещение материала нарушает чьи-либо права, то сообщите нам об этом.

Текущая страница: 3 (всего у книги 6 страниц) [доступный отрывок для чтения: 2 страниц]

4.4. Определение массовой доли белков 4 4
ГОСТ 23327-98 Молоко и молочные продукты. Метод измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю и определение массовой доли белка. ГОСТ 25179-90 «Молоко. Методы определения белка»

Белки – высокомолекулярные органические соединения, построенные из аминокислот. К основным белкам молока относятся казеин, глобулин и альбумин. Содержание белков в коровьем молоке колеблется от 2,8 до 3,8 %, в среднем, оно составляет 3,2 %, в том числе казеина около 82 %, на долю сывороточных белков приходится 15-22 % от общего количества белков молока. Молочные белки имеют важное пищевое и технологическое значение, от количественного содержания белков зависит выход сыра, творога и других белковых продуктов. Для контроля содержания белков в молоке применяют следующие методы: – метод Кьельдаля. Метод основан на сжигании органических компонентов пробы молока в колбе Кьельдаля с серной кислотой. По количеству освобождающегося при этом азота в виде аммиака, определяемого титрованием, вычисляют содержание азотистых веществ.

– колориметрический метод. Метод основан на способности белков молока при рН ниже изоэлектрической точки, связывать кислые красители (амидо черный) вследствие образования нерастворимого комплекса. При этом интенсивность окраски раствора уменьшается обратно пропорционально количеству белка. После удаления осадка измеряют оптическую плотность раствора оставшегося красителя и по эмпирической формуле определяют массовую долю белка в молоке.

– метод формольного титрования. Метод основан на реакции щелочных аминогрупп белка с формалином, при этом образуется метиламиновая кислота и, соответственно, повышается титруемая кислотность молока, по приросту которой определяют массовую долю белка в молоке.

– рефрактометрический. Метод основан на установлении разности показателя преломления луча света, проходящего через молоко и выделенную из него (после осаждения казеина хлористым кальцием) сыворотку.

– расчетный. При выводе расчетной формулы для определения белка в молоке (Бм) исходили из постоянства соотношения между составными частями молока. Белок: лактоза: зола = 9: 13: 2.

Методика может быть реализована на универсальных фотоколориметрах типа КФК (2М, 3М, 5М), СФ-16 со светофильтрами для выделения спектральной области 590-600 нм, а также приборах «Про-Милк МК-2» фирмы Foss-Electric (Дания) и «Про-о-Мат-Ш» фирмы Funke-Gerber (Германия).

Приборы и реактивы. Весы лабораторные, рН-метр лабораторный, центрифуга молочная с частотой вращения 1000 об/мин., баня водяная с температурой 60-80 °C, термометр ртутный, кюветы кварцевые рабочей длины 10 мм, стаканчики химические стеклянные вместимостью 50 и 100 см 3 , пробирки стеклянные, фильтровальная бумага или фильтры бумажные (розовая лента), пипетки вместимостью 1, 2 и 20 см 3 , колбы мерные вместимостью 200 и 2000 см 3 , колбы химические вместимостью 500 и 750 см 3 , раствор сине-черного красителя в цитратной буферной смеси (рН 2,3).

Приготовление реактивов. Реактив 1 (буферный раствор). Взвешивают 31,7 г лимонной кислоты и 8,4 г (12-водного) или 3,4 г безводного ортофосфата натрия. Реактивы помещают в колбу и добавляют в нее 400 см 3 дистиллированной воды. Содержимое нагревают до температуры около 70 °C, перемешивают до полного растворения и охлаждают до 20 о С.

Реактив 2 (раствор красителя). Навеску 4,6 г красителя «амидо черный 10 Б» помещают в колбу и добавляют в нее 200 см 3 воды, нагревают до 70 °C и перемешивают до растворения красителя. Раствор отфильтровывают через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 2000 см 3 . Фильтр промывают водой до удаления следов красителя. Затем в эту колбу переносят реактив 1. Содержимое колбы охлаждают и доливают водой до метки, закрывают резиновой пробкой и перемешивают содержимое путем многократного переворачивания колбы. Если рН раствора не соответствует 2,3 ± 0,1, то добавляют, соответственно, концентрированную серную кислоту или гидроксид натрия.

Техника анализа. В стеклянную пробирку пипеткой вносят 1 см 3 молока, приливают 20 см 3 раствора красителя, закрыв пробирку резиновой пробкой, перемешивают ее содержимое, переворачивая пробирку от 2 до 10 раз, не встряхивая. Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют в течение 20 мин. Затем отбирают пипеткой 1см 3 надосадочной жидкости, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см 3 , доливают до метки дистиллированной водой и перемешивают содержимое. Аналогичным способом разбавляют рабочий раствор красителя в 50 раз. Он должен иметь оптическую плотность 0,82 ± 0,02, если она не соответствует данному значению, то добавляют буферный раствор или раствор красителя.

Читайте также:  Анализ сказки толстого белка и волк

На фотоэлектроколориметре или спектрофотометре в кювете с длиной рабочей грани 10 мм при 590-600 нм измеряют оптическую плотность разбавленного раствора красителя по отношению к разбавленной надосадочной жидкости. Массовую долю белка (%) вычисляют по формуле (34.3):

где D – оптическая плотность;

7,78 и 1,34 – эмпирические коэффициенты.

Метод применяют для контроля массовой доли белка в молоке кислотностью не более 22°Т. Консервирование проб молока не допускается.

Приборы и реактивы. Пипетки вместимостью 20 и 50 см 3 , пипетки градуированные вместимостью 1 и 5 см 3 , стаканы химические или колбы вместимостью 150-200 см 3 , бюретка для титрования вместимостью 25 см 3 . Гидроксид натрия 0,1 н и 40 %-ный растворы, приготовленные на прокипяченной дистиллированной воде, 2 %-ный спиртовой раствор фенолфталеина, формалин технический 37-40 %-ный (нейтрализованный), 2,5 %-ный раствор сульфата кобальта, вода дистиллированная, свободная от углекислого газа.

Нейтрализация формалина. К 50 см 3 формалина добавляют 3-4 капли раствора фенолфталеина и затем по каплям приливают сначала 40 %-ный, а в завершение 0,1 н раствор гидроксида натрия до появления слабо-розового окрашивания.

Приготовление эталона окраски. В колбочку для титрования или химический стакан отмеривают 20 мл молока и добавляют 0,5 мл 2,5 %-ного сульфата кобальта.

Техника анализа. В химический стакан или колбу для титрования пипеткой отмеривают 20 см 3 молока и добавляют 0,25 см 3 (10-12 капель) раствора фенолфталеина, а затем оттитровывают 0,1 н раствором гидроксида натрия из бюретки до появления слабо-розовой окраски, соответствующей контрольному эталону. Затем вносят 4 см 3 нейтрализованного формалина, перемешивают круговыми движениями и через 1 мин вторично титруют до такой же окраски, как и при первом титровании.

Массовая доля (%) общего количества белков в молоке равна количеству 0,1 н раствора щелочи, израсходованного на титрование в присутствии формалина, умноженному на коэффициент 0,959 (4.4):

где N -количество щелочи, пошедшей на титрование.

Массовую долю белков в молоке данным методом определяют на рефрактометрах типа АМ и ИРФ-464.

Приборы и реактивы. Рефрактометр, водяная баня закрытого типа, электроплита, центрифуга молочная, пипетки вместимостью 5 см 3 , флаконы для лекарственных средств типа ФО вместимостью 10 см 3 , 4 %-ный раствор кальция хлористого, вода дистиллированная.

Проведение анализа. В 3 флакона отмеривают по 5 см 3 молока и добавляют по 6 капель раствора хлорида кальция. Флаконы закрывают пробками и перемешивают содержимое. Флаконы помещают в водяную баню так, чтобы уровень воды достигал половины высоты флаконов, закрывают крышкой, доводят до кипения и кипятят не менее 10 мин. Не открывая бани, сливают воду через отверстия в крышке и наливают в баню холодную воду для охлаждения. Флаконы энергично встряхивают и разрушают белковый сгусток. После чего их помещают в центрифугу и центрифугируют не менее 10 мин. Образовавшуюся прозрачную сыворотку отбирают пипеткой и наносят 1-2 капли на измерительную призму рефрактометра. Закрывают измерительную призму осветительной.

Наблюдая в окуляр рефрактометра, специальным корректором убирают окрашенность границы света и тени. Снимают показания оптической плотности сыворотки (Бс) по шкале «Белок» не менее 3 раз и вычисляют среднее арифметическое. Удаляют сыворотку с призмы рефрактометра, промывают водой и вытирают фильтровальной бумагой. Помещают на измерительную призму 2 капли исследуемого молока и также снимают показания (не менее 3 раз) по шкале «Белок» – Бм. Массовую долю белка в молоке Б (%) вычисляют по формуле (4.5):

Б = Бм – Бс(4.5) где Бми Бс– оптическая плотность молока и выделенной из него безбелковой сыворотки.

где Жм– массовая доля жира в молоке, %;

0,075, 0,098, 0,085 – эмпирические коэффициенты.

Данным методом на рефрактометрах типа АМ-2, ИРФ, РЛ или РЛП возможно определение лактозы в молочной сыворотке.

Метод основан на способности безбелковой сыворотки, преломлять проходящий через нее свет в зависимости от концентрации лактозы.

Приборы и реактивы. Рефрактометр типа АМ-2, ИРФ или РЛ-2, водяная баня с навинчивающейся крышкой для флаконов, медицинские флакончики с резиновыми пробками, пипетка вместимостью 5 см 3 , капельница, вата хирургическая, бумага фильтровальная, стеклянная палочка с опаянным концом, 4 %-ный раствор хлорида кальция, вода дистиллированная.

Подготовка к анализу. Подготовка к анализу заключается в получении безбелковой сыворотки из исследуемого молока. В медицинский флакончик отмеривают 5 см 3 молока и добавляют 5 капель хлорида кальция. Флакончик закрывают пробкой и перемешивают. Затем для полного осаждения белков флаконы ставят в кипящую водяную баню (с завинченной крышкой) на 10 мин. После чего воду из бани сливают через отверстия в крышке и флаконы охлаждают под проточной водой. Затем стеклянной трубкой или пипеткой с ватным тампоном в нижней части отбирают немного сыворотки, фильтруя ее через вату.

Техника анализа на рефрактометрах типа АМ-2 или ИРФ. На измерительную призму рефрактометра наносят 1-2 капли прозрачной сыворотки. Закрывают измерительную призму осветительной. Наблюдая в окуляр рефрактометра, специальным корректором убирают расплывчатость и окрашенность на границе света и тени. Снимают показания по шкале «Белок» (Xi) Удаляют сыворотку с призмы рефрактометра, промывают водой и вытирают фильтровальной бумагой.

Затем на призму наносят 1-2 капли дистиллированной воды и также снимают показания по шкале белок (Х2). Массовую долю лактозы (Л) в процентах находят по формуле (4.7):

где: Х1 – показание по шкале «Белок» для сыворотки, %;

Х2 – показание по шкале «Белок» для дистиллированной воды, %

Техника анализа на рефрактометре РЛ-2. Рефрактометр РЛ-2 имеет две шкалы: «показатель преломления» в пределах 1,33-1,54 и «содержание сухих веществ по сахарозе» до 95 %. Рефрактометр на «0» устанавливают при 20 °C. Перед работой камеры призм рефрактометра присоединяют штуцерами к ультратермостату и пропускают воду с температурой 17,5 °C в течение 1015 мин. Затем проверяют установку нуля. На нижнюю призму наносят 2 капли дистиллированной воды, закрывают верхней и устанавливают окуляр на резкость видимости по шкале и визирной линии (представляющей собой три штриха). Окуляр перемещают до совмещения визирной линии с границей светотени. Она должна совпадать с нулевым делением шкалы сухих веществ и с делением nD=1,333.

Призмы насухо вытирают и на поверхность нижней призмы наносят 2 капли прозрачной сыворотки. Наблюдая в окуляр, вращением рукоятки устанавливают поле зрения на фокус (ясную видимость), устраняют расплывчатость и радужность окраски границы светотени. Передвижением окуляра добиваются полного совпадения граничной линии с визирным указателем и отсчитывают показатель преломления сыворотки по левой шкале рефрактометра. Затем по таблице (Приложение Г) устанавливают массовую долю молочного сахара.

4.6. Определение механической загрязненности молока 5 5
ГОСТ 8218-89 «Молоко. Метод определения чистоты»

Метод основан на отделении механической примеси из дозированной пробы молока путем процеживания через фильтр и визуального сравнения наличия механической примеси на фильтре с образцом сравнения (эталоном).

Приборы и материалы. Приборы разных конструкций (типа «Рекорд» и др.) с диаметром фильтрующей поверхности 27-30 мм, ватные фильтры лабораторные, фланель (отбеленная).

Техника анализа. На сетку прибора кладут ватный или фланелевый фильтр в виде кружка и закрепляют. Пробу молока объемом 250 см 3 , подогретую до температуры (35±5)°С, тщательно перемешивают и пропускают через приготовленный фильтр. По окончании фильтрования фильтр помещают на лист пергамента и просушивают на воздухе. В зависимости от количества механической примеси на фильтре молоко подразделяют на три группы (таблица 4.3).

Таблица 4.3 – Определение группы чистоты молока

6 Цвет фильтра должен соответствовать цвету молока в соответствии с требованиями стандарта. При изменении цвета фильтра молоко, независимо от количества имеющейся на фильтре механической примеси, относят к третьей группе чистоты.

4.7. Методы определения микробной обсемененности молока 6 6
ГОСТ Р 53430-2009 Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа. ГОСТ Р 52415-2005 «Молоко натуральное коровье – сырье. Люминесцентный метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов»

Пробы для микробиологических исследований отбирают в стерильную посуду с помощью специальных приспособлений с соблюдением правил асептики. Инвентарь для отбора проб перед использованием стерилизуют фламбированием (протирание ватой, смоченной спиртом, с последующим обжиганием на огне) или в автоклаве. Стерильные колбы с пробами закрывают стерильными пробками, горлышко посуды и пробку обертывают бумагой и обвязывают. Отобранные пробы следует исследовать не позднее 4 ч с момента взятия, при условии хранения или транспортирования при температуре не выше 6 °C.

Определение бактериальной обсемененности молока может быть проведено путем непосредственного посева молока на питательную среду (чашечный метод) или по редуктазной пробе.

Эта проба является косвенным показателем микробного загрязнения сырого молока. В процессе жизнедеятельности бактерии выделяют в окружающую среду наряду с другими окислительно-восстановительными ферментами анаэробные дегидразы, по старой классификации называемые редуктазами. Существует зависимость между количеством мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в молоке и содержанием в нем редуктаз, что дает возможность использовать редуктазную пробу как косвенный показатель уровня бактериальной обсемененности сырого молока.

Метод основан на восстановлении резазурина окислительновосстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По продолжительности изменения окраски резазурина оценивают бактериальную обсемененность сырого молока.

Приборы и реактивы. Редуктазник или водяная баня с терморегулятором, пробирки диаметром 20 мм и высотой 180 мм, пипетки вместимостью 1 и 20 см 3 , рабочий раствор резазурина (готовится из основного).

Основной раствор: 100 мг резазурина растворяют в 200 см 3 прокипяченной и охлажденной дистиллированной воды. Срок хранения не более 20 сут. при 3-5 °C.

Рабочий раствор готовят из основного разбавлением прокипяченной и охлажденной дистиллированной водой в соотношении 1: 10. Срок хранения не более 7 сут.

Техника анализа. Пробу с резазурином следует проводить не ранее чем через 2 ч после доения. В пробирки наливают по 1 см 3 рабочего раствора резазурина и по 10 см 3 исследуемого сырого молока, закрывают резиновыми пробками и смешивают путем медленного трехкратного переворачивания пробирок.

Пробирки помещают в редуктазник с температурой воды (37 ±1) °С. Вода в редуктазнике или водяной бане после погружения пробирок с сырым молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Температуру (37 ±1) °С поддерживают в течение всего времени определения. Пробирки с сырым молоком и резазурином на протяжении анализа должны быть защищены от света прямых солнечных лучей (редуктазник должен быть плотно закрыт крышкой).

Время погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа. Показания снимают через 1 ч. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают.

По истечении 1 ч пробирки вынимают из редуктазника, осторожно переворачивают. Пробирки с молоком, имеющим окраску от серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком, оставляют в редуктазнике еще на 30 мин. В зависимости от продолжительности обесцвечивания или изменения цвета молоко относят к одному из классов в соответствии с таблицей 4.4.

Таблица 4.4 – Определение бактериальной обсемененности и класса молока по редуктазной пробе с резазурином

Примечания: 1. Для оценки качества сырого молока при бактериальной обсемененности до 100 тыс. в 1 см 3 используют посев на чашки Петри.

2. При бактериальной обсемененности сырого молока до 300 тыс. время выдержки проб составляет 1,5 ч. Окраска сырого молока – от серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком.

3. Цвет сырого молока от бледно-розового до белого через 1 ч выдержки свидетельствует о бактериальной обсемененности свыше 4 млн. жизнеспособных клеток.

Цветовая шкала для определения класса сырого молока по редуктазной пробе с резазурином представлена в приложении Д.

Метод основан на растворении соматических клеток, белка и жира молока АТФ-реагентом; фильтровании полученного образца через бактериальный мембранный фильтр; растворении отфильтрованных микроорганизмов реагентом на основе диметилсульфоксида; расчете концентрации АТФ микроорганизмов в полученном растворе по его биолюминесценции и определении количества микроорганизмов в 1 см 3 молока.

Приборы и реактивы: люминометр, обеспечивающий измерение люминесценции в диапазоне длин волн от 400 до 700 нм; люминонометрическая кювета (типа фильтраветы); штатив для фильтравет; шприц медицинский вместимостью 5 см 3 ; наконечник резиновый к медицинскому шприцу; фильтровальная бумага; пипетки автоматические вместимостью 0,02 см 3 , 0,1 см 3 и 1 см 3 ; наконечники к автоматическим пипеткам стерильные; баня водяная, позволяющая поддерживать температуру (45 ± 1) o C. Реагенты: флакон № 1 – АТФ-реагент ЛЮМТЕК, лиофильно высушенный; флакон № 2 – раствор для реконструкции АТФ-реагента; флакон № З – АТФ-контроль, лиофилизованный; флакон № 4 – реагент для разрушения бактериальных клеток, раствор; флакон № 5 – реагент для предобработки молока, лиофилизованный; флакон № 6 – промывочный раствор. Внимание! Реагенты следует хранить в холодильнике при температуре от 0 до 6 °C.

Для получения воспроизводимых результатов анализа молока необходимо соблюдать меры предосторожности, принятые при работе в микробиологической лаборатории, в частности: перед проведением анализа поверхность лабораторного стола обработать 70 % этанолом; использовать автоматические пипетки и стерильные наконечники к ним; для выполнения каждой операции использовать новый стерильный наконечник; после анализа каждого образца молока штативы для фильтравет, фланцевый наконечник шприца, пинцет и автоматические пипетки стерилизовать 70 % этанолом.

Подготовка реагентов к анализу. Во флакон № 1 внести 2 мл раствора из флакона № 2, выдержать 30 мин перед использованием. Полученный раствор АТФ-реагента можно хранить при комнатной температуре в течение рабочего дня, а при 4 °C – в течение 2-3 дней.

Во флакон № 3 внести 1 мл раствора из флакона № 4, перемешать. Полученный раствор АТФ контроля имеет концентрацию АТФ 10 пикомоль/мл. Полученный раствор следует использовать в течение одного рабочего дня.

Проверка АТФ-реагента по АТФ-контролю. Поместить фильтравету с помощью пинцета в кюветное отделение люминометра. Внести в нее 0,02 мл раствора АТФ-контроля из флакона №З и 0,05 мл раствора из флакона № 2, перемешать, добавить 0,05 мл раствора АТФ-реагента из флакона № 1, быстро перемещать и измерить биолюминесцентный сигнал. Повторить измерения еще раз и найти среднее значение биолюминесцентного сигнала для АТФ-контроля (IK0HmpX Если измеренные значения различаются более, чем на 20 %, то необходимо провести третье измерение и усреднить два наиболее близких значения.

Читайте также:  Анализ содержания белка в зерне

Техника анализа. Образец анализируемого молока объемом 50 мл довести до комнатной температуры и тщательно перемешать. Внести 1 мл молока во флакон № 5 с реагентом для предобработки молока и тщательно перемешать. Закрыть флакон, поместить его в водяную баню (45 ± 0,5) о С на 10 мин. Поместить в штатив для фильтравет с помощью пинцета фильтровальную полоску и установить на неё две фильтраветы.

Внести в одну фильтравету 0,2 мл предобработанного молока и продавить его на фильтровальную бумагу, создавая избыточное давление с помощью шприца с резиновым наконечником. Сдвинуть фильтровальную полоску так, чтобы под фильтраветой оказался сухой участок полоски. Внести в ту же фильтравету две капли промывочного раствора из флакона № 6 и продавить его в фильтровальную полоску, создавая избыточное давление с помощью шприца с резиновым наконечником.

Поместить фильтравету с помощью пинцета в кюветное отделение люминометра и внести в нее 0,02 мл раствора из флакона № 4. Добавить через 1-2 мин в ту же фильтравету 0,05 мл раствора из флакона № 2, перемещать, затем добавить 0,05 мл АТФ-реагента из флакона № 1, быстро перемещать и измерить максимальный биолюминесцентный сигнал (IМ0Д).

Повторить операции со второй фильтраветой. Найти среднее значение биолюминесцентного сигнала для образца молока (IМ0Д). Если измеренные значения (I различаются более, чем на 20 %, то необходимо провести третье измерение и усреднить два наиболее близких значения.

Рассчитать концентрацию АТФ в молоке по формуле (4.8):

Определить величину КМАФАнМ по таблице 4.5, приведенной ниже.

Таблица 4.5 – Определение КМАФАнМ в сыром молоке биолюминесцентным методом

источник

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3 ИЗУЧЕНИЕ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА В МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ

Цель работы: Ознакомиться с различными методами определения белка в молоке.

  • 1. Изучить различные методы определения белка в молоке.
  • 2. Дать сравнительный анализ полученных результатов, указать причины расхождений значений массовой доли белка при определении различными методами.
  • 3. Сделать вывод о целесообразности использования исследованных методов в лабораторных и промышленных масштабах.

Краткие теоретические сведения

Определение белковых веществ в молоке методом формольного титрования. Метод основан на связывании свободных аминогрупп белков альдегидными группами формалина, в результате чего кислотность молока изменяется. Наблюдается сдвиг (на кривой титрования) в область более низких значений рН. Метод применим для определения суммы белковых веществ в молоке (кислотностью не выше 22 0 Т).

Определение процентного содержания белка в молоке рефрактометрическим методом. Показатель преломления Пд молока состоит из суммы Пд воды и Пд растворенных в ней белков, молочного сахара, небелковых азотистых веществ и солей. Небелковые азотистые вещества, молочный сахар и соли находятся в молоке в виде истинного раствора, белки — в виде коллоидного. Жир в молоке находится в виде эмульсии и на суммарный показатель преломления молока не влияет. Содержание белков (сумму казеина, альбумина, глобулина) в молоке определяют по разности показаний по шкале “Белок” молока и безбелковой сыворотки при одинаковых условиях производимых измерений.

Колориметрический метод определения белка в молоке. Метод предназначен для исследовательских целей. В основу его положена способность белков связывать кислые красители. Колориметрическим методом, как и стандартным методом Къельдаля, определяют массовую долю общего белка, включая фракцию небелкового азота.

Экспрессное измерение содержания белка в молоке на приборах белкомер БМЦ-1 или БМ-003. Принцип действия прибора основан на фотоколориметрическом методе измерения оптической плотности отфильтрованной смеси дозы молока и дозы раствора красителя органического кислотного сине-черного.

Метод основан на способности белков молока при рН ниже изоэлектрической точки связывать кислые красители, образуя с ними нерастворимый комплекс, при этом оптическая плотность раствора красителя уменьшается пропорционально количеству белка. После удаления нерастворимого комплекса вновь измеряют оптическую плотность раствора, содержащего остаточно несвязанный краситель, которая пропорциональна массовой доле белка в молоке. Конструктивно прибор состоит из двух блоков: измерительного и блока приготовления пробы.

Определение общего белка в молоке методом Къельдаля. Метод определения азотистых веществ в пищевых продуктах был предложен Къельдалем в 1883 г. и до сих пор, с небольшими изменениями, является основным методом определения белковых веществ в молоке и молочных продуктах. Къельдаль разработал метод определения количества белков по азоту, основываясь на том, что органические вещества при нагревании с концентрированной серной кислотой окисляются до H2O и CO2, а азот аминогрупп — NH2 переходит в сернокислый аммоний.

Серная кислота при нагревании разлагается на сернистый ангидрид, атомарный кислород и воду:

Выделяющийся атомарный кислород окисляет аминнокислоты. После окончания окисления аминный азот белковых веществ будет находиться в форме аммонийной соли. Переводя азот белковых соединений в форму сернокислого аммония, определяют количество азота в форме аммиака, для этого раствор разбавляют водой, серную кислоту нейтрализуют раствором едкого натра и избытком его создают щелочную реакцию, благодаря чему аммонийные соли выделяют аммиак:

Образующийся аммиак перегоняют в приемную колбу с борной кислотой, в результате получается борат аммония, который в водной среде сильно гидролизован и имеет щелочную среду, Для нейтрализации его используют соляную кислоту. По количеству мл 0,1 н раствора HCl, пошедших на титрование бората, находят количество азота. Для определения количества белков количество азота умножают на коэффициент 6,38. Коэффициент установлен из расчета, что количество азота в молочных белках равно 15,65 %.

Оборудование, приборы и технические средства:

Рефрактометр, термостат водяной циркуляционный, весы, пипетки на 1мл, 5 мл, 10 мл, 20 мл, прибор для отмеривания формальдегида вместимостью 1 мл, пробирки емкостью 10 мл, колбы мерные на 100 мл, фильтровальная бумага, колба Къельдаля, бюкса с крышкой, уксусной кислоты 10%-й раствор, хлорид кальция 4%-й раствор, фенолфталеин 2%-й раствор, гидроокись натрия 0,1 н раствор, формалин 36-40%-й раствор, сульфат кобальта 25%-й раствор, молоко разного состава; сернокислый калий, окись ртути, сернокислая медь, серная кислота, индикатор Таширо, борная кислота.

Порядок выполнения работы

Определение белковых веществ в молоке методом формольного титрования. В стакан вместимостью 150-200 мл вносят пипеткой 20 мл молока, 0,25 мл 2%-го раствора фенолфталеина и титруют 0,1 н. раствором гидроксида натрия до появления слабо-розовой окраски, соответствующей контрольному эталону. Затем вносят 4 мл нейтрализованного 36-40%-го формальдегида и вторично титруют до такой окраски, как и при первом титровании.

Для приготовления контрольного эталона окраски в такой же стакан отмеривают 30 мл молока и 1 мл 0,25 %-го раствора сульфата кобальта. Эталон пригоден для работы в течение одной смены. Во избежание отстоя сливок эталон рекомендуется периодически переливать. Долю общего белка в молоке можно определить также по таблице 3.1

Количество 0,1 н раствора NaOH, см 3

Массовая доля белков в молоке, %

Количество 0,1 н раствора NaOH, см 3

Массовая доля белков в молоке, %

  • 2,45
  • 2,50
  • 2,55
  • 2,60
  • 2,65
  • 2,70
  • 2,75
  • 2,80
  • 2,85
  • 2,90
  • 2,95
  • 3,00
  • 3,05
  • 3,10
  • 3,15
  • 3,20
  • 3,25
  • 2,35
  • 2,40
  • 2,44
  • 2,49
  • 2,54
  • 2,59
  • 2,64
  • 2,69
  • 2,73
  • 2,78
  • 2,83
  • 2,88
  • 2,93
  • 2,98
  • 3,03
  • 3,07
  • 3,12
  • 3,30
  • 3,35
  • 3,40
  • 3,45
  • 3,50
  • 3,55
  • 3,60
  • 3,65
  • 3,70
  • 3,75
  • 3,80
  • 3,85
  • 3,90
  • 3,95
  • 4,00
  • 4,05
  • 4,10
  • 3,16
  • 3,21
  • 3,25
  • 3,31
  • 3,35
  • 3,40
  • 3,45
  • 3,50
  • 3,55
  • 3,60
  • 3,65
  • 3,69
  • 3,74
  • 3,79
  • 3,84
  • 3,89
  • 3,94

Параллельно проводят контрольный опыт по нейтрализации смеси 20 мл воды и 5 мл раствора формальдегида.

Массовую долю белка (Х2) в процентах вычисляют по формуле:

где: V2 — общее количество раствора, израсходованное на нейтрализацию, мл; V1 — количество раствора, израсходованное на нейтрализацию до внесения формальдегида, мл;

V — количество раствора, израсходованное на контрольный опыт, мл;

0,96 — эмпирический коэффициент, % / мл;

Х1 — поправка к результату измерения массовой доли белка, %.

Определение процентного содержания белка в молоке рефрактометрическим методом. Для получения безбелковой сыворотки отмеряют во флакон 5 мл исследуемого молока и добавляют в него 5-6 капель 4%-го раствора хлористого кальция (40 г СаСI2 в одном литре дистиллированной воды).

Флакон закрывают пробкой и слегка взбалтывают содержимое. Одновременно готовят 2-3 параллельных пробы (флаконы должны быть пронумерованы). Флаконы помещают в бачок термостата, наливают в него воду до половины высоты флаконов, закрывают крышкой. Воду в бачке кипятят в течение десяти минут. Затем горячую воду заменяют холодной. Флаконы охлаждают в течение двух минут. Флаконы вынимают из бачка, встряхивают так, чтобы сгусток разрушился и выделившаяся сыворотка смешалась с конденсатом.

Отфильтрованную сыворотку наносят на измерительную призму рефрактометра и плавно закрывают ее осветительной призмой. Наблюдая в окуляр, убирают окрашенность границы светотени. Для улучшения резкости границы измерение необходимо проводить через 0,5 — 1 мин., т.к. за это время из пробы удаляется воздух и лучше смачивается поверхность осветительной призмы.

По шкале «Белок» снимают показание для сыворотки. Измерения повторяют 3-4 раза и подсчитывают среднеарифметическое значение Бс. Удалив сыворотку с обеих призм, их тщательно промывают водой и вытирают чистой мягкой салфеткой или ватой. Затем 1-2 капли исследуемого молока помещают на измерительную призму.

Проводят измерения по шкале «Белок» в том же порядке, как на сыворотке. Так как резкость границы у молока несколько хуже, чем у сыворотки и воды, измерения повторяют 4-5 раз и подсчитывают среднеарифметическое значение Бм. Содержание белков в молоке определяют по формуле:

Общий белок (белки и небелковые азотистые вещества) определяют по формуле:

По шкале «Белок» также можно определить содержание казеина, сывороточных белков (альбумина и глобулина) в молоке. Содержание казеина в молоке определяют по формуле:

где Бк.с. — показание по шкале «Белок» для бесказеиновой сыворотки.

Для получения бесказеиновой сыворотки во флакон с молоком (5 мл) вносят 10 капель 10%-го раствора уксусной кислоты. Содержание сывороточных белков определяют по формуле:

Определение общего белка в молоке методом Къельдаля. В колбу Къельдаля помещают последовательно несколько стеклянных бусинок или кусочков фарфора, около 10 г сернокислого калия, 0,5 г окиси ртути или 0,04 г сернокислой меди. В бюксу с крышкой отмеривают 5 мл молока, крышку закрывают и взвешивают с точностью до 1 мг. Пустую бюксу вновь взвешивают и по разнице между массой бюксы с молоком и массой пустой бюксы устанавливают массу взятого молока. В колбу добавляют 20 мл серной кислоты, вливая осторожно по стенкам колбы, смывая с них капли молока. Колбу закрывают грушеобразной стеклянной пробкой и осторожно круговыми движениями перемешивают содержимое колбы.

Колбу ставят на нагревательный прибор в наклонном положении под углом 45 0 и осторожно нагревают. Продолжают нагревание колбы до тех пор, пока не прекратится пенообразование и содержимое колбы не станет жидким. Затем сжигание продолжают при более интенсивном нагревании. Степень нагревания считают достаточной, когда кипящая кислота конденсируется в середине горловины колбы Къельдаля.

Время от времени содержимое колбы перемешивают, смывая обуглившиеся частицы со стенок колбы. Нагревание продолжают до тех пор, пока жидкость не станет совершенно прозрачной и практически бесцветной (при применении в качестве катализатора окиси ртути) или слегка голубоватой (при применении в качестве катализатора сернокислой меди).

После осветления раствора нагревание продолжают в течение 1,5 ч, после чего колбе дают остыть до комнатной температуры. Добавляют 150 мл дистиллированной воды и несколько кусочков свежепрокаленной пемзы, перемешивают и снова охлаждают.

В коническую колбу отмеривают 50 мл раствора борной кислоты, добавляют 4 капли индикатора Таширо и перемешивают. Коническую колбу соединяют с холодильником с помощью аллонжа и резиновой пробки так, чтобы конец аллонжа был ниже поверхности раствора борной кислоты в конической колбе. Колбу Къельдаля соединяют с холодильником при помощи каплеуловителя, проходящего через одну пробку с делительной воронкой. Градуированным цилиндром отмеривают 80 мл раствора гидроокиси натрия (при применении в качестве катализатора красной окиси ртути используют раствор гидроокиси натрия, содержащий сульфид натрия) и через делительную (или капельную) воронку вносят его в колбу Къельдаля. Сразу же после выливания раствора закрывают кран делительной воронки для избежания потери образующегося аммиака. Содержимое колбы Къельдаля осторожно смешивают круговыми движениями и нагревают до кипения. При этом необходимо избегать пенообразования.

Продолжают перегонку до тех пор, пока жидкость не начнет вскипать толчками. При этом регулируют степень нагрева так, чтобы время дистилляции было не более 20 мин. Убедиться в полноте перегонки аммиака можно путем дополнительной перегонки в новую партию борной кислоты (20 мл) в течение 5 мин. Окраска раствора борной кислоты должна остаться без изменения. При перегонке не допускают нагревания раствора борной кислоты в конической колбе. Слишком сильное охлаждение (ниже +10 0 С) также нежелательно, так как оно может вызвать переброс жидкости из конической колбы в колбу Къельдаля.

Перед окончанием перегонки опускают коническую колбу так, чтобы конец аллонжа оказался над поверхностью раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2 мин. Прекращают нагревание и отсоединяют аллонж. В коническую колбу смывают внешнюю и внутреннюю поверхности аллонжа небольшим количеством дистиллированной воды. Титруют дистиллят 0,1 н раствором соляной кислоты до перехода зеленого цвета в фиолетовый.

Параллельно проводят контрольный анализ так же, как и основной, применяя 5 мл дистиллированной воды вместо молока. Контрольный анализ проводят в каждой серии определения количества белка и при каждой замене реактивов.

Массовую долю общего белка (Б) в процентах вычисляют с точностью до третьего десятичного знака по формуле:

где 1,4 — количество азота, эквивалентное 1 мл 0,1 н раствора соляной кислоты, мг;

0,1 — нормальность раствора соляной кислоты;

V1 — объем 0,1 н соляной кислоты, израсходованной на титрование дистиллята в основном анализе, мл;

V — объем 0,1 н соляной кислоты, израсходованной на титрование дистиллята в контрольном анализе, мл;

6,38 — коэффициент для перевода массовой доли общего азота на массовую долю общего белка;

m — масса молока, взятого на анализ, г.

Отчёт о выполнении задания

Результаты работы представить по форме, приведённой в табл.3.2

Метод формального титрования

  • 1. Белки молока, их классификация.
  • 2. Методы формольного титрования и Къельдаля, их химическая сущность.
  • 3. Рефрактометрический метод, на каких свойствах казеина и сывороточных белков он основан?

источник