Меню Рубрики

Определение первичной структуры белка аминокислотный анализ

Определение первичной структуры белков сводится к выяснению порядка расположения аминокислот в полипептидной цепочке. Эту задачу решают с помощью метода секвенирования (от англ. sequence –последовательность).

Принципиально первичную структуру белков можно определять путем непосредственного анализа аминокислотной последовательности или путем расшифровки нуклеотидной последовательности соответствующих генов с помощью генетического кода. Естественно, наибольшую надежность обеспечивает сочетание этих методов.

Собственно секвенирование на его сегодняшнем уровне позволяет определить аминокислотную последовательность в полипептидах, размер которых не превышает несколько десятков аминокислотных остатков. В то же время исследуемые полипептидные фрагменты значительно короче тех природных белков, с которыми приходится иметь дело. Поэтому необходимо предварительное разрезание исходного полипептида на короткие фрагменты. После секвенирования полученных фрагментов их необходимо снова сшить в первоначальной последовательности.

Таким образом, определение первичной последовательности белка сводится к следующим основным этапам:

1) расщепление белка на несколько фрагментов длиной, доступной для секвенирования;

2) секвенирование каждого из полученных фрагментов;

3) сборка полной структуры белка из установленных структур его фрагментов.

Исследование первичной структуры белка состоит из следующих стадий:

– определение его молекулярной массы;

– определение удельного аминокислотного состава (АК-состава);

– определение N— и С-концевых аминокислотных остатков;

– расщепление полипептидной цепи на фрагменты;

– разделение полученных фрагментов;

– аминокислотный анализ каждого фрагмента;

– расщепление исходной полипептидной цепи еще одним способом;

– разделение полученных фрагментов;

– аминокислотный анализ каждого фрагмента;

– установление первичной структуры полипептида с учетом перекрывающихся последовательностей фрагментов обоих расщеплений.

Поскольку пока не существует метода, позволяющего установить полную первичную структуру белка на целой молекуле, полипептидную цепь подвергают специфичному расщеплению химическими реагентами или протеолитическими ферментами. Смесь образовавшихся пептидных фрагментов разделяют и для каждого из них определяют аминокислотный состав и аминокислотную последовательность. После того как структура всех фрагментов установлена, необходимо выяснить порядок их расположения в исходной полипептидной цепи. Для этого белок подвергают расщеплению при помощи другого агента и получают второй, отличный от первого набор пептидных фрагментов, которые разделяют и анализируют аналогичным образом.

1. Определение молекулярной массы(нижеперечисленные методы подробно рассмотрены в теме 3):

– по скорости седиментации (метод ультрацентрифугирования);

– электрофорез в ПААГ в диссоциирующих условиях.

2. Определение АК-состава. Анализ аминокислотного состава включает полный кислотный гидролиз исследуемого белка или пептида с помощью 6 н. соляной кислоты и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Гидролиз образца проводится в запаянных ампулах в вакууме при 150°С в течение 6 ч. Количественное определение аминокислот в гидролизате белка или пептида проводится с помощью аминокислотного анализатора.

3. Определение N- и С-аминокислотных остатков. В полипептидной цепи белка с одной стороны расположен аминокислотный остаток, несущий свободную α-аминогруппу (амино- или N-концевой остаток), а с другой – остаток со свободной α-карбоксильной группой (карбоксильный, или С-концевой остаток). Анализ концевых остатков играет важную роль в процессе определения аминокислотной последовательности белка. На первом этапе исследования он дает возможность оценить число полипептидных цепей, составляющих молекулу белка, и степень гомогенности исследуемого препарата. На последующих этапах с помощью анализа N-концевых аминокислотных остатков осуществляется контроль за процессом разделения пептидных фрагментов.

Реакции определения N-концевых аминокислотных остатков:

1) один из первых методов определения N-концевых аминокислотных остатков был предложен Ф. Сенгером в 1945 г. При реакции α- аминогруппы пептида или белка с 2,4-динитрофторбензолом получается динитрофенильное (ДНФ) производное, окрашенное в желтый цвет. Последующий кислотный гидролиз (5,7 н. НСl) приводит к разрыву пептидных связей и образованию ДНФ-производного N-концевой аминокислоты. ДНФ-аминокислота экстрагируется эфиром и идентифицируется хроматографическим методом в присутствии стандартов.

2) метод дансилирования. Наибольшее применение для определения N-концевых остатков в настоящее время находит разработанный в 1963 г. В. Греем и Б. Хартли дансильный метод. Как и метод динитрофенилирования, основан на введении в аминогруппы белка «метки», не удаляющейся при последующем гидролизе. Его первая стадия – реакция дансилхлорида (1-диметиламинонафталин-5-сульфохлорида) с непротонированной а-амино-группой пептида или белка с образованием дансилпептида (ДНС-пептида). На следующей стадии ДНС-пептид гидролизуется (5,7 н. НС1, 105°С, 12 — 16 ч) и освобождается N-концевая α-ДНС-аминокислота. ДНС-аминокислоты обладают интенсивной флуоресценцией в ультрафиолетовой области спектра (365 нм); обычно для их идентификации достаточно 0,1 — 0,5 нмоль вещества.

Имеется ряд методов, с помощью которых можно определять как N-концевой аминокислотный остаток, так и аминокислотную последовательность. К ним относятся деградация по методу Эдмана и ферментативный гидролиз аминопептидазами. Эти методы будут подробно рассмотрены ниже при описании аминокислотной последовательности пептидов.

Реакции определения С-концевых аминокислотных остатков:

1) среди химических методов определения С-концевых аминокислотных остатков заслуживают внимания метод гидразинолиза, предложенный С. Акабори, и оксазолоновый. В первом из них при нагревании пептида или белка с безводным гидразином при 100 — 120°С пептидные связи гидролизуются с образованием гидразидов аминокислот. С-концевая аминокислота остается в виде свободной аминокислоты и может быть выделена из реакционной смеси и идентифицирована (рис. 6).

Рис. 6. Расщепление пептидной связи гидразином

Метод имеет ряд ограничений. При гидразинолизе разрушаются глутамин, аспарагин, цистеин и цистин; аргинин теряет гуанидиновую группировку с образованием орнитина. Гидразиды серина, треонина и глицина лабильны и легко превращаются в свободные аминокислоты, что затрудняет интерпретацию результатов;

2) оксазолоновый метод, часто называемый методом тритиевой метки, основан на способности С-концевого аминокислотного остатка под действием уксусного ангидрида подвергаться циклизации с образованием оксазолона. В щелочных условиях резко увеличивается подвижность атомов водорода в положении 4 оксазолонового кольца и они могут быть легко заменена тритием. Образующиеся в результате последующего кислотного гидролиза тритиированного пептида или белка продукты реакции содержат радиоактивно меченную С-концевую аминокислоту. Хроматографирование гидролизата и измерение радиоактивности позволяют идентифицировать С-концевую аминокислоту пептида или белка;

3) чаще всего для определения С-концевых аминокислотных остатков используют ферментативный гидролиз карбоксипептидазами, позволяющий анализировать также и С-концевую аминокислотную последовательность. Карбоксипептидаза гидролизует только те пептидные связи, которые образованы С-концевой аминокислотой, имеющей свободную α-карбоксильную группу. Поэтому под действием этого фермента от пептида последовательно отщепляются аминокислоты, начиная с С-концевой. Это позволяет определить взаимное расположение чередующихся аминокислотных остатков.

В результате идентификации N— и С-концевых остатков полипептида получают две важных реперных точки для определения его аминокислотной последовательности (первичной структуры).

Дата добавления: 2015-12-22 ; просмотров: 1533 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

источник

Для определения природы С-концевой аминокислоты часто используют ферментативные методы. Обработка полипептида карбоксипептидазой, которая разрывает пептидную связь с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа, приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, природа которой может быть идентифицирована методом хроматографии.

Предложен также химический метод Акабори (S. Akabori), который основан на гидразинолизе полипептида:

Гидразин, вызывая распад чувствительных к нему пептидных связей полипептида, реагирует со всеми аминокислотами, за исключением С-концевой аминокислоты, поскольку ее карбоксильная группа не участвует в образовании пептидной связи. При этом образуется смесь аминоацил-гидразинов и свободной С-концевой аминокислоты. Последнюю после обработки всей смеси ДНФБ отделяют и идентифицируют хроматографи-чески, для чего образовавшиеся динитрофенилпроизводные аминоацил-гидразинов предварительно экстрагируют уксусно-этиловым эфиром.

С-концевую аминокислоту идентифицируют также путем обработки полипептида восстанавливающим агентом, например боргидридом натрия. В простейшей форме эту процедуру можно представить в следующем виде:

Видно, что в указанных условиях только одна, а именно С-концевая, аминокислота будет превращаться в α-аминоспирт, легко идентифицируемый методом хроматографии. Таким образом, при помощи указанных методов определяют природу N- и С-концевых аминокислот.

Следующий этап работы связан с определением чередования (последовательности) аминокислот внутри полипептидной цепи. Для этого сначала проводят избирательный, частичный (химический и ферментативный), гидролиз полипептидной цепи на короткие пептидные фрагменты, последовательность аминокислот в которых может быть точно определена описанными ранее методами.

Химические методы избирательного и неполного гидролиза основаны на применении таких химических реактивов, которые вызывают селективный, высокоспецифический разрыв пептидных связей, образованных определенными аминокислотами, оставляя незатронутыми остальные пептидные связи. К этим избирательно гидролизующим веществам относятся цианогенбромид, CNBr (по остаткам метионина), гидроксиламин (по связям между остатками аспарагиновой кислоты и глицина), N-бромсукцинамид (по остаткам триптофана). Метионина в составе белков содержится обычно меньше, чем других аминокислот, поэтому обработка CNBr предпочтительнее, так как при этом образуется небольшое число пептидов, первичную структуру которых определяют с помощью рассмотренных ранее методов, всякий раз начиная с определения природы N- и С-концевых аминокислот.

Ферментативные методы гидролиза основаны на избирательности действия протеолитических (вызывающих распад белков) ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные определенными аминокислотами. В частности, пепсин ускоряет гидролиз связей, образованных остатками фенилаланина, тирозина и глутаминовой кислоты, трипсин – аргинина и лизина, химотрипсин – триптофана, тирозина и фенилаланина. Ряд других ферментов, например папаин, субтилизин, проназа и другие бактериальные протеиназы, также используется для неполного гидролиза белков. В результате полипептидная цепь расщепляется на мелкие пептиды, содержащие иногда всего несколько аминокислот, которые отделяют друг от друга сочетанными электрофоретическими и хроматографическими методами, получая своеобразные пептидные карты. Далее определяют чередование аминокислот в каждом индивидуальном пептиде. Завершается работа воссозданием первичной структуры полной полипептидной цепи на основании определения последовательности аминокислот в отдельных пептидах.

Метод составления пептидных карт, получивший образное название «метод отпечатков пальцев», используется при определении сходства или различия гомологичных белков по первичной структуре. Белок инкубируют с каким-либо протеолитическим ферментом. Часто порции белка инкубируют как с пепсином, так и с трипсином. При этом вследствие гидролиза строго определенных пептидных связей образуется смесь коротких пептидов, легко разделяемых с помощью хроматографии в одном направлении и электрофореза – в другом , под углом 90° от первого (пептидная карта).

Дальнейшие задачи – установление последовательности расположения аминокислот в каждом из выделенных пептидов (фенилтиогидантоиновым или другими методами), сопоставление полученных данных и установление первичной структуры всей молекулы.

Возможность применения рентгеноструктурного анализа для определения последовательности аминокислот в белковой молекуле была рассмотрена ранее. Следует отметить совершенно новый подход к решению этой важной проблемы – определение последовательности аминокислот в белковой молекуле с использованием данных о комплементарной нуклеотидной последовательности ДНК. Этому способствуют как методы быстрого секвенирования ДНК, так и техника изолирования и доступности самого гена.

В настоящее время выяснение первичной структуры белков является вопросом времени и технического оснащения лабораторий. Полностью выяснена первичная структура многих природных белков и прежде всего инсулина, содержащего 51 аминокислотный остаток [Сэнджер Ф., 1954]. Более крупным белком с выясненной первичной структурой оказался иммуноглобулин, в четырех полипептидных цепях которого насчитывается 1300 аминокислотных остатков. За эту работу Дж. Эдельман и Р. Портер были удостоены Нобелевской премии (1972).

Рис. 1.14. Структура проинсулина.

Расшифрованы первичные структуры миоглобина человека (153 аминокислотных остатка), α-цепи (141) и β-цепи (146) гемоглобина человека, цитохрома С из сердечной мышцы человека (104), лизоцима молока человека (130), химотрипсиногена быка (245) и многих других белков, в том числе ферментов и токсинов. На рис. 1.14 представлена последовательность аминокислотных остатков проинсулина. Видно, что молекула инсулина (выделена темными кружками), состоящая из двух цепей (А – 21 и В – 30 аминокислотных остатков), образуется из своего предшественника – про-инсулина (84 аминокислотных остатка), представленного одной полипептидной цепью, после отщепления от него пептида, состоящего из 33 аминокислотных остатков. Строение молекулы инсулина (51 аминокислотный остаток) схематически можно представить следующим образом:

Между цепями А и В и внутри А-цепи инсулина образуются дисуль-фидные (—S—S—) связи. Выяснена первичная структура более 18 инсули-

нов, выделенных из разных источников. Близкими по первичной структуре оказались инсулины из поджелудочной железы человека, свиньи и кашалота. Единственным отличием инсулина человека является нахождение треонина в положении 30 В-цепи вместо аланина.

Вторым белком, первичная структура которого расшифрована С. Муром и У. Стейном, является рибонуклеаза (рис. 1.15) из поджелудочной железы, катализирующая расщепление РНК. Фермент состоит из 124 аминокислотных остатков с N-концевым лизином и С-концевым валином, между остатками цистеина образуются дисульфидные (—S—S—) связи в 4 участках.

Полностью расшифрована последовательность аминокислот полипептидной цепи фермента лизоцима, имеющего важное защитное и медицинское значение, так как он вызывает лизис ряда бактерий, расщепляя основное вещество их клеточной оболочки. Лизоцим белка куриного яйца содержит 129 аминокислот (рис. 1.16) с N-концевым лизином и С-концевым лейцином.

Отечественными исследователями установлена первичная структура многих белков и полипептидов, в том числе крупного белка РНК-полимера-зы (в частности, последовательности ее β- и β 1 -субъединиц, 1342 и 1407 аминокислотных остатков соответственно фактора элонгации G из Е.coli (701 аминокислота) (Ю.А. Овчинников и др.), фермента аспартатамино-трансферазы, состоящей из 412 аминокислотных остатков (А.Е. Браун-штейн, Ю.А. Овчинников и др.), леггемоглобина, белка L25 из рибосом E.coli, нейротоксинов из яда кобры (Ю.А. Овчинников и др.), пепсиногена и пепсина (В.М. Степанов и др.), L-липотропина и лактогенного гормона быка (Н.А. Юдаев, Ю.А. Панков) и др.

Рис. 1.15. Первичная структура РНКазы. Цветом выделены четыре дисульфидные связи.

Рис. 1.16. Первичная структура полипептидной цепи лизоцима (схема).

Исследования первичной структуры α- и β-цепей гемоглобина способствовали выяснению структуры необычных, так называемых аномальных, гемоглобинов, встречающихся в крови больных гемоглобинопатиями. Иногда развитие болезни, как и изменение пространственной структуры гемоглобина человека, обусловлено заменой лишь одной какой-либо аминокислоты в структуре β-цепей (реже α-цепей) гемоглобина (см. главу 2).

Анализ данных о первичной структуре белков позволяет сделать следующие общие выводы.

1. Первичная структура белков уникальна и детерминирована генетически. Каждый индивидуальный гомогенный белок характеризуется уникальной последовательностью аминокислот: частота замены аминокислот приводит не только к структурным перестройкам, но и к изменениям физико-химических свойств и биологических функций.

2. Стабильность первичной структуры обеспечивается в основном глав-новалентными пептидными связями; возможно участие небольшого числа дисульфидных связей.

3. В полипептидной цепи могут быть обнаружены разнообразные комбинации аминокислот; в полипептидах относительно редки повторяющиеся последовательности.

4. В некоторых ферментах, обладающих близкими каталитическими свойствами, встречаются идентичные пептидные структуры, содержащие неизменные (инвариантные) участки и вариабельные последовательности аминокислот, особенно в областях их активных центров. Этот принцип структурного подобия наиболее типичен для ряда протеолитических ферментов: трипсина, химотрипсина и др. (см. главу 4).

Читайте также:  Что такое анализ падение белка

5. В первичной структуре полипептидной цепи детерминированы вторичная, третичная и четвертичная структуры белковой молекулы, определяющие ее общую пространственную конформацию.

источник

Определение аминокислотного состава белков может быть осуществлено различными методами: химическим, хроматографическим, микробиологическим и изотопным. Чаще используются хроматографические методы.

Бумажная хроматография. Бумажная хроматография используется для идентификации компонентов смеси аминокислот с ди- и три-пептидами, получаемой при частичном гидролизе белков и полипептидов.

Гидролиз может быть осуществлен кислотным, щелочным или ферментативным методом. Кислотный метод используется чаще (6 н. HCl, 8 н. H2SO4). Гидролиз проводят при нагревании, иногда при повышенном давлении. Показателями окончания гидролиза могут служить: прекращение нарастания карбоксильных или аминных групп в гидролизате, либо отрицательная биуретовая реакция. Избыток гидролизующего реагента удаляют: серную кислоту осаждают Ca(OH)2, соляную кислоту отгоняют в вакууме, а остаток кислоты осаждают нитратом серебра.

Компоненты гидролизата распределяются между водой, адсорбированной на целлюлозе и являющейся неподвижной фазой, и органическим растворителем, подвижной фазой, которая движется вдоль листа вверх или вниз. В качестве подвижной фазы используется смесь бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5). Более липофильные аминокислоты сильнее увлекаются органическим растворителем, более гидрофильные – проявляют большую тенденцию связываться с неподвижной фазой. Гомологические соединения, отличающиеся даже на одно метиленовое звено, движутся с различной скоростью и легко могут быть разделены. По окончании хроматографии бумагу высушивают и обрабатывают проявителем (0,5% раствор нингидрина в смеси ацетон-ледяная уксусная кислота-вода) и нагревают в течение нескольких минут. Аминокислоты проявляются в виде окрашенных пятен. Подвижность – постоянная величина, характерная для каждого соединения возрастает с увеличением молекулярной массы. Для аминокислот с неразветвленной цепью величина подвижности несколько больше, чем для соответствующих изомеров. Введение в молекулу полярных групп снижает подвижность соединения. Аминокислоты с объемными неполярными боковыми цепями (лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан и др.) перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими неполярными боковыми цепями (пролин, аланин, глицин) или с полярными боковыми цепями (треонин, аргини, цистеин, гистидин, лизин). Это обусловлено большей растворимостью полярных молекул в гидрофильной стационарной фазе и неполярных – в органических растворителях.

Бумажная хроматография может быть использована для количественной оценки содержания аминокислот. Каждое пятно вырезают и элюируют подходящим растворителем; затем проводят количественный колориметрический (нингидриновый) анализ. В другом варианте бумагу опрыскивают нингидрином и измеряют с помощью фотометра интенсивность окрашивания пятна в отраженном или проходящем свете. При полуколичественной оценке содержание аминокислот оценивают по площади пятен на хроматограмме, которые пропорциональны концентрациям аминокислот в разделяемой смеси.

Тонкослойная хроматография. Для разделения и определения аминокислот может быть также использована тонкослойная хроматография. ТСХ, как известно, существует в двух вариантах. Распределительная ТСХ сходна с распределительной на бумаге и адсорбционная ТСХ, основана совершенно на других принципах.

При проведении РТСХ на порошке целлюлозы или других относительно инертных носителях можно использовать такие же системы растворителей и такие же проявляющие реагенты, как и при хроматографии на бумаге.

Разделение с помощью АТСХ определяется способностью растворителя (этот растворитель не обязательно является бинарной или более сложной смесью) элюировать компоненты образца с места его адсорбции на активированном сорбенте. Например, на нагретом силикагеле. АТСХ применима для разделения таких неполярных соединений, как липиды, но не для разделения аминокислот и большинства пептидов. Для разделения аминокислот используют РТСХ, которая позволяет достаточно быстро разделять и определять 22 аминокислоты белковых гидролизатов.

Аминокислоты в белковом гидролизате могут быть определены также методом газовой хроматографии, но перед хроматографическим анализом аминокислоты как правило переводят в летучие соединения.

-Взаимодействие с нингидрином. Образуются соответствующие альдегиды.

Таким образом, получают смесь альдегидов и анализируют ее. Это простейший случай, пригоден лишь для некоторых аминокислот.

-Переводят аминоксилоты в летучие эфиры (алкильные эфиры, метильные эфиры оксикислот, метиловые эфиры хлорзамещенных кислот и др.).

Выбор производных зависит от исследуемой смеси аминокислот.

Ионообменная хроматография. В настоящее время аминокислотный состав пищевых продуктов определяется исключительно с помощью автоматической ионообменной хроматографии.

Ионообменная хроматография основана на обратимом стехиометрическом обмене ионов, находящихся в растворе, на ионы, входящие в состав ионообменника (катионита, анионита) и на различной способности разделяемых ионов к ионному обмену с фиксированными ионами сорбента, образующимися в результате диссоциации ионогенных групп. Для органических ионов на электростатическое взаимодействие с фиксированными зарядами ионита накладывается гидрофобное взаимодействие органической части иона с матрицей ионита. Чтобы уменьшить его вклад в удерживание органических ионов и добиться оптимальной селективности их разделения, к водному элюенту добавляют органический компонент (1–25% метанола, изопропанола, ацетонитрила).

В методе Мура и Штейна используют короткую и длинную колонки, заполненные смолой из сульфонированного полистирола в Na + – форме. Когда кислотный гидролизат при рН = 2 наносят на колонку, аминокислоты связываются в результате катионного обмена с ионами натрия. Далее колонку элюируют раствором цитрата натрия при заранее запрограммированных значениях рН и температуры. Короткую колонку элюируют одним буфером, длинную – двумя. Элюат обрабатывают нингидрином, измеряя интенсивность окраски с помощью проточного колориметра. Данные автоматически регистрируются на ленте самописца и могут передаваться в компьютер для вычисления площади под пиком.

Высоковольтный электрофорез на инертных носителях. В биохимии широкое применение нашло разделение аминокислот, полипептидов и других амфолитов (молекул, суммарный заряд которых зависит от рН среды) под действием наложенного постоянного электрического поля. Это метод высоковольтного электрофореза на инертных носителях. При разделении аминокислот в качестве инертных носителей чаще всего используют полоски бумаги или тонкие слои целлюлозного порошка. Разделение проводят в течение 0,5–2 ч при напряжении 2000–5000 В в зависимости от суммарных зарядов амфолитов и их молекулярных масс. Среди молекул, несущих одинаковый заряд, более легкие мигрируют быстрее. Но более важным параметром при разделении является суммарный заряд. Метод применяется для разделения аминокислот, низкомолекулярных пептидов, некоторых белков, нуклеотидов. Образец помещают на носитель, смачивают буфером при соответствующем рН и соединяют с буферным резервуаром полоской фильтровальной бумаги. Бумагу прикрывают стеклянной пластинкой или погружают в углеводородный растворитель для охлаждения. В электрическом поле молекулы, несущие при данном рН отрицательный заряд, мигрируют к аноду, а те, которые несут положительный заряд, – к катоду. Далее высушенную электрофореграмму «проявляют» нингидрином (при работе с аминокислотами, пептидами) или измеряют поглощение в УФ-свете (при работе с нуклеотидами).

Выбор рН определяется значениями рК диссоциирующих групп, входящих в состав молекул смеси. При рН 6,4 глутамат и аспарат несут заряд –1 и движутся к аноду; разделение их осуществляется благодаря различию в молекулярной массе. Лизин, аргинин и гистидин движутся в противоположном направлении, а все другие аминокислоты, входящие в состав белка, остаются вблизи места нанесения. При разделении пептидов, образовавшихся в результате ферментативного расщепления, уменьшение рН до 3,5 приводит к увеличению заряда катионных групп и обеспечивает лучшее разделение.

Аминокислоты несут по крайней мере две слабо ионизированные группы: -СООН и -NH3 + . В растворе эти группы находятся в двух формах, заряженной и незаряженной, между которыми поддерживается протонное равновесие: R-COOH « R-COO – + H + R-NH3 + « R-NH2 + H + (сопряженные кислоты и основания) R-COOH и R-NH3 + – слабые кислоты, но первая на несколько порядков сильнее. Поэтому чаще всего (плазма крови, межклеточная жидкость рН 7,1–7,4) карбоксильные группы находятся в виде карбоксилатных ионов, аминогруппы протонированы. Аминокилоты в молекулярном (недиссоциированном) виде не существуют ни при каких рН. Примерные значения рК a-аминокислоты и a-аминогруппы в a-аминокислоте равны 2 и 10 соответственно. Полный (суммарный) заряд (алгебраическая сумма всех положительных и отрицательных зарядов) аминокислоты зависит от рН, т.е. от концентрации протонов в растворе. Заряд аминокислоты можно изменить, варьируя рН. Это облегчает физическое разделение аминокислот, пептидов и белков. Значение рН при котором суммарный заряд аминокислоты равен нулю и поэтому она не перемещается в постоянном электрическом поле, называется изоэлектрической точкой (pI). Изоэлектрическая точка находится посредине между ближайшими значениями рК диссоциирующих групп.

Методы бумажной, тонкослойной хроматографии, микробиологические, газохроматографические и ряд других, в настоящее время практически не используются вследствие худшей воспроизводимости и большой длительности. Современные хроматографы позволяют определять аминокислотный состав смеси, содержащей лишь 10 –7 –10 –9 моль каждого компонента с воспроизводимостью до 5% за 2–4 часа.

Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого белка или пептида и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Поскольку при нейтральных рН пептидные связи стабильны, применяют кислотный или щелочной катализ. Ферментативный катализ для полного гидролиза менее пригоден. Полный гидролиз белка на составляющие аминокислоты неизбежно сопровождается частичной потерей некоторых аминокислотных остатков. Для гидролиза обычно используется 6 н. водный раствор соляной кислоты (110ºС), в вакуумированной ампуле. Количественное определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких анализаторов смесь аминокислот разделяют на сульфокатионитах, а детектирование осуществляют спектрофотометрически по реакции с нингидрином или флуориметрически с о-фталевым диальдегидом.

Однако данные по аминокислотному составу однотипных продуктов, полученные в разных лабораториях по отдельным аминокислотам, иногда различаются до 50%.

Эти различия обусловлены не только сортовыми, видовыми или технологическими различиями, а главным образом условием проведения гидролиза пищевого продукта. При стандартном кислотном гидролизе (6 н. HСl, 110–120ºС, 22–24 часа) происходит частичное разрушение некоторых аминокислот, в том числе треонина, серина (на 10–15% и тем больше, чем дольше проводится гидролиз) и особенно метионина (30–60%) и цистина 56–60%, а также практически полное разрушение триптофана и цистеина. Этот процесс усиливается в присутствии больших количеств углеводов в продукте. Для количественного определения метионина и цистина рекомендуется проводить предварительное их окисление надмуравьиной кислотой. При этом цистин превращается в цистеиновую кислоту, а метионин в метионин-сульфон, которые весьма устойчивы при последующем кислотном гидролизе.

Цистин Цистеиновая кислота

Трудной задачей в аминокислотном анализе является определение триптофана. Как уже говорилось, при кислотном гидролизе происходит почти полное его разрушение (до 90%). Поэтому для определения триптофана проводят один из вариантов щелочного гидролиза 2 н. NaOH, 100ºС, 16–18 часов в присутствии 5% хлорида олова или 2 н. гидроокиси бария, при которых он разрушается незначительно (до 10%). Минимальное разрушение происходит в присутствии тиогликолевой кислоты и предварительно гидролизованного крахмала. (При щелочном гидролизе происходит разрушение серина, треонина, аргинина и цистеина). Гидролизат после нейтрализации смесью лимонной и соляной кислот немедленно (во избежание студнеобразования) анализируют на аминокислотном анализаторе. Что касается многочисленных химических методов определения триптофана, то они, как правило, в пищевых продуктах плохо воспроизводимы и поэтому их использовать не рекомендуется.

Для мясных продуктов дополнительной необходимой аминокислотой является оксипролин, который характеризует количество соединительных тканных белков в мясе. Его можно определять ионообменной хроматографией с помощью автоматических анализаторов или химическим колориметрическим методом. Метод основан на нейтрализации кислотного гидролизата до рН 6,0, последующем окислении оксипролина с помощью 1,4% раствора хлорамина Т (или хлорамина Б) в смеси пропилового спирта и буфера, колориметрическом определении при 533 нм продуктов окисления оксипролина после реакции с 10%-ным раствором пара-диметиламинобензальдегида в смеси хлорной кислоты и пропилового спирта (1:2).

В связи с тем, что тирозин, фенилаланин и пролин в присутствии кислорода могут частично окисляться, стандартный кислотный гидролиз рекомендуется проводить в атмосфере азота. Ряд аминокислот, в том числе лейцин, изолейцин и валин, требуют для своего полного выделения из белков более длительного кислотного гидролиза – до 72 ч. В биохимии при анализе белков гидролизуют параллельные пробы в течение 24, 48, 72 и 96 ч.

Для точного количественного определения всех аминокислот требуется проводить 5 различных гидролизов, что весьма удлиняет определение. Обычно же проводят 1–2 гидролиза (стандартный с соляной кислотой и с предварительным оксилением надмуравьиной кислотой).

Во избежание потерь аминокислот удаление избытка кислоты при кислотном гидролизе следует проводить немедленно многократным выпариванием в вакуум-эксикаторе с добавлением дистиллированной воды.

При правильной работе анализатора ионообменные колонки работают без замены смолы довольно долго. Однако, если образцы содержат заметные количества красящих веществ и липидов, то колонка быстро забивается и для восстановления ее разделительных способностей требуется многократная регенерация, иногда с перенабивкой колонки. Поэтому, для продуктов, содержащих более 5% жира, рекомендуется предварительно удалять липиды экстракцией. В таблице 2.3 приведены условия пробоподготовки основных пищевых продуктов при анализе аминокислотного состава.

Таблица 2.3. – Условия подготовки проб пищевых продуктов к анализу

Продукт Способ удаления липидов Весовое соотношение белок: HCl (6М)
Белковые концетнраты (изоляты) Нетребуется 1:200
Мясо, рыба, мясные и рыбные консервы, субпродукты) Экстракция 10-кратным количеством диэтилового эфира 3–4 раза или смесью этанол-хлороформ (1:2) 10-кратным количеством 2 раза 1:250
Молоко и молочные продукты Экстракция 10-кратным к навеске количеством смесью этанол-хлороформ (1:2) 2 раза 1:1000
Зерно и зернопродукты Не требуется 1:1000
Растительные продукты Не требуется 1:500
Мясо-растительные и рыбо-растительные продукты Экстракция 10-кратным количеством диэтилового эфира 3-4 раза; смесью этанол-хлороформ (1:2) 10-кратным количеством к навеске 2 раза 1:1000
Яйцо, яичные продукты Экстракция смесью этанол- хлороформ (1:2), 10-кратным количеством к навеске 2 раза 1:200

Контрольные вопросы:

1. Дайте определение понятию «белки».

2. На какие группы делят белки по их функциям в организме?

3. Какова роль белков в питании человека?

4. Каковы рекомендуемые нормы белка в питании?

5. Каково рекомендуемое соотношение белков растительного и животного происхождения и как белки различного происхождения отличаются по своему аминокислотному составу?

6. Какие незаменимые аминокислоты вы знаете и какие аминокислоты могут стать незаменимыми?

7. Как определяют содержание общего азота в продуктах питания?

8. Как определяют аминокислотный состав белков?

9. Какие методы определения аминокислот вы знаете?

§ 2.4. Углеводы

Углеводы широко представлены в растениях и животных, где они выполняют как структурные, так и метаболические функции. В растениях в процессе фотосинтеза из углекислого газа и воды синтезируется глюкоза, которая далее запасается в виде крахмала или превращается в целлюлозу – структурную основу растений. Животные способны синтезировать ряд углеводов из жиров и белков, но большая часть углеводов поступает с пищей растительного происхождения.

Читайте также:  Экспресс анализ белка в зерне

Дата добавления: 2015-05-29 ; Просмотров: 3522 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник

В конце 50-х-начале 60-х годов было обнаружено, что последовательность аминокислот в белках детерминирована генетически. Последовательность нуклеотидов в ДНК-веществе наследственности определяет комплементарную последовательность нуклеотидов в РНК, а последняя в свою очередь определяет последовательность аминокислот в белке. Более того, синтез всех белков из соответствующих аминокислот имеет единый механизм.

Определение последовательности аминокислот в белках представляет интерес по четырем причинам. Во-первых, такие данные имеют большое значение для выяснения молекулярной основы биологической активности белка. Сведения о последовательности аминокислот приобретают особую ценность при их сопоставлении с другими химическими и физическими характеристиками. Во-вторых, изучение последовательности аминокислот в сочетании с детальным анализом пространственной структуры необходимо для выяснения тех принципов, на основе которых из полипептидных цепей формируются высокоспецифичные трехмерные формы. При этом последовательность аминокислот в белке служит связующим звеном между генетической информацией, заложенной в ДНК, и трехмерной структурой белка, лежащей в основе его биологической активности. В-третьих, изменения в последовательности аминокислот могут привести к нарушению нормальной функции белка, а следовательно, и к соответствующей болезни. В частности, такая тяжелая болезнь, как серповидно-клеточная анемия, нередко приводящая к легальному исходу, возникает в результате замены всею лишь одной-единственной аминокислоты в одном-единственном белке. Таким образом, определение последовательности аминокислот относится к новой области медицины -молекулярной патологии. В-четвертых, данные о последовательности аминокислот в белке могут многое рассказать о его эволюции. Дело в том, что в неродственных белках эти последовательности совершенно различны. Белки лишь в том случае имеют сходную последовательность аминокислот, если они происходят от общего белка-предшественника, Следовательно, изучение последовательностей аминокислот в белках позволяет проследить эволюцию на молекулярном уровне.

Рассмотрим, как можно определить последовательность аминокислот в коротком пептиде. Допустим, что пептид состоит из 6 аминокислотных остатков, расположенных в следующей последовательности:

(Для обозначения аминокислот использованы общепринятые сокращения). Прежде всего необходимо определить аминокислотный состав пептида. Для этого его гидролизуют до составляющих аминокислот нагреванием до 110°С в течение 24 ч в 6 н. НС1. Далее аминокислоты полученного гидролиза разделяют методом ионообменной хроматографии на колонке с сульфонированным полистиролом. Фракционированные аминокислоты определяют по окраске, образующейся при нагревании с нингидрином: б-аминокислоты дают с нигидрином интенсивное синее окрашивание, а иминокислоты, например пролин, желтое[5].

Рис. 17 нингидрин и флуорескамин

Метод ионообменной хроматографии обладает высокой чувствительностью:

рН 3,25 0,2 м Цитрат натрия

рН 4,25 0(2 м Цитрат натрия

рН 5,28 0,35 м Цитрат натрия

Рис.18 Элюция из колонки

С его помощью можно определить даже один микрограмм аминокислоты, т.е. примерно столько, сколько содержится в одном отпечатке пальца. Количество аминокислоты пропорционально оптической плотности раствора после нагревания с нингидринйм. Если требуется определить еще меньшие количества аминокислоты- порядка нескольких нанограммов, то используют флуорескамин, который реагирует с б-аминогруппой, образуя сильно флуоресцирующее соединение. О природе аминокислоты судят по объему элюции, т.е. по объему буфера, использованному для вымывания данной аминокислоты с колонки (рис. ). Сравнение результатов хроматографии гидролизата со стандартной смесью аминокислот свидетельствует о том, что исследуемый пептид имеет следующий аминокислотный состав:

Скобки показывают, что речь идет о составе, а не последовательности аминокислот в пептиде.

Рис.19 Определение N-концевого остатка пептида. Пептид метят фтординитробензолом (реактив Сэнгера) и затем гидролизуют. ДНФ-производное аминокислоты (в приведенном примере ДНФ-аланин) идентифицируют по хроматографиче-ским характеристикам.

Для определения в белке или пептиде концевого остатка, несущего аминогруппу, его метят с помощью соединения, образующего стабильную ковалентную связь с азотом аминогруппы (рис. 20).

Рис. 20 фтординитробензол и дансилхлорид

Впервые для этой цели Сэнгер использовал фтординитробензол (ФДНБ), реагирующий с незаряженной a-NH2-группой с образованием динитрофенильного (ДНФ) производного пептида желтого цвета. Связь между ДНФ и концевой аминогруппой стабильна в условиях, используемых для гидролиза пептидных связей. Поэтому при гидролизе ДНФ-производного пептида Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly в 6 н. НСl высвобождается ДНФ-аминокислота, которую можно идентифицировать хроматографически как ДНФ-аланин.

Для идентификации N-концевых аминокислот в настоящее время часто используют дансилхлорид, который при взаимодействии с аминогруппой дает стабильное, интенсивно флуоресцирующее сульфамидное производное. Этот метод позволяет выявить N-концевую аминокислоту (после кислотного гидролиза пептидных

связей), присутствующую в таком незначительном количестве, как несколько нанограммов.

При всех достоинствах методов определения N-концевых аминокислотных остатков с помощью ДНФ или лансилхлорида их, к сожалению, нельзя использовать дважды применительно к одному и тому же пептиду, поскольку последний полностью распадается при кислотном гидролизе. Пьеру Эдману (P. Edman) удалось разработать метод маркирования N-концевого остатка и отщепления его от пептида без сопутствующего расщепления остальных пептидных связей. Деградация по Эдману (реакция Эдмана) состоит в ступенчатом (по одному) отщеплении аминокислотных остатков с аминоконца пептида, Фенилизотиоциа-нат реагирует с незаряженной концевой аминогруппой пептида с образованием фенилтиокарбамоильного производного

Далее в слабокислой среде происходит отщепление циклического производного N- концевой аминокислоты, а оставшийся неразрушенным пептид оказывается укороченным на один аминокислотный остаток, Указанное циклическое производное представляет собой фенилтиогидантоинаминокислоту (ФТГ-аминокислоту). Его идентифицируют методом хроматографии. Далее аминокислотный состав укороченного пептида (Arg, Asp, Gly2, Phe) сравнивают с исходным: (Ala, Arg, Asp, Gly2, Phe).

Рис 22. Деградация по Эдману.

От пептидной цепи отщепляют меченый N-концевой остаток аминокислоты (ФТГ-аланин на первой ступени деградации). Остаток пептидной цепи при этом не гидролизуется. На второй ступени деградации определяют следующий N-концевой аминокислотный остаток. Еще три ступени деградации но Эдману позволят установить всю последовательность аминокислот во взятом пептиде.

Оказывается, что различие состоит в одном остатке аланина. Следовательно, в исходном пептиде аланин занимает N-концевое положение. Деградацию по Эдману можно вновь повторить па укороченном пептиде. Исходя из аминокислотного состава после второй ступени деградации

Можно поийти к выводу, что вторым остатком с N-конца является глицин, это заключение подтверждают путем хроматографической идентификации ФТГ-глицина, полученного на второй ступени деградации пептида. Еще три ступени деградации по Эдману позволяют полностью раскрыть последовательность аминокислот во взятом пептиде.

Стратегию анализа последовательности аминокислот в белках можно определить как «разделяй и властвуй». Белок подвергают специфическому расщеплению па более короткие пептиды, последовательность аминокислот в которых определяют по Эдману. Специфическое расщепление можно производить химическими или ферментативным методами. Так, Б. Уиткоп (В. Witkop) и Э. Гросс (Е. Gross) обнаружили, что бромистый циан (CNBr) расщепляет полипептидную цепь только по пептидной связи, образованной карбоксильной группой остатка метионина, Если в белке содержится 10 метиониновых остатков, то после обработки бромистым цианом обычно получается 11 пептидов. Высокоспецифическое расщепление достигается также с помощью трипсина-протеолитического фермента поджелудочной железы.

Трипсин расщепляет полипептидные цепи по пептидной связи, образованной карбоксильной группой остатков аргинина и лизина. В результате белок, содержащий 9 остатков лизина и 7 остатков аргинина, после расщепления трипсином распадается на 17 пептидов. Каждый из этих пептидов, кроме пептида, расположенною на карбоксильном конце белка, будет кончаться аргинином или лизином.

Пептиды, полученные при специфическом химическом или ферментативном расщеплении белка, разделяют методами хроматографии. Далее последовательность аминокислот в каждом из пептидов определяют методом Эдмана. Таким образом, достигается этап, когда последовательность аминокислот в отдельных пептидах (фрагментах белка) известна, но остается невыясненной последовательность самих пептидов. Последнюю устанавливают с помощью так называемых перекрывающихся пептидов. При этом используют уже не трипсин, а какой-либо фермент, расщепляющий полипептидную цепь в других участках, например химотрипсин, который расщепляет пептидные связи главным образом по карбоксильным группам ароматических и других больших неполярных аминокислотных остатков

Рис. 23 Бромистый циан расщепляет полипептиды по карбоксильной группе метиониновых остатков.

Пептиды, образующиеся под действием химотрипсина, неизбежно перекрывают два или более триптических пептида, что используется для установления их последовательности. Таким путем полностью определяют последовательность аминокислот в белке.

Описанные методы применимы к белкам, состоящим из одной полипептидной цепи, не имеющей дисульфидных связей. В тех же случаях, когда в белке имеются дисульфидные связи или более одной полипептидной цепи, то необходимы дополнительные методические приемы, Например, если белок содержит две или более полипептидные цепи, соединенные нековалентными связями, то, воздействуя денатурирующими агентами, такими, как мочевина или гуанидингидрохлорид, вызывают диссоциацию цепей. Диссоциированные цепи разделяют и только после этого приступают к определению последовательности аминокислот в каждой из них. Если же полипептидные цепи соединены ковалентными дисульфидными связями, как это имеет место в инсулине, то их окисляют надмуравьиной кислотой; при этом дисульфидные связи разрываются и образуются остатки цистеиновой кислоты.

Анализ структуры белков удалось значительно ускорить путем создания секвенатора-специального прибора для автоматического определения последовательности аминокислот. При таком определении белок в виде тонкой пленки помещают во вращающийся цилиндрический сосуд, где он подвергается деградации по Эдману. Реактивы и растворители проходят над иммобилизованной белковой пленкой, а высвобождающиеся ФТГ-аминокислоты подвергаются жидкостной хроматографии при высоком давлении и таким образом идентифицируются. Один цикл деградации по Эдману занимает при этом менее двух часов. С помощью секвенатора можно определить аминокислотную последовательность полипептида или белка, содержащего до ста аминокислотных остатков.

источник

Деградация по Эдмону

К раствору белка добавляют реактив Эдмона, содержащий фенилизотиоцианат.

Фенилизотиоцианат взаимодействует с альфа-аминогруппой первой (N-концевой) аминокислоты, а затем происходит ее отщепление от полипептидной цепи путем гидролиза:

После этого идентифицируют первую аминокислоту. Затем процесс повторяется.

В настоящее время процесс автоматизирован.

Секвенирование ДНК

Первичная структура любой белковой молекулы напрямую зависит от структуры ДНК-генома. Поэтому сначала выделяют ген, в котором закодирована структура белка. Далее определяют последовательность азотистых оснований в ДНК. Каждая аминокислота в белковой молекуле закодирована сочетанием трех азотистых оснований — триплетом (кодоном) в молекуле ДНК. Например, сочетание трех оснований аденина (ААА) кодирует аминокислоту фенилаланин, а последовательность из трех оснований цитозина – глицин. Это дает возможность получить информацию о первичной структуре белковой молекуле, а, значит, прогнозировать строение всей молекулы в целом, поскольку именно первичная структура определяет строение всех высших уровней организации – и вторичной, и третичной, а, иногда и четвертичной структур.

Для проверки предположений о строении высших структур используется еще один метод:

Рентгеноструктурный анализ

Схема, поясняющая принцип этого метода, представлена на рисунке:

В результате облучения на фотопленке фиксируется карта электронной плотности (похожа на географическую карту). Далее производится компьютерный анализ полученного изображения, в результате чего строится пространственная модель белковой молекулы.

Электронная микроскопия

Может быть использована для выяснения структуры белковых молекул с большой молекулярной массой – от 500.000 до 1.000.000 Да (дальтон). Дальтон (Да) и килодальтон (кДа)– единицы измерения массы белков. 1кДа=10 3 Да. 1 дальтон равен 1/16 массы атома кислорода (кислородная единица массы).

КОНФИГУРАЦИЯ И КОНФОРМАЦИЯ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ

Из всего сказанного можно заключить, что пространственная организация белков очень сложна. В химии существует понятие — пространственная КОНФИГУРАЦИЯ — жестко закрепленное ковалентными связями пространственное взаимное расположение частей молекулы (например: принадлежность к L-ряду стереоизомеров или к D-ряду).

Для белков также используется понятие КОНФОРМАЦИЯ белковой молекулы — определенное, но не застывшее, не неизменное взаимное расположение частей молекулы. Так как конформация белковой молекулы формируется при участии слабых типов связей, то она является подвижной (способной к изменениям), и белок может изменять свою структуру. В зависимости от условий внешней среды молекула может существовать в разных конформационных состояниях, которые легко переходят друг в друга. Энергетически выгодными для реальных условий являются только одно или несколько конформационных состояний, между которыми существует равновесие. Переходы из одного конформационного состояния в другое обеспечивают функционирование белковой молекулы. Это обратимые конформационные изменения (встречаются в организме, например, при проведении нервного импульса, при переносе кислорода гемоглобином). При изменении конформации часть слабых связей разрушается, и образуются новые связи слабого типа.

Взаимодействие белка с каким-нибудь веществом иногда приводит к связыванию молекулы этого вещества молекулой белка. Этот явление известно как «сорбция» (связывание). Обратный же процесс — освобождение другой молекулы от белковой называется «десорбция».

Если для какой-нибудь пары молекул процесс сорбции преобладает над десорбцией, то это уже специфическая сорбция, а вещество, которое сорбируется, называется «лиганд».

1) Лиганд белка-фермента – субстрат.

2) Лиганд траспортного белка – транспортируемое вещество.

3) Лиганд антитела (иммуноглобулина) – антиген.

4) Лиганд рецептора гормона или нейромедиатора – гормон или нейромедиатор.

Белок может изменять свою конформацию не только при взаимодействии с лигандом, но и в результате любого химического взаимодействия. Примером такого взаимодействия может служить присоединение остатка фосфорной кислоты.

В природных условиях белки имеют несколько термодинамически выгодных конформационных состояний. Это нативные состояния (природные). Natura (лат.) – природа.

НАТИВНОСТЬ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ

НАТИВНОСТЬ — это уникальный комплекс физических, физико-химических, химических и биологических свойств белковой молекулы, который принадлежит ей, когда молекула белка находится в естественном, природном (нативном) состоянии.

Например: белок хрусталика глаза — кристаллин — обладает высокой прозрачностью только в нативном состоянии).

ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКА

Для обозначения процесса, при котором нативные свойства белка теряются, используют термин ДЕНАТУРАЦИЯ.

ДЕНАТУРАЦИЯ — это лишение белка его природных, нативных свойств, сопровождающееся разрушением четвертичной (если она была), третичной, а иногда и вторичной структуры белковой молекулы, которое возникает при разрушении дисульфидных и слабых типов связей, участвующих в образовании этих структур. Первичная структура при этом сохраняется, потому что она сформирована прочными ковалентными связями. Разрушение первичной структуры может произойти только в результате гидролиза белковой молекулы длительным кипячением в растворе кислоты или щелочи.

Дата добавления: 2018-11-24 ; просмотров: 571 ; ЗАКАЗАТЬ РАБОТУ

источник

Первичная структура белков. Гидролиз белков, определение аминокислотного состава. Анализ N- и С-концевых аминокислот.

Синтез белка происходит на рибосомах в виде первичной структуры, т.е. расположенных в определенном количестве и определенной последовательности аминокислот, соединенных пептидными связями, образованными карбоксильной и α-аминогруппами соседних аминокислотных остатков Пептидная связь — жесткая, ковалентная, генетически детерминированная.В структурных формулах изображается в виде одинарной связи: ,однако на самом деле эта связь между углеродом и азотом носит характер частично двойной связи:

Вокруг нее вращение невозможно и все четыре атома лежат в одной плоскости, т.е. компланарны. Вращение же других связей вокруг полипептидного остова достаточно свободно.

Читайте также:  Если в анализах нет белка

Первичная структура открыта в 1898 году профессором казанского университета Данилевским. В 1913 году Эмилем Фишером были синтезированы первые пептиды.

Такая последовательность аминокислот является уникальной для каждого белка и закреплена генетически. При нарушении процесса синтеза первичной структуры белка на рибосоме могут развиваться различные гететические заболевания. Например, при нарушении двух аминокислот в гемоглобине развивается серповидноклеточная анемия.

Для изучения аминокислотного состава белков пользуются сочетанием (или одним из них) кислотного (НСl), щелочного (Ва(ОН)2) и реже ферментативного гидролиза. Установлено, что при гидролизе чистого белка, не содержащею примесей, освобождается 20 различных а-аминокислот. Все другие открытые в тканях животных, растений и микроорганизмов аминокислоты (более 300) существуют в природе в свободном состоянии или в виде коротких пептидов или комплексов с другими органическими веществами.

α-аминокислоты представляют собой производные карбоновых кислот, у которых один водородный атом, у α -углерода, замещен на аминогруппу (-NH2), например: следует подчеркнуть, что все аминокислоты, входящие в состав природных белков являются а-аминокислотами, хотя аминогруппа в свободных аминикарбоновых кислотах может находиться, как увидим ниже, в β, γ, δ, ε -положениях.

9. Вторичная структура белков — α-спирали и β-структуры. Строение и функциональная роль доменов.

Вторичная структура — это пространственное расположение полипептидной цепочки в виде α-спирали или β-складчатости безотносительно к типам боковых радикалов и их конформации. Она стабилизирована водородными связями, которые замыкаются между пептидными, амидными (-N-H) и карбонидными (-C=O) группами, т.е. входят в пептидную единицу, и дисульфидными мостиками между остатками цистеина

Полинг и Кори предложили модель вторичной структуры белка в виде левозакрученной α-спирали, в которой водородные связи замыкаются между каждой первой и четвертой аминокислотой, что позволяет сохранять нативную структуру белка, осуществление им простейших функций, защищать от разрушения. На один виток спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка, шаг спирали составляет 0,54 нм. В образовании водородных связей принимают участие все пептидные группы, что обеспечивает максимальную стабильность, снижает гидрофильность и увеличивает гидрофобность белковой молекулы. Альфа-спираль образуется самопроизвольно и является наиболее устойчивой конформацией, отвечающей минимуму свободной энергии

Полинг и Кори предложили и другую упорядоченную структуру — складчатый β-слой. В отличие от конденсированной α-спирали β- слои почти полностью вытянуты и могут располагаться как параллельно , так и антипараллельно

В стабилизации данных структур также принимают участие дисульфидные мостики и водородные связи.

Супервторичная структура — это более высокий уровень организации белковой молекулы, представленный ансамблем взаимодействующих между собой вторичных структур: α-спираль — два антипараллельных участка, взаимодействуют гидрофобными комплементарными поверхностями (по принципу впадина-выступ) αсα, сверхспирализация α-спирали, (βхβ)-элементы в глобулярных белках, представленные двумя параллельными β-цепями, связанные сегментом х, βαβαβ-элементы, представленные двумя сегментами α-спирали, вставленными между тремя параллельными β-цепями.

источник

Можно выделить следующие этапы выяснения первичной структуры белков и пептидов:

1. Выделение белка в чистом виде и определение его молекулярной массы

2. Определение аминокислотного состава

3. Определение N-концевой аминокислоты

4. Определение С-концевой аминокислоты

5. Определение аминокислотной последовательности

Выделение белка в чистом виде. Как правило, исходный материал содержит много различных белков. В связи с этим возникает проблема выделения из этой смеси интересующего белка в чистом виде. При очистке белков используются методы, которые основаны на разнице:

1.Поверхностного заряда белков

2.Молекулярного размера белков (зависящего от их молекулярной массы)

3.Биологической активности вследствие связывания с субстратами или ингибиторами

Разделение белков по разнице величины поверхностного заряда. Суммарный поверхностный электрический заряд белка при данном значении рН может быть отрицательным, нейтральным или положительным. Для разделения белков с различным зарядом, подобно тому, как это было в случае аминокислот, может быть использован метод ионообменной хроматографии (см. выше). Концентрацию белка в пробирках с элюатом определяют с помощью спектрофотометра по интенсивности поглощения ультрафиолетового света и строят графическую зависимость её от объема вытекшей из хроматографической колонки жидкости.

Разделение белков по молекулярной массе. Если представить молекулы белков в виде шариков различной величины, размер которых зависит от их молекулярной массы, то окажется, что у больших шариков будет большей молекулярная масса или размер молекул. Это означает, что белки можно разделить подобно частичкам в сите — молекулярном сите, образованном гелем. Такой способ часто называют гель-фильтрацией или хроматографией исключения размером. Ниже приводится иллюстрация того, как с помощью гель-фильтрации удается разделить смесь белков различного размера (рис.1.12).

Хроматографическую колонку заполняют набухшим гелем. Частицы геля приготовлены из связанного поперечными сшивками полисахаридного материала и содержат большое количество микропор. Размер микропор подбирают таким образом, чтобы в них проникали меньшие из разделяемых молекул, в то время как большие этого сделать не могли. Смесь разделяемых белков наносят на верхнюю часть колонки и элюируют буферным раствором. Увлекаемые током нисходящей жидкости большие молекулы, не имея возможности проникнуть в поры гелевых частиц, будут двигаться быстрее. Меньшие молекулы проникают в поры и задерживаются там. Если собирать вытекающий из колонки раствор равными порциями в пробирки, то окажется, что в более ранних порциях вытекающей жидкости будут содержаться белки больших размеров, а в более поздних — меньших размеров. Путем подбора размера пор можно добиться разделения самых разных смесей белков.

Рис.1.12. Схематическое изображение разделения белков методом гель-фильтрации

Если учесть, что размер молекулы зависит от молекулярной массы, то оказывается, что разделяя белки методом гель-фильтрации, одновременно можно установить его молекулярную массу.

Рис.1.13. График зависимости молекулярной массы белков от объема выхода их из хроматографической колонки в ходе гель-фильтрации

Объем вытекающего из колонки элюата обратнопропорционален логарифму молекулярной массы белка. Таким образом, достаточно знать объем жидкости, в котором вышел из колонки интересующий белок, чтобы, пользуясь подобным графиком, можно было установить его молекулярную массу (рис.1.13).

Ещё одним методом, который позволяет разделить белки в зависимости от их молекулярной массы, является гель-электрофорез (см. выше).

Ультрацентрифугирование. Если встряхнуть сосуд, заполненный песком с водой, а затем поставить его на ровную поверхность, то песок быстро осядет на дно благодаря силе земного притяжения. С высокомолекулярными веществами, находящимися в растворе, этого не произойдет, так как тепловое (броуновское) движение сохраняет их равномерное распределение в растворе. Оседание макромолекул, подобно песчинкам, произойдет, только если их подвергнуть значительному ускорению.

В 1923 году шведский биохимик Т. Сведберг впервые использовал ультрацентрифугирование. При скорости вращения ротора 80000 об/мин ему удалось показать, что многие белки состоят из субъединиц. Позже ультрацентрифугирование стало незаменимым методом для разделения белков, нуклеиновых кислот и субклеточных частиц.

Рис.1.14. Схематическое изображение зонального ультрацентрифугирования.

Образец наслаивают на градиент сахарозы (слева). После центрифугирования (середина) каждая частица осаждается на уровне, зависящем от его массы. После остановки ротора центрифужную пробирку прокалывают и разделенные частицы (зоны) собирают в пробирки (справа).

Осаждение проводят в растворе химически инертного вещества (сахарозы или CsCl), концентрация которого и, следовательно, плотность увеличивается в направлении от поверхности до дна центрифужной пробирки. Использование таких градиентов плотности значительно усиливает разрешающую способность ультрацентрифуги. Различают зональное препаративное ультрацентрифугирование (рис.1.14) и ультрацентрифугирование в равновесном градиенте плотности (изократное ультрацентрифугирование) (рис.1.15).

Разделение белков по разнице биологической активности вследствие связывания с лигандами. Характерной особенностью белков является их способность прочно связываться с различными молекулами, но нековалентными связями. На этом основан метод разделения белков аффинной хроматографией (рис.1.16).

Рис.1.16. Схематическое изображение принципа иммуноаффинной хроматографии

Антиген — лиганд для выделяемого белка. Антитело — выделяемый белок.

Молекулы веществ, с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного матрикса. Тогда они выполняют роль своеобразных «рыболовных крючков», задерживающих необходимый белок. Все остальные белки транзитом проходят через колонку. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии такие же молекулы, которые выполняли роль «рыболовных крючков», или с помощью какого-нибудь другого реактива, способного нарушить это взаимодействие. Одним из вариантов этого метода является иммуноаффинная хроматография. Тогда антитела к определенному белку присоединяют к частицам сорбента. Они обеспечивают с очень высокой специфичностью задержку в колонке этого белка (рис.1.16).

Определение аминокислотного состава белка.До определения аминокислотной последовательности выделенного белка желательно иметь представление о его аминокислотном составе, то есть знать, какие аминокислоты и в каком количестве входят в состав его молекулы. Для этого проводят полный гидролиз белка с последующим количественным анализом высвободившихся аминокислот. Чаще используют кислотный гидролиз. Полипептид растворяют в 6N НCl в отсутствие кислорода, чтобы предотвратить окисление серусодержащих аминокислот. Смесь нагревают до 100-120 0 С и выдерживают при этой температуре в течение 10-100ч. К сожалению при этом способе гидролиза некоторые аминокислоты (Сер, Три, Тир, Глн, Асн) разрушаются.

Аминокислотный состав полипептидного гидролизата определяют с помощью автоматического аминокислотного анализатора. Прибор разделяет аминокислоты посредством ионообменной хроматографии (см. выше). Их идентифицируют по элюционному объему и количественно учитывают по интенсивности флюоресценции после проведения реакции с дансилхлоридом. Современные аминокислотные анализаторы проводят анализ гидролизата белка в течение 1ч с чувствительностью, которая позволяет определить до 1 пикомоля аминокислоты.

Определение N-концевой аминокислоты.Имеется несколько эффективных подходов, с помощью которых можно идентифицировать N-концевую аминокислоту. 1-Диметиламинонафталин-5-сульфонилхлорид (дансил хлорид) взаимодействует с первичными аминами с образованием дансилированного полипептида. Последующее проведение кислотного гидролиза позволяет высвободить из полипептидной цепи N-концевую аминокислоту в виде дансил-аминокислоты, обладающей интенсивной желтой флюоресценцией (рис.1.17).

Рис.1.17. Этапы определения N-концевой аминокислоты методом дансилирования

Благодаря этому дансил-производное аминокислоты можно идентифицировать хроматографически.

Ещё более популярным методом идентификации N-концевой аминокислоты является разрушение по Эдману (Pehr Edman — автор метода). Фенилизотиоцианат (ФИТЦ, реактив Эдмана) взаимодействует с N-концевой аминогруппой белков в слабо щелочной среде (рис.1.18). В результате образуется фенилтиокарбамильный продукт. Его обрабатывают безводной сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота. При этом тиазолиновое производное N-концевой аминокислоты отщепляется, в то время как остальные пептидные связи не подвергаются гидролизу. Тем самым разрушение по Эдману заключается в отщеплении остатка только N-концевой аминокислоты и сохранении оставшейся части полипептидной цепи.

Рис.1.18. Этапы определения N-концевой аминокислоты методом Эдмана

Тиазолиновое производное аминокислоты избирательно экстрагируют органическим растворителем и превращают в более стабильное фенилтиогидантоиновое производное. Последнее можно идентифицировать сравнением с известными стандартами при проведении тонкослойной хроматографии, электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии или газо-жидкостной хроматографии.Наиболее важным преимуществом расщепления по Эдману по сравнению с другими методами определения N-концевой аминокислоты является то, что, проводя повторно с одним и тем же пептидом эту процедуру, каждый раз можно идентифицировать новую N-концевую фенилгидантоин-аминокислоту, выясняя таким образом аминокислотную последовательность.

Идентификация С-концевой аминокислоты. Один из подходов заключается в использовании ферментов — карбоксипептидаз (катализирует отщепление от пептида С-концевой аминокислоты). Карбоксипептидазы, подобно другим ферментам, обладают субстратной специфичностью, то есть они катализируют отщепление определенных аминокислот. Вместе с тем, наличие рядом с С-концевой аминокислотой остатка Про делает невозможной её отщепление под влиянием карбоксипептидазы. В этом случае наиболее надежным считается метод гидразинолиза. Полипептид обрабатывают безводным гидразином при температуре 90 0 С в течение 20-100ч в присутствии ионообменного сорбента (в качестве катализатора). При этом разрушаются все пептидные связи, а из высвобождающихся аминокислот образуются гидразиды. Но С-концевая аминокислота высвобождается как свободная и поэтому её можно идентифицировать хроматографически.

Определение аминокислотной последовательности. Установление концевых аминокислот в исследуемом пептиде позволяет в дальнейшем определить всю его аминокислотную последовательность. Для этого обычно проводят повторное разрушение по Эдману (см. выше) в автоматическом приборе — секвенаторе, который был предложен П. Эдманом и Г. Бэгом. Современный такой прибор определяет 1 аминокислотный остаток в час. Таким способом можно установить последовательность расположения 40-60 остатков аминокислот. Затем накапливаются незавершенные реакции, продукты побочных реакций. Наряду с потерей самого пептида они делают малоинформативной и ненадежной дальнейшую идентификацию аминокислот. Чтобы установить последовательность их расположения в больших полипептидных молекулах, их подвергают расщеплению ферментативным или химическим путем на фрагменты с размерами, достаточными для проведения секвенирования (рис.1.19).

Рис.1.19. Аминокислотную последовательность полипептидной цепи определяют, совмещая перекрывающиеся последовательности фрагментов пептида. В данном случае после расщепления исследуемого пептида трипсином (катализирует разрыв пептидных связей, в образовании которых участвует карбоксильные группы Арг и Лиз), а в другом случае — бромцианом (CNBr) (катализирует разрыв пептидных связей, в образовании которых участвует Мет) были получены два набора пептидных фрагментов. Порядок связывания первых двух фрагментов, образовавшихся в результате действия трипсина, устанавливается на основании того наблюдения, что фрагмент Гли-Ала-Лиз-Лей-Про-Мет (результат расщепления CNBr) имеет последовательность аминокислот на N и С — концах, включающую N и С — концы двух трипсиновых фрагментов. Иными словами, обнаружение накладывающихся участков позволяет установить последовательность расположения пептидных фрагментов, то есть аминокислотную последовательность всего исследуемого пептида.

Исследование последовательности нуклеотидов ДНК — рутинная операция в молекулярной биологии.Этот метод в последнее время вытеснил другие методы исследования первичной структуры белков. Зная последовательность нуклеотидов, можно легко установить последовательность аминокислот (более подробное описание этого метода см. в главе 13).

Метод пептидных карт.Процесс определения аминокислотной последовательности в белке — процедура достаточно длительная. Её можно существенно ускорить в случае выяснения аминокислотной последовательности гомологичного белка[2], если у сравниваемого белка она уже известна. Метод носит название «метод пептидных карт» или «метод отпечатков пальцев». Он включает в себя сочетание хроматографии и электрофореза на бумаге продуктов неполного гидролиза сравниваемых белков. При этом пептидные фрагменты, отличающиеся аминокислотной последовательностью, будут обладать разной подвижностью по сравнению с таковыми у исходного белка (рис.1.21).

Рис.1.21. Сравнение «отпечатков пальцев» (окраска нингидрином) продуктов расщепления трипсином (а) гемоглобина А и (б) гемоглобина S. Пептиды, отличающиеся по подвижности, обведены квадратом. Они включают в себя 98 аминокислот, расположенных на N-конце b-субъединицы гемоглобина. Различие заключается в замене 6-ой аминокислоты (Глю) в составе Hb A на Вал в составе Hb S.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник