Меню Рубрики

Методы качественного и количественного анализа белков

Как при выделении и очистке белков, так и при проведении разнообразных биохимических исследований необходимо количественное определение содержания белка в исследуемой фракции, в выделенном или исследуемом образце. Кроме того, анализ содержания белков в биологических жидкостях (крови) имеет важное биомедицинское значение и используется в диагностических целях.

Количественное определение белка проводится, как правило, с небольшим количеством материала и требует высокочувствительных методов детекции.

Наиболее широко распространены колориметрические и спектрофотометрические методы количественного определения белка.

Основан на образовании биуретового комплекса (имеет фиолетовый цвет) пептидных связей белков с двухвалентными ионами меди. В методе используют т. н. биуретовый реактив, состоящий из KOH, CuSO4 и цитрата натрия (или тартрата натрия). В образовавшемся комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами — электростатическими. Полноценный комплекс образуется лишь с пептидами, состоящими более чем из 4 остатков.

Ход работы. Для построения калибровочного графика из стандартного раствора альбумина готовят растворы белка, содержащие 2, 4, 6, 8 и 10 мг альбумина в 1 мл. В каждую пробирку, содержащую 1 мл раствора белка соответствующего разведения добавляют 4 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Измеряют оптическую плотность раствора на ФЭК при 540 нм в 1 см кювете. Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывают по калибровочному графику.

Ныне мало используется в биохимической лабораторной практике (за исключением медицинских анализов на белок) из-за низкой чувствительности.

К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к посторонним веществам, невысокую погрешность. Простота.

Метод Бенедикта аналогичен биуретовому методу, однако позволяет определять белок в диапазоне концентраций от 0,1 до 2 мг в пробе.

Бенедикта реактив — реактив, представляющий собой водный раствор сернокислой меди, лимоннокислого натрия (или калия) и углекислого натрия.

К 0,2 мл раствора белка добавляют 3,5 мл раствора NаОН и 0,2 мл реактива Бенедикта. Смесь инкубируют 15 мин при комнатной температуре и спектрофотометрируют на длине волны 330 нм. Построение калибровочного графика проводят по стандартному раствору белка.

Более чувствителен. Но и к примесям.

Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Метод характеризуется высокой чувствительностью и позволяет определять содержание белка в диапазоне концентраций от 10 до 100 мкг на пробу.

Для построения калибровочного графика из стандартного раствора альбумина готовят растворы белка, содержащие 10, 20, 40, 60, 80 и 100 мкг альбумина в 1 мл. К 1 мл исследуемого раствора,

содержащего 10 – 100 мкг белка, приливают 2,0 мл рабочего раствора (4), перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем в пробирку с реакционной смесью добавляют 0,2 мл реактива Фолина – Чокальтеу, тщательно перемешивают и через 30 мин определяют оптическую плотность раствора при 750 нм. Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывают по калибровочному графику. Увеличение адсорбции при 750 нм пропорционально концентрации белка. Метод очень чувствителен к наличию в растворе посторонних восстановителей (что затрудняет его использование при определении белка в неочищенных препаратах), чувствительность к белку — 10 — 100 мкг/мл.

Принцип метода. Данный метод аналогичен методу Лоури, характеризуется высокой чувствительностью (10 – 100 мкг белка), позволяет эффективно определять белок в мембранных фракциях.

Ход работы. Для построения калибровочного графика из стандартного раствора альбумина готовят растворы белка, содержащие 10, 20, 40, 60, 80 и 100 мкг альбумина в 1 мл. К 1 мл исследуемого раствора, содержащего от 10 до 100 мкг белка, приливают 1 мл реагента А (Реагент А: 1 часть СТС-реактива смешивают с 1 частью 0,8 моль/л раствора NaOH , после чего в полученную смесь доливают 2 части 5 % раствора додецилсульфата натрия, тщательно перемешивают), перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем в пробирку с реакционной смесью добавляют 0,5 мл реактива В (Реагент В: 1 часть реактива Фолина – Чокальтеу смешивают с 5 частями дистиллированной воды), тщательно перемешивают и через 30 мин определяют оптическую плотность раствора при 670 нм. Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывают по калибровочному графику.

Метод основан на способности ароматических аминокислот (триптофана, тирозина и в меньшей степени фенилаланина) поглощать ультрафиолетовый свет при 280 нм. Поскольку белки отличаются по содержанию ароматических аминокислот, их поглощение ультрафиолетовой области спектра может сильно различаться. Измеряя величину оптической плотности при этой длине волны, определяют количество белка в растворе.

Использование данного метода позволяет проводить определение белка быстро и не требует использования дополнительных реагентов.

Имеются и другие методы определения азота, такие как метод Дюма, нейтронно-активационный. Принцип метода Дюма заключается в разложении органического соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объема азота (N2). В нейтронно-активационном методе атомы азота образца бомбардируются нейтронами в ядерном реакторе с получением изотопа 13 N. Содержание белка рассчитывают по количеству гамма-лучей.

Дата добавления: 2015-11-05 ; просмотров: 2135 | Нарушение авторских прав

источник

Цель занятия. Овладеть некоторыми методами качественного и количественного анализа белков, освоить правила работы с биологическим материалом, научиться производить измерения оптической плотности на фотоэлектроколориметре (ФЭК).

Студент должен
знать: уметь:
-строение и свойства протеиногенных аминокислот; -уровни организации белковой молекулы; -качественные реакции на белки; -методы установления первичной структуры белков; -принцип работы и устройство ФЭК. -писать формулы пептидов заданного состава; -определять количество белка в сыворотке крови биуретовым методом.

Содержание занятия. В ходе занятия студентам предстоит:

-ознакомиться с требованиями кафедры к студентам;

-ознакомиться с правилами работы в биохимической лаборатории;

-ответить на вопросы тест-контроля;

-ответить на вопросы преподавателя и обсудить основные вопросы темы;

— произвести количественное определение содержания белка в сыворотке крови биуретовым методом.

УИРС.Решение ситуационных задач, исследование некоторых особенностей аминокислотного состава яичного, соевого белков и белка соединительной ткани – коллагена.

Методические указания к самоподготовке

При подготовке к занятию повторите раздел из курса биоорганической химии «Структура и свойства аминокислот». Используя лекции и учебник по биохимии, изучите химический состав, строение, уровни организации белковой молекулы, биологические функции белков.

Для успешного усвоения материала и плодотворной работы на лабораторном занятии дома необходимо выполнить следующие задания:

№№ Задание Указания к выполнению задания
1. Сформулируйте, почему будущему врачу необходимо знать структуру, свойства и биологическую роль белков. 1. Вспомните химический состав живых объектов. 2. Опишите функциональное многообразие белков – белки ферменты, белки-рецепторы, транспортные белки, антитела. Приведите примеры белковых гормонов, важнейших сократительных и структурных белков.
2. Изучите уровни организации белковой молекулы. 1. Что такое первичная структура белка (дайте определение)? 2. Напишите структурную формулу трипептида мет-про-илей. 3. Что такое вторичная структура белка, какие ее разновидности вы знаете? Дайте характеристику связи, стабилизирующей вторичную структуру. 4. Нарисуйте схему α–спирали и β–складчатого листа. 5. Что такое супервторичная структура? Какие виды супервторичной структуры вы знаете? 6. Что такое третичная структура? Покажите связи, стабилизирующие третичную структуру. 7. Что такое четвертичная структура? Приведите примеры белков, имеющих четвертичную структуру.
3. Изучите методы исследования первичной структуры белка. 1. Какие методы гидролиза белка Вы знаете? 2. В чем суть хроматографического анализа. Приведите классификацию хроматографических методов. 3. Выпишите методы избирательного гидролиза белков (реагент — тип гидролизуемых связей). 4. Приведите примерную последовательность операций при установлении первичной структуры белка. 5. Продумайте, какое практическое значение для медицины имеют исследование аминокислотного состава и первичной структуры белков.
4. Ознакомьтесь с методами установления вторичной, третичной и четвертичной структуры белка. 1. Перечислите и охарактеризуйте методы, позволяющие изучить вторичную, третичную и четвертичную структуру белка.
5. Изучите, какими методами можно определить количественное содержание белка и аминокислот в биологических объектах. 1. Опишите принцип количественного определения белка по белковому азоту. 2. Сформулируйте принцип количественного определения белка биуретовым методом. 3. Выпишите границы содержания белка в сыворотке крови в физиологичеких условиях и приведите примеры заболеваний, сопровождающихся гипо- и гиперпротеинемией.
6. Вспомните, каков характер зависимости степени поглощения света раствором от интенсивности окраски. 1. Нарисуйте график зависимости степени поглощения от интенсивности окраски. 2. Занесите в тетрадь схему фотоэлектроколориметра, кратко выпишите принцип действия и последовательность операций при работе на этом приборе (из курса биоорганической химии).

Занесите в тетрадь протоколы лабораторных работ, оставляя место для выводов и расчетов.

Графологическая структура

«Качественный анализ – установление структуры белка»

Примеры тестов контроля исходного уровня знаний

Вид 1. Выберите один наиболее правильный ответ:

1.1. Компонент мочи, который не позволяет использовать биуретовый метод для количественного определения белка в моче —

Последнее изменение этой страницы: 2017-01-24; Нарушение авторского права страницы

источник

Присутствие белков в пищевых объектах устанавливается с помощью качественных реакций, которые условно разделяют на две группы: а) цветные реакции; б) реакции осаждения.

Среди первой группы различают универсальные реакции (биуретовая на пептидные связи и нингидриновая на α-аминокислоты) и специфические, обусловленные присутствием в белках остатков определенных аминокислот. Так, ксантопротеиновая реакция свидетельствует о наличии в белках остатков ароматических аминокислот, реакция Паули – гистидина и тирозина, Адамкевича и Вуазене – триптофана, нитропруссидная – цистеина, а реакция Сакагучи – аргинина. По результатам специфических реакций ориентировочно можно судить о пищевой ценности белков.

Во второй группе реакций белки осаждают действием солей, органических растворителей, концентрированных кислот, щелочей, ионов тяжелых металлов, температуры и в изоэлектрической точке. Белки в растворенном состоянии крайне неустойчивы, поэтому при добавлении органических растворителей (спирт, ацетон), концентрированных растворов нейтральных солей щелочных металлов и воздействии физических факторов (нагревание, облучение, ультразвук) гидратная оболочка разрушается и они выпадают в осадок.

Так как белковые вещества сырья (муки, крупы, молока, мяса), включая ферменты, часто являются определяющими в обеспечении качества пищевых изделий, то для изучения физико-химических, биохимических и физиологических свойств этих соединений обязательным условием является получение белков в индивидуальном и, по возможности, неденатурированном состоянии. Белки обычно теряют природные (нативные) свойства (растворимость, гидратацию, ферментативную активность и т.д.), подвергаясь денатурации под влиянием различных факторов.. Длительный контакт со спиртом также приводит к необратимой денатурации белка. Денатурирующее действие различных факторов на белки можно смягчить, если проводить операции выделения их при температуре не выше +4°С.

Методы выделения и очистки белков. Общая схема операций по выделению белков сводится к измельчению биологического материала (гомогенизации), экстрагированию и собственно выделению, то есть очистке и получению белка в индивидуальном состоянии.Разрушение клеточной структуры осуществляется тщательным измельчением материала в гомогенизаторах, мельницах, попеременным замораживанием и оттаиванием, применением ультразвуковых высокочастотных колебаний, пресс-методов с использованием высоких давлений и метода «азотной бомбы». В последнем случае клетки насыщаются азотом под давлением, которое затем сбрасывается и клетки разрушаются. Эффективность гомогенизации зависит не только от способа разрушения клеточных структур, но и от вида анализируемого материала. Животные клетки разрушаются относительно легко, особенно в отсутствие сосудистой и соединительной ткани, тогда как растительные и микробные – из-за присутствия клеточных стенок – трудно. В таком случае применяют методы растирания материала с твердыми веществами (песок, абразивный порошок) или обработку клеточных стенок лизоцимом или ферментными препаратами, содержащими целлюлазу, хитиназу и липазу. Гомогенизацию рекомендуется проводить в холодных комнатах или с использованием льда.

Экстракция белков может быть совмещена с гомогенизацией клеток и тканей либо проведена отдельно, если продукт заранее измельчен.

При изучении физико-химических свойств белков и их превращений в пищевых системах широко используют методы фракционирования и очистки от небелковых соединений. Они основаны на различиях таких свойств белков, как размер молекул, растворимость, заряд и сродство к специфическим химическим группам.

Осаждение белков из раствора под действием солей щелочных и щелочноземельных металлов называют высаливанием. Для высаливания чаще применяется сульфат аммония, под влиянием которого белки, как правило, сохраняют растворимость и ферментативную активность. Главную роль при высаливании играет не природа солей, а валентность ионов, действие которых оценивается по ионной силе (μ):

где С – концентрация каждого вида иона; V – валентность ионов.

В практике выделения и очистки белков используются различные типы хроматографии: адсорбционная, распределительная, ионообменная и хроматография по сродству. Адсорбционнаяхроматография основана на различиях в полярности белков. В колонке вместе с буферным раствором упаковывают адсорбент, на который в небольшом объеме растворителя наносят исследуемый образец. Компоненты разделяемой смеси адсорбируются, затем элюируются с помощью буферного раствора с увеличивающейся концентрацией или полярностью. Фракции белка собирают с помощью автоматического коллектора фракций.

В распределительной хроматографии, в отличие от адсорбционной, в качестве неподвижной фазы выступает водный слой, удерживаемый твердой фазой (силикагель, бумага). Разделяемые вещества многократно распределяются между водным слоем и движущейся фазой растворителя и с разной скоростью перемещаются подлине колонки или бумаге. Распределительную хроматографию на бумаге часто используют для анализа пептидов и аминокислот. Адсорбентом служат нити целлюлозы, а растворителем – смесь органических растворителей, например: бутиловый спирт–уксусная кислота–вода. Хроматограмму проявляют, высушивают и анализируют местонахождение разделяемых компонентов тем или иным способом.

Методом ионообменной хроматографии белки или аминокислоты разделяют на основе различий в общем заряде молекул. Если белок в нейтральной среде (рН 7) имеет положительный заряд, то он связывается на колонке с ионообменником, содержащим фенольные, сульфо- и карбоксильные группы (катионообменник), если отрицательный, то – на колонке с ионообменником, представленным аминами или органическими основаниями (анионообменник). Чаще всего для фракционирования белков используют производные полистирола и целлюлозы:

Хроматография по сродству (аффинная хроматография,) основана на принципе избирательного связывания белков со специфическими веществами (лигандами), прикрепленными к носителю. Лиганд (глюкозу) ковалентно присоединяют к носителю (проводят иммобилизацию) и наносят на колонку исследуемую белковую смесь. Несвязавшиеся белки удаляют соответствующим буфером, а нужный белок элюируют раствором, содержащим лиганд в очень высокой концентрации. При этом присоединенные к колонке остатки глюкозы в молекуле белка замещаются на глюкозу, находящуюся в растворе (рис. 2.20).

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит заключается в пропускании белков через колонку с гелем сефадекса или других типов (агарозных, полистирольных). Применяются также пористые стеклянные шарики и пористый кварц (порасил). Наибольшее распространение получили декстрановые гели (сефадекс), являющиеся продуктом поперечного сшивания полисахаридных цепочек декстрана. Зерна сефадексов разных номеров содержат поры разных размеров, в которые могут проникать белки с определенной молекулярной массой. Низкомолекулярные белки распределяются в растворенном виде как внутри частиц полимера, так и между ними, а высокомолекулярные – только между частицами, поэтому вторые быстрее проходят через колонку и первыми вытекают из нее (рис. 2.21). В итоге белки распределяются по молекулярной массе и могут быть собраны в виде отдельных хроматографических

Читайте также:  Анализ белка у сахарного диабета

Принцип методов электрофоретического разделения заключается в способности молекул пептидов и аминокислот, находясь в заряженной форме в виде катионов (+) или анионов (–), передвигаться в электрическом поле с определенной скоростью. Кроме того, молекулы с близкими зарядами, но разными размерами, отличаются отношением заряда к массе. Все эти различия и обуславливают высокую разрешающую способность электрофоретических методов. Скорость миграции белков в электрическом поле (V) зависит от напряжения электрического поля(ε), заряда белков (z) и сопротивления трения (О-Сопротивление трения определяется размерами, формой белка, значениями рН и концентрацией буфера. Указанные величины связаны между собой соотношением: V = ε · z / f.

Впервые метод электрофореза был разработан Тизелиусом с применением бумаги в качестве носителя и специальных оптических устройств, регистрирующих передвижение границы раздела раствора белка и растворителя по показателям преломления (фронтальный электрофорез). В настоящее время распространены методы зонального электрофореза, предусматривающие использование крахмальных и полиакриламидных гелей (ПААГ). Наиболее распространенным методом фракционирования белков является диск-электрофорез (от англ, discontinuous – прерывистый) в ПААГ, при котором используется пара буферных растворов с различными значениями рН в присутствии ДДС-Na и гели различной пористости (концентрирующие и разделяющие) (Laemmli, 1970). Для обнаружения белков гели обрабатывают красителями: амидовым черным 10В, кумасси синим R-250. Интенсивность окраски, а по ней количественное содержание белковых фракций, определяют сканированием на денситометре.

Для электрофоретического разделения белков и пептидов успешно применяется двумерный электрофорез в ПААГ. В соответствии с этим методом смесь компонентов разделяют сначала в столбиках геля электрофорезом в горизонтальном направлении, затем в гелевых пластинах – в вертикальном (рис. 2.23). При разделении белков, например гороха, этим методом удалось получить более 150 различных компонентов.

Очень высокую разрешающую способность имеет метод изоэлектрического фокусирования белков, в основе которого лежит фронтальный электрофорез, проводимый на колонке одновременно в градиенте рН и напряжения. Колонку предварительно заполняют носителями с синтетическими смесями полиаминополикарбоновых кислот (амфолитами), затем сверху в нее подают раствор сильной кислоты, снизу – сильнощелочной раствор для того, чтобы установить градиент рН с крайними значениями, соответствующими рН кислого и щелочного растворов. Амфолиты прекращают движение по колонке, когда их суммарный заряд становится равным нулю, и тем самым стабилизируют исходный градиент рН. В подготовленную колонку вносят образец исследуемой смеси, компоненты которой распределяются по зонам со значениями рН, характерными их изоэлектрическим точкам.

В химии пищевого белка применяют и другие разновидности ектрофоретическогоразделения(иммуноэлектрофорез, изотахофорез), а также метод пептидных карт и ультрацентрифугирование. Метод пептидных карт (отпечатков пальцев) относится к методам двумерного разделения и наиболее часто используется для анализа пептидов. Пептиды получают избирательным гидролизом белков, затем на бумаге их разделяют в горизонтальном направлении электрофорезом, в вертикальном – распределительной хроматографией. Пептиды окрашивают нингидрином, элюируют и определяют аминокислотный состав.

В методе ультрафильтрации белки в градиенте плотности распределяются на разных уровнях центрифужной пробирки в процессе седиментации (осаждения) в виде отдельных зон. Для создания градиента используют соли тяжелых металлов и растворы сахарозы. Метод широко применяется для определения молекулярных масс белков по константе седиментации (S), которая зависит от массы и формы белковых частиц:

где v – скорость перемещения границы растворитель–белок, см/с; w– угловая скорость ротора, рад/с; г – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка.

Величина S, равная 1 · 10 -13 с, принята за единицу и названа сведбергом (S) в честь Т. Сведберга, впервые сконструировавшего ультрацентрифугу.

Очистка белков от низкомолекулярных соединений (солей, сахаров, аминокислот) осуществляется методами диализа, гель-фильтрации на сефадексе G-25, кристаллизации, ультрафильтрации и с помощью полых волокон. При диализе используют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), через которые белки не диффундируют и остаются внутри диализного мешочка. Более мелкие молекулы проходят через поры диализной мембраны и выходят в диализат. В методе ультрафильтрации, который применяется, например, в производстве сывороточных белков молока, соевых белковых изолятов, по обе стороны мембраны создается разность давлений за счет продавливания фильтруемого белкового раствора. В качестве мембран используются целлюлозные пленки и нецеллюлозные полиэлектролитные комплексы. Аналогично мембранам по принципу молекулярного сита действуют и полые волокна. Белковый раствор помещается с внешней стороны волокон, и создается разность давления за счет повышения его в растворе или понижения внутри их.

Гомогенность белка определяется на последнем этапе выделения и очистки с применением по меньшей мере двух методов, оценивающих то или иное физико-химическое свойство. Наиболее достоверными являются ультрацентрифугирование в градиенте плотности, диск-электрофорез в ПААГ, иммунохимические методы и растворимость. Если белок при электрофорезе представлен только одной полосой и обладает при этом максимальной биологической активностью, то он считается гомогенным. Для гомогенного белка на кривой растворимости (зависимости растворенного белка от общего его количества в постоянном объеме растворителя) имеется только один перегиб, тогда как для гетерогенного – столько, сколько в нем индивидуальных компонентов.

Содержание белка в пищевых объектах обычно определяют по количеству азота с использованием метода Кьельдаля. С целью упрощения и сокращения длительности анализа этот метод с момента его разработки (1983) неоднократно модифицировался с применением различных катализаторов и условий минерализации. На основе модифицированных методов созданы высокопроизводительные автоматические анализаторы типа «Кьельфос», стоимость определения содержания белка на которых и сегодня остается высокой. Существует и некоторая условность в методе Кьельдаля при расчете количества белка, заключающаяся в использовании переводного коэффициента. Однако, несмотря на недостатки, метод Кьельдаля является унифицированным, он включен в ГОСТы на многие пищевые продукты.

Для перевода количества азота в содержание белка используют коэффициент 6,25. Принят он потому, что большинство белков содержит 16% азота (100/6,25 = 16). Однако более правильным является использование коэффициентов, соответствующих фактическому содержанию сырого белка в каждом его виде. Так, для пшеницы получен коэффициент 5,7, так как ее белки содержат 17,5% азота. Для других белковых ресурсов коэффициенты перевода приняты следующими: 5,7 – рожь, ячмень, овес, семена подсолнечника; 5,8 – соя; 6,25 – кукуруза, мясо; 6,38 – молоко.

Имеются и другие методы определения азота, такие как метод Дюма, нейтронно-активационный и с фенолятгипохлоритом на приборе «Техникон». Принцип метода Дюма заключается в разложении органического соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объема азота (N2). В нейтронно-активационном методе атомы азота образца бомбардируются нейтронами в ядерном реакторе с получением изотопа 13 N. Содержание белка рассчитывают по количеству гамма-лучей. Определение азота на приборе «Техникон» осуществляется колориметрическим способом, в котором измеряется интенсивность сине-голубой окраски, образующейся по реакции взаимодействия сульфата аммония, выделяющегося в процессе минерализации образца, с щелочным раствором фенола и гипохлорита. Все описанные здесь методы по точности анализа не уступают методу Кьельдаля, однако они являются достаточно дорогими.

Широкое распространение получил метод инфракрасной спектроскопии, в основе которого лежит поглощение белками света с определенной длиной волны и измерение интенсивности его отражения в приборах-анализаторах. Приборы калибруют по образцам зерна (эталонам) с известным содержанием белка, определяемым по методу Кьельдаля.

Известны методы количественного определения белка, основанные на различной степени помутнения (нефелометрический метод), способности белков адсорбировать красители (кумасси синий R-250, амидочерный и др.) и преломлять лучи света (по показателю преломления). Они характеризуются высокой точностью и простотой определения, хотя имеют ряд ограничений. Наиболее удобными являются методы с кумасси синим, биуретовый и Лоури. В основе биуретового метода лежит биуретовая реакция, в основе метода Лоури – восстановление фосфомолибденовой кислоты тирозином и триптофаном с одновременным протеканием биуретовой реакции. По оптической плотности с использованием калибровочных графиков находят концентрацию белка в растворах.

Дата добавления: 2016-04-11 ; просмотров: 2318 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

источник

Количественное определение белков. Количество белка можно определять:

  • 1) по содержанию в них азота (для этого белковый препарат сначала подвергают минерализации, а затем определяют содержание азоту по реакции Несслера);
  • 2) биуретовый метод — основан на образовании окрашенных в сине-фиолетовый цвет комплексов между ионами меди и пептидными связями белков;
  • 3) метод Лоури, который основан на способности медных комплексов белков, восстанавливать реактив Фолина;
  • 4) метод Бредфорда, который основан на способности белков связывать красители — бромфеноловый синий, кумасси голубой;
  • 5) на кафедре разработан метод определения белков по их взаимодействию с коллоидным раствором высокодисперсного кремнезема.

Качественное определение белков — используются осадочные пробы с органическими кислотами (трихлоруксусная, сульфосалициловая кислоты), цветные реакции на определенные аминокислоты в составе белка (реакция Фоля, ксантопротеиновая реакции и др).

Минеральные вещества относятся к жизненно необходимым компонентам питания, обеспечивающим развитие и нормальное функциональное

состояние организма. По содержанию в пищевых продуктах их принято условно разделять на две группы: в первую включаются так называемые макроэлементы, содержащиеся в сравнительно больших количествах (кальций, фосфор, магний, калий, сера, хлор и др.), во вторую входят микроэлементы, находящиеся в продуктах в малых количествах (железо, кобальт, марганец, йод, фтор, цинк, стронций и др.). Некоторые исследователи выделяют еще группу ультрамикроэлементов, концентрация которых соответствует гамма-процентам (золото, свинец, ртуть, радий и др.).

Можно считать установленным участие минеральных веществ наряду с другими компонентами пищи во всех биохимических процессах, протекающих в организме. Доказанным также является факт, что данные вещества обладают выраженной активностью и могут считаться истинными биоэлементами. При этом, находясь в плазме крови и других жидкостях организма, они имеют большое значение в регуляции основных жизненно важных функций. Это прежде всего связано с их влиянием на состояние коллоидов тканей, определяющих степень дисперсности, гидратации и растворимости внутриклеточных и внеклеточных белков. Вместе с тем достаточно высокое и стабильное содержание некоторых макроэлементов способствует поддержанию на неизменном уровне солевого состава крови и осмотического давления, от чего в значительной мере зависит количество воды, удерживаемой в тканях. Так, ионы натрия усиливают способность тканевых белков связывать воду, а ионы калия и кальция уменьшают. В результате избыток поваренной соли будет в конечном итоге затруднять деятельность сердца и почек и отрицательно сказываться на состоянии соответствующих категорий больных. Весьма важную роль играют минеральные вещества для формирования буферных систем организма и поддержания на должном уровне его кислотно-щелочного состояния. При этом преобладание в пищевых продуктах калия, натрия, магния и кальция обусловливает их щелочную ориентацию, а серы, фосфора и хлора — кислотную. При обычном смешанном питании пищевые рационы нередко отличаются большим содержанием кислых веществ, что может приводить к возникновению ацидоза. Установленным является значение микроэлементов для эндокринного аппарата, активности гормонов и ферментативных процессов. Об этом свидетельствует участие йода в деятельности щитовидной железы, влияние меди и кобальта, действие адреналина, цинка и кадмия — инсулина и т. д. Большую физиологическую роль играют минеральные вещества в пластических процессах, в построении и формировании тканей организма, особенно скелета. В этом отношении общеизвестно значение кальция, фосфора, магния, стронция и фтора, причем недостаточное их поступление, вместе с пищей неизбежно приводит к нарушению роста и обызвествления костей.

О биологической активности минеральных компонентов питания свидетельствует существование биогеохимических провинций, т. е. районов, где количество некоторых микроэлементов в почве резко увеличено или понижено, что отражается на составе произрастающих на ней растений, составе воды, молока и мяса животных. Если люди длительное время проживают в таких районах, то это может повлечь за собой развитие своеобразных патологических состояний, например эндемического зоба или флюороза.

При характеристике отдельных микроэлементов необходимо, прежде всего остановиться на физиологической роли кальция, соединения которого существенно влияют на обмен веществ, рост и деятельность клеток, возбудимость нервной системы я сократимость мышц. Особенно важное значение он имеет в формировании костей скелета в качестве одного из основных структурных компонентов. При этом только при определенном соотношении в крови фосфора и кальция отложение последнего в костной ткани протекает нормально. Если же количество данных элементов не сбалансировано, то наблюдается нарушение процессов окостенения, выражающееся в возникновении рахита у детей, остеопороза и других костных изменений у взрослых. Установлено, что оптимальное их соотношение 1:1,5 — 1:2. Ввиду того что в пищевом рационе это соотношение обычно далеко от оптимального, то для нормализации соответствующих процессов необходима регулирующая роль витамина О, способствующего усвоению кальция и задержке его в организме. Необходимо также отметить, что он является весьма трудно усвояемым макроэлементом из-за чрезвычайно малой растворимости в воде. Только воздействие желчных кислот, сопровождаемое образованием комплексных соединений, позволяет перевести кальций в усвояемое состояние. Весьма большое значение для организма имеет содержание в пище фосфатов, так как органические соединения фосфора представляют подлинные аккумуляторы энергии (аденозинтрифосфат, фосфорилкреатинин). Именно эти соединения используются организмом при сокращении мышц и биохимических процессах, протекающих в мозге, печени, почках и других органах. Вместе с тем фосфорная кислота участвует в построении молекул многочисленных ферментов катализаторов распада пищевых веществ, создающих условия для использования потенциальной их энергии. Наконец, фосфор широко представлен в пластических процессах, особенно протекающих в костной системе животного организма.

При характеристике физиологической роли магния следует указать, что он имеет важное значение для нормализации возбудимости нервной системы, обладает антиспазматическими и сосудорасширяющими свойствами и оказывает влияние на снижение уровня холестерина в крови. Отмечено также, что при его недостатке увеличивается содержание кальция в мышцах и стенках артерий. Имеются данные о том, что соли магния угнетают рост злокачественных новообразований и, таким образом, обладают антибластомогенным действием. Наконец, известно, что он участвует в процессах углеводного, фосфорного и кальциевого обмена, причем его избыток отрицательно сказывается на усвоении последнего. Говоря о макроэлементах, входящих в состав пищевых продуктов, необходимо отметить значение калия, натрия, хлора и серы. Первый из них играет важную роль во внутриклеточном обмене, некоторых ферментативных процессах, образовании ацетилхолина и способствует выведению жидкости из организма. Ионы натрия являются в известной мере физиологическими антагонистами калия, и его соединения (бикарбонаты и фосфаты) принимают непосредственное участие в образовании буферных систем, обеспечивающих кислотно-щелочное состояние и постоянство осмотического давления. Что касается хлора, то он в составе хлорида натрия служит одним из регуляторов водного обмена и используется для синтеза соляной кислоты железами желудка. Наконец, сера представляет важный структурный компонент некоторых аминокислот, витаминов и ферментов, а также входит в состав инсулина. Переходя к краткой биологической характеристике микроэлементов, необходимо подчеркнуть, что их содержание в пищевых продуктах растительного и животного происхождения подвержено большим колебаниям, поскольку оно зависит от геохимических особенностей местности. Одним из наиболее ярких примеров в этом отношении является изменение концентрации в почве йода и фтора, служащее причиной возникновения своеобразных эндемических заболеваний. Интересно отметить, что в настоящее время из элементов, входящих в таблицу Менделеева, более 60 уже обнаружены в составе живых организмов. Однако иногда еще очень трудно сказать, какие из этих элементов представляются жизненно необходимыми, а какие случайно попадают из окружающей внешней среды. Тем не менее то, что мы знаем, позволяет прийти к заключению об огромной роли их в нашем организме, о чем впервые высказал предположение выдающийся русский биохимик Т. А. Бунге. К числу наиболее изученных микроэлементов относится железо, основное значение которого заключается в его участии в процессе кроветворения. Кроме того, оно является составной частью протоплазмы и клеточных ядер, входит в состав окислительных ферментов и т. д. Вместе с железом в синтезе гемоглобина и других жедезопорфиринов принимают участие медь и кобальт, последний к тому же воздействует на образование ретикулоцитов и превращение их в зрелые эритроциты.

Читайте также:  Анализ белка при сахарном диабете

Что касается марганца, то он, очевидно, является активатором процессов окисления, обладает выраженным липотропным влиянием, а также служит одним из факторов оссификации, определяющих состояние костной ткани. Вместе с тем он обладает стимулирующим влиянием на процессы роста и деятельности эндокринного аппарата. Из других микроэлементов обращает на себя внимание цинк, причем, по мнению ряда исследователей, его роль в организме не менее важна, чем железа. В частности, имеются данные об участии этого элемента в кроветворении, деятельности гипофиза, поджелудочной и половых желез, а также значение его как фактора роста. Наконец, цинк оказывает влияние на содержание витаминов в пищевых продуктах, причем обогащение им почв способствует синтезу растениями аскорбиновой кислоты и тиамина. Все сказанное о роли макро- и микроэлементов делает необходимым нормирование их в питании населения. В этом отношении более или менее точно определена средняя потребность взрослого человека в целом ряде минеральных веществ (табл. 1).

Однако принятые в настоящее время официальные рекомендации включают пока соответствующие нормативы только для трех наиболее важных микроэлементов. При этом относительно подробная дифференциация этих нормативов имеется для детей, подростков, беременных и кормящих женщин, взрослых (табл. 2).

К числу минеральных жизненно важных веществ необходимо отнести и воду, недостаток и избыток которой в нашем рационе является вредным для организма. При этом водное голодание наиболее тяжело переносится человеком и оно значительно опаснее, чем пищевое, приводя к летальному исходу уже через несколько суток. Вместе с тем излишнее ее потребление способствует большой нагрузке на сердце, повышает процессы белкового распада и увеличивает жирообразование. Установлено, что суточная потребность в воде определяется условиями внешней среды, характером работы и количеством принятой пищи. Так, водный баланс взрослого человека в среднем определяется следующими величинами: супы 500-600 г, вода питьевая 800-1000 г, содержащаяся в твердых продуктах 700 г и образующаяся в самом организме 300-400 г.

источник

Нормальные показатели: белок в норме в моче содержится в минимальных количествах, которые не обнаруживаются обычными качественными реакциями. Верхняя граница нормы белка в моче – 0,033 г/л. Если содержание белка выше этого значения, то качественные пробы на белок становятся положительными.

Клиническое значение определения:

Появление белка в моче называется протеинурия. Протеинурии могут быть ложными и почечными. Экстраренальные протеинурии могут быть при наличии примесей белкового происхождения из половых органов (вагинитах, уретритах и др.), количество белка при этом незначительно – до 0,01 г/л. Почечные протеинурии могут быть функциональными (при переохлаждении, физических нагрузках, лихорадке) и органическими — при гломерулонефрите, пиелонефрите, нефрите, нефрозах, почечной недостаточности. При почечных протеинуриях содержание белка может быть от 0,033 до 10 – 15 г/л, иногда выше.

Принцип метода: основан на том, что белок под действием неорганических кислот коагулирует (становится видимым). Степень помутнения зависит от количества белка.

Обнаружение белка в моче с 20% сульфосалициловой кислотой.

Реактивы: 20% р-р сульфосалициловой кислоты. Оборудование: темный фон.

1. Требования к моче: моча должна быть кислой (или слабокислой) рН, должна быть прозрачной, для этого мочу центрифугируют. Щелочную мочу подкисляют до слабокислой реакции среды, используя для контроля индикаторную бумагу.

2. В 2 пробирки одинакового диаметра наливают по 2 мл подготовленной мочи. 1 пробирка – контроль, 2 – опыт. В опытную пробирку добавляют 4 капли 20% сульфосалициловой кислоты.

3. Результат отмечают на темном фоне.

4. При наличии белка, моча в опытной пробирке мутнеет.

Качественное определение белка в моче тест – полосками.

Для выявления протеинурий используют различные монотест – полоски: Альбуфан, Альбустикс, Биофан Е и политесты: Трискан, Нонафан и др.

Обнаружение белка в моче по методу Робертса – Стольникова.

Принцип метода: основан на том, что белок под действием неорганических кислот коагулирует (становится видимым). Степень помутнения зависит от количества белка (т.е. кольцевая проба Геллера). При концентрации белка в моче 0,033 г/л к концу 3 минуты после наслаивания мочи появляется тонкое нитевидное белое кольцо.

Реактивы: 50% р-р азотной кислоты или реактив Робертса (98 частей насыщенного раствора поваренной соли и 2 части концентрированной соляной кислоты) или реактив Ларионовой (98 частей насыщенного р-ра поваренной соли и 2 части концентрированной азотной кислоты).

1. Требования к моче: моча должна быть кислой (или слабокислой) рН, должна быть прозрачной, для этого мочу центрифугируют. Щелочную мочу подкисляют до слабокислой реакции среды, используя для контроля индикаторную бумагу.

2. В пробирку наливают 2 мл 50% р-ра азотной кислоты или один из реактивов, затем осторожно по стенке пробирки с помощью пипетки наслаивают такой же объем подготовленной мочи

3. Пробу оставляют на 3 минуты

4. Через 3 минуты отчитывают результат. Результат отмечают на темном фоне в проходящем свете. Если кольцо широкое, компактное, то мочу разводят дистиллированной водой и вновь наслаивают на реактив.

5. Мочу разводят до тех пор, пока через 3 минуты не образуется тонкое нитевидное кольцо.

6. Расчет содержания белка в моче производят по формуле:

С = 0,033г/л х степень разведения.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: На стипендию можно купить что-нибудь, но не больше. 8921 — | 7216 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

источник

Министерство образования и науки Украины

Реферат на тему: «Методы определения белков. Кислотный метод измерения жирности продуктов.»

1. Белки, их аминокислотный состав, продукты протеолиза………………………………………………………….…3

2. Определение белковой фракции пищи………………………………………………………. …………4

2.3. Ускоренный метод определения белков в готовых блюдах и рационах……………………………………………………………………….…9

3. Кислотный метод измерения жирности продуктов………………… 9

1. БЕЛКИ, ИХ АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ, ПРОДУКТЫ ПРОТЕОЛИЗА

Белки представляют главнейшую составную часть пищи человека, и потому количественное определение белковой фракции пищи и изучение ее аминокислотного состава дает важный материал для суждения о питательной ценности пищевых продуктов и пищу в целом.

Белки в то же время, как наименее устойчивое пищевое вещество, легко подвергаются распаду в результате воздействия бактериальных ферментов (реже ферментов самой пищи-аутолиз), что ведет к порче продуктов.

Белки сначала распадаются на протеазы, пептоны, пептиды, которые, не накапливаясь, распадаются на аминокислоты. В дальнейшем происходит расщепление аминокислот ,которое может идти различными путями: декарбоксилированием, дезаминированием, обоими этими путями совместно в результате образуются азотистые основания(аммиак, амины) жирные кислоты, свободные углеводороды и пр. Конечными продуктами распада и превращения белков являются сероводород, аммиак, меркаптаны, фенол, индол, скатол и др.

Необходимо, однако, указать, что по отдельным химическим показателям нельзя судить о порче белковых продуктов питания. Так, накопление аминокислот не дает еще представления о порче, например, мяса. То же можно сказать о положительных качественных реакциях на аммиак и сероводород, которые обнаруживаются иногда и в совершенно свежем мясе. Методы, основанные на качественном обнаружении типичных продуктов гниения белка – индола, скатола, фенола, меркаптанов, не имеют практического значения, так как эти продукты обнаруживаются лишь тогда, когда развитие гнилостного распада не вызывает уже сомнения по одним органолептическим показателям.

Вот несмотря на большую давность вопроса о способах обнаружения порчи белковых продуктов питания, особенно на ранних стадиях протеолиза, этот вопрос не нашел еще своего разрешения, и в литературе появляются все новые и новые предложения по этому поводу.

Нет сомнения в том, что только в комплексах методов, слагающихся из органолептических, химических и микробиологических исследований, нужно искать разрешение вопроса.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВОЙ ФРАКЦИИ ПИЩИ

2.1. Качественные реакции на белок

Для качественного обнаружения белка предложено много реакций( цветный и осадочные ).

Б и у р е т о в а я р е а к ц и я.К раствору белка добавляют равный объем 10% раствора едкого натра и затем по каплям 0,1% раствор сернокислой меди. Жидкость приобретает фиолетовое окрашивание, переходящее в красное, если, наряду с белками , имеются альбумозы и пептоны. Реакция обусловлена наличием в белковой молекуле группировок

—CO—NH, т.е. пептидных связей. Продукты гидролиза белка ( аминокислоты и амиды) после достаточного разбавления этого эффекта не дают эффекта и потому биуретовой реакцией можно пользоваться для установления конца гидролиза белка.

Появление сине-фиолетового окрашивания при описанной реакции обусловлено образованием Сu—Na – комплексной соли биурета.

Следует избегать прибавления избытка медного купароса, так как голубая получающегося гидрата окиси меди может маскировать реакцию.

Кроме белков, биуретовую реакцию дают: биурет (NH2—СО—HN—СО—NH2),

оксамид (H2N—СО—СО—NH2), глицинамид (H2N—СH2—СО—NH2),малонамид

(H2N—СО—СH2—СО—NH2), а также следующие аминокислоты а достаточно концентрированных растворах: гистидин, серин и треонин. Таким образом, биуретовая реакция не является строго специфичной для полипептидных цепей.

Присутствие в исследуемом растворе MgSO4 и (NH4) 2SO4 препятствует биуретовой реакции. При налички аммонийных солей следует употреблять большой избыток едкой щелочи.

Н и н г и д р и н о в а я р е а к ц и я.К 3мл нейтрального водного раствора белка добавляют 1 мл свежеприготовленного 0,1% раствора нингидрина(трикетогидринденгидрата);

Смесь нагревают до кипения и через минуту охлаждают. Появляется синее окрашивание. Объясняется это ем, что нингидрин дает окрашивание(обычно синее) с любой α- аминокислотой, а так как любой белок содержит α-аминокислоты, то нингидриновая реакция получается со всеми без исключения белками. Химизм реакции можно представить в следующем виде:

Восстановленный нингидрин с аммиаком и второй молекулой нингидрина образует окрашенный в синий цвет продукт конденсации.

Нужно иметь в виду, что аммонийные соли и β-аланин также дают положительную нингидриновую реакцию. Добавление аскорбиновой кислоты повышает чувствительность реакции.

К с а н т о п р о т е и н о в а я р е а к ц и я.К раствору белка приливают концентрированной азотной кислоты(уд. вес. 1,4); при этом белок выпадает в осадок. При нагревании осадок частью растворяется и жидкость окрашивается в желтый цвет. При этом происходит образование нитросоединений циклических аминокислот: тирозина и триптофана, которые содержатся в подавляющем большинстве белков.

Если полученный желтый раствор охладить, а затем осторожно добавить немного раствора едкой щелочи или аммиака, то появляется красновато-оранжевое окрашивание, обусловленное образованием солей нитроновых кислот.

Р е а к ц и я А д а м к е в и ч а. Аминокислота триптофан в кислой среде, взаимодействуя с альдегидами кислот, образует продукты конденсации красно-фиолетового цвета.

К одной капле белка прибавляют 10 капель уксусной кислоты. Наклонив пробирку, осторожно по стенке добавляют по каплям 0,5 мл серной кислоты так, чтобы жидкости не смешивались. При стоянии пробирки на границе жидкостей появляется красно-фиолетовое кольцо.

Р е а к ц и я Ф о л я. Аминокислоты, содержащие сульфгидрильные группы — SH, подвергаются щелочному гидролизу с образованием сульфида натрия Na2S. Последний, взаимодействуя с плюмбитом натрия (образуется в ходе реакции между ацетатом свинца и NaOH), образует осадок сульфида свинца PbS черного или бурого цвета.

К 5 каплям раствора белка прибавляют 5 капель реактива Фоля и кипятят 2-3 мин. После отстаивания 1-2 мин. появляется черный или бурый осадок.

Для белков характерны реакции осаждения солями и гидратами окисей тяжелых металлов и некоторыми кислотами. Приведем важнейшие из этих реакций.

Осаждение белков тяжелыми металлами

Осаждение белков солями тяжелых металлов производится обычно в нейтральном млм слабокислом растворе. Полноте осаждения часто способствует присутствие солей щелочных металлов—К SO4, MgSO4 и др.

Следует иметь ввиду, что во многих случаях образующиеся осадки могут растворяться в избытке реактива.

Х л о р н о е ж е л е з о и у к с у с н о е ж е л е з о осаждают белки из их растворов; осадок легко растворяется в избытке хлорного железа.

Х л о р н а я р т у т ь (сулема) осаждает белки и продукты частичного гидролиза их- пептоны.

У к с у с н р к и с л ы й с в и н е ц — нейтральный и основной (свинцовый уксус) является хорошим осадителем белков.

Г и д р а т о к и с и м е д и и г и д р а т о к и с и ц и н к а осаждают белки.

Гидрат окиси цинка, кроме белков, осаждает еще глутатион, мочевую кислоту и креатинин.

Осаждение белков кислотами

При осаждении белков кислотами происходит образование солей, устойчивых в кислой среде. В избытке реактива осадки могут раствориться.

Т р и х л о р у к с у с н а я и м е т а ф о с ф о р н а я к и с л о т ы осаждают только белки.

Сульфосалициловая кислота в форме кислого суфосалициловокислого натра и

В о л ь ф р а м о в а я к и с л о т а являются также осадителями белков.

2.2. Количественное определение белка

Среди азотистых веществ, входящих в состав пищевых продуктов, растительного и животного происхождения главное место принадлежит белкам. В связи с этим содержание белков в пищевых продуктах часто определяют на основании найденного в продукте количества общего азота; при этом при пересчете азота на белок исследуемого продукта учитывают процентное содержание азота в белке данного продукта; так, например, если азот составляет 16% белка продукта, то, очевидно, для пересчета найденного количества азота на белок нужно весовое количество азота умножить на 6,25. Таким образом, для данного случая пересчетным коэффициентом является число 6,25.

Этот способ расчета белка дает представление о содержании в продуктах не чистого белка, а так называемого «сырого протеина», так как вместе с азотом белка по обычно применяемому методу Кьельдаля определения азота, а пищевых продуктах одновременно определяется азот и других соединений, могущих присутствовать в пищевых продуктах; сюда относятся альбумозы и пептоны, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, амиды, азотосодержащие экстрактивные вещества (креатин, мочевина, мочевая

кислота), алкалоиды(кофеин, теин, теобромин), некоторые глюкозиды( соланин, вицин, синигрин), некоторые азотосодержащие неорганические соединения( аммонийные и азотнокислые соли, свободный аммиак) и др. В отдельных случаях содержание некоторых из перечисленных веществ может достигать заметных размеров: так, содержание в мясе азотосодержащих экстрактивных веществ доходит до 10%.

М е т о д К ь е л ь д а л я состоит в том, что органические азотосодержащие вещества подвергаются разрушению с помощью крепкой серной кислоты с применением катализатора и при нагревании. При этом углерод и водород органических соединений полностью окисляются до СО2 и Н2О за счет кислорода, освобождающегося при восстановлении серной кислоты. Азот органических веществ отщепляется в виде аммиака, который с серной кислотой образует сульфат аммония.

При помощи крепкой щелочи разлагают затем сульфат аммония и освободившийся при этом аммиак отгоняют и улавливают в титрованный раствор серной кислоты, который берется с избытком. Обратным титрованием определяют этот избыток, а отсюда делают вывод о количестве кислоты, связавшейся с аммиаком и о количестве азота сожженного вещества.

Д л я о п р е д е л е н и я к о л и ч е с т в а б е л к а в о б р а з ц е и с п о л ь з у е т с я р я д м е т о д и к :

Б и у р е т о в ы й м е т о д.Основан на образовании биуретового комплекса (имеет фиолетовый цвет) пептидных связей белков с двухвалентными ионами меди. В методе используют т. н. биуретовый реактив, состоящий из KOH, CuSO4 и цитрата натрия (или тартрата натрия). В образовавшемся комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами — электростатическими. Полноценный комплекс образуется лишь с пептидами, состоящими более чем из 4 остатков.

Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически.

К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к посторонним веществам, невысокую погрешность.

М и к р о б и у р е т о в ы й м е т о д основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса, образующегося в результате взаимодействия пептидных связей с Cu2+ в щелочной среде. К 0,2 мл ПМ лимфоцитов, сыворотки или плазмы добавляли 3,5 мл раствора NаОН и 0,2 мл реактива Бенедикта. Выдерживали 15 мин при комнатной температуре и спектрофотометрировали на СФ — 46 при 330 нм. Построение калибровочного графика проводили по стандартному раствору белка.

М е т о д Б р э д ф о р д а один из наиболее популярных методов, используемый для определения концентрации белка в растворе. Метод определения концентрации белка по Брэдфорд успешно используется в случае измерения растворов с низкой концентрацией белка и растворов, содержащих компоненты, также обладающие значительным поглощением при 280 нм. Метод определения концентрации белка по Брэдфорд, так же, как и метод Лоури и BSA, требует построения стандартной калибровочной кривой перед измерением концентрации неизвестного белка.

Универсальность метода и его гибкость позволяют создавать модификации процедуры измерений для различных целей и типов измерений.

Метод Брэдфорд основан на сдвиге спектра поглощения кумасси (Coomassie Blue) в сторону значений 595 нм прямо пропорционально концентрации содержащегося в растворе белка. Кумасси образует комплекс с белком; этот комплекс измеряют при длине волны 595 нм. абсорбционная фотометрия комплекса кумасси / белок имеет очень высокую чувствительность и эффективна даже в случае следовых концентраций белков.

М е т о д Л о у р и. Метод количественного определения белка, основанный на измерении концентрации окрашенных продуктов, образующихся в результате сочетания двух химических реакций: биуретовой реакции на пептидную связь и взаимодействия реактива Фолина-Чокалтеу с ароматическими аминокислотами.

С п е к т р о ф о т о м е т р и ч е с к и й м е т о д. Спектрофотометрия (абсорбционная) — физико-химический метод исследования растворов и твёрдых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200—400 нм), видимой (400—760 нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра. Основная зависимость, изучаемая в спектрофотометрии зависимость интенсивности поглощения падающего света от длины волны. Спектрофотометрия широко применяется при изучении строения и состава различных соединений (комплексов, красителей, аналитических реагентов и др.), для качественного и количественного определения веществ (определения следов элементов в металлах, сплавах, технических объектах).

2.3. Ускоренный метод определения белков в готовых блюдах и рационах

Для ускоренного определения белков в готовых блюдах и рационах В. А. Бабин и Н.Н. Мусерский разработали метод, представляющий модификацию метода, предложенного Джеремилло.

Сущность метода сводится к тому, что вещество, содержащее белки, минерализуется в металлической гильзе (медь, нержавеющая сталь, никель), которая герметически закрывается ввинчивающейся металлической пробкой с газоотводной трубкой, через которую газообразный аммиак и другие газы, образующиеся при минерализации, поступают в приемную колбу с серной кислотой.

Минерализация белков производится едким натром, растворенным в расплавленном уксусном натре при нагревании гильзы. Процесс минерализации белка происходит быстро ( в течении 2-3 минут) при температуре нагрева не выше 325ºС, что является преимуществом данного метода перед другими методами количественного определения белка.

3. КИСЛОТНЫЙ МЕТОД ИЗМЕРЕНИЯ ЖИРНОСТИ ПРОДУКТОВ

Рассмотрим данный метод на примере измерения жирности молока и молочных продуктов.

Метод основан на выделении жира из молока и молочных продуктов под действием концентрированной серной кислоты и изоамилового спирта с последующим центрифугированием и измерении объема выделившегося жира в градуированной части жиромера.

Чтобы определить содержание жира в молоке, освобождают жировые шарики от белковых оболочек. В качестве растворителя применяют концентрированную серную кислоту. Для более полного выделения освободившегося от оболочек жира употребляют изоамиловый спирт. При последующем центрифугировании смеси жир, как наиболее легкая составная часть, концентрируется в градуированной шкале стеклянного прибора — жиромера.

Если молоко исследуется вскоре после отбора, то его хорошо перемешивают, переворачивая до 6 раз закрытые бутылочки с пробами. При этом не допускают образования пены, которая приводит к неправильному отмериванию. Особенно тщательно подливают пробы долго стоявшего молока. Иногда их прогревают в воде, чтобы смыть жировой слой, приставший к стенкам бутылочки, а затем перемешивают.

В штатив устанавливают нужное количество пронумерованных жиромеров. Нумеруют жиромеры путем загибания вокруг шкалы жестяных пластинок с высеченными номерами.

В каждый жиромер отмеривают дозатором 10 мл серной кислоты. Потом отбирают пипеткой 10,78 мл (11 г) хорошо перемешанного молока. Осторожно, по стенке вливают молоко в жиромер. Во избежание преждевременного разогревания слой молока должен расположиться над слоем кислоты. При этом конец пипетки не должен касаться серной кислоты.

Отмеривают дозатором 1 мл изоамилового спирта, стараясь не смочить горлышко жиромера, что в последующем может привести к выскакиванию пробки.

Заполненные жиромеры закрывают резиновыми пробками и вставляют в центрифугу, привинчивают крышку центрифуги и центрифугируют 5 мин со скоростью около 1000 об/мин. По окончании центрифугирования жиромеры на 5 мин устанавливают пробками вниз в водяную баню при 65 °С.

1. «Вопросы питания»,В. А. Бабин, Н.Н. Мусерский, 1958г;

2. «Методы исследований пищевых продуктов», А.И. Бурштейн,Киев 1963г;

источник

ЗАКОНСПЕКТИРУЙТЕ ЭТОТ МАТЕРИАЛ И ЗАПОЛНИТЕ ТАБЛИЦЫ, ИСПОЛЬЗУЯ УЧЕБНИКИ ИЛ И МАТЕРИАЛ ИХ ЭЛЕКТРОННЫХ УЧЕБНИКОВ

1. Биохимия : учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М. : ГЭОТАР-Медиа, 2014. — 768 с. : ил. http://www.studentlibrary.ru

Список полезных web-страниц

Наглядная биохимия/ Я. Кольман, К.- Г. Рем, — Москва “Мир” 2000

Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003

Биологическая химия под ред. Е.С. Северина, 2011 г (новая редакция учебника с упражнениями, тестами и задачами для студентов специальности Лечебное дело и Фармация)

Очень полезный ресурс, в котором представлен хороший лекционный материал

Тема: Белки.
Белки (протеины) – высокомолекулярные азотсодержащие органические соединения, играют важную роль в построении живой ткани и в осуществлении процессов жизнедеятельности. Особенности структуры и наличие ряда уникальных свойств обеспечивают функционирование белков как одного из основных материальных носителей жизни. Представление о структуре, физико-химических свойствах и биологических функциях белков являются теоретической основой изучения всех последующих разделов биологической химии.
Строение и функции белков. Методы качественного и количественного анализа белков.
Используя лекции и учебники по биохимии, изучите химический состав, строение, уровни организации белковой молекулы, биологические функции белков, письменно ответьте на вопросы в тетради. Используйте таблицу 1 и рисунок 1.

Название: Методы определения белков. Кислотный метод измерения жирности продуктов
Раздел: Рефераты по химии
Тип: реферат Добавлен 14:48:12 17 июля 2011 Похожие работы
Просмотров: 2733 Комментариев: 12 Оценило: 3 человек Средний балл: 5 Оценка: неизвестно Скачать
№№ Задание Указания к выполнению задания
1 2 3
1. Вспомните структуру и свойства аминокислот, аминокислотный состав белков.

1. Напишите общую формулу α-аминокислоты. Как классифицируются аминокислоты по строению бокового радикала? Напишите формулы аминокислот с неполярным радикалом. Напишите формулы α-аминокислот с полярными, но незаряженными радикалами, с полярными анионогенными радикалами, с полярными катионногенными радикалами.В виде каких частиц находятся α-аминокислоты в водных растворах при нейтральном значении рН?

Напишите формулы трипептидов: а) пролил-глицил-аланин; б) лизил-фенилаланил-серин.

Приведите формулы кислого, основного и нейтрального трипептидов.

  1. Вспомните функциональное многообразие белков – белки ферменты, белки-рецепторы, транспортные белки, антитела.

3.Перечислите группы простых белков, охарактеризуйте их биологическую роль.

4. Перечислите группы сложных белков, охарактеризуйте их биологическую роль. охарактеризуйте функции небелковой части (лиганда).

Приведите примеры важнейших хромопротеидов, отметьте их биологическую роль.

Какова функция липопротеинов плазмы крови? Перечислите основные группы липопротеинов сыворотки крови, отметьте клиническое значение определения липопротеинов в сыворотке крови.

Зарисуйте схему строения биомембран как липопротеинового бислоя.

Приведите примеры наиболее распространенных фосфопротеинов и охарактеризуйте их биологическую роль.

2. Изучите уровни организации белковой молекулы. 1. Дайте определение первичной структуры белка. Какая основная связь стабилизирует первичную структуру? Дайте определение конформации и нативной конформации полипептидной цепи. Дайте определение понятию «конформационная лабильность белков», ее значение.

Дайте определение вторичной структуры. Какие формы вторичной структуры встречаются в природных белках? За счет каких связей стабилизируются конформации α-спирали?

Аминокислотные радикалы каких α-аминокислот способствуют образованию α-спирали? Для какой формы вторичной структуры полипептидной цепи характерны межцепочечные водородные связи?

Дайте определение понятия «третичная структура» полипептидной цепи. Какие связи обеспечивают стабильность третичной структуры полипептидной цепи? Между какими группами может возникнуть гидрофобное взаимодействие? Между аминокислотными остатками каких α-аминокислот возникает дисульфидная связь? Покажите на примере.

Как располагаются полярные радикалы аминокислотных остатков при формировании третичной структуры полипептидной цепи в водной среде?

Каковы основные факторы, определяющие трехмерную структуру белка?

Какие белки называют гомологичными?

Каков характер взаимосвязи между уровнями организации белковой молекулы и ее биологической активностью?

Дайте определение четвертичной структуре белка.

Какие связи стабилизируют четвертичную структуру белка?

3. Изучите методы исследования первичной структуры белка. 1. Какие методы гидролиза белка Вы знаете?

2. В чем суть хроматографического анализа. Приведите классификацию хроматографических методов.

3. Приведите примерную последовательность операций при установлении первичной структуры белка.

4. Продумайте, какое практическое значение для медицины имеют исследование аминокислотного состава и первичной структуры белков.

4. Ознакомьтесь с методами установления вторичной, третичной и четвертичной структуры белка. 1.Перечислите и охарактеризуйте методы, позволяющие изучить вторичную, третичную и четвертичную структуру белка.
5. Изучите, какими методами можно определить количественное содержание белка и аминокислот в биологических объектах. 1.Сформулируйте принцип количественного определения белка биуретовым методом.

3.Выпишите границы содержания белка в сыворотке крови в физиологичеких условиях и приведите примеры заболеваний, сопровождающихся гипо- и гиперпротеинемией.

Рисунок 1. Графологическая структура

«Качественный анализ – установление структуры белка»

Задача 1.Будет ли одинаковой интенсивность окраски, полученной в реакции с биуретовым реактивом, для 100 молекул альбумина (Mr 64000 D) и 100 молекул иммуноглобулина G (Mr 175000D)? В чем заключается принцип биуретовой реакции?

Ответ. С биуретовым реактивом реагируют пептидные группы белков – образуется хелатный комплекс фиолетового цвета. По сравнению с иммуноглобулинами, альбумин содержит меньше остатков аминокислот, так как имеет меньшую молекулярную массу, следовательно, интенсивность окраски раствора альбумина будет меньше.

Задача 2.Подавляющее большинство протеиногенных аминокислот дают синее окрашивание с нингидрином, а пролин и оксипролин – желтое. Объясните это различие, принимая во внимание химизм нингидриновой пробы и особенности структуры протеиногенных аминокислот.

Ответ. Нингидрин является специфичным реагентом для -аминокислот, тогда как пролин и оксипролин являются иминокислотами. С -аминокислотами нингидрин реагирует по следующей схеме:

нингидрин α — аминокислота

продукт реакции сине-фиолетового цвета альдегид

(светопоглощение в области 550-570 нм)
Физико-химические свойства белков.

источник