Меню Рубрики

Методы анализа пептидов и белков

Этапы исследования структуры белка:
1).Выделение белка из смеси в чистом виде.
2).Определение N-концевой аминокислоты.
3).Определение С-концевой аминокислоты.
4).Определение аминокислотной последовательности.

Методы разделения смеси белков
1).Диализ (метод мембранных сил).
Для этого используют полуроницаемые мембраны (целлофан, целлюлоза), диаметр пор которых варьирует в широких пределах.
2).Гель-хроматография.
Используеься гель с порами. Белки с маленьким размером заходят в поры, и скорость их прохождения больше.
3).Аффинная хроматография.
Основана на высоком сродстве белков к специфическим группам и молекулам. Колонка для аффинной хроматографии заполняется твёрдым носителем, поверхность которого содержит вещества, способные специфически связываться с анализируемыми белками (например белок лектин связывается с глюкозой).
4).Ионно-обменная хроматография.
Каждый белок имеет определённый заряд — положительный или отрицательный в определённом рН. Это свойство и лежит в основе ионной хроматографии. Для этого используют целлюлозу, которая заряжена либо отрицательно (катионный обменник) либо положительно (анионный обменник). Белки, которые имеют противоположный заряд по отношению к целлюлозе, сохраняются при прохождении раствора белков через колонку. Потом их отсоединяют с помощью элюентов.
5).Адсорбционная хроматография.
Разделение компонентов смеси (образца) основана на их различной сорбируемости на твёрдых адсорбентов. В качестве адсорбентов используют:
-активированный древесный уголь;
-гель фосфата кальция;
-оксид аллюминия;
-оксид кремния;
6).Распределительная хроматография.
Твёрдый носитель играет роль опоры для передвигающего с разной скоростью белка. Носители — силикагель, крахмал, плёнки.
7).Ультрацентрифугирование.
8).Электрофорез ( смотри методичку А.Д.Тагановича «Нуклеопротеины»).
9).Изоэлектрофокусирование.
Основано на проведение электрофореза в средах с градиентом рН. При этом точное месторасположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки.

Определение N-концевой аминокислоты
Перед тем, как определять последовательность аминокислот в белке, необходимо удалить дисульфидные связи внутри пептидов и между другими пептидами. Для этого используют 2-меркаптоэтанол или дитиотреитол. Чтобы предотвратить обратное образование дисульфидных связей, белок надо обработать йодацетатной кислотой (алкилирует свободные сульфогидрильные радикалы). Методы:
1).Метод Сенжера. Для этого используют 1-фтор-2,4-динитробензол (ФДНБ), который взаимодействует с N-концевой аминокислотой в щелочных условиях. Такая аминокислота может быть отщеплена от белка и идентифицирована, т.к. имеет жёлтый цвет. Затем проводят электрофорез и сравнивают искомую аминокислоту со стандартами.
2).Даксил-хлорид. Как и ФДНБ, даксил-хлорид взаимодействует с N-концевой аминокислотой в щелочных условиях. Анализ как по методу Сенжера, только даксилированные аминокислоты определяют посредством флюоресценции.
3).Метод деградации Эдмана. При использовании этого метода аминокислотная последовательность в белке остаётся невредимой. Это имеет преимущество перед предыдующими методами, т.к. можно определить всю последовательность аминокислот в белке. При этом методе используют фенилизотиоционат (ФИТЦ).

Определение С-концевой аминокислоты
1).Метод Акабори. Используется гидразин. Он расщепляет пептидные связи , не нарушая последовательность а-т в пептиде. Эту а-ту определяют с помощью ФДНБ.
2).Ферментативные методы, Используются карбоксипептидазы, которые осуществляют разрыв пептидной связи с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа. Это приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, природа которой может быть идентифицирована методом хроматографии.

Определение аминокислотной последовательности
Для этого сначала проводят избирательный (частичный) (химический или ферментативный) гидролиз пептида на олигопептиды, последовательность а-т в которых может быть точно определена.
Химические методы избирательного гидролиза основаны на применении таких химических реактивов, которые вызывают селективный распад пептидных связей, образованных определёнными а-тами, оставляя незатронутыми другие связи:
-бромциан (по остаткам метионина)
-гидроксиамин (меду аспаргиновой кислотой и глицином)
-N-бромсукцинамид (по остаткам триптофана).
Ферментативные методы — основаны на избирательном действии протеолитических ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные определёнными а-тами:
-пепсин (фен-тир-глу)
-химотрипсин (три-тир-фен)
-папаин, субтилизин и др.
Метод пептидных карт (метод отпечатков пальцев, метод Ингрена).
Используется при определении сходства и различий гомологических белков по первичной структуре.
Гомологические белки — это белки, которые выполняют одну и туже функцию, но различаются по структуре (норма и патология, локализованные в разных органах).
Этапы:
-оба белка (например от здорового и больного человека) расщепляют на пептиды с помощью пепсина, трипсина.
-затем смесь пептидов наносят в виде пятна на угол листа фильтровальной бумаги.
-проводят электрофорез в горизонтальном направлении и хроматографию в вертикальном.
-полученные карты (их две) сравнивают.
Этим методом определяется серповидно-клеточная анемия (глу — вал).

Синтез жирных кислот
Синтез жирных кислот — путь, обратный окислению ЖК. Однако имеются существенные отличия. Синтез ЖК протекает в цитоплазме, в то время, как окисление — в митохондрии. Другое отличие связано с использованием разных нуклеотидов как кофакторов: окисление сопровождается восстановлением ФАД+ и НАД+, а синтез — окислением НАДФН.
Первый шаг в синтезе ЖК — это превращение ацетилКоА в малонилКоА с помощью фермента ацетилКоАкарбоксилазы (АКК). АКК — главное место регуляции. Этот фермент существует в двух формах — мономерной и полимерной. Активной является полимерная форма. Активирует АКК цитрат, а ингибируют длинноцепочечные ЖК. АКК требует биотин как кофактор.
Для синтеза ЖК используется ацилсинтетазный комплекс, который состоит из:
-ацилпереносящий белок (АПБ)
-бетта-кетоацилсинтетаза (КС)
-малонилтрансфераза (МТ)
-бетта-кетоацилКоАредуктаза (КР)
-бетта-гидроксиацилДГ (ГД)
-еноилредуктаза (ЕР)
-ацилтрансацетилаза (АТ).
Сначала одна молекула ацетилКоА присоединяется к КС, а малонилКоА — к АПБ. Реакция конденсации приводит к образованию соединения с четырьмя углеродами, которое, будучи присоединёной к АПБ, подвергается востановлению (КР), дегидротации (ГД), и ещё раз восстановлению (ЕР). В завершение цикла полностью восстановленный продукт попадает опять на КС, а к АПБ присоединяется следующая молекула малонилКоА. Тем самым начинается следующий цикл реакций.
Суммарное уравнение:
ацетилКоА + 7малонил-КоА + 14НАДФН + 14Н+ = пальмитат + 7СО2 + 14НАДФ + 8КоА-SH + 6Н2О.
Сначала образуется пальмитат, из которого могут образовываться другие ЖК.
Источник цитоплазматического ацетилКоА
АцетилКоА образуется в митохондриях главным образом в ходе двух рекций: пируватдегидрогеназной (ПВК — АцетилКоА) и окисление ЖК. Для того, чтобы ацетилКоА был использован для синтеза ЖК, он должен перейти в цитоплазму.
АцетилКоА идёт в цитоплазму в форме цитрата. В цитоплазме под действием цитратлиазы цитрат превращается в ЩУК и ацетилКоА. Затем ЩУК превращается в малат посредством малатДГ. А малат под действием малик-фермента превращается в пируват (кофактор — НАДФ+/НАДФН). Пируват затем идёт в митохондрию, где под действием пируваткарбоксилазы превращается в ЩУК.
В ходе синтеза ЖК образуется пальмитат, который содержит 16 углеродных атомов и все связи насыщены. Чтобы получить другие ЖК пальмитат надо удлинить (элонгация) и/или добавить двойные связи (десатурация, ненасыщение, в общем desaturation). Элонгация и десатурация ЖК проходит как в митохондриях, так и эндоплазматическом ретикулуме.
Элонгация осуществляется благодаря конденсации ацилКоА с малонилКоА. В результате получается ЖК , на два атома углерода длиннее предыдущей, которая проходит восстановление, дегидратацию и снова восстановление.
Десатурация проходит под действием десатураз, которые содержат негемовое железо. Известно 4 вида десатураз, которые образуют двойные связи по С4, С5, С6 и С9-углеродным атомам. Электроны, которые переносятся во время десатурации, в свою очередь транспортируются на цитохром b5, а потом на НАДН-цитохром-b5-редуктазу.
Таких десатураз, которые образовывали двойную связь дальше, чем С9, в организме человека нет, поэтому такие ЖК, как линолевая и леноленовая, в организме синтезироваться не могут и обязательно должны поступать с пищей. Они называются незаменимые ЖК или витамин F. Арахидоновая кислота является частично незаменимой, поскольку она может синтезироваться из линолевой. А арахидоновая кислота является предшественником эйкозаноидов (простагландинов и тромбоксанов).

Синтез триацилглицеролов (ТАГ)
ТАГ являются эфирами трёхатомного спирта глицерола и трёх ЖК. ЖК, которые входят в состав ТАГ, в основном насыщены. Главным строительным кирпичиком для синтеза ТАГ во всех тканях, кроме жировой, является глицерол. В адипоцитах отсутствует фермент глицеролкиназа, поэтому здесь предшественником ТАГ является ФДА, промежуточный продукт гликолиза. Это означает, что для того, чтобы сохранить ЖК в форме ТАГ, необходимо окислить глюкозу.
Если в синтез вступает глицерол, то он активируется фосфорилированием с помощью глицеролкиназы, а если предшественником является ФДА, то он активируется с помощью фермента глицерол-3-фосфатДГ (реакция требует НАДН). ЖК, прежде чем включиться в ТАГ, должны активироваться с помощью ацилКоАсинтетазы. Сначала две молекулы ацилКоА присоединяются к глицерол-3-фосфату, и образуется 1,2-диацилглицеролфосфат (также называется фосфатидная кислота). Потом с помощью фосфатазы от фосфатидной кислоты уходит фосфат, образуется 1,2-ДАГ, который является субстратом для присоелинения третьего моля ЖК.

КИШЕЧНОЕ ВСАСЫВАНИЕ ЛИПИДОВ

Для того, чтобы липиды пищевого происхождения смогли использоваться организмом, они сперва должны всосаться в малом кишечнике. Жиры не растворимы в жидкой среде кишечника и для того, чтобы они всосались, необходимо их эмульгирование. Эмульгирование липидов идёт с помощью желчных кислот, которые синтезируются из холестерина в печени.
Как только произошло эмульгирование, липиды становятся доступными для панкреатических липаз (особенно липаза и фосфолипаза А2).
Продукты панкреатических липаз затем диффундируют в кишечные эпителиальные клетки, где из них снова ресинтезируются триацилглицеролы (ТАГ).
Затем эти триацилглицеролы и холестерол пищевого происхождения соединяются с протеинами и образуются аполипопротеины. Именно в таком виде они доставляются к клеткам организма. В этих апопротеинах разное соотношение липидов и белков. И как следствие этого они имеют разную плотность. Больше всего белков содержится в липопротеинах высокой плотности и поэтому они самые маленькие. Меньше всего — в хиломикронах, и из-за этого они самые крупные.

ХИЛОМИКРОНЫ
Хиломикроны собираются в слизистой оболочке кишечника, а точнее в энтероцитах.
Из липидов в хиломикронах больше всего ТАГ. Из апобелков они содержат АпоВ-48, АпоА-1, АпоА-2 и 4. АпоВ-48 входит только в состав хиломикронов.
Хиломикроны из-за своего большого размера не могут проникнуть в кровеносный сосуд, поэтому они поступают в лимфатическую систему, а только потом через подключичную вену в кровь. Для того, чтобы хиломикроны смогли путешествовать по крови, им требуется АпоС-2 и АпоЕ. Эти апопротеины они берут из ЛПВП.
В капиллярах жировой ткани и мышцах от ТАГ (которые входят в состав хиломикронов) уходят жирные кислоты (ЖК) посредством активности липопротеинлипазы(ЛПЛ), которая расположена на поверхности эндотелиальных клетках капилляров. Для того, чтобы активировалась ЛПЛ, необходимо присутствие АпоС-2.
Затем ЖК входят в клетки жировой или мышечной ткани, а глицерол идёт в печень, где превращается в 2-фосфодиоксиацетон.
Во время удаления ЖК часть фосфолипидов и апобелков переносится на ЛПВП. Как только от хиломикронов ушёл АпоС-2, происходит инактивация ЛПЛ. При этом хиломикроны превращаются в остатки хиломикронов.
Остатки хиломикронов, состоящие главным образом из холестерина, АпоЕ и АпоВ-48, доставляются и потребляются печенью посредством взаимодействия со специальным рецептором. Для того, чтобы произшло узнавание, требуется присутствие АпоЕ и АпоВ-48.
Функции хиломикронов:
-доставка ТАГ пищевого происхождения в жировую ткань;
-доставка холестерола пищевого происхождения в печень.

ЛИПОПРОТЕИНЫ ОЧЕНЬ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ (ЛПОНП)
Если мы потребили жиров и углеводов больше, чем это нужно организму, то они превратятся в печени в ТАГ.
Затем эти ТАГ упаковываются в ЛПОНП и идут в кровь для доставки к различным тканям (в основном жировой и мышечной) для продукции энергии, полученную путём окисления.
Следовательно, ЛПОНП — это молекулы, которые образовались для транспорта ТАГ эндогенного происхождения к внепечёночным тканям. Как и хиломикроны, ЛПОНП для путеществия по крови требуют АпоЕ и АпоС, которые они берут от ЛПВП. Кроме ТАГ в состав ЛПОНП входят холестерол, эфиры холестерола и апопротеины (АпоВ-100, АпоС-2 и 3, АпоЕ).
ЖК ЛПОНП освобождаются в жировой или мышечной ткани по тому же пути, что и хиломикроны (через активацию ЛПЛ).
После действия ЛПЛ ЛПОНП превращаются в липопротеины промежуточной плотности (ЛППП), которые также называются остатками ЛПОНП.
При дальнейшей потере ТАГ ЛППП превращаются в липопротеины низкой плотности (ЛПНП).
ЛИПОПРОТЕИНЫ ПРОМЕЖУТОЧНОЙ ПЛОТНОСТИ (ЛППП)
ЛППП образуются из ЛПОНП путём удаления от последних ТАГ. Дальше ЛППП либо превращаются в ЛПНП, либо непосредственно потребляются печенью.
ЛППП взаимодействуют с специальным рецептором, после этого формируется комплекс, который эндоцитозом входит в цитоплазму гепатоцитов. Для того, чтобы этот рецептор узнал ЛППП, требуется присутствие АпоВ-100 и АпоЕ, поэтому этот рецептор ещё называется АпоВ-100/ АпоЕ-рецептор.

ЛИПОПРОТЕИНЫ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ (ЛПНП)
Каждая клетка для своей жизнедеятельности требует холестерол как мембранный компонент. Это удолетворяется двумя путями: либо холестерол в клетке синтезируется de novo, либо приходит в клетку из внеклеточных источников (хиломикроны и ЛПНП).
Как было сказано выше, холестерол пищевого происхождения доставляется в печень в составе хиломикронов. Кроме того, в печени синтезируется свой собственный холестерол. Он может транспортироваться к внепечёночным тканям, если упакован в ЛПОНП. В крови ЛПОНП под действием ЛПЛ превращается в ЛПНП, поэтому ЛПОНП — первичные переносчики холестерола ко всем тканям.
Исключительный апопротеин ЛПНП — это АпоВ-100. ЛПНП потребляются клетками после взаимодействия их с рецептором. Потребление ЛПНП в основном происходит в печени, надпочечниках и жировой ткани.
В цитоплазме клетки холестерол встраивается в мембрану в тех местах, где это необходимо. Если внутриклеточного холестерола итак много, то он превращается в эфиры холестерола посредством фермента ацилКоА-холестерол ацилтрансферазы (АХАТ). Эфиры холестерола могут запасаться в клетке. Активность АХАТ увеличивается в клетках в присутствии холестерола.

Читайте также:  Анализ на непереносимость молочного белка

ЛИПОПРОТЕИНЫ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ (ЛПВП)
ЛПВП образуются de novo в печени и малом кишечнике как протеин-богатые частицы. ЛПВП не имеют холестерола и эфиров холестерола. Основные апопротеины — АпоС-1, АпоА-1, АпоС-2, АпоЕ и другие. Главная их функция — это накопление апопротеинов.
Свободный холестерол, который присутствует в остатках хиломикронов и ЛППП, может быть этерифицирован через активность лецитин-холестерол-ацилтрансферазы, которая ассоциирована с ЛПВП.

Окисление жирных кислот
Использование липидов пищевого происхождения требует того, чтобы они всосались в кишечнике. Но липиды не растворимы в водной среде кишечника, поэтому необходимо их эмульгирование. Эмульгирование осуществляется с помощью солей желчных кислот, которые синтезируются печенью.
Эмульгированные жиры могут расщепляться под действием панкреатических липаз (в основномлиназа и фосфолипаза А2). Эти ферменты, секретируемые поджелудочной железой, дают свободные ЖК и смесь моно- и диацилглицеролов из ТАГ. Панкреатическая липаза расщепляет ТАГ по первой и второй позиции последовательно, образуя 1,2-ДАГ и 2-ацилглицерол. Фосфолипиды расщепляются с помощью панкреатической фосфолипазы А2. При этом образуются свободные ЖК и лизофосфолипиды.
Потом продукты панкреатических действий липаз вступают в клетки кишечника, где заново осуществляется ресинтез ТАГ. Затем ТАГ соединяются с протеинами, формируя липопротеиновые комплексы, которые называются хиломикроны. Хиломикроны состоят из липидных капель, окружённых более полярными липидами и протеинами. ТАГ, синтезируемые в печени, упаковываются в ЛПОНП и идут прямо в кровь, в то время как хиломикроны из-за своего большого размера не могут попасть сразу в кровь и поэтому сначала идут в лимфу, а только потом в кровь.
Хиломикроны и ЛПОНП затем идут к различным тканям и органам для доставки энергии через окисление ЖК. С помощью фермента липопротеинлипаза идёт гидролиз ТАГ, которые содержаться в хиломикронах и ЛПОНП, на глицерол и свободные ЖК. Глицерол затем идёт в печень, где превращается в промежуточный продукт гликолиза — ФДА.

Мобилизация жировых депо
Основные источники ЖК для окисления — это ЖК пищевого происхождения и мобилизованные из клеточных депо. ЖК накапливаются главным образом в составе ТАГ в адипоцитах жировой ткани. Если организм нуждается в энергии, то эти ЖК, которые находятся в составе ТАГ, могут мобилизоваться для использования их периферическими тканями. Освобождение ЖК от ТАГ — это результат активности фермента гормон-чувствительной липазы.
Стимулом может быть глюкагон, эпинефрин (адреналин), бетта-кортикотропин. Эти гормоны связываются с рецепторами, которые расположены на поверхности клеток. Это ведёт к активации аденилатциклазы, возрастанию уровня цАМФ, что в свою очередь ведёт к активации протеинкиназы А, которая фосфорилирует и таким образом активирует гормон-чувствительную липазу. Этот фермент освобождает ЖК от первого и третьего углеродного атома ТАГ. Потом ДАГ расщепляются с помощью диацилглицероллипазы, а МАГ — с помощью моноацилглицероллипазы. При этом образуется один моль глицерола и три моля ЖК.
Свободные ЖК диффундируют через адипоциты, в крови связываются с альбумином и транспортируются в другие ткани, где вступают в клетки с помощью пассивной диффузии.
Но мобилизация может тормозиться многими стимулами, например, инсулином. Когда человек хорошо поел, то из клеток поджелудочной железы секретируется инсулин, который предупреждает мобилизацию ЖК из жировых депо, тормозя активность гормон-чувсвительной липазы.

Реакции окисления
Прежде чем ЖК будут окислены в митохондрии, сначала они должны активироваться в цитоплазме. Активация проходит с помощью фермента ацилКоАлигаза (ацилКоАсинтетаза или тиокиназа).
ЖК + АТФ + КоА = АцилКоА + ФФн + АМФ
Окисление ЖК проходит в митохондриях. Транспорт ацилКоА в митохондрию идёт с помощью ацилкарнитинового посредника, который образуется в результате активности карнитин-ацилтрансферазы 1, фермента, который расположен на наружной мембране митохондрий. Ацилкарнитиновая молекула затем транспортируется в митохондрию, где с помощью карнитин-ацилтрансферазы 2 идёт регенерация ацилКоА.
Каждый цикл бетта-окисления генерирует 1 моль НАДН, 1 моль ФАДН2 и 1 моль ацетилКоА, который идёт в цикл Кребса, где даёт 12 моль АТФ. Окисление олеиновой кислоты (18С) даёт 146 АТФ, в то время, как эквивалентное количество углеродных атомов глюкозы только 114 АТФ.

Альтернативные пути окисления
Большинство природных липидов содержат ЖК с чётным количеством углеродных атомов. При окислении ЖК с нечётным количеством углеродных атомов на последнем витке образуется 1 моль ацетилКоА и 1 моль пропионилКоА. ПропионилКоА потом превращается в сукцинилКоА, который идёт в цикл Кребса.
Окисление ненасыщенных ЖК точно такое же, как и насыщенных, исключая реакцию образования двойной связи. В этих случаях связь изомеризуется с помощью еноилКоАизомеразы и окисление продолжается дальше.

Регуляция метаболизма ЖК
Главным органом, который чувствует поел человек или нет, является поджелудочная железа. При низкой концентрации глюкозы в крови клетки поджелудочной железы секретируют глюкагон, а при повышенной — инсулин.
Метаболизм жиров регулируется двумя различными механизмами:
-кратковременная регуляция осуществляется через модификацию фермента.
-долговременная регуляция осуществляетяс с помощью изменения скорости синтеза фермента.

Синтез кетоновых тел
Во время высокого уровня окисления жирных кислот образуется большое количество ацетилКоА. Если в цикле Кребса его достаточно, то он идёт на синтез кетоновых тел, кетогенез.
Кетоновые тела:
-ацетоацетат
-бетта-гидроксибутират (восстановленная форма ацетоацетата)
-ацетон.
Формирование ацетоацетилКоА осуществляется путём конденсации двух молекул ацетилКоА в реакции, обратной тиолазной. АцетоацетилКоА и ещё один моль ецтилКоА превращаются в бетта-гидрокси-бетта-метилглутарилКоА (ГОМГ-КоА) с помощью фермента ГОМГ-КоАсинтетазы. Этот фермент находится в большом количестве в печени. Небольшое количество ГОМГ-КоА покидает митохондрию и затем с помощью ГОМГ-КоА редуктазы превращается в мевалонат, который является предшественником в синтезе холестерола). В митохондрии под действием ГОМГ-КоА лиазы ГОМГ-КоА превращается в ацетоацетат. Ацетоацетат может спонтанно декарбоксилироваться до ацетона или превращаться в бетта-гидроксибутират под действием бетта-гидроксибутиратДГ. Когда уровень гликогена в печени высок, то продукция бетта-гидроксибутирата возрастает.
Когда использование углеводов низкое или недостаточное, то падает уровень ЩУК. Это в свою очередь ведёт к возрастанию освобождения кетоновых тел из печени для исползования их как топливо другими тканями. В ранних стадиях голдания, когда последние остатки жиров окислились, сердце и мышцы главным образом будут потреблять кетоновые тела для того, чтобы сохранить драгоценную глюкозу, которая необходима мозгу.
Кетоновые тела используются внепечёночными тканями посредством превращения бетта-гидроксибутирата в ацетоацетат, а ацетоацетат в ацетоацетилКоА. Первый шаг — это реакция, обратная бетта-гидроксибутиратДГ-азной реакции. Второй — посредством активности ацетоацетат-сукцинилКоА трансферазы, которая также называется кетоацилКоА трансфераза.
ацетоацетат + сукцинилКоА = ацетоацетилКоА + сукцинат
Этот фермент присутствует во всех тканях, кроме печени, что позволяет печени продуцировать кетоновые тела, не используя их.


Регуляция кетогенеза

1).Освобождение свободных ЖК из жировой ткани напрямую тормозит уровень кетогенеза в печени.
2).Как только ЖК попадает в печень, то у неё есть два пути. Она может активироваться до ацил-КоА и потом окисляться, а может этерифицировать глицерол для синтеза ТАГ. Если в печени достаточно глицерол-3-фосфата, то большое количество ЖК пойдёт на синтез ТАГ.
3).Окисление ЖК регулируется гормонами посредством фосфорилированием АКК (активирует глюкагоном и ингибируется инсулином).
4).АцетилКоА может идти в цикл Кребса. Так что если клетка нуждается в АТФ, то ни о каком синтезе кетоновых тел не может быть и речи.

Биосинтез холестерола
Холестерол выполняет в организме очень важные функции:
-входит в состав мембран;
-является предшественником желчных кислот и стероидных гормонов.

Холестерол пищевого происхождения и холестерол, который синтезируется de novo, доставляются клетками через циркуляцию липопротеинов. Также транспортируются и эфиры холестерола (в этой форме холестеррол запасается в клетках).
Синтез и использование холестерола должно тщательно регулироваться, для того, чтобы предотвратить его ненормальное отложение в организме (особенно опасно его отложение в коронарных артериях).
Около половины всего холестерола организма синтезируется de novo.

АцетилКоА, который используется в синтезе холестерола, получается в окислительных реакциях (ЖК, пирувата) в митохондриях и затем транспортируется в цитоплазму тем же самым путём, который описан в синтезе ЖК.
АцетилКоА также может быть получен и в цитоплазме в результате окисления этанола- ацетилКоА-синтетазой.
Все восстановительные реакции синтеза холестерола используют НАДФН как кофактор.
Сначала конденсируются два моля ацетил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА (реакция, обратная тиолазной). Затем ацетоацетил-КоА и третий моль ацетил-КоА под действием ГОМГ-КоА-синтетазы (ГОМГ — 3-гидрокси-3-метил-глатарил) превращаются в ГОМГ-КоА. Потом ГОМГ-КоА под действием ГОМГ-КоА-редуктазы превращается в мевалонат (требуется два моля НАДФН). Мевалонат затем проходит три фосфорилирования (надо три моля АТФ), образуя 5-пирофосфо-3-фосфомевалонат. Потом — декарбоксилирование с образованием изопентенилпирофосфата (ИПФ).
ИПФ находится в равновесии с его изомером — диметилаллилпирофосфатом (ДМПП). Затем одна молекула ИПФ конденсируется с одной молекулой ДМПП и образуется геранилпирофосфат (ГПФ). ГПФ затем конденсируется с ИПФ и получается фарнезилпирофосфат(ФПФ). Затем под действием НАДФН-зависимого фермента соединяется две молекулы ФПФ и образуется сквален. Потом сквален превращается в ланостерол, а ланостерол — в холестерол.

Регуляция
ГОМГ-редуктаза:
-синтез фермента затормаживается холестеролом
-вариабельность активности в течении дня
-активность усиливает инсулин, уменьшает глюкагон.
-активность регулируется за счёт фосфорилирования/дефосфорилирования.
-ингибиторы — мевастатин, мевакор, ловастатин.

Холесерол в клетках для его запасания может превращаться в эфиры холестерола. Это происходит благодаря двум ферментам:
-ацетилКоА-холестеролтрансфераза (АХАТ)
-лецитин-холестеролацилтрансфераза (ЛХАТ).

Репликация
Механизм репликации ДНК хорошо исследован у бактерий E.coli. Он состоит из трёх различных ферментов — полимеразы 1, 2 и 3. Репликацию генома обеспечивает пол.3.
В эукариотических клетках найдено пять различных полимераз — альфа, бетта, гамма, сигма и эпселон. Пол. альфа эукариот соответствует пол.3 прокариот, пол. бетта — пол.1, а полимераза гамма ответствена за синтез митохондриальной ДНК.
Для того, чтобы ДНК-полимеразы могли реплицировать ДНК, требуется множество дополнительных белков:
1).Праймаза — это ни что иное, как РНК-полимераза, которая катализирует синтез короткого олигорибонуклеотида (4-10 нуклеотидов), т.е. праймера, с которого потом начинается синтез ДНК.
2).Хеликаза — выполняет функцию раскручивания двойной спирали ДНК.
3).ДНК-связывающие белки — препятствуют обратному скручеванию цепочек ДНК.
4).ДНК-лигаза — сшивает фрагменты Оказаки.
5).Топоизомеразы — снимают суперскручивание, разрезая цепочку ДНК.
Процесс репликации ДНК начинается в определённом месте хромосомы, требует праймер, идёт в направлении 5` — 3` на обоих цепочках одновременно и даёт точные копии цепочек.
Сначала идёт раскручивание двойной спирали ДНК с помощью хеликазы. Образовавшиеся на некоторое время одноцепочечные участки ДНК служат в качестве матрицы при репликации и стабилизируются при помощи особых белков, которые связываются с одной цпочкой ДНК и препятствуют обратному комплементарному взаимодействию цепей ДНК.
Потом праймаза катализирует синтез праймера. С праймера начинается синтез ДНК. Синтез ДНК идёт в направлении 5` — 3` посредством прикрепления 5`-фосфатной группы dНТФ к существующей свободной 3`-ОН группе праймера с последующим освобождением пирофосфата.
Синтез одной цепи осуществляется непрерывно, а другой — прерывисто.Цепочка, синтез которой осуществляется непрерывно, называется ведущая, а та, которой прерывисто, — отстающая. На отстающей цепи синтезируются короткие (100-200 нуклеотидов) фрагменты (Оказаки), которые затем сшиваются ДНК-лигазами.
Как получается так, что ДНК-полимераза копирует обе цепочки одновременно? ДНК-полимераза — это димер, ассоциированный с другими белками в репликационной вилке, которая называется реплисомой. Отстающая цепочка временно делает петлю через реплисому и ДНК-полимераза идёт вдоль двух цепочек одновременно.
Терминация наступает тогда, когда исчерпана ДНК-матрица.

Репарация
Репарация — это внутриклеточный процесс, обеспечивающий восстановление повреждённой структуры молекулы ДНК.
1).Эндонуклеаза — «узнаёт» повреждённый участок и рядом с ним разрывает нить ДНК.
2).Экзонуклеаза «вырезает» повреждённый участок.
3).ДНК-полимераза по принципу комплементарности синтезирует фрагмент ДНК на месте разрушенного.
4).Лигаза «сшивает» концы ресинтезированного участка с основной нитью ДНК.
Принципиально доказана возможность репарации молекулы ДНК при повреждении обоих цепей. При этом информация может быть считана с иРНК (фермент ревертаза).

Читайте также:  Анализ на непереносимость белка молока

Обратная транскрипция
Обратная транскрипция — это синтез ДНК на матрице РНК. В 1970г. в составе онковирусов был открыт фермент обратная транскриптаза (ревертаза, РНК-зависимая ДНК-полимераза), который катализирует биосинтез молекулы ДНК на матрице РНК.Фермент также открыт во многих клетках про- и эукариот, в частности — в лейкозных клетках, пролиферирующих тканях, включая эмбриональные ткани.
Синтез ДНК на матрице РНК включает три стадии:
1).Ревертаза синтезирует на матрице вирусной РНК комплементарную цепь ДНК, что приводит к формированию гибридной молекулы.
2).Разрушение исходной вирусной РНК из комплекса гибридной молекулы под действием РНКазы.
3).На матрице цепи ДНК комплементарно синтезируются новые цепи ДНК.
Обратная транскрипция имеетогромное значение для процессов малигнизации.

Синтез иРНК
Главный фермент синтеза иРНК — это РНК-полимераза (транскриптаза, ДНК-зависимая РНК-полимераза).
Этот фермент отличается от ДНК-полимеразы:
-РНК-полимеразы в клетке значительно больше, чем ДНК-полимеразы;
-РНК-полимераза работает с меньшей скоростью (50-100 нуклеотидов/сек, а ДНК-полимераза — 1000 нуклеотидов/сек)
-ДНК-полимераза обеспечивает большую верность, чем РНК-полимераза.
Наиболее изучена РНК-полимераза E.coli. Она состоит из пяти субъединиц — две альфа, две бетта и одна гамма. Считается, что функция гамма-субъединицы — это узнавание определённого участка на матрице ДНК, который называется промотор, куда присоединяется РНК-полимераза. Другим субъединицам фермента (core — ядро) приписывается функция инициации биосинтеза РНК (альфа), связывание субстратов и элонгация синтеза (бетта).
Сначала РНК-полимераза связывается с одной цепью нативной ДНК в определённой точке, вызывая расплетение биспиральной структуры на ограниченном участке, где и происходит ситез РНК. Потом синтез идёт в направлении 5` — 3`. К свободной 3`-ОН группе присоединяется 5`-фосфатная группа другого нуклеотидтрифосфата (НТФ) с последующим освобождением пирофосфата. Терминация идёт за счёт ро-фактора. Этот фактор обладает способностью обратимо связываться с терминирующим участком ДНК, выключая действие РНК-полимеразы. Таким образом происходит синтез пре-иРНК.
После синтез пре-иРНК у эукариот происходит процессинг, который включает:
-сплайсинг (нуклеотические и лигазные реакции)
-кепирование (образование шапочки)
-терминальные реакции полиаденилирования и метилирования.
Последовательность нуклеотидов в иРНК начинается с пары ГУ (5`-конец) и заканчивается парой АГ (3`-конец). Эти последовательности служат местами узнавания для ферментов сплайсинга.
Химический смысл кепирование сводится к присоединению 7-метилгуанозина посредством трифосфорной связи к 5`-концу молекулы иРНК.
Полиаденилирование заключается в последовательном ферментативном присоединении от 100 до 200 остатков АМФ и фрагментов ААУАА к 3`-концу иРНК. Также происходит метилирование 2`-ОН групп рибозы и N6-атомов АМФ.

Синтез белка
Синтез белка (трансляция) условно может быть разделён на 2 этапа: активирование аминокислот и собственно процесс трансляции, который состоит из инициации, элонгации и терминации.
Активирование а-т — идёт с помощью специфических аминоацил-тРНК синтетазы.
Инициация
Инициация требует специфической тРНК. Для E.coli — это тРНКфmet, для эукариот — тРНКmet. Инициация требует узнавания кодона АУГ. Сначала с помощь eIF1 и eIF3 рибосомадиссоциирует на 40S и 60S субъединицы. Потом с помощью ГТФ и eIF2 активированная тРНК, мет-тРНКmet, связывается с 40S субъединицей, формируя преинициаторный комплекс. Затем с помощью eIF4 преинициаторный комплекс (43S) связывается с инициаторным кодоном АУГ. После этого с помощью eIF5 присоединяется 60S субъединица хромосомы. То место, где произошло связывание РНК с мет-тРНКmet, называется П-центр (пептидильный), другой — называется А-центр (аминоацильный).
Элонгация
Процесс элонгации, как и инициации, требует специфических белков — EF у прокариот и еEF у эукариот. Сначала пептид, который связан с тРНК и находится в П-центре, переносится на NH2-группу аминоацил-тРНК, которая расположена в А-центре. Реакция эта катализируется ферментом пептидилтрансферазой. Для того, чтобы присоединилась следующая аминоацил-тРНК, А-центр должен быть свободным. Для этого пептидил-тРНК из А-центра перемещается в П-центр. Этот процесс называется транслокацией и катализируется ферментом пептидилтранслоказой.
Терминация
Терминация также требует специфических белков — RF у прокариот и еRF у эукариот. Стимулом для терминации являются терминирующие кодоны (УАГ,УАА,УГА). После того, как терминирующий кодон иРНК займёт своё место в А-центре, к нему не присоединится тРНК, а присоединится один из белковых факторов терминации и блокируется дальнейшая элонгация цепи. Затем иРНК покидает рибосому, которая диссоциирует на 40S и 60S субъединицы снова.

Генетический код
Генетический код — это система записи генетической информации в ДНК (иРНК) в виде определённой последовательности нуклеотидов.
Свойства генетического кода:
1).Триплетность — одной а-те соответствует три расположенных рядом нуклеотида молекулы ДНК (иРНК).
2).Вырожденность (избыточность). Количество возможных триплетов — 64, а а-т только 20, поэтому одну а-ту могут кодировать несколько триплетов.
3).Неперекрываемость — один нуклеотид входит в состав только одного триплета.
4).Универсальность — у всех живых организмах одинаковые а-ты кодируются одинаковыми кодонами.

Тиамин также называется ещё витамин В1. Тиамин происходит от замещённого пиримидина и тиазола, которые связаны метиленовым мостиком. Тиамин очень быстро превращается в активную форму, тиамин пирофосфат (ТПФ), в мозге и печени с помощью фермента тиамин дифосфотрансферазы.
ТПФ является необходимым кофактором для пируватДГ, альфа-кетоглутаратДГ и транскетолазы, катализируемой реакции пентозофосфатного пути. Недостаточность потребления тиамина ведёт к тому, что клетка неспособна генерировать энергию (ведь энергия главным образом получается из глюкозы, которая распадается до пирувата, а пируват с помощью пируватДГ превращается в ацетилКоА, который сгорает в цикле Кребса, поэтому при недостатке тиамина пируват не превращается в ацетилКоА, который является главным источником энергии).
Суточное потребление тиамина составляет 1-1,5 мг.
Клинические проявления недостаточности тиамина.
Самыми ранними симптомами недостаточности тиамина являются запор, потеря аппетита, тошнота, депрессия, периферическая невропатия и общая слабость. Хроническая недостаточность тиамина ведёт к более тяжёлым неврологическим симптомам таких как атаксия, помутнение сознания и потеря координации глаз.
Болезнь при тяжёлой недостаточности тиамина называется Бери-Бери. Она развивается либо при диете, богатой углеводами, либо при недостаточности потребления тиамина. Также может развиваться болезнь, известная как синдром Вернике-Корсакова. Этот синдром чаще развивается у алкоголиков благодаря их стилю жизни.
Рибофлавин

Известен ещё как витамин В2. Рибофлавин является предшественником коферментов флавин мононуклеотид (ФМН) и флавин аденин динуклеотид (ФАД). Ферменты, которые требуют ФМН или ФАД как кофактор, называются флавопротеины. Некоторые флавопротеины содержат металл, и тогда они называюстя металлофлавопротеины. Оба класса этих ферментов вовлечены в широкий круг редокс- реакций. В ходе этих реакций образуются восстановленные формы ФМН и ФАД, ФМНН2 и ФАДН2 соответственно. Нормальная суточная потребность в рибофлавине составляет 1,2-1,7 мг.
Клинические проявления недостаточности рибофлавина.
Недостаточность рибофлавина редко наблюдается у жителей большинства европейских стран, т.к. он содержится в нормальных количествах в хлебе, яйцах, молоке, мясе и т.д. Недостаточность рибофлавина очень часто наблюдается у хронических алкоголиков.
Симптомы, связанные с недостаточностью рибофлавина, включают глоссит, себорея, ангулярный стоматит, хеёлоз и фотофобию. Рибофлавин разрушается на свету, поэтому недостаточность рибофлавина может возникнуть у новорожденных, которые лечатся от гипербилирубинемии фототерапией.
Ниацин

Ниацин (никотиновая кислота, никотинамид) известен также под названием витамин В3. Как никотиновая кислота, так и никотинамид могут служить как пищевые источники витамина В3. Ниацин требуется для синтеза активных форм витамина В3, никотинамид аденин динуклеотид (НАД+) и никотинамид аденин динуклеотид фосфат (НАДФ+). НАД+ и НАДФ+ являются кофакторами для значительного числа дегидрогеназ, например лактатДГ, малатДГ.
Ниацин может синтезироваться из аминокислоты триптофана. Однако эта возможность использованиятриптофана для синтеза ниацина ограничена. Из 60 мг триптофана образуется только 1 мг ниацина, кроме того для этого синтеза требуется присутствие витаминов В1, В2 и В6, которых не всегда присутствует в организме в избытке.
Рекомендованая суточная потребность для ниацина составляет 13-19 мг.
Клинические проявления недостаточности ниацина.
Недостаточное потребление ниацина (как и триптофана) ведёт к глосситу, дерматиту, потере веса, диарее, депрессии и деменции. Такие симптомы как депрессия, дерматит и диарея объединены в одно состояние, которое называется пеллагра. Некоторые физиологические состояния организма (например болезнь Хартнупа), а также применение некоторых лекарств может привести к недостаточности ниацина. При болезни Хартнупа страдает всасывание триптофана. Из лекарств можно выделить изониазид, который является основным лекарством для лечения туберкулёза.
Никотиновая кислота (не никотинамид) при назначении фармакологических доз (2-4 г/день) понижает уровень холестерола в крови, поэтому это используется для лечения гиперхолестеролемии. Это связано с тем, что никотиновая кислота уменьшает мобилизацию ЖК из жировых депо. Также никотиновая кислота исчерпывает депо гликогена, что ведёт к возрастанию уровня глюкозы в крови, поэтому терапия никотиновой кислотой не рекомендуется диабетикам и больным подагрой.
Пантотеновая кислота.


Также известна как витамин В5. Пантотеновая кислота образуется из аланина и пантоевой кислоты. Пантотеновая кислота требуется для синтеза коэнзимА (КоА), а также как компонент ацилпереносящего белка, который используется для синтеза ЖК. Следовательно, пантотеновая кислота используется для метаболизма углеводов в цикле Кребса и метаболизма всех жиров и белков.
Недостаточность пантотеновой кислоты набдюдается очень редко, т.к. она широко распространена в пищевых продуктах.
Витамин В6

Пиридоксаль, пиридоксамин и пиридоксин в общем известны как витамин В6. Все три компонента превращаются в биологически активную форму витамина В6, пиридоксальфосфат. Это превращение катализируется пиридоксаль киназой.
Пиридоксальфосфат как кофактор используется в реакциях трансаминирования аминокислот, а также в гликогенолизе как кофактор гликогенфосфорилазы. Суточная потребность в витамине В6 составляет 1,4 — 2,0 мг. Во время беременности и лактации потребность в витамине В6 возрастает на 0,6 мг в день.
Недостаточность витамина В6 бывает редко и обычно ассоциируется с недостаточностью других витаминов из группы В. Недостаточность в этом витамине может возникнуть при применении изониазида (используется для лечения туберкулёза) и пенициллинамина (используется для лечения ревматоидного артрита).



Биотин сам является коферментов для ферментов, которые используются в реакциях карбоксилирования (ацетилКоА карбоксилаза и пируват карбоксилаза). Биотин содержиться во многих продуктах, а также синтезируется нормальной микрофлорой, поэтому его недостаточность наблюдается очень редко. Недостаточность возникает при применении лекарств, которые влияют на микрофлору, а также при чрезмерном потреблении сырых яиц. Последнее связано с тем, что в яйцах содержится белок авидин, который препятствует абсорбции биотина.

Кобаламин более известен как витамин В12. Витамин В12 состоит из тетрапиррольного кольца и иона кобальта в центре. Витамин В12 синтезируется исключительно микроорганизмами и найден в печени животных, связанного с белком в виде метилкобаламина или 5-деоксиаденозилкобаламин. Витамин может освобождаться от белка, и тогда он становится активным. Освобождение осуществляется в желудке с помощью желудочного сока или трипсина после потребления мяса. Витамин потом связывается с фактором Касла, который снтезируется париетальными клетками желудка, и в таком виде происходит его всасывание.
В организме человека имеется только две реакции, которые требуют витамин В12 как кофактор. В ходе катаболизма ЖК с нечётным числом углеродных атомов и в катаболизме валина, изолейцина и треонина конечным продуктом является пропионилКоА, который превращается в сукцинилКоА для окисления его в цикле Кребса. Одним из ферментов для этого превращения является метилмалонилКоА мутаза, который требует витамин В12 как кофактор в превращении метилмалонилКоА в сукцинилКоА.
Второй реакцией, которая требует витамин В12 как кофактор, является превращение гомоцистеина в метионин. Ферментом этой реакции является метионин синтаза.
Клинические проявления недостаточности витамина В12.
Печень может накапливать витамин В12, поэтому его недостаточность встречается очень редко. При недостаточности витамина В12 развивается мегалобластическая анемия, которая в этом случае называется пернициозная анемия. Это наблюдается при недостатке фактора Касла, который необходим для всасывания В12. Анемия является результатом того, что страдает синтез пуриновых и пиримидиновых оснований, а следовательно и синтез ДНК. В синтезе нуклеотидов используется N5-метилТГФК, а для этого необходимо действие метионин синтазы, коферментом которого является витамин В12.
Также неврологическим осложнением недостаточности витамина В12 является демиелизация нервных клеток. Считается, что демиелинизация связана с возрастанием метилмалонилКоА, потому что он является ингибитором малонилКоА, который используется в синтезе ЖК. Это в свою очередь ведёт к нарушения синтеза миелина и деструкции миелиновой оболочки.

Фолиевая кислота

Фолиевая кислота состоит из трёх частей: птеридиновое кольцо, пара-аминобензойная кислота и глутаминовая кислота. Фолевая кислота содержится в дрожжах, листьевых овощах, печени животных и др.
В клетках фолиевая кислота превращается в тетрагидрофолиевую кислоту с помощью фермента дигидрофолат редуктазы. ТГФК переносит различные формы одноуглеродных радикалов (метил, метилен, метенил, формил) в ходе различных реакций. Эти реакции требуются в синтезе серина, метионина, глицина, холина и пуриновых нуклеотидов и дТМФ.
Клинические проявления недостаточности фолиевой кислоты.
Недостаточность фолиевой кислоты связана в первую очередь с нарушением синтеза ДНК. Это ведёт к остановке клеточного цикла быстро пролиферирующих клеток, в частности гемопоэтических клеток. В результате возникает мегалобластическая анемия как и при витамине В12.
Недостаточность фолиевой кислоты из-за его широкого распространения в продуктах встречается редко. Очень часто наблюдается у алкоголиков. У неалкоголиков главными причинами недостаточности является нарушения абсорбции, метаболизма витамина или его повышенной потребности. Например, во время беременности потребность в витамине возрастает. Это происходит благодаря увеличению быстро пролиферирующих клеток. Такие лекарства как антиконвульсанты и оральные контрацептивы ведут к нарушению абсорбции фолиевой кислоты.

Читайте также:  Анализ на потерю белка что показывает

Дата добавления: 2016-02-24 ; просмотров: 1312 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

источник

Можно выделить следующие этапы выяснения первичной структуры белков и пептидов:

1. Выделение белка в чистом виде и определение его молекулярной массы

2. Определение аминокислотного состава

3. Определение N-концевой аминокислоты

4. Определение С-концевой аминокислоты

5. Определение аминокислотной последовательности

Выделение белка в чистом виде. Как правило, исходный материал содержит много различных белков. В связи с этим возникает проблема выделения из этой смеси интересующего белка в чистом виде. При очистке белков используются методы, которые основаны на разнице:

1.Поверхностного заряда белков

2.Молекулярного размера белков (зависящего от их молекулярной массы)

3.Биологической активности вследствие связывания с субстратами или ингибиторами

Разделение белков по разнице величины поверхностного заряда. Суммарный поверхностный электрический заряд белка при данном значении рН может быть отрицательным, нейтральным или положительным. Для разделения белков с различным зарядом, подобно тому, как это было в случае аминокислот, может быть использован метод ионообменной хроматографии (см. выше). Концентрацию белка в пробирках с элюатом определяют с помощью спектрофотометра по интенсивности поглощения ультрафиолетового света и строят графическую зависимость её от объема вытекшей из хроматографической колонки жидкости.

Разделение белков по молекулярной массе. Если представить молекулы белков в виде шариков различной величины, размер которых зависит от их молекулярной массы, то окажется, что у больших шариков будет большей молекулярная масса или размер молекул. Это означает, что белки можно разделить подобно частичкам в сите — молекулярном сите, образованном гелем. Такой способ часто называют гель-фильтрацией или хроматографией исключения размером. Ниже приводится иллюстрация того, как с помощью гель-фильтрации удается разделить смесь белков различного размера (рис.1.12).

Хроматографическую колонку заполняют набухшим гелем. Частицы геля приготовлены из связанного поперечными сшивками полисахаридного материала и содержат большое количество микропор. Размер микропор подбирают таким образом, чтобы в них проникали меньшие из разделяемых молекул, в то время как большие этого сделать не могли. Смесь разделяемых белков наносят на верхнюю часть колонки и элюируют буферным раствором. Увлекаемые током нисходящей жидкости большие молекулы, не имея возможности проникнуть в поры гелевых частиц, будут двигаться быстрее. Меньшие молекулы проникают в поры и задерживаются там. Если собирать вытекающий из колонки раствор равными порциями в пробирки, то окажется, что в более ранних порциях вытекающей жидкости будут содержаться белки больших размеров, а в более поздних — меньших размеров. Путем подбора размера пор можно добиться разделения самых разных смесей белков.

Рис.1.12. Схематическое изображение разделения белков методом гель-фильтрации

Если учесть, что размер молекулы зависит от молекулярной массы, то оказывается, что разделяя белки методом гель-фильтрации, одновременно можно установить его молекулярную массу.

Рис.1.13. График зависимости молекулярной массы белков от объема выхода их из хроматографической колонки в ходе гель-фильтрации

Объем вытекающего из колонки элюата обратнопропорционален логарифму молекулярной массы белка. Таким образом, достаточно знать объем жидкости, в котором вышел из колонки интересующий белок, чтобы, пользуясь подобным графиком, можно было установить его молекулярную массу (рис.1.13).

Ещё одним методом, который позволяет разделить белки в зависимости от их молекулярной массы, является гель-электрофорез (см. выше).

Ультрацентрифугирование. Если встряхнуть сосуд, заполненный песком с водой, а затем поставить его на ровную поверхность, то песок быстро осядет на дно благодаря силе земного притяжения. С высокомолекулярными веществами, находящимися в растворе, этого не произойдет, так как тепловое (броуновское) движение сохраняет их равномерное распределение в растворе. Оседание макромолекул, подобно песчинкам, произойдет, только если их подвергнуть значительному ускорению.

В 1923 году шведский биохимик Т. Сведберг впервые использовал ультрацентрифугирование. При скорости вращения ротора 80000 об/мин ему удалось показать, что многие белки состоят из субъединиц. Позже ультрацентрифугирование стало незаменимым методом для разделения белков, нуклеиновых кислот и субклеточных частиц.

Рис.1.14. Схематическое изображение зонального ультрацентрифугирования.

Образец наслаивают на градиент сахарозы (слева). После центрифугирования (середина) каждая частица осаждается на уровне, зависящем от его массы. После остановки ротора центрифужную пробирку прокалывают и разделенные частицы (зоны) собирают в пробирки (справа).

Осаждение проводят в растворе химически инертного вещества (сахарозы или CsCl), концентрация которого и, следовательно, плотность увеличивается в направлении от поверхности до дна центрифужной пробирки. Использование таких градиентов плотности значительно усиливает разрешающую способность ультрацентрифуги. Различают зональное препаративное ультрацентрифугирование (рис.1.14) и ультрацентрифугирование в равновесном градиенте плотности (изократное ультрацентрифугирование) (рис.1.15).

Разделение белков по разнице биологической активности вследствие связывания с лигандами. Характерной особенностью белков является их способность прочно связываться с различными молекулами, но нековалентными связями. На этом основан метод разделения белков аффинной хроматографией (рис.1.16).

Рис.1.16. Схематическое изображение принципа иммуноаффинной хроматографии

Антиген — лиганд для выделяемого белка. Антитело — выделяемый белок.

Молекулы веществ, с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного матрикса. Тогда они выполняют роль своеобразных «рыболовных крючков», задерживающих необходимый белок. Все остальные белки транзитом проходят через колонку. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии такие же молекулы, которые выполняли роль «рыболовных крючков», или с помощью какого-нибудь другого реактива, способного нарушить это взаимодействие. Одним из вариантов этого метода является иммуноаффинная хроматография. Тогда антитела к определенному белку присоединяют к частицам сорбента. Они обеспечивают с очень высокой специфичностью задержку в колонке этого белка (рис.1.16).

Определение аминокислотного состава белка.До определения аминокислотной последовательности выделенного белка желательно иметь представление о его аминокислотном составе, то есть знать, какие аминокислоты и в каком количестве входят в состав его молекулы. Для этого проводят полный гидролиз белка с последующим количественным анализом высвободившихся аминокислот. Чаще используют кислотный гидролиз. Полипептид растворяют в 6N НCl в отсутствие кислорода, чтобы предотвратить окисление серусодержащих аминокислот. Смесь нагревают до 100-120 0 С и выдерживают при этой температуре в течение 10-100ч. К сожалению при этом способе гидролиза некоторые аминокислоты (Сер, Три, Тир, Глн, Асн) разрушаются.

Аминокислотный состав полипептидного гидролизата определяют с помощью автоматического аминокислотного анализатора. Прибор разделяет аминокислоты посредством ионообменной хроматографии (см. выше). Их идентифицируют по элюционному объему и количественно учитывают по интенсивности флюоресценции после проведения реакции с дансилхлоридом. Современные аминокислотные анализаторы проводят анализ гидролизата белка в течение 1ч с чувствительностью, которая позволяет определить до 1 пикомоля аминокислоты.

Определение N-концевой аминокислоты.Имеется несколько эффективных подходов, с помощью которых можно идентифицировать N-концевую аминокислоту. 1-Диметиламинонафталин-5-сульфонилхлорид (дансил хлорид) взаимодействует с первичными аминами с образованием дансилированного полипептида. Последующее проведение кислотного гидролиза позволяет высвободить из полипептидной цепи N-концевую аминокислоту в виде дансил-аминокислоты, обладающей интенсивной желтой флюоресценцией (рис.1.17).

Рис.1.17. Этапы определения N-концевой аминокислоты методом дансилирования

Благодаря этому дансил-производное аминокислоты можно идентифицировать хроматографически.

Ещё более популярным методом идентификации N-концевой аминокислоты является разрушение по Эдману (Pehr Edman — автор метода). Фенилизотиоцианат (ФИТЦ, реактив Эдмана) взаимодействует с N-концевой аминогруппой белков в слабо щелочной среде (рис.1.18). В результате образуется фенилтиокарбамильный продукт. Его обрабатывают безводной сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота. При этом тиазолиновое производное N-концевой аминокислоты отщепляется, в то время как остальные пептидные связи не подвергаются гидролизу. Тем самым разрушение по Эдману заключается в отщеплении остатка только N-концевой аминокислоты и сохранении оставшейся части полипептидной цепи.

Рис.1.18. Этапы определения N-концевой аминокислоты методом Эдмана

Тиазолиновое производное аминокислоты избирательно экстрагируют органическим растворителем и превращают в более стабильное фенилтиогидантоиновое производное. Последнее можно идентифицировать сравнением с известными стандартами при проведении тонкослойной хроматографии, электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии или газо-жидкостной хроматографии.Наиболее важным преимуществом расщепления по Эдману по сравнению с другими методами определения N-концевой аминокислоты является то, что, проводя повторно с одним и тем же пептидом эту процедуру, каждый раз можно идентифицировать новую N-концевую фенилгидантоин-аминокислоту, выясняя таким образом аминокислотную последовательность.

Идентификация С-концевой аминокислоты. Один из подходов заключается в использовании ферментов — карбоксипептидаз (катализирует отщепление от пептида С-концевой аминокислоты). Карбоксипептидазы, подобно другим ферментам, обладают субстратной специфичностью, то есть они катализируют отщепление определенных аминокислот. Вместе с тем, наличие рядом с С-концевой аминокислотой остатка Про делает невозможной её отщепление под влиянием карбоксипептидазы. В этом случае наиболее надежным считается метод гидразинолиза. Полипептид обрабатывают безводным гидразином при температуре 90 0 С в течение 20-100ч в присутствии ионообменного сорбента (в качестве катализатора). При этом разрушаются все пептидные связи, а из высвобождающихся аминокислот образуются гидразиды. Но С-концевая аминокислота высвобождается как свободная и поэтому её можно идентифицировать хроматографически.

Определение аминокислотной последовательности. Установление концевых аминокислот в исследуемом пептиде позволяет в дальнейшем определить всю его аминокислотную последовательность. Для этого обычно проводят повторное разрушение по Эдману (см. выше) в автоматическом приборе — секвенаторе, который был предложен П. Эдманом и Г. Бэгом. Современный такой прибор определяет 1 аминокислотный остаток в час. Таким способом можно установить последовательность расположения 40-60 остатков аминокислот. Затем накапливаются незавершенные реакции, продукты побочных реакций. Наряду с потерей самого пептида они делают малоинформативной и ненадежной дальнейшую идентификацию аминокислот. Чтобы установить последовательность их расположения в больших полипептидных молекулах, их подвергают расщеплению ферментативным или химическим путем на фрагменты с размерами, достаточными для проведения секвенирования (рис.1.19).

Рис.1.19. Аминокислотную последовательность полипептидной цепи определяют, совмещая перекрывающиеся последовательности фрагментов пептида. В данном случае после расщепления исследуемого пептида трипсином (катализирует разрыв пептидных связей, в образовании которых участвует карбоксильные группы Арг и Лиз), а в другом случае — бромцианом (CNBr) (катализирует разрыв пептидных связей, в образовании которых участвует Мет) были получены два набора пептидных фрагментов. Порядок связывания первых двух фрагментов, образовавшихся в результате действия трипсина, устанавливается на основании того наблюдения, что фрагмент Гли-Ала-Лиз-Лей-Про-Мет (результат расщепления CNBr) имеет последовательность аминокислот на N и С — концах, включающую N и С — концы двух трипсиновых фрагментов. Иными словами, обнаружение накладывающихся участков позволяет установить последовательность расположения пептидных фрагментов, то есть аминокислотную последовательность всего исследуемого пептида.

Исследование последовательности нуклеотидов ДНК — рутинная операция в молекулярной биологии.Этот метод в последнее время вытеснил другие методы исследования первичной структуры белков. Зная последовательность нуклеотидов, можно легко установить последовательность аминокислот (более подробное описание этого метода см. в главе 13).

Метод пептидных карт.Процесс определения аминокислотной последовательности в белке — процедура достаточно длительная. Её можно существенно ускорить в случае выяснения аминокислотной последовательности гомологичного белка[2], если у сравниваемого белка она уже известна. Метод носит название «метод пептидных карт» или «метод отпечатков пальцев». Он включает в себя сочетание хроматографии и электрофореза на бумаге продуктов неполного гидролиза сравниваемых белков. При этом пептидные фрагменты, отличающиеся аминокислотной последовательностью, будут обладать разной подвижностью по сравнению с таковыми у исходного белка (рис.1.21).

Рис.1.21. Сравнение «отпечатков пальцев» (окраска нингидрином) продуктов расщепления трипсином (а) гемоглобина А и (б) гемоглобина S. Пептиды, отличающиеся по подвижности, обведены квадратом. Они включают в себя 98 аминокислот, расположенных на N-конце b-субъединицы гемоглобина. Различие заключается в замене 6-ой аминокислоты (Глю) в составе Hb A на Вал в составе Hb S.

источник