Меню Рубрики

Качественный и количественный анализ белка

КАЧЕСТВЕННОЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА — часть 1

Присутствие белков в пищевых объектах устанавливается с помощью качественных реакций, которые условно разделяют на две группы: а) цветные реакции; б) реакции осаждения.

Среди первой группы различают универсальные реакции (биурето-вая на пептидные связи и нингидриновая на а-аминокислоты) и специфические, обусловленные присутствием в белках остатков определенных аминокислот. Так, ксантопротеиновая реакция свидетельствует о наличии в белках остатков ароматических аминокислот, реакция Паули — гистидина и тирозина, Адамкевича и Вуазене — триптофана, нитропрус -сидная — цистеина, а реакция Сакагучи — аргинина. По результатам специфических реакций ориентировочно можно судить о пищевой ценности белков.

Во второй группе реакций белки осаждают действием солей, органических растворителей, концентрированных кислот, щелочей, ионов тяжелых металлов, температуры и в изоэлектрической точке. Белки в растворенном состоянии крайне неустойчивы, поэтому при добавлении органических растворителей (спирт, ацетон), концентрированных растворов нейтральных солей щелочных металлов и воздействии физических факторов (нагревание, облучение, ультразвук) гидратная оболочка разрушается и они выпадают в осадок.

Так как белковые вещества сырья (муки, крупы, молока, мяса), включая ферменты, часто являются определяющими в обеспечении качества пищевых изделий, то для изучения физико-химических, биохимических и физиологических свойств этих соединений обязательным условием является получение белков в индивидуальном и, по возможности, недена-турированном состоянии. Белки обычно теряют природные (нативные)

свойства (растворимость, гидратацию, ферментативную активность и т.д.), подвергаясь денатурации под влиянием различных факторов. Типичным примером необратимой денатурации белков является выпадение их в осадок под действием ТХУ. Длительный контакт со спиртом также приводит к необратимой денатурации белка. Денатурирующее действие различных факторов на белки можно смягчить, если проводить операции выделения их при температуре не выше +4°С.

Методы выделения и очистки белков. Общая схема операций по выделению белков сводится к измельчению биологического материала (гомогенизации), экстрагированию и собственно выделению, то есть очистке и получению белка в индивидуальном состоянии. При изучении метаболических процессов в живых организмах (в созревшем зерне, плодах, овощах) морфологическая и биохимическая целостность клеток и тканей сохраняется в максимальной степени, тогда как при исследовании состава сырья и готовых пищевых продуктов потеря целостности структуры несущественна. Гомогенизацию объектов следует рассматривать как начальную стадию выделения белков, но способ ее определяется постановкой задачи. Например, анализ ферментов из растительных материалов часто затруднен тем, что при гомогенизации экстрагируется большое количество фенолов, которые взаимодействуют с карбонильными группами пептидных групп при помощи водородных связей и вызывают денатурацию белка и потерю ферментами своей активности. Добавление в экстракт поливинилпирролидона, образующего с фенолами нерастворимые комплексы, предотвращает инактивацию ферментов.

Разрушение клеточной структуры осуществляется тщательным измельчением материала в гомогенизаторах, мельницах, попеременным замораживанием и оттаиванием, применением ультразвуковых высокочастотных колебаний, пресс-методов с использованием высоких давлений и метода «азотной бомбы». В последнем случае клетки насыщаются азотом под давлением, которое затем сбрасывается и клетки разрушаются. Эффективность гомогенизации зависит не только от способа разрушения клеточных структур, но и от вида анализируемого материала. Животные клетки разрушаются относительно легко, особенно в отсутствие сосудистой и соединительной ткани, тогда как растительные и микробные — из-за присутствия клеточных стенок — трудно. В таком случае применяют методы растирания материала с твердыми веществами (песок, абразивный порошок) или обработку клеточных стенок лизоцимом или ферментными препаратами, содержащими целлюлазу, хитиназу и липазу. Гомогенизацию рекомендуется проводить в холодных комнатах или с использованием льда.

Экстракция белков может быть совмещена с гомогенизацией клеток и тканей либо проведена отдельно, если продукт заранее измельчен. Для

определения ферментативной активности белка достаточно одноразовой экстракции, тогда как для количественного определения белковых фракций зерна — трех- или пятикратной. Условия экстрагирования белков (время, гидромодуль, температура и т.д.) подбираются эмпирически, основываясь на методиках ведущих научных школ.

Большинство белков животных тканей хорошо растворимы в 5—10% растворах солей, тогда как для перевода в раствор белков зерновых культур применяют более широкий набор растворителей. Для этого используются буферные системы со значениями pH от кислых до слабощелочных (фосфатные, боратные, цитратные. трис-HCl), органические растворители и неионные детергенты, разрывающие белок-липидные или бе-лок-белковые связи:

Растворители подбираются с учетом разрыва в белках определенных типов связей. Так, уксусная кислота ослабляет ионные связи, сообщая молекулам одноименные положительные заряды, мочевина — водородные и гидрофобные, салицилат натрия и ДЦС-Na — гидрофобные и ионные, а водные растворы спиртов — водородные и гидрофобные взаимодействия. Органические растворители разрывают белок-липидные связи.

При изучении физико-химических свойств белков и их превращений в пищевых системах широко используют методы фракционирования и очистки от небелковых соединений. Они основаны на различиях таких свойств белков, как размер молекул, растворимость, заряд и сродство к специфическим химическим группам.

Осаждение белков из раствора под действием солей щелочных и щелочноземельных металлов называют высаливанием. Для высаливания чаще применяется сульфат аммония, под влиянием которого белки, как правило, сохраняют растворимость и ферментативную активность. Главную роль при высаливании играет не природа солей, а валентность ионов, действие которых оценивается по ионной силе (м):

Глобулины выпадают в осадок при 50% насыщении, альбумины — при 100% насыщении растворов солей, а при ступенчатом фракционирова-нии (20—100% насыщения) выпадают белки и других классов (проламины, глютелины).

В практике выделения и очистки белков используются различные типы хроматографии: адсорбционная, распределительная, ионообменная и хроматография по сродству. Адсорбционная хроматография основана на различиях в полярности белков. В колонке вместе с буферным раствором упаковывают адсорбент, на который в небольшом объеме растворителя наносят исследуемый образец. Компоненты разделяемой смеси адсорбируются, затем элюируются с помощью буферного раствора с увеличивающейся концентрацией или полярностью. Фракции белка собирают с помощью автоматического коллектора фракций.

источник

Количественный анализ белков

Для количественного определения белков в биологическом материале или лекарственных препаратах чаще всего употребляются азотометрия, фотоколориметрия, фотонефелометрия и спектрофотометрия.

Азотометрия основана на определении содержания азота белка после минерализации исследуемого образца. Поскольку белки содержат в среднем 16% азота, то найденное количество его умножают на 6,25 (так как 100:16=6,25) и получают содержание белка в пробе. Эти методы (к ним относится классический метод Кьельдаля и его модификации) очень трудоемки и не всегда надежны, так как процентное содержание азота в разных белках колеблется от 14 до 19.

Фотоколориметрическиеметоды основаны на так называемых «цветных» реакциях на функциональные группы белков. Среди них наибольшее применение нашли биуретовая реакция на пептидные группы и реакция Фолина на ароматические радикалы аминокислот (тирозин, триптофан). Биуретовый метод более специфичен, так как пептидные связи имеются только в белках и пептидах. Он широко применяется в клинико-биохимических исследованиях. Метод Лоури, основанный на реакции Фолина, высокочувствительный, но малоспецифичный, поскольку сходную окраску дают свободные ароматические аминокислоты и многие другие соединения, содержащие фенольную группу.

Фотонефелометрические методы определения содержания белка основываются на оценке степени мутности его взвеси в растворах. Эти методы не получили широкого распространения.

Спектрофотометрические методы делятся на прямые и косвенные. Последние представляют собой боле чувствительный и точный вариант фотоколориметрического. После проведения цветной реакции на белки проводят спектрофотометрию окрашенного раствора и по светопоглощению его в монохроматическом свете рассчитывают содержание белка.

Прямой метод состоит в измерении светопоглощения раствора белка в ультрафиолетовой области при 200-220 нм (в этой области абсорбируют пептидные группы белка) и при 280 нм (зона поглощения ароматических радикалов аминокислот, в основном триптофана и тирозина). Эти методы весьма удобны и не требуют предварительного образования окрашенных комплексов. Более специфична спектрофотометрия при 200-220 нм, чем при 280 нм, так как в последнем случае мешает светопоглощение различных низкомолекулярных ароматических соединений, содержащихся в биологическом материале.

Реактивы. Биуретовый реактив * ; хлорид натрия, 0,9%-ный раствор.

Оборудование. Микропипетки и пипетки вместимостью 1 и 5 мл; штатив с пробирками; стеклянные палочки; фотоэлектроколориметр (ФЭК); спектрофотометр (СФ).

Материалы. Сыворотка крови; альбумин, 10%-ный раствор.

а. Биуретовый метод определения содержания белка в сыворотке крови. Метод основан на способности пептидных связей белков и полипептидов образовывать с ионами Cu 2+ в щелочной среде комплексное соединение фиолетового цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию белка в среде.

Ход определения. Для определения содержания белка в сыворотке крови или в других объектах, содержащих белок, необходимо построить калибровочный график. Для этого применяют стандартный белок – кристаллический альбумин сыворотки крови.

Схема разведения альбумина для построения калибровочного графика приведена в таблице:

№ пробирки Стандартный 10%-ный раствор альбумина, мл 0,9%-ный раствор хлорида натрия, мл Концентрация белка, г/л Экстинкция
0,4 0,6
0,6 0,4
0,8 0,2
1,0

Из каждой пробирки с разведенным стандартным раствором альбумина берут по 0,1 мл раствора и добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое смешивают встряхиванием.

Через 30 мин измеряют экстинкцию каждой пробы на ФЭКе против контрольного раствора (0,1 мл 0,9%-ного раствора NaCl + 5,0 мл биуретового реактива) в кювете толщиной 1 см, длина волны 540-560 нм (светофильтр зеленый).

По полученным данным строят калибровочную кривую, откладывая по оси ординат значения экстинкции, по оси абсцисс – концентрацию белка.

Берут 2 пробирки – в одну наливают 0,1 мл исследуемой сыворотки, в другую (контрольную) – 0,1 мл раствора хлорида натрия. В обе пробирки добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое смешивают встряхиванием.

Через 30 мин измеряют экстинкцию исследуемого раствора на ФЭКе в кювете толщиной 1 см при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против контрольного раствора.

Содержание белка в сыворотке крови находят по калибровочной кривой.

б. Спектрофотометрический метод определения содержания белка в сыворотке крови. Метод основан на светопоглощении при 280 нм ароматических радикалов тирозина, триптофана и в меньшей степени фенилаланина, содержащихся в белке. Однако при данной длине волны поглощают и нуклеиновые кислоты, хотя их максимум абсорбции приходится на 260 нм. Поэтому измерение экстинкции раствора проводят при 260 и 280 нм, чтобы сделать поправку на примесь нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Метод неприменим к материалу, где содержание нуклеиновой кислоты превышает 20%.

Ход определения. В пробирку вносят 0,1 мл сыворотки крови и добавляют 9,9 мл раствора хлорида натрия. Содержимое перемешивают стеклянной палочкой.

Измеряют экстинкцию исследуемого раствора против контрольного раствора хлорида натрия на спектрофотометре в кювете толщиной 1 см при двух длинах волн – 260 и 280 нм.

Расчет можно проводить по формуле, эмпирически полученной Калькаром (поэтому можно не прибегать к калибровочному графику):

где х – концентрация белка в растворе, г/л.

Оформление работы. По калибровочной кривой рассчитать содержание белка. Сравнить результаты, полученные биуретовым методом и спектрофотометрическим. Сделать вывод о наличии отклонения концентрации белка в исследуемой сыворотке крови от нормы и о возможных его причинах.

Практическое значение работы. Сыворотка крови содержит смесь белков, различных по физиологическому значению, структуре и физико-химическим свойствам (более 100 различных белков плазмы крови). Нормальное содержание белка в сыворотке крови (нормопротеинемия) составляет 65-85 г/л. Определение общего белка в сыворотке крови находит широкое применение в практической медицине, так как по изменению его нормального содержания можно судить о различных нарушениях в организме. Повышенное содержание белка (гиперпротеинемия) относительно редко: при сгущении крови из-за потери жидкости (длительная рвота, усиленное потоотделение, холера, тяжелые ожоги и т.п.), при некоторых хронических воспалительных процессах вследствие образования антител (ревматизм, полиартрит). Пониженное содержание белка в крови (гипопротеинемия): при недостаточном поступлении белка с пищей (голодание, нарушение проходимости кишечного тракта), при нарушении образования белка в органах (при поражении печени химическими веществами, опухолями, микроорганизмами и т.д.), при потере белка организмом (кровотечения, повышенная проницаемость сосудов, заболевания почек, беременность и т.д.).

В фармацевтической практике количественные методы определения белка необходимы для контроля белковых лекарственных средств (вакцин, сывороток, γ-глобулина, белковых препаратов крови и т.д.).

Дата добавления: 2014-11-06 ; Просмотров: 3797 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник

цветные осаждения Без минерализации с минера-

метод Биуретовый методы, методы метод Лоури метод основанные УФ- Къельдаля

Рисунок 3.2 – Методы определения белка

Для наблюдения реакции в пробирки наливают по 1-2см 3 белка с равным количеством 4 % раствора щёлочи и добавляют 1-2 капли 0,5% раствора медного купороса.

Реакцию дают все белки, а так же продукты их гидролиза -пептоны и пептиды, начиная с тетрапептидов.

Другой качественной реакцией на белки, содержащие α – аминокислоты является нингидриновая реакция. Нингидрин в концентрации 0,1 % реагирует с равным объёмом раствора белка NН2— группами, содержащимися в α – положении при нагревании с последующим охлаждением придаёт системам синее окрашивание.

Существуют также частные реакции на белки, связанные с присутствием фенольных и гетероциклических групп.

Во второй группе реакций белки осаждают действием солей, органических растворителей, концентрированных кислот, щелочей, ионов тяжёлых металлов, температуры и в изоэлектрической точке. Белки в растворённом состоянии крайне неустойчивы, поэтому при добавлении органических растворителей (спирт, ацетон), концентрированных растворов нейтральных солей щелочных металлов и воздействий физических факторов (нагревание, облучение, ультразвук) гидратная оболочка разрушается и они выпадают в осадок.

Так как белковые вещества сырья (муки, крупы, молока, мяса), включая ферменты, часто являются определяющими в обеспечении качества пищевых изделий, то для изучения физико-химических, биохимических и физиологических свойств этих соединений обязательным условием является получение белков в индивидуальном и, по возможности, неденатурированном состоянии. Белки обычно теряют природные (нативные) свойства (растворимость, гидратацию, ферментативную активность и т.д.), подвергаясь денатурации под влиянием различных факторов.

Наиболее распространённым количественными методами являются метод Кьельдаля, Лоури с реактивом Фолина, Войвуда в модификации Т.А. Глагоревой, К.А. Мерка.

Содержание белка в пищевых объектах обычно определяют по количеству азота с использованием метода Кьельдаля. С целью упрощения и сокращения длительности анализа этот метод с момента его разработки (1983) неоднократно модифицировался с применением различных катализаторов и условий минерализации. На основе модифицированных методов созданы высокопроизводительные автоматические анализаторы типа «Кьельфос», стоимость определения содержания белка на которых и сегодня остаётся высокой.

Метод основан на минерализации навесок при нагревании с концентрированной серной кислотой в присутствии катализаторов. Аммиак отгоняют в раствор борной кислоты и оттитровывают его 0,1н. раствором серной кислоты. Объём кислоты, пошедший на титрование, умножают на титр по азоту и узнают содержание азота в пробе.

Читайте также:  Общий анализ следы в белке

Химическая реакция аммиака с борной кислотой идёт с образованием метаборной кислоты из ортоборной (Н3ВО3НВО2 + Н2О). Сама борная кислота очень слабая и не оказывает влияния на концентрацию ионов водорода. Реакция идёт следующим образом: NH3 + HBO2 = NH4 + + BO2 — . Полученный в результате анион ВО2 — оттитровывают раствором кислоты; при этом происходит восстановление протона в боррат-анион (основание): Н + + ВО2 — = НВО2. Анион ВО2 является сильным основанием и, следовательно, его можно титровать сильной кислотой.

Существует и некоторая условность в методе Кьельдаля при расчёте количества белка, заключающаяся в использовании переводного коэффициента. Однако, несмотря на недостатки, метод Кьельдаля является унифицированным, он включён в ГОСТы на многие пищевые продукты.

Для перевода количества азота в содержание белка используют коэффициент 6,25. Принят он потому, что большинство белков содержит 16 % азота (100:6,25 = 16). Однако более правильным является использование коэффициентов, соответствующих фактическому содержанию сырого белка в каждом его виде. Так, для пшеницы получен коэффициент 5,7, так как её белки содержат 17,5 % азота. Для других белковых ресурсов коэффициенты перевода приняты следующими: 5,7 – рожь, ячмень, овёс, семена подсолнечника; 5,8 – соя; 6,25 – кукуруза, мясо; 6,38 – молоко.

Колориметрический метод определения белка (Метод Лоури) основан на реакции белков с реактивом Фолина, дающей синее окрашивание. Интенсивность окраски определяют на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром (или на спектрофотометре при длине волны 750 нм). Количество белка в растворе находят по калибровочной кривой. Метод применяют для определения белка в растворах с концентрацией от 10 до 100мкг.

В основе биуретового метода лежит биуретовая реакция. По оптической плотности с использованием калибровочных графиков находят концентрацию белка в растворах. Этот метод определения белка требует для выполнения доступных реактивов и используется для определения белков в растворах, в том числе предназначенных для электрофореза.

Имеются различные методы определения азота, такие как метод Дюма, нейтронно-активационный и с фенолятгипохлоридом на приборе «Техникон». Принцип метода Дюма заключается в разложении органического соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объёма азота (N2). В нейтронно-активационном методе атомы азота образца бомбардируются нейтронами в ядерном реакторе с получением изотопа 13 N. Содержание белка рассчитывают по количеству гамма-лучей.

Широкое распространение получил метод инфракрасной спектроскопии, в основе которого лежит поглощение белками света с определённой длиной волны и измерение интенсивности его отражения в пробах анализаторах. Приборы калибруют по образцам зерна (эталонам) с известным содержанием белка, определяемым по методу Кьельдаля.

Известны методы количественного определения белка, основанные на различной степени помутнения (нефелометрический метод), способности белков адсорбировать красители (кумасси синий R-250, амидочёрный и др.) и преломлять лучи света (по показателю преломления). Они характеризуются высокой точностью и простотой определения, хотя имеют ряд ограничений. Наиболее удобными являются методы с кумасси синим, биуретовый и Лоури.

Массовую долю белка определяют также колориметрическим методом, который основан на способности белков при рН ниже изоэлектрической точки связывать кислые красители вследствие образования нерастворимого комплекса. При этом интенсивность окраски раствора уменьшается обратно пропорционально количеству белка. После удаления нерастворимого комплекса измеряют оптическую плотность раствора оставшегося красителя и по градуировочному графику определяют массовую долю белка.

Определение массовой доли белков методом формольного титрования. Этот метод применяют для контроля массовой доли белка в молоке кислотностью не более 22 о С. Он основан на реакции щелочных аминогрупп белка с формалином, в результате которой высвобождаются карбоксильные кислые группы белка. При этом повышается титруемая кислотность молока. По приросту которой определяют массовую долю белка в молоке.

Для определения массовой доли белка в молоке применяют также рефрактометрический метод. Он основан на изменении показателей преломления молока и безбелковой молочной сыворотки, полученной из того же образца молока, разность между которыми пропорциональна массовой доле белка в молоке.

При изучении физико-химических свойств белков и их превращении в пищевых системах широко используют методы фракционирования и очистки от небелковых соединений. Они основаны на различии таких свойств белков, как размер молекул, растворимость заряд и сродство к специфическим химическим группам.

Общая схема операций по выделению белков сводится к измельчению биологического материала (гомогенизации), экстрагирования и собственно выделению, то есть очистки и получению белка в индивидуальном состоянии.

Осаждение белков из раствора под действием солей щелочных и щелочноземельных металлов называют высаливанием. Для высаливания чаще применяются сульфат аммония, под влиянием которого белки, как правило, сохраняют растворимость и ферментативную активность.

Глобулины выпадают в осадок при 50 % насыщении, альбумины при 100 % насыщении растворов солей, а при ступенчатом фракционировании (20-100 % насыщения) выпадают белки и других классов (проламины, глютелины).

В практике выделения и очистки белков используются различные типы хроматографии: адсорбционная, распределительная, ионообменная и хроматография по сродству.

Адсорбционнная хроматография основана на различиях в полярности белков. В колонке вместе с буферным раствором упаковывают адсорбент, на который в небольшом объёме растворителя наносят исследуемый образец. Компоненты разделяемой смеси адсорбируются, затем элюируются с помощью буферного раствора с увеличивающейся концентрацией или полярностью. Фракции белка собирают с помощью автоматического коллектора фракций.

В распределительной хроматографии, в отличие от адсорбционной, в качестве неподвижной фазы выступает водный слой, удерживаемый твёрдой фазой (силикагель, бумага). Разделяемые вещества многократно распределяются между водным слоем и движущейся фазой растворителя и с разной скоростью перемещаются по длине колонки или бумаге. Распределительную хроматографию на бумаге часто используют для анализа пептидов и аминокислот. Адсорбентом служат нити целлюлозы, а растворителем – смесь органических растворителей, например: бутиловый спирт – уксусная кислота – вода. Хроматограмму проявляют, высушивают и анализируют местонахождение разделяемых компонентов тем или иным способом.

Методом ионообменной хроматографии белки или аминокислоты разделяют на основе различий в общем заряде молекул. Если белок в нейтральной среде (рН 7) имеет положительный заряд, то он связывается на колонке с ионообменником, содержащим фенольные, сульфо- и карбоксильные группы (катионообменник). Чаще всего для фракционирования белков используют производные полистерола и целлюлозы.

Положительно заряженный белок снимается с колонки с помощью раствора хлористого натрия или изменением рН элюирующего буфера. При этом ионы натрия конкурируют с положительно заряженными группами белков. Белки с меньшим положительным зарядом вымываются с колонки первыми, с большим зарядом – последними.

Хроматография по сродству (аффинная хроматография) основана на принципе избирательного связывания белков со специфическими веществами (лигандами) прикреплёнными к носителю. Лиганды (глюкозу) ковалентно присоединяют к носителю (проводя иммобилизацию) и наносят на колонку исследуемую белковую смесь. Несвязавшиеся белки удаляют соответствующим буфером, а нужный белок элюируют раствором, содержащим лиганд в очень высокой концентрации. При этом присоединённые к колонке остатки глюкозы в молекуле белка замещаются на глюкозу, находящуюся в растворе.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит заключается в пропускании белков через колонку с гелем сефадекса или других типов (агарозных, полистирольных). Применяются также пористые стеклянные шарики и пористый кварц (порасил).

Принцип методов электрофоретического разделения заключается в способности молекул пептидов и аминокислот, находясь в заряженной форме в виде катионов (+) или анионов (-), передвигаться в электрическом поле с определённой скоростью.

Очень высокую разрешающую способность имеет метод изоэлектрического фокусирования белков, в основе которого лежит фронтальный электрофорез, проводимый на колонке одновременно в градиенте рН и напряжения.

В организме синтезируется только часть аминокислот, другие должны доставляться с пищей. Первые из них называются заменимыми, вторые незаменимыми. Заменимые аминокислоты способны заменять одна другую в рационе, так как они превращаются одна в другую или синтезируются из промежуточных продуктов углеводного или липидного обмена.

Жизнедеятельность человека обеспечивается ежедневным потреблением с пищей сбалансированной смеси, содержащей восемь незаменимых аминокислот и две частичнозаменимые. Незаменимые представлены аминокислотами с разветвлённой цепью углерода – лейцином, изолейцином и валином, ароматическими – фенилаланином, триптофаном и алифатическими – треонином, лизином и метионином. К частичнозаменимым относят аргинин и гистидин, так как в организме они синтезируются довольно медленно.

Важным понятием, характеризующим качество поступающего в организм белка, является биологическая ценность, то есть наличие незаменимых аминокислот и степень их усвоения. Чем ближе потребляемый белок по аминокислотному составу подходит к составу белков организма, тем выше его биологическая ценность.

Изучение химического состава пищевых продуктов, закономерностей метаболических превращений в организме каждого из многочисленных белковых веществ, входящих в состав продукта, выявление их участия в жизнедеятельности, а также интегрального биологического эффекта, привело к возникновению научных представлений о биологической ценности, под которой понимают относительную степень задержки азота пищи или эффективность его утилизации для поддержания азотистого равновесия, зависящая от аминокислотного состава и других структурных особенностей белков. Таким образом, термин «биологическая ценность» отражает качество белковых компонентов продукта, связанных как с перевариванием белка, так и со степенью сбалансированности его состава. Биологическая ценность может быть определена химическими и биологическими методами (например, с использованием тест-организмов).

Основываясь на понятии биологической ценности как степени соответствия состава пищи физиологическим потребностям организма, разработаны некоторые принципы биологической оценки качества продуктов питания.

Большинство исследований пришло к единому мнению, что биологическую ценность белков, независимо от использованного варианта проведения эксперимента или метода её расчёта необходимо выражать не в абсолютных, а в относительных величинах (в процентах) то есть в сравнении с аналогичными показателями, полученными с применением стандартных белков.

Химические методы исследования биологической ценности белков разрабатывались на основании результатов изучения состава белков в пищевых продуктах и установленной связи между степенью задержки азота, пищевого белка в живом организме и наличием в нём незаменимых аминокислот.

Наиболее широко используется метод Х. Митчела и Р. Блока, в соответствии с которым рассчитывается показатель аминокислотного скора (а.с.). Скор выражают в процентах или безразмерной величиной, представляющей собой отношение содержания аминокислот (а.к.) в исследуемом белке к её количеству в эталонном белке. При расчёте скора формула выглядит следующим образом:

Аминокислотный скор = , (3.8)

Аминокислота, скор который имеет самое низкое значение, называется лимитирующей аминокислотой.

Таблица 3.2 Содержание аминокислот в 1 г идеального белка

Аминокислота Содержание, мг Аминокислота Содержание, мг
Изолейцин Фенилаланин+тирозин
Лейцин Треонин
Метионини + цистин Триптофан
Валин Всего

Другой метод определения биологической ценности белков заключается в определении индекса незаменимых аминокислот (ИНАК). Метод представляет собой модификацию метода аминокислотного скора и позволяет учитывать количество всех незаменимых кислот. Индекс рассчитывают по формуле:

ИНАК = , (3.9)

индексы б, э – содержание аминокислоты в изучаемом и эталоном белке соответственно.

Известны и другие химические методы, которые основаны на исследовании аминокислотного состава белка с последующим расчётом индексов биологической ценности (индексы Озера, Митчела, Корпачи).

Вышеперечисленные методы индексов и скора по стандарту, не позволяют учитывать одну из важнейших характеристик биологической ценности белка, а именно, доступность усвоения в организме аминокислот, входящих в его состав. Например, количество доступного лизина является в настоящее время наиболее ценным показателем «технологического» снижения биологической ценности белков. В литературе описаны различные способы определения доступного лизина в белковых продуктах: химические, биологические и микробиологические.

Особый интерес вызывают у исследователей такие методы определения биологической ценности белков, в которых в какой либо степени имитируются условия пищеварения в организме человека. Метод ферментативного переваривания белков протеолитическими ферментами желудочно-кишечного тракта применяется для изучения скорости расщепления белков, находящихся в составе различных пищевых продуктов.

Для изучения биологической ценности белков наибольшее применение получили биологические методы исследования, результаты которых служат основой для сравнения с данными, полученными при использовании химических методов.

Биологические методы основаны на скармливании изучаемого белка живому организму с последующим выявлением его реакции. Основными показателями оценки при этом являются привес (рост животных) за определённый период времени, расход белка и энергии на единицу привеса, коэффициенты перевариваемости и отложения азота в теле, доступность аминокислот. Биологические методы исследования биологической ценности белков можно классифицировать на росто-весовые и балансовые. Эти методы широко используют для определения различных индексов биологической ценности белков.

Росто-весовые методы основаны на учёте прибавки веса тела на единицу потреблённого белка за определённое время.

Наибольшее распространение получили, разработанные П.Осборном, методы определения коэффициента эффективности белка (КЭБ или PER), которым определяют прибавку веса тела на один грамм потреблённого белка за экспериментальный период. Для сравнения при определении показателя используют контрольную группу животных со стандартным белком – казеином. В количестве, обеспечивающем в рационе 10% белка. Методика определения КЭБ признана оригинальной в ряде стран (США, Канада).

Балансовые методы исследования биологической ценности белка основаны на определении различных реакций организма на потребляемый белок. Методы определения биологической ценности белков, основанные на данных балансовых исследований, считают наиболее точными из всех предложенных.

В настоящее время в исследовательских целях используют метод с реснитчатой инфузорией Tetrahimena pyriformis. Метод был разработан S.A. Stott и H. Smith.

Однако наибольшее распространение получил модифицированный метод определения относительной биологической ценности. В отличие от общепринятого метода Стотта и Смита предлагаемый метод значительно проще и дешевле, производительнее и легко доступен любым лабораториям, которые имеют самый необходимый минимум для проведения микробиологических исследований. Модификация сводится к следующему:

1. Используемые в анализе витамины и нуклеотиды заменяются дрожжевым экстрактом, а соли – морской солью.

2. В 10 раз уменьшается количество всех компонентов анализа (величина навески исследуемого продукта, объём инокулята и т.д.).

3. Вместо специальных плоскодонных колб Элрленмеера, занимающих много места в термостате, что существенно ограничивает производительность анализа, используются флаконы из-под антибиотиков с резиновой пробкой, имеющей срез внутреннего валика для аэрации среды. Флаконы размещают в штативе, что значительно облегчает все манипуляции с пробами.

4.Используемый в заключительной стадии опыта раствор формалина для фиксации инфузорий вносится непосредственно во флаконы и из них уже берётся взвесь для подсчёта клеток.

Сущность метода заключается в термостатировании флаконов микрофлоры с исследуемыми образцами продуктов (мясных, овощных, молочных и др.) и фиксируют инфузории йодноспиртовым раствором или раствором формалина. Относительная биологическая ценность продукта определяется отношением числа выросших на опытном продукте к числу инфузорий, выросших на контрольном продукте, умноженном на 100.

Изложенный выше метод был использован для определения биологической ценности пищевых продуктов прошедших тепловую обработку и некоторой готовой продукции. Полученные данные позволили предложить ряд рекомендаций для рационализации технологических процессов производства продуктов.

Читайте также:  Общий анализ белка и его фракции

Результаты исследований по определению влияния способов тепловой обработки на биологическую ценность овощей приведены в таблице 3.3.

Таблица 3.3 — Влияние тепловой обработки на биологическую ценность овощей

Наименование продукта Общий азот в % (на абсолютно сухое вещество) ОБЦ по отношению к внутреннему стандарту Потери в % по отношению к внутреннему стандарту
Капуста белокочанная свежая сырая варёная варёная с солью тушёная тушёная с солью Капуста квашенная сырая варёная тушёная Картофель сырой очищенный варёный целым клубнем в воде варёный на пару варёный в кожице в воде 2,73 2,16 2,25 1,75 2,20 2,57 2,20 2,49 1,75 1,30 1,24 1,4 100,0 129,97 122,57 125,84 112,94 94,66 125,51 92,84 100,0 121,36 137,76 108,51 — 29,57 22,57 25,84 12,94 5,34 25,51 7,16 — 21,36 37,70 8,51

Липидами (от греч. lipos – жир) называют сложную смесь органических соединений с близкими физико-химическими свойствами, которая содержится в растениях, животных и микроорганизмах. Липиды широко распространены в природе и вместе с белками и углеводами составляют основную массу органических веществ всех живых организмов, являясь обязательным компонентом каждой клетки. Они широко используются при получении многих продуктов питания, являются важными компонентами пищевого сырья, полуфабрикатов и готовых пищевых продуктов, во многом определяя их пищевую и биологическую полноценность и вкусовые качества.

Липиды не растворимы в воде (гидрофобны), хорошо растворимы в органических растворителях (бензине, диэтиловом эфире, хлороформе и др.).

В растениях липиды накапливаются главным образом, в семенах и плодах. Ниже приведено содержание липидов (%) в разных культурах: арахис (ядро) – 50-68; какао (бобы) – 49-57; подсолнечник – 30-58; соя (семена) – 15-25; кукуруза – 5,6; гречиха – 3,8; рис – 2,9; пшеница – 2,7.

У животных и рыб липиды концентрируются в подкожных, мозговой и нервных тканях и тканях, окружающих важные органы (сердце, почки). Содержание липидов в тушке рыбы (осетров) можно достигать 20-25 %, сельди – 10 %, у туш наземных животных оно сильно колеблется: 33 % (свинина), 9,8 % (говядина), 3,0 % (поросята). В молоке оленя – 17-18 %, козы – 5,0 %, коровы – 3,5-4,0 %. Содержание липидов в отдельных видах микроорганизмов может достигать 60 %.

По химическому строению липиды являются производными жирных кислот, спиртов, альдегидов, построенных с помощью сложноэфирной, простой эфирной, фосфоэфирной, гликозидной связей. Липиды делят на две основные группы: простые и сложные липиды. К простым нейтральным липидам (не содержащим атомов азота, фосфора, серы) относят производные высших жирных кислот и спиртов, глицериды, воски, эфиры холестерина, гликопептиды и другие соединения. Молекулы сложных липидов содержат в своём составе не только остатки высокомолекулярных карбоновых кислот, но и фосфорную или серную кислоты.

В определении содержания жира в сырье и готовой продукции чаще всего используют методы, приведённые ниже.

Метод Гербера используют при определении жира в полуфабрикатах из мяса (мясной фарш, полуфабрикаты из котлетной массы), творога, в кулинарных изделиях, мучных кондитерских изделиях, молока и молочных продуктах, сухих продуктах детского и диетического питания.

Метод основан на разрушении белков исследуемого продукта концентрированной серной кислотой и растворении жира в изоамиловом спирте. Образующийся в реакции изоамилового спирта с серной кислотой сложный эфир растворяется в ней, что способствует выделению жира. Полученную смесь центрифугируют в жиромерах (бутиролитрах). Отделившийся жировой слой собирается в градуированной части жиромера и отсчитывается там.

Определение жира проводят в молочных или сливочных жиромерах, отличающихся размером и градуировкой. Объём деления в молочных жиромерах равен 0,1 % или 0,011332 жира в продукте. В сливочных жиромерах объём двух делений соответствует 1 % жира в продукте пр навеске 5 г. Их используют, если содержание жира в продукте превышает 10 %.

Весовой метод с экстракцией жира в микроизмельчителе. Метод используется для кулинарных изделий и некоторой продукции консервной промышленности. Жир извлекают из продукта при измельчении последнего в микроизмельчителе. После отгона растворителя высушенный жир взвешивают.

Рефрактометрический метод применяют для определения жира в мучных кулинарных, сдобных булочных и мучных кондитерских полуфабрикатах и изделиях, овощных полуфабрикатах, консервированных продуктах.

Метод основан на том, что при растворении жира коэффициент преломления растворителя понижается пропорционально количеству присутствующего жира. По разности между коэффициентом преломления чистого растворителя и раствора жира определяют массовую долю последнего. Чем больше разница между этими коэффициентами, тем точнее определение.

Метод определения жира с предварительным гидролизом крахмала используют при определении жира в полуфабрикатах из муки, булочных и мучных кондитерских изделиях (ГОСТ 5899-85). Он основан на извлечении жира растворителем из навески, обработанной предварительно соляной кислотой, удалении растворителя и взвешивании жира.

Для качественного определения масел существуют следующие характерные реакции.

Проба на акролеин. Две-три капли испытуемого вещества (масло, экстракт после отгонки растворителя) нагревают в пробирке на голом огне с 1,5-2 частями безводного сернокислого натрия. Появление после вспенивания тяжелых белых паров и резкий запах акролеина (чада), вызывающего слезоточение, указывают на наличие масла. Акролеин – непредельный альдегид СН2=СНСНО – образуется из глицерина при отнятии двух молекул воды. Если пары отвести в пробирку с фуксиносернистой кислотой, то последняя приобретает красную окраску.

Проба на омыление. Нагревают 2-3 капли испытуемого вещества в пробирке с 5 см 3 раствора спиртовой щелочи; отгоняют спирт. Оставшийся продукт растворяют в воде (мыло в воде растворимо). Прибавление кислоты до кислой реакции вызывает образование всплывающих на поверхность водного раствора жирных кислот.

Проба с галоидами. Эта реакция является характерной для масел, содержащих непредельные жирные кислоты. В пробирку с раствором масла в эфире прибавляют 1-2 капли бромной воды и встряхивают. Быстрое исчезновение желтой окраски бромной воды указывает на присутствие ненасыщенных кислот.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Нормальные показатели: белок в норме в моче содержится в минимальных количествах, которые не обнаруживаются обычными качественными реакциями. Верхняя граница нормы белка в моче – 0,033 г/л. Если содержание белка выше этого значения, то качественные пробы на белок становятся положительными.

Клиническое значение определения:

Появление белка в моче называется протеинурия. Протеинурии могут быть ложными и почечными. Экстраренальные протеинурии могут быть при наличии примесей белкового происхождения из половых органов (вагинитах, уретритах и др.), количество белка при этом незначительно – до 0,01 г/л. Почечные протеинурии могут быть функциональными (при переохлаждении, физических нагрузках, лихорадке) и органическими — при гломерулонефрите, пиелонефрите, нефрите, нефрозах, почечной недостаточности. При почечных протеинуриях содержание белка может быть от 0,033 до 10 – 15 г/л, иногда выше.

Принцип метода: основан на том, что белок под действием неорганических кислот коагулирует (становится видимым). Степень помутнения зависит от количества белка.

Обнаружение белка в моче с 20% сульфосалициловой кислотой.

Реактивы: 20% р-р сульфосалициловой кислоты. Оборудование: темный фон.

1. Требования к моче: моча должна быть кислой (или слабокислой) рН, должна быть прозрачной, для этого мочу центрифугируют. Щелочную мочу подкисляют до слабокислой реакции среды, используя для контроля индикаторную бумагу.

2. В 2 пробирки одинакового диаметра наливают по 2 мл подготовленной мочи. 1 пробирка – контроль, 2 – опыт. В опытную пробирку добавляют 4 капли 20% сульфосалициловой кислоты.

3. Результат отмечают на темном фоне.

4. При наличии белка, моча в опытной пробирке мутнеет.

Качественное определение белка в моче тест – полосками.

Для выявления протеинурий используют различные монотест – полоски: Альбуфан, Альбустикс, Биофан Е и политесты: Трискан, Нонафан и др.

Обнаружение белка в моче по методу Робертса – Стольникова.

Принцип метода: основан на том, что белок под действием неорганических кислот коагулирует (становится видимым). Степень помутнения зависит от количества белка (т.е. кольцевая проба Геллера). При концентрации белка в моче 0,033 г/л к концу 3 минуты после наслаивания мочи появляется тонкое нитевидное белое кольцо.

Реактивы: 50% р-р азотной кислоты или реактив Робертса (98 частей насыщенного раствора поваренной соли и 2 части концентрированной соляной кислоты) или реактив Ларионовой (98 частей насыщенного р-ра поваренной соли и 2 части концентрированной азотной кислоты).

1. Требования к моче: моча должна быть кислой (или слабокислой) рН, должна быть прозрачной, для этого мочу центрифугируют. Щелочную мочу подкисляют до слабокислой реакции среды, используя для контроля индикаторную бумагу.

2. В пробирку наливают 2 мл 50% р-ра азотной кислоты или один из реактивов, затем осторожно по стенке пробирки с помощью пипетки наслаивают такой же объем подготовленной мочи

3. Пробу оставляют на 3 минуты

4. Через 3 минуты отчитывают результат. Результат отмечают на темном фоне в проходящем свете. Если кольцо широкое, компактное, то мочу разводят дистиллированной водой и вновь наслаивают на реактив.

5. Мочу разводят до тех пор, пока через 3 минуты не образуется тонкое нитевидное кольцо.

6. Расчет содержания белка в моче производят по формуле:

С = 0,033г/л х степень разведения.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: При сдаче лабораторной работы, студент делает вид, что все знает; преподаватель делает вид, что верит ему. 9260 — | 7276 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

источник

Присутствие белков в пищевых объектах устанавливается с помощью качественных реакций, которые условно разделяют на две группы: а) цветные реакции; б) реакции осаждения.

Среди первой группы различают универсальные реакции (биуретовая на пептидные связи и нингидриновая на α-аминокислоты) и специфические, обусловленные присутствием в белках остатков определенных аминокислот. Так, ксантопротеиновая реакция свидетельствует о наличии в белках остатков ароматических аминокислот, реакция Паули – гистидина и тирозина, Адамкевича и Вуазене – триптофана, нитропруссидная – цистеина, а реакция Сакагучи – аргинина. По результатам специфических реакций ориентировочно можно судить о пищевой ценности белков.

Во второй группе реакций белки осаждают действием солей, органических растворителей, концентрированных кислот, щелочей, ионов тяжелых металлов, температуры и в изоэлектрической точке. Белки в растворенном состоянии крайне неустойчивы, поэтому при добавлении органических растворителей (спирт, ацетон), концентрированных растворов нейтральных солей щелочных металлов и воздействии физических факторов (нагревание, облучение, ультразвук) гидратная оболочка разрушается и они выпадают в осадок.

Так как белковые вещества сырья (муки, крупы, молока, мяса), включая ферменты, часто являются определяющими в обеспечении качества пищевых изделий, то для изучения физико-химических, биохимических и физиологических свойств этих соединений обязательным условием является получение белков в индивидуальном и, по возможности, неденатурированном состоянии. Белки обычно теряют природные (нативные)

свойства (растворимость, гидратацию, ферментативную активность и т.д.), подвергаясь денатурации под влиянием различных факторов. Типичным примером необратимой денатурации белков является выпадение их в осадок под действием ТХУ. Длительный контакт со спиртом также приводит к необратимой денатурации белка. Денатурирующее действие различных факторов на белки можно смягчить, если проводить операции выделения их при температуре не выше +4°С.

Методы выделения и очистки белков. Общая схема операций по выделению белков сводится к измельчению биологического материала (гомогенизации), экстрагированию и собственно выделению, то есть очистке и получению белка в индивидуальном состоянии. При изучении метаболических процессов в живых организмах (в созревшем зерне, плодах, овощах) морфологическая и биохимическая целостность клеток и тканей сохраняется в максимальной степени, тогда как при исследовании состава сырья и готовых пищевых продуктов потеря целостности структуры несущественна. Гомогенизацию объектов следует рассматривать как начальную стадию выделения белков, но способ ее определяется постановкой задачи. Например, анализ ферментов из растительных материалов часто затруднен тем, что при гомогенизации экстрагируется большое количество фенолов, которые взаимодействуют с карбонильными группами пептидных групп при помощи водородных связей и вызывают денатурацию белка и потерю ферментами своей активности. Добавление в экстракт поливинилпирролидона, образующего с фенолами нерастворимые комплексы, предотвращает инактивацию ферментов.

Разрушение клеточной структуры осуществляется тщательным измельчением материала в гомогенизаторах, мельницах, попеременным замораживанием и оттаиванием, применением ультразвуковых высокочастотных колебаний, пресс-методов с использованием высоких давлений и метода «азотной бомбы». В последнем случае клетки насыщаются азотом под давлением, которое затем сбрасывается и клетки разрушаются. Эффективность гомогенизации зависит не только от способа разрушения клеточных структур, но и от вида анализируемого материала. Животные клетки разрушаются относительно легко, особенно в отсутствие сосудистой и соединительной ткани, тогда как растительные и микробные – из-за присутствия клеточных стенок – трудно. В таком случае применяют методы растирания материала с твердыми веществами (песок, абразивный порошок) или обработку клеточных стенок лизоцимом или ферментными препаратами, содержащими целлюлазу, хитиназу и липазу. Гомогенизацию рекомендуется проводить в холодных комнатах или с использованием льда.

Экстракция белков может быть совмещена с гомогенизацией клеток и тканей либо проведена отдельно, если продукт заранее измельчен. Для

определения ферментативной активности белка достаточно одноразовой экстракции, тогда как для количественного определения белковых фракций зерна – трех- или пятикратной. Условия экстрагирования белков (время, гидромодуль, температура и т.д.) подбираются эмпирически, основываясь на методиках ведущих научных школ.

Большинство белков животных тканей хорошо растворимы в 5–10% растворах солей, тогда как для перевода в раствор белков зерновых культур применяют более широкий набор растворителей. Для этого используются буферные системы со значениями рН от кислых до слабощелочных (фосфатные, боратные, цитратные, трис-HCl), органические растворители и неионные детергенты, разрывающие белок-липидные или белок-белковые связи:

Растворители подбираются с учетом разрыва в белках определенных типов связей. Так, уксусная кислота ослабляет ионные связи, сообщая молекулам одноименные положительные заряды, мочевина – водородные и гидрофобные, салицилат натрия и ДДС-Na – гидрофобные и ионные, а водные растворы спиртов – водородные и гидрофобные взаимодействия. Органические растворители разрывают белок-липидные связи.

При изучении физико-химических свойств белков и их превращений в пищевых системах широко используют методы фракционирования и очистки от небелковых соединений. Они основаны на различиях таких свойств белков, как размер молекул, растворимость, заряд и сродство к специфическим химическим группам.

Осаждение белков из раствора под действием солей щелочных и щелочноземельных металлов называют высаливанием. Для высаливания чаще применяется сульфат аммония, под влиянием которого белки, как правило, сохраняют растворимость и ферментативную активность. Главную роль при высаливании играет не природа солей, а валентность ионов, действие которых оценивается по ионной силе (μ):

Читайте также:  Общий анализ белка у новорожденного

где С – концентрация каждого вида иона; V – валентность ионов.

Глобулины выпадают в осадок при 50% насыщении, альбумины – при 100% насыщении растворов солей, а при ступенчатом фракционировании

(20–100% насыщения) выпадают белки и других классов (проламины, глютелины).

В практике выделения и очистки белков используются различные типы хроматографии: адсорбционная, распределительная, ионообменная и хроматография по сродству. Адсорбционная хроматография основана на различиях в полярности белков. В колонке вместе с буферным раствором упаковывают адсорбент, на который в небольшом объеме растворителя наносят исследуемый образец. Компоненты разделяемой смеси адсорбируются, затем элюируются с помощью буферного раствора с увеличивающейся концентрацией или полярностью. Фракции белка собирают с помощью автоматического коллектора фракций.

В распределительной хроматографии, в отличие от адсорбционной, в качестве неподвижной фазы выступает водный слой, удерживаемый твердой фазой (силикагель, бумага). Разделяемые вещества многократно распределяются между водным слоем и движущейся фазой растворителя и с разной скоростью перемещаются подлине колонки или бумаге. Распределительную хроматографию на бумаге часто используют для анализа пептидов и аминокислот. Адсорбентом служат нити целлюлозы, а растворителем – смесь органических растворителей, например: бутиловый спирт–уксусная кислота–вода. Хроматограмму проявляют, высушивают и анализируют местонахождение разделяемых компонентов тем или иным способом.

Методом ионообменной хроматографии белки или аминокислоты разделяют на основе различий в общем заряде молекул. Если белок в нейтральной среде (рН 7) имеет положительный заряд, то он связывается на колонке с ионообменником, содержащим фенольные, сульфо- и карбоксильные группы (катионообменник), если отрицательный, то – на колонке с ионообменником, представленным аминами или органическими основаниями (анионообменник). Чаще всего для фракционирования белков используют производные полистирола и целлюлозы:

Положительно заряженный белок снимается с колонки с помощью раствора хлористого натрия или изменением рН элюирующего буфера. При этом ионы натрия конкурируют с положительно заряженными группами

белков. Белки с меньшим положительным зарядом вымываются с колонки первыми, с большим зарядом – последними.

Хроматография по сродству (аффинная хроматография,) основана на принципе избирательного связывания белков со специфическими веществами (лигандами), прикрепленными к носителю. Лиганд (глюкозу) ковалентно присоединяют к носителю (проводят иммобилизацию) и наносят на колонку исследуемую белковую смесь. Несвязавшиеся белки удаляют соответствующим буфером, а нужный белок элюируют раствором, содержащим лиганд в очень высокой концентрации. При этом присоединенные к колонке остатки глюкозы в молекуле белка замещаются на глюкозу, находящуюся в растворе (рис. 2.20).


Рис. 2.20.Хроматография по сродству (афинная хроматография)


Рис. 2.21.Распределение молекул белка среди гранул сефадекса

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит заключается в пропускании белков через колонку с гелем сефадекса или других типов (агарозных, полистирольных). Применяются также пористые стеклянные шарики и пористый кварц (порасил). Наибольшее распространение получили декстрановые гели (сефадекс), являющиеся продуктом поперечного сшивания полисахаридных цепочек декстрана. Зерна сефадексов разных номеров содержат поры разных размеров, в которые могут проникать белки с определенной молекулярной массой. Низкомолекулярные белки распределяются в растворенном виде как внутри частиц полимера, так и между ними, а высокомолекулярные – только между частицами, поэтому вторые быстрее проходят через колонку и первыми вытекают из нее (рис. 2.21). В итоге белки распределяются по молекулярной

массе и могут быть собраны в виде отдельных хроматографических фракций (рис. 2.22).


Рис. 2.22.Картина распределения смеси веществ, различающихся по молекулярным массам, при методе гель-фильтрации

Принцип методов электрофоретического разделения заключается в способности молекул пептидов и аминокислот, находясь в заряженной форме в виде катионов (+) или анионов (–), передвигаться в электрическом поле с определенной скоростью. Кроме того, молекулы с близкими зарядами, но разными размерами, отличаются отношением заряда к массе. Все эти различия и обуславливают высокую разрешающую способность электрофоретических методов. Скорость миграции белков в электрическом поле (V) зависит от напряжения электрического поля(ε), заряда белков (z) и сопротивления трения (О-Сопротивление трения определяется размерами, формой белка, значениями рН и концентрацией буфера. Указанные величины связаны между собой соотношением: V = ε · z / f.

Впервые метод электрофореза был разработан Тизелиусом с применением бумаги в качестве носителя и специальных оптических устройств, регистрирующих передвижение границы раздела раствора белка и растворителя по показателям преломления (фронтальный электрофорез). В настоящее время распространены методы зонального электрофореза, предусматривающие использование крахмальных и полиакриламидных гелей (ПААГ). Наиболее распространенным методом фракционирования белков является диск-электрофорез (от англ, discontinuous – прерывистый) в ПААГ, при котором используется пара буферных растворов с различными значениями рН в присутствии ДДС-Na и гели различной пористости (концентрирующие и разделяющие) (Laemmli, 1970). Для обнаружения белков гели обрабатывают красителями: амидовым черным 10В, кумасси синим R-250. Интенсивность окраски, а по ней количественное содержание белковых фракций, определяют сканированием на денситометре.

Для электрофоретического разделения белков и пептидов успешно применяется двумерный электрофорез в ПААГ. В соответствии с этим методом смесь компонентов разделяют сначала в столбиках геля электрофорезом в горизонтальном направлении, затем в гелевых пластинах – в вертикальном (рис. 2.23). При разделении белков, например гороха, этим методом удалось получить более 150 различных компонентов.


Рис. 2.23.Двумерный электрофорез

Очень высокую разрешающую способность имеет метод изоэлектрического фокусирования белков, в основе которого лежит фронтальный электрофорез, проводимый на колонке одновременно в градиенте рН и напряжения. Колонку предварительно заполняют носителями с синтетическими смесями полиаминополикарбоновых кислот (амфолитами), затем сверху в нее подают раствор сильной кислоты, снизу – сильнощелочной раствор для того, чтобы установить градиент рН с крайними значениями, соответствующими рН кислого и щелочного растворов. Амфолиты прекращают движение по колонке, когда их суммарный заряд становится равным нулю, и тем самым стабилизируют исходный градиент рН. В подготовленную колонку вносят образец исследуемой смеси, компоненты которой распределяются по зонам со значениями рН, характерными их изоэлектрическим точкам.

В химии пищевого белка применяют и другие разновидности электрофоретическогоразделения(иммуноэлектрофорез, изотахофорез), а также метод пептидных карт и ультрацентрифугирование. Метод пептидных карт (отпечатков пальцев) относится к методам двумерного разделения и наиболее часто используется для анализа пептидов. Пептиды получают избирательным гидролизом белков, затем на бумаге их разделяют в горизонтальном направлении электрофорезом, в вертикальном – распределительной хроматографией. Пептиды окрашивают нингидрином, элюируют и определяют аминокислотный состав.

В методе ультрафильтрации белки в градиенте плотности распределяются на разных уровнях центрифужной пробирки в процессе седиментации (осаждения) в виде отдельных зон. Для создания градиента используют соли тяжелых металлов и растворы сахарозы. Метод широко применяется для определения молекулярных масс белков по константе седиментации (S), которая зависит от массы и формы белковых частиц:

где v – скорость перемещения границы растворитель–белок, см/с; w– угловая скорость ротора, рад/с; г – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка.

Величина S, равная 1 · 10 -13 с, принята за единицу и названа сведбергом (S) в честь Т. Сведберга, впервые сконструировавшего ультрацентрифугу.

Очистка белков от низкомолекулярных соединений (солей, сахаров, аминокислот) осуществляется методами диализа, гель-фильтрации на сефадексе G-25, кристаллизации, ультрафильтрации и с помощью полых волокон. При диализе используют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), через которые белки не диффундируют и остаются внутри диализного мешочка. Более мелкие молекулы проходят через поры диализной мембраны и выходят в диализат. В методе ультрафильтрации, который применяется, например, в производстве сывороточных белков молока, соевых белковых изолятов, по обе стороны мембраны создается разность давлений за счет продавливания фильтруемого белкового раствора. В качестве мембран используются целлюлозные пленки и нецеллюлозные полиэлектролитные комплексы. Аналогично мембранам по принципу молекулярного сита действуют и полые волокна. Белковый раствор помещается с внешней стороны волокон, и создается разность давления за счет повышения его в растворе или понижения внутри их.

Гомогенность белка определяется на последнем этапе выделения и очистки с применением по меньшей мере двух методов, оценивающих то или иное физико-химическое свойство. Наиболее достоверными являются ультрацентрифугирование в градиенте плотности, диск-электрофорез в ПААГ, иммунохимические методы и растворимость. Если белок при электрофорезе представлен только одной полосой и обладает при этом максимальной биологической активностью, то он считается гомогенным. Для гомогенного белка на кривой растворимости (зависимости растворенного белка от общего его количества в постоянном объеме растворителя) имеется только один перегиб, тогда как для гетерогенного – столько, сколько в нем индивидуальных компонентов.

Содержание белка в пищевых объектах обычно определяют по количеству азота с использованием метода Кьельдаля. С целью упрощения и сокращения длительности анализа этот метод с момента его разработки (1983) неоднократно модифицировался с применением различных катализаторов и условий минерализации. На основе модифицированных методов созданы высокопроизводительные автоматические анализаторы типа «Кьельфос», стоимость определения содержания белка на которых и сегодня остается высокой. Существует и некоторая условность в методе Кьельдаля при расчете количества белка, заключающаяся в использовании переводного коэффициента. Однако, несмотря на недостатки, метод Кьельдаля является унифицированным, он включен в ГОСТы на многие пищевые продукты.

Для перевода количества азота в содержание белка используют коэффициент 6,25. Принят он потому, что большинство белков содержит 16% азота (100/6,25 = 16). Однако более правильным является использование коэффициентов, соответствующих фактическому содержанию сырого белка

в каждом его виде. Так, для пшеницы получен коэффициент 5,7, так как ее белки содержат 17,5% азота. Для других белковых ресурсов коэффициенты перевода приняты следующими: 5,7 – рожь, ячмень, овес, семена подсолнечника; 5,8 – соя; 6,25 – кукуруза, мясо; 6,38 – молоко.

Имеются и другие методы определения азота, такие как метод Дюма, нейтронно-активационный и с фенолятгипохлоритом на приборе «Техникон». Принцип метода Дюма заключается в разложении органического соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объема азота (N2). В нейтронно-активационном методе атомы азота образца бомбардируются нейтронами в ядерном реакторе с получением изотопа 13 N. Содержание белка рассчитывают по количеству гамма-лучей. Определение азота на приборе «Техникон» осуществляется колориметрическим способом, в котором измеряется интенсивность сине-голубой окраски, образующейся по реакции взаимодействия сульфата аммония, выделяющегося в процессе минерализации образца, с щелочным раствором фенола и гипохлорита. Все описанные здесь методы по точности анализа не уступают методу Кьельдаля, однако они являются достаточно дорогими.

Широкое распространение получил метод инфракрасной спектроскопии, в основе которого лежит поглощение белками света с определенной длиной волны и измерение интенсивности его отражения в приборах-анализаторах. Приборы калибруют по образцам зерна (эталонам) с известным содержанием белка, определяемым по методу Кьельдаля.

Известны методы количественного определения белка, основанные на различной степени помутнения (нефелометрический метод), способности белков адсорбировать красители (кумасси синий R-250, амидочерный и др.) и преломлять лучи света (по показателю преломления). Они характеризуются высокой точностью и простотой определения, хотя имеют ряд ограничений. Наиболее удобными являются методы с кумасси синим, биуретовый и Лоури. В основе биуретового метода лежит биуретовая реакция, в основе метода Лоури – восстановление фосфомолибденовой кислоты тирозином и триптофаном с одновременным протеканием биуретовой реакции. По оптической плотности с использованием калибровочных графиков находят концентрацию белка в растворах.

Контрольные вопросы

  1. Какова роль белков в питании человека? Что такое азотистый баланс и какие его виды могут наблюдаться в организме?
  2. Каковы рекомендуемые нормы белка в питании и от каких факторов они зависят?
  1. Дайте характеристику проблемы дефицита белка и каковы пути ее решения? Какова роль нетрадиционного растительного и животного сырья для пополнения ресурсов пищевого белка?
  2. Что такое синдром квашиоркора и каковы его последствия?
  3. Что включают в себя понятия пищевая и биологическая ценность белков? Как определяется биологическая ценность белков?
  4. Какие свойства характерны для аминокислот?
  5. Какова специфическая роль отдельных аминокислот (цистеина, тирозина, фенилаланина, метионина, глутаминовой и аспарагиновой) в организме?
  6. Как классифицируются биологически активные пептиды в соответствии с их функциями в организме и в составе пищи? Дайте краткую характеристику представителям групп пептидов.
  7. Каковы особенности аминокислотного состава белков злаковых культур по сравнению с белками бобовых и масличных культур?
  8. Назовите основные отличия фракционного состава белков злаковых культур (на примере пшеницы) от белков бобовых и масличных культур.
  9. Каковы отличия физико-химических свойств и структурных особенностей двух фракций клейковины пшеницы: глиадина и глютенина? Какова их роль в обеспечении реологических свойств теста и качества хлеба?
  10. Дайте характеристику фракционного состава и особенностей структуры белков мяса и молока.
  11. Что включает в себя понятие «новые формы белковой пищи» и какова их роль в обогащении пищи лимитирующими аминокислотами?
  12. Дайте определение функциональным свойствам белков.
  13. Перечислите основные функциональные свойства белков. Какова их роль в технологических процессах производства пищевых продуктов?
  14. Какие физико-химические и химические превращения претерпевают белки в технологическом потоке производства пищевых продуктов?
  15. Какие методы качественного и количественного определения белков вы знаете?

112 :: 113 :: 114 :: 115 :: 116 :: 117 :: 118 :: 119 :: 120 :: 121 :: Содержание

Название «углеводы» было дано соединениям этого класса почти 90 лет назад, когда полагали, что все они содержат углерод, водород и кислород в таких соотношениях, как будто представляют собой различные гидраты углерода общей формулы Cn(H2O)m. В дальнейшем оказалось, что ряд соединений, принадлежащих по своим свойствам к классу углеводов, содержат водород и кислород в несколько иной пропорции, чем указано в общей формуле (например, дезоксирибоза – С5Н10О4). Однако название «углеводы» сохранилось, хотя химического смысла оно не имеет.

Углеводы широко распространены в природе, они встречаются в свободной или связанной форме в любой растительной, животной или бактериальной клетке. Углеводы составляют три четверти биологического мира и примерно 60–80% калорийности пищевого рациона.

Наиболее распространенный углевод – целлюлоза, структурный компонент деревьев и других растений. Главный пищевой ингредиент – крахмал. Моносахариды встречаются в свободном виде в природе в небольших количествах; в основном они присутствуют как структурные единицы полисахаридов, входят в дисахариды и олигосахариды.

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2019 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.005 с) .

источник