Меню Рубрики

Использование хроматографии в аминокислотном анализе белков

Разделение аминокислот методом хроматографии на бумаге проводится с целью идентификации аминокислот, находящихся в растворе.

Определение свободных аминокислот важно для изучения обмена белков в организме. В норме в плазме крови и в моче содержится определенное количество аминокислот. При нарушении функции отдельных органов или физиологических систем (недостаточная функция печени, усиленный распад белков, ослабление выделительной функции почек и т.д.) в сыворотке, а иногда и в моче наблюдаются изменения в содержании аминокислот и в аминокислотном составе.

Метод основан на различной растворимости отдельных аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которой является вода, другой – водонасыщенный органический растворитель (смесь бутилового спирта с уксусной кислотой). Водная фаза неподвижна, так как в данном случае вода сорбирована на инертном носителе – целлюлозе, которая в насыщенной влагой атмосфере (хроматографической камере) удерживает до 20% воды, оставаясь внешне сухой; подвижной фазой является насыщенный водой органический растворитель. Чем больше растворимость аминокислоты в водной фазе и меньше – в органическом растворителе, тем медленнее движется аминокислота по бумаге с органическим растворителем. По ходу передвижения растворителя смесь аминокислот будет разделяться, причем те из них, которые растворяются в органическом растворителе лучше, продвигаются вдоль бумаги дальше, те же, которые растворяются в нем хуже, делают более короткий путь. Поэтому местоположение вещества на хроматограмме зависит от его коэффициента распределения — ά:

В распределительной хроматографии важен подбор такого органического растворителя (подвижная фаза), при котором различны значения » ά » для отдельных компонентов смеси.

В свою очередь от » ά » зависит коэффициент скорости движения – Rf (retention factor – фактор удерживания), который легко определить практически:

Rf данного вещества зависит не только от качества растворителя (его состава, рН), но и от температуры среды и качества используемой бумаги (плотность, толщина и др.). Поэтому очень важно хроматографию проводить при определенной и постоянной температуре (20-22°) и пользоваться только предназначенной для хроматографии бумагой.

Rf является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен для данных условий опыта. Поэтому им широко пользуются при идентификации веществ при их анализе методом распределительной хроматографии на бумаге. Для этого сравнивают Rf аминокислот исследуемой смеси с Rf известных стандартных аминокислот.

Основные преимущества хроматографического метода – простота, точность данных при незначительных количествах исследуемых веществ (десятые и сотые доли миллиграмма), быстрота и возможность одновременно проводить большое количество анализов.

Ход работы: Для разделения смеси аминокислот вырезают полоску хроматографической бумаги длиной 15-16 см и шириной 1,5 см, в зависимости от величины хроматографической камеры, в которой проводится хроматографирование. В качестве хроматографической камеры могут использоваться большие пробирки, стеклянные цилиндры. Хроматографическую бумагу, можно брать только пинцетом. Один из концов полоски «заостряют», отрезая от него кусочки ножницами, и на нем проводят простым карандашом линию на расстоянии 2 см от края. Этот конец бумаги зажимают между двумя стеклянными пластинками и проводят стеклянной палочкой, смоченной раствором смеси аминокислот, по начерченной линии. После подсыхания полоски вновь наносят порцию аминокислот. Эту процедуру повторяют 3-4 раза.

На дно хроматографической камеры осторожно, не смачивая стенок, наливают из пипетки 1-2 мл смеси бутанола, уксусной кислоты и воды (4:1:5).

Конец хроматограммы, где не нанесена смесь аминокислот, прикрепляют с помощью иголки к пробке, которой плотно закрывают хроматографическую камеру, при этом заостренный конец хроматограммы должен быть погружен в растворитель на 1 см, полоска со смесью аминокислот не должна касаться растворителя, (рис.1). Хроматографирование проводят в течение 1,5-2 часов. За это время проявитель пройдет по хроматограмме путь снизу вверх, равный примерно 10 см. Затем хроматограмму вынимают из камеры, отмечают границу фронта продвижения растворителя (делают надрезы ножницами слева и справа) и высушивают под тягой. На высушенную хроматограмму наносят с помощью пульверизатора 0,5% раствор нингидрина в ацетоне так, чтобы вся хроматограмма была равномерно (без подтеков) смочена раствором. Как только ацетон испарится, хроматограмму помещают в сушильный шкаф при температуре 70°С на 15 минут. Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде цветных (синих или фиолетовых) пятен, расположенных на разных расстояниях от места нанесения исследуемой смеси.

На хроматографической бумаге наблюдают нингидриновую реакцию (лабораторная работа №1).

Рис.1. Упрощенный прибор для распределительной хроматографии на бумаге: 1-пробка; 2-иголка; 3-фронт растворителя; 4-пробирка; 5-полоска хроматографической бумаги; 6-место нанесения смеси аминокислот, очерченное карандашом; 7-растворитель.

Идентификацию аминокислот осуществляют по значению Rf. Для этого измеряют с точностью до миллиметра расстояние, пройденное проявителем от линии нанесения аминокислот до границы фронта проявителя. С такой же точностью измеряют расстояние от точки нанесения аминокислот до центра цветного пятна. Путем деления величины пути, пройденного аминокислотой на хроматограмме, на величину пути, пройденного проявителем, находят значение коэффициента Rf.

Таким же образом вычисляют Rf для стандартных известных аминокислот (хроматограммы с известными аминокислотами ставятся параллельно). И сравнивая Rf известных аминокислот с Rf аминокислот смеси, определяют последние.

ЗНАЧЕНИЯ Rf АМИНОКИСЛОТ (при температуре 20°С)

Аминокислота Растворитель бутанол-уксусная кислота:вода /4:1:5/
Цистин 0,04
Цистеин 0,05
Аспарагиновая кислота 0,24
Глутаминовая кислота 0,28
Серии 0,22
Лизин 0,14
Глицин 0,25
Треонин 0,29
Гистидин 0,16
Алании 0,36
Тирозин 0,45
Валин 0,50
Метионин 0,50
Лейцин 0,69
Фенилаланин 0,66
Изолейцин 0,68
Аргинин 0,18

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

При всех хроматографических методах разделения молекулы распределяются между стационарной и подвижной фазами (табл. 3.6). Разделение зависит от относительной способности содержащихся в смеси молекул к более прочной ассоциации с одной или другой фазой.

Здесь мы рассмотрим в основном методы разделения аминокислот, однако применение этих методов ни в коей мере не ограничивается данными молекулами.

Сейчас этот метод в значительной мере вытеснен более совершенными методами, однако он все же применяется для разделения аминокислот. Образцы наносят на бумагу в заранее отмеченную точку, отступив примерно 5 см от верхнего края полоски фильтровальной бумаги. Затем полоску подвешивают в закрытом сосуде, на дно которого налита смесь растворителей (рис. 3.9).

Для разделения аминокислот используют полярные растворители в виде бинарных, тройных и более сложных смесей воды, спиртов, кислот и оснований. Более полярные компоненты растворителя ассоциируются с целлюлозой и образуют стационарную

Таблица 3.6. Физическое состояние фаз в хроматографических системах, используемых в биохимии

Рис. 3.9. Устройство для хроматографии на бумаге (в нисходящем варианте).

фазу, а менее полярные составляют подвижную фазу. Это — нормальная распределительная хроматография. В распределительной хроматографии с обращенной фазой полярная и неполярная фазы меняются местами (для этого, например, бумагу предварительно погружают в раствор силикона). Распределительная хроматография с обращенной фазой используется для разделения неполярных пептидов или липидов; для таких полярных соединений, как аминокислоты, она непригодна. Растворитель перемещается по бумаге вверх или вниз (восходящая или нисходящая хроматография). Когда он доходит почти до конца, полоску вынимают из сосуда, высушивают и обрабатывают определенным образом, чтобы на ней проявились интересующие исследователя соединения (при разделении аминокислот используют обработку 0,5%-ным нингидрином в ацетоне с последующим прогреванием в течение нескольких минут при . Аминокислоты с объемными неполярными боковыми цепями , перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими неполярными боковыми цепями или с полярными боковыми цепями . Это обусловлено большей растворимостью полярных молекул в гидрофильной стационарной фазе и неполярных — в органических растворителях. Отметим, что в ряду неполярных аминокислот при увеличении длины неполярной боковой цепи, сопровождающемся усилением ее неполярного характера, увеличивается и подвижность аминокислоты.

Отношение расстояния, на которое перемещается данная аминокислота, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя (оба они отсчитываются от точки нанесения смеси аминокислот), обозначают через (подвижность по отношению к фронту растворителя). Значение для данной аминокислоты зависит от условий эксперимента, например от типа растворителя. Хотя предварительную идентификацию аминокислоты можно провести исходя лишь из ее значения R, рекомендуется одновременно с неизвестной смесью проводить хроматографирование известной стандартной смеси аминокислот.

Рис. 3.10. Идентификация аминокислот, входящих в состав белков. После хроматографического разделения на бумаге с использованием в качестве растворителя системы бутанол/уксусная кислота (нисходящий вариант) аминокислоты окрашивают нингидрином.

В этом случае подвижность исследуемой аминокислоты можно отнести к подвижности стандарта (например, не Подвижности, выраженные относительно стандарта, меняются от эксперимента к эксперименту в меньшей степени, чем

Для количественного анализа аминокислот каждое пятно вырезают и элюируют (вымывают) вещество подходящим растворителем; затем проводят количественный колориметрический (нингидриновый) анализ. В другом варианте бумагу опрыскивают нингидрином и измеряют с помощью фотометра интенсивность окрашивания пятна в проходящем или отраженном свете.

При двумерной хроматографии на бумаге образец наносят на один из углов квадратного листа бумаги и проводят разделение в одной системе растворителей. Затем лист вынимают, высушивают, поворачивают его на 90° и хроматографируют в другом растворителе (рис. 3.11).

Имеются два четко различающихся варианта тонкослойной хроматографии. Распределительная тонкослойная хроматография (РТСХ) сходна с

Рис. 3.11. Двумерная хроматограмма аминокислот, входящих в состав белка (воспроизведена с некоторыми модификациями из работы Anal. Chem. 1953:25:396).

распределительной хроматографией на бумаге, а адсорбционная тонкослойная хроматография (АТСХ) основана на совершенно иных принципах.

При проведении РТСХ на порошке целлюлозы или на других сравнительно инертных носителях можно использовать такие же системы растворителей и такие же проявляющие реагенты, как и при хроматографии на бумаге. Возможна и РТСХ с обращенной фазой.

Разделение с помощью АТСХ определяется способностью растворителя (этот растворитель не обязательно является бинарной или более сложной смесью) элюировать компоненты образца с места его адсорбции на активированном сорбенте, например на нагретом силикагеле. АТСХ применима для разделения таких неполярных соединений, как липиды, но не для разделения аминокислот и большинства пептидов.

Разделение аминокислот можно проводить разными методами, но для анализа аминокислотного состава полипептида после его гидролиза обычно используют автоматическую ионообменную хроматографию. Полное разделение аминокислот, их идентификация и количественная оценка занимают менее трех часов. В методе Мура и Штейна используют короткую и длинную колонки, заполненные смолой из сульфонированного полистирола в -форме. Когда кислотный гидролизат при наносят на колонку, аминокислоты связываются в результате катионного обмена с Далее колонку элюируют раствором цитрата натрия при заранее запрограммированных значениях и температуры. Короткую колонку элюируют одним буфером, длинную — двумя. Элюат обрабатывают нингидрином, измеряя интенсивность окраски с помощью проточного колориметра. Данные автоматически регистрируются на ленте самописца и могут передаваться в компьютер для вычисления площади под пиком (рис. 3.12).

Рис. 3.12. Автоматический анализ кислотного гидролизата эндосперма пшеницы по Муру и Штейну на колонках . Л. Для идентификации оснбвных аминокислот используется короткая колонка (5 х 0,9 см); элюирование проводят при pH = 5,28, продолжительность опыта 60 мин. Б. Для разделения нейтральных и кислых аминокислот используется более длинная колонка (55 у 0,9 см); элюирование проводят сначала буфером с pH = 3,25, а затем буфером с pH = 4,25. В качестве внутреннего стандарта добавлен норлейцин. Оснбвные аминокислоты остаются на колонке. Продолжительность опыта 180 мин. Элюируемые фракции автоматически обрабатывают нингидрином, после чего измеряют их оптическую плотность при 570 и 440 нм. Регистрация при длине волны 440 нм используется исключительно для идентификации пролина и гидроксипролина (в эндосперме пшеницы они отсутствуют). (С любезного разрешения Е. Т. Mertz, Purdue University.)

В биохимии широкое применение нашло разделение аминокислот, полипептидов и других амфолитов (молекул, суммарный заряд которых зависит от среды) под действием наложенного постоянного электрического поля. При разделении аминокислот в качестве инертных носителей чаще всего используют полоски бумаги или тонкие слои целлюлозного порошка. Разделение проводят в течение 0,5—2 ч при напряжении 2000—5000 В в зависимости от суммарных зарядов амфолитов и их молекулярных масс. Среди молекул, несущих одинаковый заряд, более легкие мигрируют быстрее. Но более важным параметром при разделении является суммарный заряд. Метод применяется для разделения аминокислот, низкомолекулярных пептидов, некоторых белков, нуклеотидов и сахарофосфатов. Образец помещают на носитель, смачивают буфером при соответствующем и соединяют с буферным резервуаром полоской фильтровальной бумаги. Бумагу прикрывают стеклянной пластинкой или погружают в углеводородный растворитель для охлаждения. В электрическом поле молекулы, несущие при данном pH отрицательный заряд, мигрируют к аноду, а те, которые несут положительный заряд,—к катоду. Далее высушенную электрофореграмму «проявляют» нингидрином (при работе с аминокислотами, пептидами) или измеряют поглощение в Уф-свете (при работе с нуклеотидами).

Выбор определяется значениями диссоциирующих групп, входящих в состав молекул смеси. При глутамат и аспартат несут заряд — 1 и движутся к аноду; разделение их осуществляется благодаря различию в молекулярной массе. Лизин, аргинин и гистидин движутся в противоположном направлении, а все другие аминокислоты, входящие в состав белка, остаются вблизи места нанесения. При разделении пептидов, образовавшихся в результате ферментативного расщепления, уменьшение pH до 3,5 приводит к увеличению заряда катионных групп и обеспечивает лучшее разделение.

Читайте также:  Анализ на переносимость молочного белка

Barrett G. С. Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids, Chapman and Hall, 1985.

Cooper T.G. The Tools of Biochemistry, Wiley, 1977. Friedman M. The Chemistry and Biochemisrty of the Sulfhydryl Group in Amino Acids, Peptides, and Proteins, Pergamon Press, 1973.

Greenstein J.P., Winitz M. Chemictry of the Amino Acids, 3 vols, Wiley, 1961.

Heftman E. Chromatography: A Laboratory Handbook of Chromatographic and Electrophoretic Methods, 3rd ed., Van Nostrand, 1975.

Touchstone J. C. Practice of Thin Layer Chromatography, Wi-ley-Interscience, 1978.

Zweig G., Sherma J. Handbook of Chromatography, 2 vols, CRC Press, 1972.

источник

Определение аминокислотного состава белков может быть осуществлено различными методами: химическим, хроматографическим, микробиологическим и изотопным. Чаще используются хроматографические методы.

Бумажная хроматография. Бумажная хроматография используется для идентификации компонентов смеси аминокислот с ди- и три-пептидами, получаемой при частичном гидролизе белков и полипептидов.

Гидролиз может быть осуществлен кислотным, щелочным или ферментативным методом. Кислотный метод используется чаще (6 н. HCl, 8 н. H2SO4). Гидролиз проводят при нагревании, иногда при повышенном давлении. Показателями окончания гидролиза могут служить: прекращение нарастания карбоксильных или аминных групп в гидролизате, либо отрицательная биуретовая реакция. Избыток гидролизующего реагента удаляют: серную кислоту осаждают Ca(OH)2, соляную кислоту отгоняют в вакууме, а остаток кислоты осаждают нитратом серебра.

Компоненты гидролизата распределяются между водой, адсорбированной на целлюлозе и являющейся неподвижной фазой, и органическим растворителем, подвижной фазой, которая движется вдоль листа вверх или вниз. В качестве подвижной фазы используется смесь бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5). Более липофильные аминокислоты сильнее увлекаются органическим растворителем, более гидрофильные – проявляют большую тенденцию связываться с неподвижной фазой. Гомологические соединения, отличающиеся даже на одно метиленовое звено, движутся с различной скоростью и легко могут быть разделены. По окончании хроматографии бумагу высушивают и обрабатывают проявителем (0,5% раствор нингидрина в смеси ацетон-ледяная уксусная кислота-вода) и нагревают в течение нескольких минут. Аминокислоты проявляются в виде окрашенных пятен. Подвижность – постоянная величина, характерная для каждого соединения возрастает с увеличением молекулярной массы. Для аминокислот с неразветвленной цепью величина подвижности несколько больше, чем для соответствующих изомеров. Введение в молекулу полярных групп снижает подвижность соединения. Аминокислоты с объемными неполярными боковыми цепями (лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан и др.) перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими неполярными боковыми цепями (пролин, аланин, глицин) или с полярными боковыми цепями (треонин, аргини, цистеин, гистидин, лизин). Это обусловлено большей растворимостью полярных молекул в гидрофильной стационарной фазе и неполярных – в органических растворителях.

Бумажная хроматография может быть использована для количественной оценки содержания аминокислот. Каждое пятно вырезают и элюируют подходящим растворителем; затем проводят количественный колориметрический (нингидриновый) анализ. В другом варианте бумагу опрыскивают нингидрином и измеряют с помощью фотометра интенсивность окрашивания пятна в отраженном или проходящем свете. При полуколичественной оценке содержание аминокислот оценивают по площади пятен на хроматограмме, которые пропорциональны концентрациям аминокислот в разделяемой смеси.

Тонкослойная хроматография. Для разделения и определения аминокислот может быть также использована тонкослойная хроматография. ТСХ, как известно, существует в двух вариантах. Распределительная ТСХ сходна с распределительной на бумаге и адсорбционная ТСХ, основана совершенно на других принципах.

При проведении РТСХ на порошке целлюлозы или других относительно инертных носителях можно использовать такие же системы растворителей и такие же проявляющие реагенты, как и при хроматографии на бумаге.

Разделение с помощью АТСХ определяется способностью растворителя (этот растворитель не обязательно является бинарной или более сложной смесью) элюировать компоненты образца с места его адсорбции на активированном сорбенте. Например, на нагретом силикагеле. АТСХ применима для разделения таких неполярных соединений, как липиды, но не для разделения аминокислот и большинства пептидов. Для разделения аминокислот используют РТСХ, которая позволяет достаточно быстро разделять и определять 22 аминокислоты белковых гидролизатов.

Аминокислоты в белковом гидролизате могут быть определены также методом газовой хроматографии, но перед хроматографическим анализом аминокислоты как правило переводят в летучие соединения.

-Взаимодействие с нингидрином. Образуются соответствующие альдегиды.

Таким образом, получают смесь альдегидов и анализируют ее. Это простейший случай, пригоден лишь для некоторых аминокислот.

-Переводят аминоксилоты в летучие эфиры (алкильные эфиры, метильные эфиры оксикислот, метиловые эфиры хлорзамещенных кислот и др.).

Выбор производных зависит от исследуемой смеси аминокислот.

Ионообменная хроматография. В настоящее время аминокислотный состав пищевых продуктов определяется исключительно с помощью автоматической ионообменной хроматографии.

Ионообменная хроматография основана на обратимом стехиометрическом обмене ионов, находящихся в растворе, на ионы, входящие в состав ионообменника (катионита, анионита) и на различной способности разделяемых ионов к ионному обмену с фиксированными ионами сорбента, образующимися в результате диссоциации ионогенных групп. Для органических ионов на электростатическое взаимодействие с фиксированными зарядами ионита накладывается гидрофобное взаимодействие органической части иона с матрицей ионита. Чтобы уменьшить его вклад в удерживание органических ионов и добиться оптимальной селективности их разделения, к водному элюенту добавляют органический компонент (1–25% метанола, изопропанола, ацетонитрила).

В методе Мура и Штейна используют короткую и длинную колонки, заполненные смолой из сульфонированного полистирола в Na + – форме. Когда кислотный гидролизат при рН = 2 наносят на колонку, аминокислоты связываются в результате катионного обмена с ионами натрия. Далее колонку элюируют раствором цитрата натрия при заранее запрограммированных значениях рН и температуры. Короткую колонку элюируют одним буфером, длинную – двумя. Элюат обрабатывают нингидрином, измеряя интенсивность окраски с помощью проточного колориметра. Данные автоматически регистрируются на ленте самописца и могут передаваться в компьютер для вычисления площади под пиком.

Высоковольтный электрофорез на инертных носителях. В биохимии широкое применение нашло разделение аминокислот, полипептидов и других амфолитов (молекул, суммарный заряд которых зависит от рН среды) под действием наложенного постоянного электрического поля. Это метод высоковольтного электрофореза на инертных носителях. При разделении аминокислот в качестве инертных носителей чаще всего используют полоски бумаги или тонкие слои целлюлозного порошка. Разделение проводят в течение 0,5–2 ч при напряжении 2000–5000 В в зависимости от суммарных зарядов амфолитов и их молекулярных масс. Среди молекул, несущих одинаковый заряд, более легкие мигрируют быстрее. Но более важным параметром при разделении является суммарный заряд. Метод применяется для разделения аминокислот, низкомолекулярных пептидов, некоторых белков, нуклеотидов. Образец помещают на носитель, смачивают буфером при соответствующем рН и соединяют с буферным резервуаром полоской фильтровальной бумаги. Бумагу прикрывают стеклянной пластинкой или погружают в углеводородный растворитель для охлаждения. В электрическом поле молекулы, несущие при данном рН отрицательный заряд, мигрируют к аноду, а те, которые несут положительный заряд, – к катоду. Далее высушенную электрофореграмму «проявляют» нингидрином (при работе с аминокислотами, пептидами) или измеряют поглощение в УФ-свете (при работе с нуклеотидами).

Выбор рН определяется значениями рК диссоциирующих групп, входящих в состав молекул смеси. При рН 6,4 глутамат и аспарат несут заряд –1 и движутся к аноду; разделение их осуществляется благодаря различию в молекулярной массе. Лизин, аргинин и гистидин движутся в противоположном направлении, а все другие аминокислоты, входящие в состав белка, остаются вблизи места нанесения. При разделении пептидов, образовавшихся в результате ферментативного расщепления, уменьшение рН до 3,5 приводит к увеличению заряда катионных групп и обеспечивает лучшее разделение.

Аминокислоты несут по крайней мере две слабо ионизированные группы: -СООН и -NH3 + . В растворе эти группы находятся в двух формах, заряженной и незаряженной, между которыми поддерживается протонное равновесие: R-COOH « R-COO – + H + R-NH3 + « R-NH2 + H + (сопряженные кислоты и основания) R-COOH и R-NH3 + – слабые кислоты, но первая на несколько порядков сильнее. Поэтому чаще всего (плазма крови, межклеточная жидкость рН 7,1–7,4) карбоксильные группы находятся в виде карбоксилатных ионов, аминогруппы протонированы. Аминокилоты в молекулярном (недиссоциированном) виде не существуют ни при каких рН. Примерные значения рК a-аминокислоты и a-аминогруппы в a-аминокислоте равны 2 и 10 соответственно. Полный (суммарный) заряд (алгебраическая сумма всех положительных и отрицательных зарядов) аминокислоты зависит от рН, т.е. от концентрации протонов в растворе. Заряд аминокислоты можно изменить, варьируя рН. Это облегчает физическое разделение аминокислот, пептидов и белков. Значение рН при котором суммарный заряд аминокислоты равен нулю и поэтому она не перемещается в постоянном электрическом поле, называется изоэлектрической точкой (pI). Изоэлектрическая точка находится посредине между ближайшими значениями рК диссоциирующих групп.

Методы бумажной, тонкослойной хроматографии, микробиологические, газохроматографические и ряд других, в настоящее время практически не используются вследствие худшей воспроизводимости и большой длительности. Современные хроматографы позволяют определять аминокислотный состав смеси, содержащей лишь 10 –7 –10 –9 моль каждого компонента с воспроизводимостью до 5% за 2–4 часа.

Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого белка или пептида и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Поскольку при нейтральных рН пептидные связи стабильны, применяют кислотный или щелочной катализ. Ферментативный катализ для полного гидролиза менее пригоден. Полный гидролиз белка на составляющие аминокислоты неизбежно сопровождается частичной потерей некоторых аминокислотных остатков. Для гидролиза обычно используется 6 н. водный раствор соляной кислоты (110ºС), в вакуумированной ампуле. Количественное определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких анализаторов смесь аминокислот разделяют на сульфокатионитах, а детектирование осуществляют спектрофотометрически по реакции с нингидрином или флуориметрически с о-фталевым диальдегидом.

Однако данные по аминокислотному составу однотипных продуктов, полученные в разных лабораториях по отдельным аминокислотам, иногда различаются до 50%.

Эти различия обусловлены не только сортовыми, видовыми или технологическими различиями, а главным образом условием проведения гидролиза пищевого продукта. При стандартном кислотном гидролизе (6 н. HСl, 110–120ºС, 22–24 часа) происходит частичное разрушение некоторых аминокислот, в том числе треонина, серина (на 10–15% и тем больше, чем дольше проводится гидролиз) и особенно метионина (30–60%) и цистина 56–60%, а также практически полное разрушение триптофана и цистеина. Этот процесс усиливается в присутствии больших количеств углеводов в продукте. Для количественного определения метионина и цистина рекомендуется проводить предварительное их окисление надмуравьиной кислотой. При этом цистин превращается в цистеиновую кислоту, а метионин в метионин-сульфон, которые весьма устойчивы при последующем кислотном гидролизе.

Цистин Цистеиновая кислота

Трудной задачей в аминокислотном анализе является определение триптофана. Как уже говорилось, при кислотном гидролизе происходит почти полное его разрушение (до 90%). Поэтому для определения триптофана проводят один из вариантов щелочного гидролиза 2 н. NaOH, 100ºС, 16–18 часов в присутствии 5% хлорида олова или 2 н. гидроокиси бария, при которых он разрушается незначительно (до 10%). Минимальное разрушение происходит в присутствии тиогликолевой кислоты и предварительно гидролизованного крахмала. (При щелочном гидролизе происходит разрушение серина, треонина, аргинина и цистеина). Гидролизат после нейтрализации смесью лимонной и соляной кислот немедленно (во избежание студнеобразования) анализируют на аминокислотном анализаторе. Что касается многочисленных химических методов определения триптофана, то они, как правило, в пищевых продуктах плохо воспроизводимы и поэтому их использовать не рекомендуется.

Для мясных продуктов дополнительной необходимой аминокислотой является оксипролин, который характеризует количество соединительных тканных белков в мясе. Его можно определять ионообменной хроматографией с помощью автоматических анализаторов или химическим колориметрическим методом. Метод основан на нейтрализации кислотного гидролизата до рН 6,0, последующем окислении оксипролина с помощью 1,4% раствора хлорамина Т (или хлорамина Б) в смеси пропилового спирта и буфера, колориметрическом определении при 533 нм продуктов окисления оксипролина после реакции с 10%-ным раствором пара-диметиламинобензальдегида в смеси хлорной кислоты и пропилового спирта (1:2).

В связи с тем, что тирозин, фенилаланин и пролин в присутствии кислорода могут частично окисляться, стандартный кислотный гидролиз рекомендуется проводить в атмосфере азота. Ряд аминокислот, в том числе лейцин, изолейцин и валин, требуют для своего полного выделения из белков более длительного кислотного гидролиза – до 72 ч. В биохимии при анализе белков гидролизуют параллельные пробы в течение 24, 48, 72 и 96 ч.

Для точного количественного определения всех аминокислот требуется проводить 5 различных гидролизов, что весьма удлиняет определение. Обычно же проводят 1–2 гидролиза (стандартный с соляной кислотой и с предварительным оксилением надмуравьиной кислотой).

Читайте также:  Анализ на непереносимость белка у новорожденных

Во избежание потерь аминокислот удаление избытка кислоты при кислотном гидролизе следует проводить немедленно многократным выпариванием в вакуум-эксикаторе с добавлением дистиллированной воды.

При правильной работе анализатора ионообменные колонки работают без замены смолы довольно долго. Однако, если образцы содержат заметные количества красящих веществ и липидов, то колонка быстро забивается и для восстановления ее разделительных способностей требуется многократная регенерация, иногда с перенабивкой колонки. Поэтому, для продуктов, содержащих более 5% жира, рекомендуется предварительно удалять липиды экстракцией. В таблице 2.3 приведены условия пробоподготовки основных пищевых продуктов при анализе аминокислотного состава.

Таблица 2.3. – Условия подготовки проб пищевых продуктов к анализу

Продукт Способ удаления липидов Весовое соотношение белок: HCl (6М)
Белковые концетнраты (изоляты) Нетребуется 1:200
Мясо, рыба, мясные и рыбные консервы, субпродукты) Экстракция 10-кратным количеством диэтилового эфира 3–4 раза или смесью этанол-хлороформ (1:2) 10-кратным количеством 2 раза 1:250
Молоко и молочные продукты Экстракция 10-кратным к навеске количеством смесью этанол-хлороформ (1:2) 2 раза 1:1000
Зерно и зернопродукты Не требуется 1:1000
Растительные продукты Не требуется 1:500
Мясо-растительные и рыбо-растительные продукты Экстракция 10-кратным количеством диэтилового эфира 3-4 раза; смесью этанол-хлороформ (1:2) 10-кратным количеством к навеске 2 раза 1:1000
Яйцо, яичные продукты Экстракция смесью этанол- хлороформ (1:2), 10-кратным количеством к навеске 2 раза 1:200

Контрольные вопросы:

1. Дайте определение понятию «белки».

2. На какие группы делят белки по их функциям в организме?

3. Какова роль белков в питании человека?

4. Каковы рекомендуемые нормы белка в питании?

5. Каково рекомендуемое соотношение белков растительного и животного происхождения и как белки различного происхождения отличаются по своему аминокислотному составу?

6. Какие незаменимые аминокислоты вы знаете и какие аминокислоты могут стать незаменимыми?

7. Как определяют содержание общего азота в продуктах питания?

8. Как определяют аминокислотный состав белков?

9. Какие методы определения аминокислот вы знаете?

§ 2.4. Углеводы

Углеводы широко представлены в растениях и животных, где они выполняют как структурные, так и метаболические функции. В растениях в процессе фотосинтеза из углекислого газа и воды синтезируется глюкоза, которая далее запасается в виде крахмала или превращается в целлюлозу – структурную основу растений. Животные способны синтезировать ряд углеводов из жиров и белков, но большая часть углеводов поступает с пищей растительного происхождения.

Дата добавления: 2015-05-29 ; Просмотров: 3521 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник

Хроматография является эффективным методом для решения одной из важнейших задач биохимии – разделения и идентификации химических соединений (белков, аминокислот, жирных кислот, моно- и дисахаридов и др.). Метод предложен в 1903 г. профессором Воронежского университета М.С. Цветом для разделения растительных пигментов.

В настоящее время известно большое число различных видов хроматографии (распределительная, адсорбционная, ионообменная, на молекулярных ситах) и различных приемов их применения (на бумаге, колоночная, тонкослойная, газовая). Современные разновидности хроматографии, различающиеся по технике выполнения позволяют быстро разделить отдельные компоненты из небольшого количества сложной смеси.

Принцип распределительной хроматографии состоит в том, что вещества помещают в систему, которая содержит два физически различных компонента- подвижную и неподвижную фазы. Неподвижную (стационарную) фазу называют сорбентом. Если сорбентом служит жидкость, удерживаемая каким-либо твердым телом, то это тело называют носителем или матрицей. Подвижную фазу называют растворителем или проявителем; компоненты разделяемой смеси – растворенными веществами. В варианте распределительной хроматографии на бумаге носителем служит целлюлоза в виде листов хроматографической бумаги. Неподвижной фазой служат пары воды, насыщающие лист этой бумаги при данных условиях. В качестве подвижной фазы применяют насыщенный водой органический растворитель, который, двигаясь по бумаге, растворяет и увлекает за собой нанесенный образец.

Распределительная хроматография основана на том, что растворенное вещество распределяется между подвижной и неподвижной фазами. Этот процесс называется распределением и количественно описывается коэффициентом распределения, представляющим собой отношение концентраций растворенного вещества в каждой из двух фаз. Рассчитывают этот коэффициент по следующей формуле:

,

где, mп – масса подвижной фазы;

mн – масса неподвижной фазы;

Rf – коэффициент подвижности (скорости перемещения зоны компонента).

По мере движения растворителя происходит множество микроскопических актов распределения каждого из исследуемых компонентов между подвижной и неподвижной фазами, в результате чего вещества с разными коэффициентами распределения оказываются на различном расстоянии от старта.

Коэффициентом Rf (подвижности) называют отношение расстояния от места нанесения исследуемого вещества до середины пятна (а) к расстоянию, от места нанесения вещества до фронта растворителя (в): Rf = а/в. Каждое из разделяемых веществ имеет свой Rf. Этот коэффициент может быть использован для идентификации (определения) компонентов исследуемой смеси, но воспроизводимость его зависит от условий опыта (температура, сорт бумаги, чистота растворителя, однотипность процедур и др.).

Существуют различные виды хроматографии на бумаге: нисходящая (растворитель движется по бумаге сверху вниз), восходящая (растворитель движется по бумаге снизу верх), круговая (движение растворителя происходит от центра круга к периферии) и др. В учебных целях наиболее удобна круговая (радиальная) хроматография.

Все операции с хроматографической бумагой проделывают тщательно вымытыми перед работой руками или в чистых резиновых перчатках. Надписи на бумаге делают простым карандашом.

ХОД РАБОТЫ. Работа состоит из нескольких этапов, которые выполняются в определенной последовательности:

1.Разметка и маркировка хроматографической бумаги. Из хроматографической бумаги вырезают квадрат со стороной на 0,5 см больше диаметра используемой для работы чашки Петри (рис.3).

Двумя перпендикулярными линиями, проведенными карандашом через центр, квадрат делят на четыре сектора. По краю каждого сектора делают простым карандашом надпись о наносимом веществе.

На взаимно перпендикулярных прямых, отступив от центра 1,5 см к краю каждой стороны квадрата, сделать карандашом метки (1). Это будет место для нанесения пробы (стартовая линия).

2. Нанесение растворов. В отмеченные точки микропипеткой наносят растворы аминокислот (в соответствии с надписью) или смесь в объеме 0,002-0,01 мл. Нанесение осуществляют прикосновением острого конца заполненной микропипетки к бумаге в отмеченную точку и быстром ее поднятии. При этом на бумаге должно оставаться пятно диаметром не более 3-4 мм. После полного подсыхания пятна операцию повторяют. Так поступают до тех пор, пока весь раствор из микропипетки не будет перенесен на отмеченную точку (стартовую линию).

В центре хроматограммы просверливают отверстие (2) и в него вставляют фитилек (трубочку, скрученную из хроматографической бумаги). Фитилек (3) должен плотно прилегать к краям отверстия, высота его должна быть несколько меньше, чем внутренняя высота камеры.

3. Приготовление растворителя. В колбу объемом 100 мл приливают бутанол, уксусную кислоту и воду в соотношении 12:3:5 и тщательно перемешивают. Полученный раствор наливают в одну из половин чашки Петри по 15-20 мл, приготовленного для разделения смеси аминокислот.

4. Разгонка аминокислот. Хроматограмму укладывают на половинку чашки так, чтобы фитилек располагался в центре и касался ее дна. Для уменьшения испарения растворителя хроматограмму накрывают второй половиной чашки, добиваясь совмещения краев чашек.

Насыщенный неподвижной фазой растворитель по фитильку непрерывно поступает к центру хроматограммы и, двигаясь к краям, растворяет нанесенные аминокислоты и увлекает их за собой. При этом каждая из аминокислот движется по слою бумаги с определенной скоростью, что обусловлено коэффициентом распределения. Скорость аминокислот неодинакова, так как зависит от степени их растворения в неподвижной и подвижной фазе растворителя. Аминокислоты с полярными незаряженными, отрицательно и положительно заряженными (гидрофильными) радикалами движутся медленно, вместе с водой, некоторые чуть впереди воды. Аминокислоты с неполярными, гидрофобными радикалами перемещаются быстрее, так как вода, продвигаясь по бумаге, выталкивает их, а бутилово-уксусная фракция – увлекает за собой. Скорость перемещения аминокислот одновременно зависит от величины и объема радикала.

После того как растворитель дойдет почти до краев чашки, хроматограмму снимают, удаляют фитилек, простым карандашом проводят линию между сухой и мокрыми зонами бумаги (отмечают границу фронта растворителя) и высушивают в вытяжном шкафу.

5. Проявление. Хроматограмму смачивают в налитом в ванночку растворе с массовой концентрацией нингидрина в ацетоне 1 %, вновь высушивают в вытяжном шкафу и помещают для развития окраски пятен аминокислот на 1,5-2 мин в сушильный шкаф при температуре 100 °С или прогревают над плиткой до полного развития окраски комплексов аминокислот с нингидрином.

6. Определение коэффициента подвижности аминокислот. Описывают кратко принцип метода бумажной хроматографии, определяют Rf аминокислот-метчиков и аминокислот смеси, идентифицируют аминокислоты смеси, хроматограмму зарисовывают. Замеряют расстояние, пройденное каждой аминокислотой от точки старта до середины пятна (а), и расстояние пройденное растворителем в данном секторе (в). По формуле рассчитывают коэффициент подвижности:

7. Идентификация аминокислот, содержащихся в смеси, осуществляется по совпадению их позиций с позицией аминокислот-метчиков на хроматограмме, по совпадению коэффициентов подвижности и по однородности окраски пятен.

Rf для аминокислот при разделении на бумаге растворителем, состоящим из бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 12:3:5 приведены в табл.7.

Коэффициенты подвижности аминокислот (Rf)

Аминокислоты Rf Аминокислоты Rf Аминокислоты Rf
Цистеин 0,08 Оксипролин 0,22 Тирозин 0,45
Гистидин 0,11 Глицин 0,23 Триптофан 0,50
Лизин 0,12 Аспарагиновая 0,23 Метионин 0,50
Аспарагин 0,12 Треонин 0,26 Валин 0,51
Глутамин 0,17 Глутаминовая 0,28 Фенилаланин 0,60
Аргинин 0,15 Аланин 0,30 Изолейцин 0,67
Серин 0,22 Пролин 0,34 Лейцин 0,70

Хроматографический метод позволяет произвести и количественное определение аминокислот в смеси. Для этого пятна аминокислот смеси и аминокислот-метчиков обводят карандашом, нумеруют, вырезают, делают в них надрезы и помещают в пробирки с соответствующим пятну номером.

Затем в пробирки наливают по 3 мл насыщенного сульфатом меди раствора с объемной концентрацией этанола 80 %, содержимое в пробирках перемешивают и ставят в темное место на 30 мин (каждые 10 мин содержимое пробирок перемешивают). Окраска с бумаги переходит в раствор этанола с образованием медных производных сине-фиолетового Руэмана, окрашенных в красный цвет. Оптическую плотность окрашенных растворов аминокислот-метчиков и аминокислот смеси измеряют при 540 нм (зеленный светофильтр) на ФЭКе против насыщенного сульфатом меди раствора с объемной концентрацией этанола 80 %. Массовую концентрацию каждой аминокислоты в смеси рассчитывают по формуле:

,

где, Х – массовая концентрация аминокислоты в исследуемой смеси, мг/мл;

С – массовая концентрация аминокислоты-метчика (свидетеля), мг/мл;

u — объем нанесенного на хроматограмму раствора аминокислоты-метчика, мл;

u1 — объем нанесенного на хроматограмму раствора исследуемой смеси, мл;

Dпр – оптическая плотность раствора с пятна аминокислоты смеси;

Dсв – оптическая плотность раствора с пятна аминокислоты метчика.

Результаты расчетов по количественному составу аминокислот смеси записывают и делают окончательный вывод по всей работе.

РЕАКТИВЫ. Хроматографическая бумага; вода дистиллированная; органический растворитель (бутанол, ледяная уксусная кислота, вода в соотношении по объему 12:3:5); этанол; раствор с массовой концентрацией нингидрина в ацетоне 1 %; смесь аминокислот (взвешивают по 10 мг лизина, аланина и лейцина, смешивают вместе и растворяют в 10 мл раствора с объемной концентрацией этанола 80 %, при отсутствии какой-либо из аминокислот для приготовления смеси можно взять другие аминокислоты с существенно отличающимися величинами Rf); растворы аминокислот-метчиков, или «свидетелей» (10 мг каждой из аминокислот, взятых для приготовления смеси, растворяют в отдельных флаконах в 10 мл раствора с объемной концентрацией этанола 80 %); раствор с объемной концентрацией этанола 80 % насыщенный сульфатом меди.

1. Общая характеристика метода хроматографии и ее роль в биохимии.

2. Назовите основные виды хроматографии.

3. Общая характеристика принципа хроматографии.

4. Назовите разновидности метода хроматографии на бумаге и чем они отличаются.

5. Назовите основные этапы радиальной хроматографии на бумаге.

6. Техника разметки и маркировки хроматографической бумаги.

7.Техника нанесения растворов в точки старта.

8. Состав и техника приготовления растворителя для «разгонки» аминокислот на бумаге.

9. От чего зависит скорость движения аминокислот в процессе хроматографии.

10. Как рассчитывается коэффициент подвижности (Rf) и что он характеризует?

11. Что такое «идентификация аминокислот» и как её проводят.

12. Назовите основные этапы количественного определения аминокислот методом хроматографии на бумаге.

13. Техника экстрагирования окрашенных пятен.

14. Как определяется содержание аминокислот в 1 мл смеси.

Дата добавления: 2015-02-13 ; просмотров: 4893 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

источник

В настоящее время для разделения и количественного определения белков и аминокислот, а также нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и их метаболитов широко используется метод хроматографии – динамического разделения смеси веществ.

Существует несколько разновидностей хроматографического метода анализа, различающихся по механизму разделения веществ. Важнейшими из них являются следующие:

адсорбционная хроматография, основанная на различной способности отдельных соединений адсорбироваться на тех или иных сорбентах;

Читайте также:  Анализ на содержание белка в плазме

ионообменная хроматография, основанная на различной способности разделяемых веществ к ионному обмену с тем или иным ионитом;

распределительная хроматография, основанная на различной растворимости разделяемых веществ в двух частично смешивающихся жидкостях;

диффузионная хроматография, основанная на разделении веществ по скорости диффузии внутрь сорбента; к этому типу хроматографии относится гель-фильтрационная хроматография, разделение веществ при которой основано на механическом явлении молекулярного просеивания;

хроматография по сродству, новый и высокоспецифический метод разделения различных соединений, основанный на применении нерастворимых биологически активных веществ, обладающих сродством к разделяемым веществам.

Различаются хроматографические методы анализа и по технике выполнения. Так адсорбционная, ионообменная, распределительная и диффузионная хроматографии могут проводиться в колонках и на плоскости (на бумаге или в тонких слоях).

При газовой хроматографии (адсорбционной или распределительной) разделение смеси веществ ведется в атмосфере газа (разделение компонентов газовой смеси).

Современные хроматографические методы позволяют быстро выделить отдельные компоненты из небольшого количества сложной смеси.

Для разделения аминокислот наиболее доступным и сравнительно точным является метод распределительной хроматографии на бумаге. Для этой цели можно применять любую фильтровальную бумагу хорошего качества. Метод основан на различной растворимости отдельных аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой – водонасыщенный органический растворитель (фенол, смесь бутилового спирта с уксусной кислотой и др.). Водная фаза неподвижна, так как в данном случае вода сорбирована на инертном носителе – целлюлозе, которая в насыщенной влагой атмосфере (в хроматографической камере) удерживает до 20-22% воды, оставаясь внешне сухой; подвижной фазой обычно является насыщенный водой раствор фенола. Чем больше растворимость аминокислоты в водной фазе и меньше – в органическом растворителе, тем медленнее движется аминокислота по бумаге с органическим растворителем.

Сущность метода заключается в том, что на хроматографическую бумагу в одну точку или по одной линии наносят исследуемую смесь веществ (аминокислот). После подсушивания конец бумаги погружают в смесь растворителей, которая вследствие капиллярности бумаги постепенно всасывается в нее. По ходу передвижения растворителя смесь аминокислот будет разделяться, причем те из них, которые растворяются в органическом растворителе лучше, продвигаются вдоль бумаги дальше, те же, которые растворяются в нем хуже, делают более короткий путь. Когда фронт растворителя начнет приближаться к другому краю бумаги, процесс прекращают и бумагу высушивают. Затем хроматограмму проявляют реагентом, дающим с аминокислотами цветную реакцию. Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде цветных пятен, расположенных на разных расстояниях от места нанесения исследуемой смеси.

Скорость перемещения отдельных аминокислот может быть выражена посредством коэффициента распределения (Rf). Коэффициентом распределения называется отношение расстояния (в миллиметрах) от места нанесения аминокислоты (в составе исследуемой смеси) до середины ее пятна (a) к расстоянию от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя (b):

Коэффициент распределения является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги и др.).

Наиболее часто идентификация аминокислот на хроматограммах проводится путем использования чистых аминокислот «свидетелей», наносимых на ту же хроматограмму. Методы хроматографического анализа на бумаге довольно разнообразны.

1. Хроматографическое разделение растительных пигментов на бумаге

Приборы. Ступка фарфоровмя, химический стакан на 250 мл., стеклянная палочка, полосы фильтровальной бумаги 4х25 мм, штатив с кольцом, воронка с бумажным фильтром.

Реактивы. Стеклянный песок, свежие зеленые листья, ацетон, 85% раствор, мел.

Ход работы. Берут 2,0 г мелкоизмельченных листьев, помещают их в фарфоровую ступку и добавляют небольшое количество стеклянного песка и щепотку мела (для нейтрализации органических кислот, находящихся в растительных соках). К полученной смеси небольшими порциями добавляют 10 мл ацетона, непрерывно растирая содержимое ступки. Когда в ступке образуется однородная масса, ее фильтруют через бумажный фильтр в химический стакан. В отфильтрованный ацетоновый экстракт из листьев опскают на 2-3 мм полоску фильтровальной бумаги, укрепленную при помощи скрепки на стеклянной палочке. Полоска бумаги не должна касаться стенок стакана. Спустя 20-30 мин наблюдают зональное разделение разноокрашенных растительных пигментов на полоске фильтровальной бумаги.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Существует несколько разновидностей хроматографиче­ского метода анализа. Для разделения аминокислот наибо­лее доступным и сравнительно точным является метод рас­пределительной хроматографии на бумаге.

Метод основан на различной растворимости отдельных аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой — водонасыщенный органический растворитель (фенол, смесь бутилового спирта с уксусной кислотой и др.).

Сущность метода заключается в том, что каплю смеси аминокислот или гидролизата белка наносят на полоску хроматографической бумаги, конец которой опускают в под­ходящий органический растворитель. Растворитель всасыва­ется хроматографической бумагой и увлекает за собой нанесенные на бумагу аминокислоты. Скорость перемещения аминокислот на бумаге зависит от химического строения аминокислот и их способности растворяться в подвижном и неподвижном растворителе. В качестве подвижного раство­рителя употребляют, например, водонасыщенный раствор фе­нола, бутиловый спирт, амиловый спирт и др. Неподвижным растворителем является вода, пары которой насыщают хроматографическую бумагу (внешне бумага остается сухой). Чем меньше растворимость аминокислот в воде и чем больше их растворимость в органическом растворителе, тем быстрее они движутся вслед за его фронтом.

Положение аминокислот на бумаге можно обнаружить при помощи цветной реакции с нингидрином. Реакцию про­водят путем опрыскивания из пульверизатора высушенной полоски бумаги 0,5 % спиртовым раствором нингидрина и последующим нагреванием в сушильном шкафу. Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде пятен, окрашенных в голубой, фиолетовый или оранжевый цвета (в зависимости от химической структуры аминокислоты). Основной физико-химической характеристикой хроматографического процесса является коэффициент распределения Kd.

Коэффициент распределения (Kd) характеризует распределение вещества между подвижной и неподвижной фазами при достижении равновесия в хроматографическом процессе. Определить Kd непосредственно из эксперимента (т.е. найти концентрацию соединения в подвижной и неподвижной фазе) довольно сложно. Поэтому в качестве основной характеристики удерживания вещества, определяющей положение его зоны на бумаге используется фактор Rf.ФакторомRfназывают отношение расстояния (в мм) от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна ак расстоянию (в мм) от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя (в):

Фактор Rf является характерной вели­чиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги и т. д.). Идентификация аминокислот на хроматограммах проводится путем использования чистых аминокислот — «свидетелей», наносимых на ту же хроматограмму.

Исследуемые растворы аминокислот наносят вблизи цент­ра бумажного диска, зажатого по краям. Смесь растворите­лей подводят к центру диска при помощи «ножек» из бума­ги. Проводят разделение смеси, состоящей из трех аминокис­лот.

1 Цель работы – провести разделение и идентификацию аминокислот методом бумажной хроматографии

Приборы и материалы

Система растворителя — бутанол:уксусная кислота (конц.):вода в соотношении 3:1:1,4

Задача (раствор, содержащий смесь аминокислот)

Растворы аминокислот – «свидетелей» (глицин, лейцин, триптофан)

Раствор нингидрина в ацетоне 0,5 %.

Описание работы

1. Нанесение раствора на хроматографическую бумагу.

Из хроматографической бумаги вырезают диск диаметром 14 см. Диск перегибают по диаметрам, перпендикулярным друг к другу, и от центра круга чертят квадрат со стороной 2 см, далее делают надрез по диагоналям квадрата; полученные в виде уголков «ножки» отгибают. На расстоянии 0,5 см от линий сгиба «но­жек» простым карандашом чертят еще один квадрат, на середине каждой стороны отмечают точки. В одну точку при помощи капилляра наносят небольшую каплю исследуемого раствора смеси аминокислот. Диаметр получен­ного пятна не должен превышать 3 – 4 мм. В три другие точ­ки наносят растворы аминокислот-«свидетелей», входящих в исследуемую смесь. Рядом с точкой нанесения необходимо обозначить объект нанесения (задача, название аминокислоты-«свидетеля») простым карандашом. На одну и ту же точку следует наносить по 2 – 3 капли раствора, при этом после нанесения каждой капли бумагу слегка просушивают на воздухе и лишь затем наносят сле­дующую каплю.

2. Разделение в хроматографической ка­мере.

Просушенную на воздухе хроматограмму помещают между двумя половинами чашек Петри с одинаковыми диа­метрами, образующими хроматографическую камеру, так, чтобы «ножки» хроматограммы были погружены в органический растворитель бутанол – вода – уксусная кислота (3:1,4:1), который наливают в нижнюю чашку. Хроматографическое разделение проводят при комнатной температуре около 40 минут. Необходимо следить за линией фронта растворителя.

Насыщенный водой бутиловый спирт в уксусной кислоте впитывается бумажным диском и движется по нему, увлекая нанесенные вещества. Дальнейшее продвижение растворите­ля вызывает разделение исследуемой смеси на отдельные аминокислоты, движущиеся с разной скоростью соответствен­но коэффициентам их распределения между водой и органи­ческим растворителем.

3. Проявление хроматограммы.

После того как фронт растворителя пройдет 4/5 длины хроматограммы, хроматограмму извлекают из камеры, отмечают ка­рандашом фронт растворителя и сушат на воздухе под тягой до удаления растворителя. После этого хроматограмму проявляют, опус­кая в 0,5 % раствор нингидрина в ацетоне, и помещают в сушильный шкаф на 5 мин при температуре 80— 100°С, также можно проявить хроматограмму, нагревая ее над электроплиткой. На хроматограмме появляются пятна сине-фиолетового цвета. С по­мощью линейки измеряют расстояния а – от места нанесе­ния капли до середины каждого пятна и в – от места нане­сения капли до фронта растворителя. Проявившиеся пятна обводят карандашом и вычисляют фактор Rf для каждой аминокислоты. Сопостав­ляя положения пятен исследуемого раствора с положением пятен «свидетелей», определяют наличие тех или иных ами­нокислот в исследуемой смеси.

Дата добавления: 2017-02-28 ; просмотров: 1066 | Нарушение авторских прав

источник

Разделение и анализ аминокислот и их производных используются при определении аминокислотного состава белков, секвенировании пептидов, а также с целью диагностики нарушений аминокислотного и белкового обмена. В этом разделе рассматриваются два наиболее важных в практическом отношении метода аминокислотного анализа.

А. Ионообменная хроматография свободных аминокислот

Ионообменная хроматография основана на электростатическом взаимодействии между ионами противоположного заряда. Главное условие при этом, чтобы ионы одного заряда были ковалентно фиксированы на инертном носителе. Такой ионообменник будет связывать ионы противоположного заряда. При промывании ионообменника раствором с более высокой ионной силой или иным значением рН сорбированные ионы можно селективно перевести в раствор люировать) .

При разделении аминокислот методом ионообменной хроматографии в качестве неподвижной фазы используются гранулы синтетического полимера, несущие сульфогруппы (-SО 3 — ). Эти группы ионизированы во всем диапазоне рН и несут отрицательный заряд. Для подготовки к работе ионообменник помещают в колонку и промывают Na + -содержащим буферным раствором с рН 2. При этом сульфогруппа (красный цвет) связывает ионы натрия (синий цвет). Если теперь нанести на колонку раствор аминокислот ( 1а ), то положительно заряженные аминокислоты (зеленый цвет) вытеснят ионы натрия и будут сорбированы на ионите. Поскольку аминокислоты не несут заряда в изоэлектрической точке, их злюируют с колонки буфером с более высоким значением рН ( 1б ). В качестве примера приведен эксперимент ( 3 ) по разделению аспарагиновой кислоты, треонина и гистидина. Графики титрования ( 2 ) наглядно объясняют, почему три аминокислоты элюирутся в указанной последовательности.

Строго говоря, аминокислоты элюируются при величинах рН, значительно ниже изоэлектрических точек, поскольку за связывание с ионообменником конкурируют Na + -ионы буферного раствора.

Б. Распределительная хроматография ФТЦ-производных аминокислот

Распределительная хроматография основана на различной полярности разделяемых веществ. Если на инертный носитель нанести мапополярную неподвижную фазу , а затем смесь неполярных веществ, то они будут удерживаться носителем за счет гидрофобного взаимодействия (см. с. 34). Если такую колонку промыть смесью полярных растворителей ( подвижной фазой ), то компоненты смеси будут перемещаться с различной скоростью в зависимости от их полярности. Вначале будут элюироваться гидрофильные вещества, слабо взаимодействующие с неподвижной фазой, а затем гидрофобные вещества.

В первых вариантах распределительной хроматографии гидрофильной была неподвижная фаза, а гидрофобной — подвижная. Приведенная здесь современная модификация метода носит название обращенно-фазовая хроматография (ОФХ).

Сначала при взаимодействии с фенилизотиоцианатом получают производные аминокислот ( 1 ). ФТЦ-аминокислоты (РТС-аминокислоты) малополярны и благодаря поглощению в УФ-обпасти спектра их можно обнаруживать в элюате фотометрически. В качестве неподвижной фазы используются мелкие частицы силикагеля (диаметром 5 мкм) с привитыми углеводородными цепями (лигандами). Использование мелкодисперсных носителей позволяет повысить качество разделения, однако при этом растет механическое сопротивление колонки. Поэтому высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводят в капиллярах или колонках, выполненных из нержавеющей стали, а элюент подают с помощью насосов высокого давления ( 2 ). В качестве элюентов используются системы растворителей с возрастающей концентрацией ацетонитрила (СН 3 СN). Состав подвижной фазы, а следовательно, и качество разделения ( 3 ) оптимизируют с помощью программируемых градиентных смесителей.

источник