Меню Рубрики

Физико химические методы анализа белков

Растворимость белков сильно зависит от концентрации солей (от ионной силы). В дистиллированной воде белки чаще всего растворяются плохо, однако их растворимость возрастает по мере увеличения ионной силы. При этом все большее количество гидратированных неорганических ионов связывается с поверхностью белка и тем самым уменьшается степень его агрегации (засаливание). При высокой ионной силе молекулы белков лишаются гидратирующих оболочек, что приводит к агрегации и выпадению белка в осадок (высаливание). Используя различие в растворимости, можно с помощью обычных солей, например (NН4)2SО4, разделить (фракционировать) смесь белков.

Для отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды используют диализ. Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе.

Гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) позволяет разделять белки по величине и форме молекул. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля (размером 10-500 мкм) из полимерных материалов (1а). Частицы геля проницаемы благодаря внутренним каналам, которые характеризуются определенным средним диаметром. Смесь белков вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором. Белковые молекулы, не способные проникать в гранулы геля, будут перемещаться с высокой скоростью. Средние и небольшие белки будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля. На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций. Объем выхода того или иного белка зависит в основном от его молекулярной массы.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

В настоящее время электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) является общепринятым методом определения гомогенности белковых препаратов. Метод основан на свойстве заряженных частиц (молекул) перемещаться под действием электрического поля. Обычно скорость миграции зависит от трех параметров анализируемых белков: величины молекул, формы молекул и суммарного заряда. Поэтому предварительно белки денатурируют с тем, чтобы скорость миграции зависела только от молекулярной массы. Для этого анализируемую смесь обрабатывают додецилсульфа-том натрия (C12H25OSO3Na), который представляет собой детергент с сильно выраженными амфифильными свойствами. Под действием ДСН олигомерные белки диссоциируют на субъединицы и денатурируют. Развернутые полипептидные цепи связывают ДСН (примерно 0,4 г/г белка) и приобретают отрицательный заряд. Для полной денатурации в среду добавляют тиолы, которые расщепляют дисульфидные мостики.

Электрофорез проводят в тонком слое полиакриламида. После завершения электрофореза, зоны белков выявляют c помощью красителя, В качестве примера на схеме 3 приведена электрофореграмма трех препаратов: клеточного экстракта, содержащего сотни белков; выделенного из экстракта гомогенного белка; контрольной смеси белков с известными молекулярными массами.

Изменение белкового состава организма. В процессе развития организма белковый состав значительно меняется. В специализированных тканях появляются специфические белки. Например, гемоглобин в эритроцитах, родопсин в клетках сетчатки глаза. Специализированные клетки отличаются и по количеству белков, присутствующих во всех или во многих тканях организма. Белковый состав организма здорового взрослого человека относительно постоянен. Вариации количества отдельных белков могут определяться составом пищи, режимом питания, физиологической активностью.

При различных заболеваниях происходит изменение белкового состава тканей. Эти изменения называют протеинопатиями. Различают наследственные и приобретенные протеинопатии. Пример наследственной протеинопатии – гемоглобинопатии. В зависимости от роли дефектного белка в жизнедеятельности организма наследственные протеинопатии могут вызывать болезни или летальный исход. При наследственных протеинопатиях нарушается первичная структура белка.

Приобретенные протеинопатии развиваются в результате болезни. В этом случае первичная структура белка не нарушается, а происходит

1. количественное изменение белков в пораженном органе или ткани.

2. изменение биологической активности белков из-за нарушения нативной конформации:

– при сдвигах рН среды в щелочную или кислую сторону;

– при присоединении низкомолекулярных веществ к белкам, например, при сахарном диабете к белкам крови присоединяется глюкоза;

Изменение белкового состава крови и мочи используется для диагностики ряда заболеваний.

источник

Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набуханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электрическом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давление, способность к поглощению ультрафиолетовых лучей.

Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных NH2— и СООН-групп. Для них характерны все свойства кислот и оснований. В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных аминокислот белки в растворе несут или отрицательный, или положительный заряд, перемещаясь к аноду или катоду. Это свойство используется при очистке белков методом электрофореза.

Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Растворы белков имеют очень низкое осмотическое давление, высокую вязкость и незначительную способность к диффузии. Белки способны к набуханию в очень больших пределах. С коллоидным состоянием белков связан ряд характерных свойств, в частности явление светорассеяния, лежащее в основе количественного определения белков методом нефелометрии. Этот эффект используется, кроме того, в современных методах микроскопии биологических объектов. Молекулы белка не способны проникать через полупроницаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также биомембраны растительных и животных тканей, хотя при органических поражениях, например, почек капсула почечного клубочка (Шумлянского-Боумена) становится проницаемой для альбуминов сыворотки крови и последние появляются в моче.

Молекулярная масса белков. Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых входят сотни и даже тысячи аминокислотных остатков, объединенных в макромолекулярную структуру. Молекулярная масса белков колеблется от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от количества отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной структуры белка. Такие полипептидные цепи получили название субъединиц.

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснена для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природе белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике наиболее часто используются методы седиментационного анализа, где определение молекулярной массы белков проводят в ультрацентрифугах и вычисляют её по скорости седиментации молекул белка или седиментационному равновесию.

Форма белковых молекул. Данные различных видов анализа указывают на существование в природе глобулярных (шарообразных) и фибриллярных (нитевидных) белков. В настоящее время общие представления о форме белковых молекул в основном подтвердились, однако только современные методы исследования позволили установить детали пространственной конфигурации (трехмерной структуры) белковых молекул. Благодаря применению сканирующей микроскопии и рентгеноструктурного анализа удалось в деталях расшифровать не только полную пространственную структуру, форму, но и степень асимметрии белковых молекул во всех трех измерениях. Оказалось, что даже глобулярные белки крови (гемоглобин, альбумины и глобулины) являются асимметричными в указанных измерениях.

Денатурация белков.Природные белковые тела наделеныопределенной, строго заданной пространственной конфигурацией и обладают рядом характерных физико-химических и биологических свойств при физиологических значениях температуры и рН среды.Под влиянием различных физических и химических факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя нативные свойства.

Таким образом, под денатурацией следует понимать нарушение общего плана уникальной структуры нативной молекулы белка, преимущественно ее третичной структуры, приводящее к потере характерных для нее свойств (растворимость, электрофоретическая подвижность, биологическая активность и т.д.). Большинство белков денатурирует при нагревании их растворов выше 50–60°С (рис.6).

Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых растворов, увеличению количества свободных функциональных SH-групп и изменению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря белком его биологической активности (каталитической, антигенной или гормональной). При денатурации белка, разрушаются в основном нековалентные связи (в частности, гидрофобные взаимодействия и водородные связи).

а — исходное состояние; б — начинающееся обратимое нарушение молекулярной структуры; в — необратимое развертывание полипептидной цепи.

Рисунок 6 —Денатурация белковой молекулы (схема)

а — развертывание (мочевина + меркаптоэтанол); б — повторное свертывание

Рисунок 7-Денатурация и ренатурация рибонуклеазы (по Анфинсену)

При непродолжительном действии и быстром удалении денатурирующих агентов возможна ренатурация белка с полным восстановлением исходной трехмерной структуры и нативных свойств его молекулы (рис. 7), включая биологическую активность. Таким образом, при денатурации белковая молекула полностью теряет биологические свойства, демонстрируя тем самым тесную связь между структурой и функцией. Для практических целей иногда используют процесс денатурации в «мягких» условиях, например при получении ферментов или других биологически активных белковых препаратов в условиях низких температур в присутствии солей и при соответствующем значении рН. При лиофилизации белков (высушивание в вакууме путем возгонки влаги из замороженного состояния) для предотвращения денатурации часто пользуются химическими веществами (простые сахара, глицерин, органические анионы).

Изоэлектрическая и изоионная точки белков. В изоэлектрической точке суммарный заряд белков, обладающих амфотерными свойствами, равен нулю и белки не перемещаются в электрическом поле. Зная аминокислотный состав белка, можно приближенно определить изоэлектрическую точку (pI); pI является характерной константой белков. Изоэлектрическая точка большинства белков животных тканей лежит в пределах от 5,5 до 7,0, что свидетельствует о частичном преобладании кислых аминокислот. Однако в природе имеются белки, у которых значения изоэлектрических точек лежат в крайних значениях рН среды. В частности, величина рI пепсина (фермент желудочного сока) равна 1, а сальмина (основной белок из молоки семги) – почти 12.

В изоэлектрической точке белки наименее устойчивы в растворе и легко выпадают в осадок. Изоэлектрическая точка белка в сильной степени зависит от присутствия в растворе ионов солей; в то же время на ее величину не влияет концентрация белка.

Раствор белка называется изоионным, если он не содержит никаких других ионов, кроме ионизированных остатков аминокислот белковой молекулы и ионов, образующихся при диссоциации воды. Для освобождения белка от посторонних ионов обычно его раствор пропускают через колонку, наполненную смесью анионо- и катионообменников. Изоионной точкой данного белка принято называть значение рН изоионного раствора этого белка:

где [Р] – молярная концентрация белка; Z – средний заряд молекулы. Согласно этому уравнению, изоионная точка белка зависит от его концентрации. Очевидно, поэтому белок, за исключением случая, когда рI равно 7, не может быть одновременно изоэлектрическим и изоионным.

Кислотно-основные свойства.Белки, как и аминокислоты, являются полиамфолитами, проявляя кислотные свойства за счет неионизированных группы – СООН, аммонийных групп – NН3 + , тиольных групп – SН. Основные свойства белки проявляют за счет групп –СОО — , аминогрупп –NН2 и др. В водных растворах в зависимости от рН среды белки могут находиться при рН=рI белка в молекулярной, т.е. нейтральной форме, при рН рI проявляется анионная форма.

3 + – Рrot – СОО — ↔ NН3 + – Рrot – СОО — ↔ NН3 + – Рrot – СОО —

катион белка молекула белка анион белка

В зависимости от аминокислотного состава белки подразделяются на «нейтральные» ( рI = 5,0-7,0), «кислотные» ( рI 7,5). На основе белков в организме действуют буферные свойства белков.

Буферные свойства белков обусловлены наличием в составляющих их аминокислотах (карбоксикислотах) аминогруппы (NH2-группы). Благодаря ней аминокислоты могут реагировать не только как слабые кислоты, но и как основания, то есть сами проявлять буферные свойства, присоединяя или отдавая ион водорода. Отщепляемый от карбоксильной группы протон может присоединиться к аминогруппе. В результате – молекула аминокислоты принимает дипольную форму (или форму цвиттер-иона), заряжаясь с одной стороны отрицательно, а с другой – положительно, но оставаясь в целом нейтральной. Именно в этой форме аминокислота и проявляет свои буферные свойства. При повышении концентрации протонов в среде (снижение рН) они фиксируются карбоксильной группой, а молекула оказывается положительно заряженной. Наоборот, при падении концентрации протонов третий протон с положительно заряженной стороны молекулы отдается, а вся молекула заряжается отрицательно. Аминокислота диссоциирует с образованием протона и диссоциированной карбоксильной группы.

Или аминогруппа принимает свободный протон и приобретает форму цвиттер-иона. В избытке протонов молекула заряжается положительно:

При дефиците протонов — молекула приобретает отрицательный заряд:

Буферные свойства белков проявляются в связывании не только протонов, но и других заряженных частиц. Основная масса поступающих в кровоток веществ (красители, жирные кислоты, липиды, водорастворимые наркотики, релаксанты) связывается с белками, проявляя конкурентные отношения. Естественно, при этом уменьшается буферная емкость белков в отношении протонов, и высокая концентрация последних затрудняет освобождение и ослабляет действие веществ, образующих положительные заряды.

Белки активно вступают в химические реакции. Это свойство связано с тем, что аминокислоты, входящие в состав белков, содержат разные функциональные группы, способные реагировать с другими веществами. Важно, что такие взаимодействия происходят и внутри белковой молекулы, в результате чего образуется пептидная, водородная, дисульфидная и другие виды связей. Белки обладают большим сродством к воде, то есть они гидрофильны. Это значит, что молекулы белка, как заряженные частицы, притягивают к себе диполи воды, которые располагаются вокруг белковой молекулы и образуют водную или гидратную оболочку. Эта оболочка предохраняет молекулы белка от склеивания и выпадения в осадок. Величина гидратной оболочки зависит от структуры белка. Например, альбумины более легко связываются с молекулами воды и имеют относительно большую водную оболочку, тогда как глобулины, фибриноген присоединяют воду хуже, и гидратная оболочка и них меньше. Таким образом, устойчивость водного раствора белка определяется двумя факторами: наличием заряда белковой молекулы и находящейся вокруг нее водной оболочки. При удалении этих факторов белок выпадает в осадок. Данный процесс может быть обратимым и необратимым. Обратимое осаждение белков (высаливание) предполагает выпадение белка в осадок под действием определенных веществ, после удаления которых, он вновь возвращается в свое исходное (нативное) состояние. Для высаливания белков используют соли щелочных и щелочноземельных металлов (наиболее часто в практике используют сульфат натрия и аммония). Эти соли удаляют водную оболочку (вызывают обезвоживание) и снимают заряд. Между величиной водной оболочки белковых молекул и концентрацией солей существует прямая зависимость: чем меньше гидратная оболочка, тем меньше требуется солей. Так, глобулины, имеющие крупные и тяжелые молекулы и небольшую водную оболочку, выпадают в осадок при неполном насыщении раствора солями, а альбумины как более мелкие молекулы, окруженные большой водной оболочкой — при полном насыщении. Необратимое осаждение связано с глубокими внутримолекулярными изменениями структуры белка, что приводит в потере ими нативных свойств – денатурации, которая влечет потерю растворимости, биологической активности и т.д. Необратимое осаждение можно вызвать кипячением, действием концентрированными растворами некоторых из минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов.Гидролиз белка достигается при помощи кипячения белка с сильными минеральными кислотами (кислотный гидролиз) или основаниями (щелочной гидролиз). Но щелочной гидролиз редко используется из-за неустойчивости аминокислот в этих условиях. Проводят его при нагревании до 110 0 С в запаянной ампуле с 20% соляной кислотой в течение 24 ч. В организме он протекает при участии пептидаз в липосомах. Гидролиз может быть частичным (до пептидов) или полным (до аминокислот). В организме гидролиз белков осуществляется целым набором ферментов, каждый из которых расщепляет ту или иную связь. Карбоксипептидаза отщепляет от белка С-концевую кислоту, трипсин гидролизует связь образованную аминокислотами с неполярным (гидрофобным) заместителем, химотрипсин – связь, образованную между фенилаланином, тирозином, триптофаном с другими аминокислотами. В организме белки гидролизуются полностью. О H О Н О || | || | || NH2— СН—С—N—СH—С—N—СН—С— ·· + nH2O ↔ ОН — + | | | R1 R2 R3 O O О || || ||·· + NH2—СН—С— ОН+ NH2—СН—С—ОН + NH2—СН—С—ОН + ·· | | | R2 R3 R1

Читайте также:  Слишком много белка в анализах

Белки, содержащие аспарагиновую и глутаминовую кислоту, вступают в реакцию амидированиябелков, при которой обезвреживается аммиак:

3 + – Рrot – СОО — + NН3 ↔ NН3 + – Рrot – СОО —

Окислительно-восстановительные свойства. Белки относительно устойчивы к мягкому окислению, за исключением содержащих аминокислоту цистеин, так как тиольная группа её легко окисляется в дисульфидную группу, причем этот процесс может носить и обратный характер:

Восстановленная восстановитель окисленная

В результате этих превращений происходит изменение конформации белка и его нативных свойств. Эти превращения лежат в основе химической завивки волос, так как цистеин и цистин входят в состав белка волос кератина. Сначала волосы обрабатывают восстановителем, чтобы разрушить связи –S – S – цистина и превратить в тиольные группы цистеина. Затем волосы укладывают в локоны и обрабатывают окислителем. При этом образуются дисульфидные связи цистина, которые помогают волосам сохранить их новую форму.

В организме белки, содержащие остатки лизина, пролина, фенилаланина и триптофана, подвергаются ферментативному гидроксилированию при участии кислорода и восстановленной формы кофермента:

3 + – Рrot – СОО — + О2 + восстановленная ↔ NН3 + – Рrot – СОО — + Н2О + окисленная

RН кофермента RОН кофермента

Также для белков характерны и все цветные (качественные) реакции на аминокислоты.

источник

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ

Физико-химические свойства белков обусловлены их структурной организацией и зависят от факторов внешней среды.

1. Высокая молекулярная масса — от 6000 до нескольких миллионов Дальтон.

2. Амфотерность – способность белка проявлять кислотные и основные свойства.В молекуле белка есть катионообразующие группы (аминогруппы) и анионообразующие (карбоксильные группы). Если преобладают карбоксильные группы, то заряд молекулы отрицательный (слабокислые свойства), если аминогруппы – то положительный (основные свойства). Заряд белка также зависит от рН среды. В кислой среде молекула приобретает положительный заряд, в щелочной – отрицательный.

3. Гидратация и растворимость. Зависит от сродства аминокислотных остатков на поверхности белковой молекулы к воде.

4. Способность к ионизации. Благодаря наличию аминогрупп и карбоксильных групп белки – амфотерные полиэлетролиты. В растворах находятся в виде биполярных ионов.

5. Способность радикалов аминокислот к химическим превращениям и взаимодействиям.

6. Способность к денатурации и ренатурации.

7. Способность к гидролизу. Благодаря пептидной связи белки подвергаются кислотному, щелочному и ферментативному гидролизу. При этом образуются свободные аминокислоты.

Факторы стабилизации белка в растворе.

1. Гидратная оболочка – слой молекул воды на поверхности белковой молекулы. Вода связана с белковой молекулой слабыми связями («связанная вода»). Гидратная оболочка не дает белковым молекулам сближаться и выпадать в осадок.

2. Заряд белковой молекулы. На поверхности белковой молекулы есть положительно и отрицательно заряженные радикалы аминокислот. Количество этих групп и, следовательно, заряд белков зависят от рН среды. Значение рН, при котором белок имеет нулевой заряд, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). В ИЭТ белки наименее устойчивы. При потере заряда в ИЭТ белки агрегируют и выпадают в осадок.

Денатурация– нарушение нативной конформации белка. При денатурация изменяются физико-химические свойства и теряется биологическая активность белка. При денатурации не изменяется первичная структура, но изменяется вторичная, третичная и, если есть, четвертичная структура.

1. Физические (высокая температура, вибрация, радиация, УФО, ультразвук и др.).

2. Химические (мочевина, кислоты и щелочи, соли тяжелых металлов, растительные алкалоиды, органические растворители и др.).

При денатурации уменьшается растворимость, изменяется электрофоретическая подвижность, изменяется число реакционных групп.

Способность белков к денатурации используется в медицине.

  1. Пастеризация продуктов.
  2. Стерилизация шовного материала.

Ренатурация– восстановление нативной конформации денатурированного белка. При ренатурации восстанавливаются физико-химические свойства белков и их активность. В организме происходит быстрая ренатурация при помощи специфических белков — шаперонов. Шапероны присоединяются к денатурированному белку слабыми связями и создают условия для ренатурации.

Классификации белков.

1.По растворимости — водорастворимые (альбумины), солерастворимые (глобулины), спирторастворимые (протамины), нерастворимые (склеропротеины).

2.По форме белковой молекулы – фибриллярные, глобулярные, мембраносвязанные.

3.По химическому строению – простые белки (состоят только из аминокислот) и сложные (состоят из аминокислот и небелковой части – липидов, углеводов, металлов, нуклеиновых кислот).

4.По функциям – структурная, каталитическая, регуляторная, двигательная, транспортная, рецепторная, защитная, резервная, опорная.

Методы исследования белков.

Дата добавления: 2016-11-23 ; просмотров: 1287 | Нарушение авторских прав

источник

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ

Физико-химические свойства белков обусловлены их структурной организацией и зависят от факторов внешней среды.

1. Высокая молекулярная масса — от 6000 до нескольких миллионов Дальтон.

2. Амфотерность – способность белка проявлять кислотные и основные свойства.В молекуле белка есть катионообразующие группы (аминогруппы) и анионообразующие (карбоксильные группы). Если преобладают карбоксильные группы, то заряд молекулы отрицательный (слабокислые свойства), если аминогруппы – то положительный (основные свойства). Заряд белка также зависит от рН среды. В кислой среде молекула приобретает положительный заряд, в щелочной – отрицательный.

3. Гидратация и растворимость. Зависит от сродства аминокислотных остатков на поверхности белковой молекулы к воде.

4. Способность к ионизации. Благодаря наличию аминогрупп и карбоксильных групп белки – амфотерные полиэлетролиты. В растворах находятся в виде биполярных ионов.

5. Способность радикалов аминокислот к химическим превращениям и взаимодействиям.

6. Способность к денатурации и ренатурации.

7. Способность к гидролизу. Благодаря пептидной связи белки подвергаются кислотному, щелочному и ферментативному гидролизу. При этом образуются свободные аминокислоты.

Факторы стабилизации белка в растворе.

1. Гидратная оболочка – слой молекул воды на поверхности белковой молекулы. Вода связана с белковой молекулой слабыми связями («связанная вода»). Гидратная оболочка не дает белковым молекулам сближаться и выпадать в осадок.

2. Заряд белковой молекулы. На поверхности белковой молекулы есть положительно и отрицательно заряженные радикалы аминокислот. Количество этих групп и, следовательно, заряд белков зависят от рН среды. Значение рН, при котором белок имеет нулевой заряд, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). В ИЭТ белки наименее устойчивы. При потере заряда в ИЭТ белки агрегируют и выпадают в осадок.

Денатурация– нарушение нативной конформации белка. При денатурация изменяются физико-химические свойства и теряется биологическая активность белка. При денатурации не изменяется первичная структура, но изменяется вторичная, третичная и, если есть, четвертичная структура.

1. Физические (высокая температура, вибрация, радиация, УФО, ультразвук и др.).

2. Химические (мочевина, кислоты и щелочи, соли тяжелых металлов, растительные алкалоиды, органические растворители и др.).

При денатурации уменьшается растворимость, изменяется электрофоретическая подвижность, изменяется число реакционных групп.

Способность белков к денатурации используется в медицине.

  1. Пастеризация продуктов.
  2. Стерилизация шовного материала.

Ренатурация– восстановление нативной конформации денатурированного белка. При ренатурации восстанавливаются физико-химические свойства белков и их активность. В организме происходит быстрая ренатурация при помощи специфических белков — шаперонов. Шапероны присоединяются к денатурированному белку слабыми связями и создают условия для ренатурации.

Классификации белков.

1.По растворимости — водорастворимые (альбумины), солерастворимые (глобулины), спирторастворимые (протамины), нерастворимые (склеропротеины).

2.По форме белковой молекулы – фибриллярные, глобулярные, мембраносвязанные.

3.По химическому строению – простые белки (состоят только из аминокислот) и сложные (состоят из аминокислот и небелковой части – липидов, углеводов, металлов, нуклеиновых кислот).

4.По функциям – структурная, каталитическая, регуляторная, двигательная, транспортная, рецепторная, защитная, резервная, опорная.

Методы исследования белков.

Дата добавления: 2016-11-23; просмотров: 573 | Нарушение авторских прав

Растворимость белков сильно зависит от концентрации солей (от ионной силы). В дистиллированной воде белки чаще всего растворяются плохо, однако их растворимость возрастает по мере увеличения ионной силы.

При этом все большее количество гидратированных неорганических ионов связывается с поверхностью белка и тем самым уменьшается степень его агрегации (засаливание). При высокой ионной силе молекулы белков лишаются гидратирующих оболочек, что приводит к агрегации и выпадению белка в осадок (высаливание).

Используя различие в растворимости, можно с помощью обычных солей, например (NН4)2SО4, разделить (фракционировать) смесь белков.

Для отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды используют диализ.

Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе.

Гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) позволяет разделять белки по величине и форме молекул. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля (размером 10-500 мкм) из полимерных материалов (1а). Частицы геля проницаемы благодаря внутренним каналам, которые характеризуются определенным средним диаметром. Смесь белков вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором.

Белковые молекулы, не способные проникать в гранулы геля, будут перемещаться с высокой скоростью. Средние и небольшие белки будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля. На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций. Объем выхода того или иного белка зависит в основном от его молекулярной массы.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

В настоящее время электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) является общепринятым методом определения гомогенности белковых препаратов.

Метод основан на свойстве заряженных частиц (молекул) перемещаться под действием электрического поля. Обычно скорость миграции зависит от трех параметров анализируемых белков: величины молекул, формы молекул и суммарного заряда. Поэтому предварительно белки денатурируют с тем, чтобы скорость миграции зависела только от молекулярной массы.

Для этого анализируемую смесь обрабатывают додецилсульфа-том натрия (C12H25OSO3Na), который представляет собой детергент с сильно выраженными амфифильными свойствами. Под действием ДСН олигомерные белки диссоциируют на субъединицы и денатурируют.

Развернутые полипептидные цепи связывают ДСН (примерно 0,4 г/г белка) и приобретают отрицательный заряд. Для полной денатурации в среду добавляют тиолы, которые расщепляют дисульфидные мостики.

Электрофорез проводят в тонком слое полиакриламида.

После завершения электрофореза, зоны белков выявляют c помощью красителя, В качестве примера на схеме 3 приведена электрофореграмма трех препаратов: клеточного экстракта, содержащего сотни белков; выделенного из экстракта гомогенного белка; контрольной смеси белков с известными молекулярными массами.

Изменение белкового состава организма. В процессе развития организма белковый состав значительно меняется. В специализированных тканях появляются специфические белки. Например, гемоглобин в эритроцитах, родопсин в клетках сетчатки глаза. Специализированные клетки отличаются и по количеству белков, присутствующих во всех или во многих тканях организма. Белковый состав организма здорового взрослого человека относительно постоянен.

Вариации количества отдельных белков могут определяться составом пищи, режимом питания, физиологической активностью.

При различных заболеваниях происходит изменение белкового состава тканей. Эти изменения называют протеинопатиями. Различают наследственные и приобретенные протеинопатии. Пример наследственной протеинопатии – гемоглобинопатии. В зависимости от роли дефектного белка в жизнедеятельности организма наследственные протеинопатии могут вызывать болезни или летальный исход.

При наследственных протеинопатиях нарушается первичная структура белка.

Приобретенные протеинопатии развиваются в результате болезни. В этом случае первичная структура белка не нарушается, а происходит

количественное изменение белков в пораженном органе или ткани.

2. изменение биологической активности белков из-за нарушения нативной конформации:

– при сдвигах рН среды в щелочную или кислую сторону;

– при присоединении низкомолекулярных веществ к белкам, например, при сахарном диабете к белкам крови присоединяется глюкоза;

Изменение белкового состава крови и мочи используется для диагностики ряда заболеваний.

Ультрацентрифугирование,метод разделения и исследования высокомолекулярных соединений, вирусов и субклеточных частиц с помощью ультрацентрифуги.

Идея ультрацентрифугирования была предложена А. В. Думанским в 1913, однако разработка современной теории седиментационного анализа стала возможной только после того, как Т. Сведберг в 1926 сконструировал высокоскоростную ультрацентрифугу, обеспечивавшую ускорение 105 g.

Читайте также:  Снижение общего белка в биохимическом анализе

Принято различать 2 типа ультрацентрифугирования: препаративное и аналитическое. Препаративное ультрацентрифугирование применяют для фракционирования и выделения биополимеров в количествах, достаточных для практических целей.

Широко используют ультрацентрифугирование в градиенте плотности растворовсахарозы, глицерина, декстринов; оно позволяет разделять смеси веществ на отдельные компоненты, различающиеся эффективной массой и коэффициентом трения частиц или молекул.

Применение зональных и проточных роторов дало возможность значительно повысить объёмы растворов фракционируемых частиц и использовать их для очистки вируса гриппа при изготовлении вакцин.

Аналитическое ультрацентрифугирование используют для исследования гомогенности (чистоты) препаратов биополимеров (белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов), а также для определения константседиментации, молекулярной массы, констант ассоциации и размеров макромолекул. Ультрацентрифугирование применяется в медицине при клинической диагностике, для приготовления кровезаменителей и т.п.

В., Методы исследования биополимеров с помощью аналитической ультрацентрифуги, в кн.: Современные методы в биохимии, М., 1964; Боуэн Т., Введение в ультрацентрифугирование, пер.

с англ., М., 1973; Schachman Н.

К., Ultra centrifugation in biochemistry, N. Y. — L., 1959.

84-85

Биомолекулы. Пептиды и белки

Препараты высокоочищенных белков находят разнообразное применение в научных исследованиях, медицине и биотехнологии. Так как многие белки, и в особенности глобулярные, высоколабильны (см.

с. 80), выделение проводят с помощью предельно мягких методов и при пониженной температуре (0-5°С). К таким методам относится ионообменная хроматография, которая обсуждалась на с. 68. Другие методы выделения белков представлены в этом разделе.

Растворимость белков сильно зависит от концентрации солей (от ионной силы). В дистиллированной воде белки чаще всего растворяются плохо, однако их растворимость возрастает по мере увеличения ионной силы. При этом все большее количество гидратированных неорганических ионов (светло-синие кружочки) связывается с поверхностью белка и тем самым уменьшается степень его агрегации (засаливание).

При высокой ионной силе молекулы белков лишаются гидратирующих оболочек, что приводит к агрегации и выпадению белка в осадок (высаливание). Используя различие в растворимости, можно с помощью обычных солей, например (NН4)2SО4, разделить (фракционировать) смесь белков.

Для отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды используют диализ.

Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе.

Гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) позволяет разделять белки по величине и форме молекул.

Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля (размером 10-500 мкм) из полимерных материалов (1а).

Частицы геля проницаемы благодаря внутренним каналам, которые характеризуются определенным средним диаметром. Смесь белков (1б) вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором. Белковые молекулы, не способные проникать в гранулы геля (помечены красным цветом), будут перемещаться с высокой скоростью.

Средние (зеленого цвета) и небольшие белки (синего цвета) будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля (1в).

На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций (2). Объем выхода того или иного белка зависит в основном от его молекулярной массы (3).

В настоящее время электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) [ДСН-ПААГ-электрофорез (SDS-PAGE)] является общепринятым методом определения гомогенности белковых препаратов.

Метод основан на свойстве заряженных частиц (молекул) перемещаться под действием электрического поля (см. с. 270). Обычно скорость миграции зависит от трех параметров анализируемых белков: величины молекул, формы молекул и суммарного заряда.

Поэтому предварительно белки денатурируют с тем, чтобы скорость миграции зависела только от молекулярной массы. Для этого анализируемую смесь обрабатывают додецилсульфа-том натрия [ДСН (SDS)] (C12H25OSO3Na), который представляет собой детергент с сильно выраженными амфифильными свойствами (см. с. 34). Под действием ДСН олигомерные белки диссоциируют на субъединицы и денатурируют.

Развернутые полипептидные цепи связывают ДСН (примерно 0,4 г/г белка) и приобретают отрицательный заряд. Для полной денатурации в среду добавляют тиолы, которые расщепляют дисульфидные мостики (1).

Электрофорез проводят в тонком слое полиакриламида (2). После завершения электрофореза, зоны белков выявляют c помощью красителя, В качестве примера на схеме 3 приведена электрофореграмма трех препаратов: клеточного экстракта, содержащего сотни белков (а); выделенного из экстракта гомогенного белка (б); контрольной смеси белков с известными молекулярными массами (в).

источник

Белки – высокомолекулярные, азотосодержащие органические вещества, состоящие из аминокислот, соединённых в цепи с помощью пептидных связей, имеющих сложную структурную организацию.

Признаки белков: содержит азот; альфа-аминокислоты L-ряда; формируют полипептидную цепь; высокая молекулярная масса (от 6 тысяч до нескольких млн. дальтон); сложная структурная организация.

Первичная структура белков в значительной степени определяет вторичную, третичную структуры и особенности четвертичной структуры. В свою очередь, первичная и пространственная структуры белков, их молекулярная масса, форма и размеры обусловливают их физико-химические свойства.

Белки способны связываться с лигандами. Белки специфично узнают свои лиганды, что обусловлено комплементарным строением определенного участка белка и лиганда. Избирательность обеспечивается белковой частью гемоглобина. Центр связывания лиганда называется активным центром.

Белки имеют различную форму, но выделяют две основных группы: глобулярные (шарообразные) и фибриллярные (веретенообразные). Глобулярные белки более компактны, в этих белках гидрофильные группы расположены преимущественно снаружи, а гидрофобные – внутри, образуя ядро.

Различия в первичной структуре белков, их конфигурации, молекулярной массе, размерах определяют разнообразные свойства белков. Можно выделить несколько групп физико-химических свойств:

1.) Электрохимические свойства белков.

Белки — амфотерные полиэлектролиты, т. е. подобно аминокислотам они обладают кислотными и основными свойствами. Эти свойства белка обусловлены электрохимической природой R-радикалов аминокислот, входящих в состав белка. Поскольку большая часть ионогенных и полярных R-групп находится на поверхности белковой глобулы, то именно они определяют кислотно-основные (амфотерные) свойства и заряд белковой молекулы. Кислые свойства белку придают аспарагиновая и глутаминовая аминокислоты, диссоциация их карбоксильных групп является источником отрицательных электрических зарядов на поверхности белковой молекулы. Основные свойства белку придают лизин, аргинин, гистидин, способные к протонированию и к созданию на поверхности белковой молекулы положительных зарядов. В амфотерную природу белковой молекулы вносят вклад (хотя и несущественный) ее N- и С-концевые аминокислоты. Слабая диссоциация SН-групп цистеина и ОН-групп тирозина весьма несущественно влияет на амфотерность белков. В целом, чем больше кислых аминокислот содержится в белке, тем сильнее выражены его кислотные свойства, тем выше суммарная плотность отрицательного заряда, и чем больше основных аминокислот, тем ярче проявляются основные свойства белка и выше плотность положительных зарядов на его молекуле. Однако следует отметить, что значения рК радикалов аминокислот колеблются в довольно широких пределах.

Амфотерная природа белков обусловливает определенную буферность их растворов. Однако при физиологических значениях рН она невелика. Исключение составляют белки, содержащие большое количество гистидина, так как только боковые имидазольные группы гистидина обладают буферными свойствами в интервале значений рН, близких к физиологическим. Таких белков мало; к ним относится, например, гемоглобин животных, содержащий 8% гистидина, обусловливающего высокую внутриклеточную буферность в эритроцитах, поддерживая рН крови на постоянном уровне.

Суммарный заряд белковой молекулы определяется соотношением в ней кислотных и основных радикалов аминокислот и величиной их рК. Если в белке кислые аминокислоты преобладают над основными, то в целом молекула белка электроотрицательна, т. е. находится в форме полианиона; и наоборот, если преобладают основные аминокислоты — в форме поликатиона.

Амфотерный характер белков особенно ярко проявляется при изменении рН белкового раствора. В кислой среде в результате высокой концентрации Н+-ионов идет подавление кислотной диссоциации карбоксильных групп и интенсивное протонирование NH-2, —NH—, имидазольных групп — суммарный заряд белковой молекулы будет положителен; в щелочной среде при избытке ОH-ионов будет наблюдаться обратная картина: интенсивная диссоциация карбоксильных групп и депротонирование основных групп — суммарный заряд отрицателен. Естественно, что каждый белок при каком-то определенном значении рН будет иметь суммарный электрический заряд, равный нулю; такое состояние белка называется изоэлектрическим состоянием, а величина рН, обусловливающая это состояние, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). В этой точке белок не обладает подвижностью в электрическом поле; имеет наименьшую растворимость в воде; белковые растворы обладают минимальной устойчивостью и минимальным осмотическим давлением. ИЭТ каждого белка определяется соотношением кислых и основных групп, величиной их рК: чем больше это соотношение и ниже величина рК групп, тем ниже ИЭТ белка. У кислых белков ИЭТ 7; при рН ИЭТ — в форме полианиона, в ИЭТ — в форме амфотерного полииона (цвиттер-полииона). ИЭТ большинства белков клеток животных, растений, микроорганизмов лежит в пределах 5,5—6,0, а внутриклеточная величина рН находится в пределах 7,0—7,2 (физиологическое значение рН). Следовательно, клеточные белки имеют в общем отрицательный заряд, который уравновешивается неорганическими катионами.

2.) Коллоидные свойства белков.

Водные растворы белков — это устойчивые системы, по этому свойству их можно отнести к истинным молекулярным растворам. Однако высокая молекулярная масса белков придает им коллоидный характер.

Биологические мембраны живых клеток также непроницаемы для белков. Поэтому содержащиеся в протоплазменных структурах этих клеток белки создают в них определенное осмотическое давление, называемое коллоидно-осмотическое или онкотическое давление.

Малой скоростью диффузии обладают белки и в водных растворах, она зависит не только от молекулярной массы, но и от формы белковой молекулы. Глобулярные белки в водных растворах имеют более высокий коэффициент диффузии, чем фибриллярные.

Характерными признаками коллоидного характера белковых растворов являются их опалесценция, блеск и способность рассеивать лучи света (эффект Тиндаля). Если через кювету с раствором низкомолекулярного вещества, например NaС1, пропустить пучок света, то в кювете он не будет обнаружен, раствор является «оптически пустым». Иная картина будет наблюдаться в кювете с раствором белка, при боковом освещении в ней появляется светящаяся полоса или конус. При прохождении света через раствор, содержащий белковые глобулы, радиус которых намного превышает длину волны света, будет наблюдаться дифракция света: падая на белковую глобулу, свет будет отражаться в различных направлениях.

3.) Гидратация белков.

Гидратация белков — способность белков связывать воду. 100 г. белка связывает 30-35 г. воды. Вода связывается ионогенными группами и пептидными группами, расположенными в основном, внутри молекулы белка. Проникновение воды внутрь молекулы белка называется набуханием. Связывание воды ионогенными группами, расположенными на поверхности белковой молекулы, приводит к образованию гидратной оболочки. Количество связанной воды для различных белков составляет около 35 г на 100 г белка. Связанная вода в гидратной оболочке находится в упорядоченном состоянии, что приводит к уменьшению энтропии при гидратации.

4.) Растворимость белков в воде.

Многие белки хорошо растворимы в воде, что определяется количеством полярных групп. Растворимость глобулярных молекул лучше, чем фибриллярных белков. Факторы, определяющие стабильность белковых растворов:

наличие зарядов в белковой молекуле. Одноименные заряды способствуют растворимости белка, т.к. препятствуют соединению молекул и выпадению в осадок.

наличие гидратной оболочки, препятствующей объединению белковых молекул. Для осаждения белка, его необходимо лишить этих двух факторов устойчивости. Методом осаждения белка является вливание — осаждение белка с помощью нейтральных солей — (NH4)2-S04. В полунасыщенном растворе (NH4)2-SO4 осаждаются глобулины, а в насыщенном — альбумины. После удаления осаждающего фактора, белки переходят в растворённое состояние.

5.) Лабильность пространственной структуры белка.

Под действием внешних факторов может происходить нарушение высших уровней организации белковой молекулы (вторичной, третичной, четвертичной структур) при сохранении первичной структуры. При этом белок теряет свои нативные, физико-химические и биологические свойства. Это явление называется денатурацией. Денатурацию вызывают физические факторы (повышение температуры, давления, механическое воздействие, УЗ, ионизирующее излучение), химические факторы (кислоты, щелочи, органические растворители — спирт, фенол; соли тяжёлых металлов). В некоторых случаях возможна ренатурация, когда денатурирующий фактор действовал кратковременно и нанёс лёгкое разрушение молекуле. В последние годы установлено, что в организме есть белки предотвращающие денатурацию.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.

Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ — конструкции, предназначен­ные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.

источник

Важное место в биохимических исследованиях занимает выделение индивидуальных белков из органов и тканей. Очищенные индивидуальные белки нужны для изучения их первичной структуры, получения кристаллов белков с целью исследования их пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа, установления взаимосвязи между первичной, пространственной структурой белка и его функцией.

Некоторые очищенные индивидуальные белки используют в медицине как лекарственные препараты, например, гормон инсулин применяют для лечения сахарного диабета, а пищеварительные ферменты поджелудочной железы назначают при нарушении её функций в качестве заместительной терапии. Кроме того, очищенные ферменты часто используют в биохимических исследованиях в качестве химических реактивов для определения веществ в биологических жидкостях.

Большинство методов, используемых для очистки индивидуальных белков, основано на различиях их физико-химических свойств, а также возможности специфично связываться с лигандом.

А. Физико-химические свойства белков

Индивидуальные белки различаются по своим физико-химическим свойствам: форме молекул, молекулярной массе, суммарному заряду молекулы, соотношению полярных и неполярных групп на поверхности нативной молекулы белка, растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов.

1. Различия белков по форме молекул

Как уже говорилось выше, по форме молекул белки делят на глобулярные и фибриллярные. Глобулярные белки имеют более компактную структуру, их гидрофобные радикалы в большинстве своём спрятаны в гидрофобное ядро, и они значительно лучше растворимы в жидкостях организма, чем фибриллярные белки (исключение составляют мембранные белки).

Читайте также:  Содержание белка в организме анализ

2. Различия белков по молекулярной массе

Белки — высокомолекулярные соединения, но могут сильно отличаться по молекулярной массе, которая колеблется от 6000 до 1 000 000 Д и выше. Молекулярная масса белка зависит от количества аминокислотных остатков в полипептидной цепи, а для олигомерных белков — и от количества входящих в него протомеров (или субъединиц).

Белки имеют в своём составе радикалы лизина, аргинина, гистидина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, содержащие функциональные группы, способные к ионизации (ионогенные группы). Кроме того, на N- и С-концах полипептидных цепей имеются α-амино- и α-карбоксильная группы, также способные к ионизации. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от соотношения ионизированных анионных радикалов Глу и Асп и катионных радикалов Лиз, Apг и Гис.

Степень ионизации функциональных групп этих радикалов зависит от pH среды. При pH раствора около 7 все ионогенные группы белка находятся в ионизированном состоянии. В кислой среде увеличение концентрации протонов (Н + ) приводит к подавлению диссоциации карбоксильных групп и уменьшению отрицательного заряда белков: -СОО — + Н + —> -СООН. В щелочной среде связывание избытка ОН — с протонами, образующимися при диссоциации NH3 + с образованием воды, приводит к уменьшению положительного заряда белков:

Значение pH, при котором белок приобретает суммарный нулевой заряд, называют «изоэлектрическая точка» и обозначают как pI. В изоэлектрической точке количество положительно и отрицательно заряженных групп белка одинаково, т. е. белок находится в изоэлектрическом состоянии.

Так как большинство белков в клетке имеет в своём составе больше анионогенных групп (-СОО — ), то изоэлектрическая точка этих белков лежит в слабокислой среде. Изоэлектрическая точка белков, в составе которых преобладают катионогенные группы, находится в щелочной среде. Наиболее яркий пример таких внутриклеточных белков, содержащих много аргинина и лизина, — гистоны, входящие в состав хроматина.

Белки, имеющие суммарный положительный или отрицательный заряд, лучше растворимы, чем белки, находящиеся в изоэлектрической точке. Суммарный заряд увеличивает количество диполей воды, способных связываться с белковой молекулой, и препятствует контакту одноимённо заряженных молекул, в результате растворимость белков увеличивается. Заряженные белки могут двигаться в электрическом поле: анионные белки, имеющие отрицательный заряд, будут двигаться к положительно заряженному аноду (+), а катионные белки — к отрицательно заряженному катоду (-). Белки, находящиеся в изоэлектрическом состоянии, не перемещаются в электрическом поле.

4. Соотношение полярных и неполярных групп на поверхности нативных молекул белков

На поверхности большинства внутриклеточных белков преобладают полярные радикалы, однако соотношение полярных и неполярных групп отлично для разных индивидуальных белков. Так, протомеры олигомерных белков в области контактов друг с другом часто содержат гидрофобные радикалы. Поверхности белков, функционирующих в составе мембран или прикрепляющиеся к ним в процессе функционирования, также обогащены гидрофобными радикалами. Такие белки лучше растворимы в липидах, чем в воде.

Растворимость белков в воде зависит от всех перечисленных выше свойств белков: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворённых веществ. Например, некоторые белки легче растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. С другой стороны, увеличение концентрации нейтральных солей может способствовать выпадению определённых белков в осадок. Денатурирующие агенты, присутствующие в растворе, также снижают растворимость белков.

Б. Методы выделения и очистки белков

Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных культур) требует проведения последовательных операций, включающих:

• дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран;

• фракционирование органелл, содержащих те или иные белки;

• экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние);

• разделение смеси белков на индивидуальные белки.

1. Методы разрушения тканей и экстракции белков

Для разрушения биологического материала используют методы: гомогенизации ткани, метод попеременного замораживания и оттаивания, а также обработку клеток ультразвуком.

Гомогенизация биологического материала

Ткань, находящуюся в буферном растворе с определённым значением pH и концентрацией солей, помещают в стеклянный сосуд (гомогенизатор) с пестиком. Вращающийся пестик измельчает и растирает ткань о притёртые стенки сосуда.

Метод замораживания и оттаивания ткани

В результате попеременного замораживания и оттаивания образующиеся кристаллы льда разрушают оболочки клеток.

После разрушения ткани нерастворимые части осаждают центрифугированием. Последующее центрифугирование гомогената с разной скоростью позволяет получить отдельные фракции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые белки цитозоля клетки. Искомый белок будет содержаться в одной из этих фракций.

Экстракция белков, связанных с мембранами, и разрушение олигомерных белков на протомеры

Если искомый белок прочно связан с какими-либо структурами клетки, его необходимо перевести в раствор. Так, для разрушения гидрофобных взаимодействий между белками и липидами мембран в раствор добавляют детергенты; чаще всего используют тритон Х-100 или додецилсульфат натрия.

Механизм действия детергентов описан в разделе «Денатурация белков» (см. рис. 1-15). При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные взаимодействия между протомерами в олигомерных белках.

Удаление из раствора небелковых веществ

Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их особенные физико-химические свойства. Так, липиды легко удаляются из раствора добавлением органических растворителей, например, ацетона. Однако воздействие должно быть кратковременным, так как ацетон вызывает денатурацию некоторых белков. Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением в раствор стрептомицина.

Наиболее трудоёмкий этап получения индивидуальных белков — их очистка от других белков, находящихся в растворе, полученном из данной ткани. Часто изучаемый белок присутствует в небольших количествах, составляющих доли процента от всех белков раствора.

Так как белки обладают конформационной лабильностью, при работе с белками следует избегать денатурирующих воздействий, поэтому выделение и очистка белков происходят при низких температурах.

На первых стадиях очистки белков целесообразно использовать методы, учитывающие какую-либо характерную особенность данного белка, например, термостабильность или устойчивость в кислых растворах. Первыми методами очистки необходимо удалить из раствора основную массу балластных белков, которые значительно отличаются от выделяемого белка физико-химическими свойствами. Впоследствии применяют всё более тонкие методы очистки белка.

Очистка белков избирательной денатурацией

Большинство белков денатурирует и выпадает в осадок уже при кратковременном нагревании раствора до 50 — 70 °С или подкислении раствора до pH 5. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то с помощью избирательной денатурации можно удалить большую часть посторонних белков, отфильтровав выпавшие в осадок белки, или осадить их центрифугированием.

Метод очистки белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щелочноземельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т. е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония — (NН4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит

Для разделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства.

Метод разделения белков с помощью гель- фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с «порами», через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной «пор».

Неподвижная фаза — жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы.

Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул (рис. 1-55).

Рис. 1-55. Разделение смеси белков методом гель-фильтрации.

Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии (о других хроматографических методах будет сказано ниже).

Метод разделения также основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость седиментации веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге, где центробежное ускорение достигает 100 000 — 500 000 g, пропорционально их молекулярной массе. На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора в течение 10 — 12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой (рис. 1-56). После расслоения белковых фракций дно кюветы прокалывают иглой и по каплям собирают содержимое небольшими порциями в пробирки.

Рис. 1-56. Кювета, заполненная буферным раствором с разделёнными белковыми фракциями.

Метод основан на том, что при определённом значении pH и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки — к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α1-глобулины, α2-глобулины, β-глобулины и y-глобулины (рис. 1-57). Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.

Рис. 1-57. Электрофорез белков сыворотки крови здорового человека на бумаге.

Так же, как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях pH и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.

В качестве неподвижной фазы используют ионообменники — полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы.

Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ- целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например, карбоксиметилцеллюлозу (КМ-целлюлозу), содержащую анионные группы.

Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaСl, и разными значениями pH. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение pH, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству

Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т. д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом (рис. 1-58). Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением pH или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.

Рис. 1-58. Аффинная хроматография.

Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.

3. Очистка белков от низкомолекулярных примесей

Для удаления низкомолекулярных соединений, в частности сульфата аммония после высаливания, применяют диализ. Метод основан на том, что через полупроницаемую мембрану, пропускающую низкомолекулярные вещества, не проходят белки, имеющие более высокую молекулярную массу. В стакан большой ёмкости (около 1 л) с буферным раствором помещают полупроницаемый мешочек, заполненный раствором белка с солью.

Скорость выхода соли из мешочка в буферный раствор пропорциональна градиенту его концентраций по обе стороны от мембраны. По мере выхода соли из мешочка буферный раствор в стакане меняют.

Для очистки белков от низкомолекулярных примесей используют также метод гель-фильтрации (см. выше).

Для определения частоты (гомогенности) выделенного белка применяют методы с высокой разрешающей способностью, например, электрофорез в полиакриламидном геле, высокоэффективная хроматография высокого давления. От чистоты лекарственного белкового препарата зависят его биологическая эффективность и аллергенность (т. е. способность вызывать аллергические реакции). Чем качественнее очищен препарат, тем меньше вероятность осложнений при его применении.

источник