Меню Рубрики

Анализ белка по методу кьельдаля

Одним из важнейших показателей качества продукции, определяющим ее пищевую ценность, является содержания белка. Классическим способом определения белка является метод, разработанный еще в 1883 году датским химиком Иоганном Кьельдалем, который впоследствии был назван его именем. Это очень трудоемкий и продолжительный анализ, и потому в современной лабораторной практике метод Кьельдаля часто пытаются заменить альтернативными методами определения белка, в том числе, с использованием дорогостоящих программно-аппаратных комплексов. Но метод Кьельдаля, несмотря на его сложность, до сих пор остается единственным общепризнанным арбитражным методом определения белка, и чаще всего используется в качестве эталонного для калибровки и настройки других методик анализа сырья и готовой продукции.

Почему же методу Къельдаля, не смотря на более чем 120-летнюю историю, до сих пор не найдено достойной альтернативы? Причиной тому — высокая специфичность выбранной реакции окисления белка серной кислотой, в результате которой разрушаются пептидные связи в его молекуле и образуются ионы аммония, которые в последующем и могут быть легко проанализированы стандартными методами. Однако воспроизводимость и точность метода Кьельдаля в существенной степени зависит от опыта аналитика. Стремясь свести к минимуму влияние человеческого фактора на результаты анализа, ускорить выполнение методики и повысить ее безопасность, ведущие производители аналитического оборудования разработали специализированные комплекты оборудования для анализа по методу Кьельдаля. Метод включает в себя несколько основных этапов: отбор и подготовку проб, мокрое озоление, отгонку с паром и определение концентрации аммония (фотометрически или титриметрически). Для каждого этапа предусмотрены свои аппаратные решения, которые в настоящее время фактически стали стандартом де-факто и практически полностью заменили действия, выполняемые лаборантом вручную.

Этап 1. Отбор и подготовка проб. Необходимое условие получения точных результатов анализа по Кьельдалю — тщательная подготовка образцов. Процедура подготовки проб должна обеспечивать гомогенизацию образца, т. к. размер частиц в анализируемых пробах не должен превышать 1 мм. Взвешивание образцов для последующего анализа по Къельдалю должно проводиться на аналитических весах с точностью до 0,1 мг. Важно знать влажность образца и всегда анализировать либо предварительно высушенные образцы, либо образцы с точно установленным содержанием влаги.
Этап 2. Мокрое озоление. Самым трудоемким и продолжительным этапом в методе Кьельдаля является стадия мокрого озоления, в результате которого происходит полное «сжигание» образца в серной кислоте. Однако использовать для озоления чистую серную кислоту нецелесообразно из-за низкой скорости протекания процесса. Скорость озоления и разрушения образца зависят не только от свойств кислоты, но и от температуры обработки. Чем выше температура, тем меньше времени уходит на разложение. При использовании чистой серной кислоты температура озоления ограничивается, в основном, её точкой кипения (338°С), в то время как для полного разложения необходима более высокая температуры. Скорость мокрого озоления можно значительно увеличить за счет добавления солей и катализаторов. В классическом приборе Кьельдаля на каждый грамм образца обычно необходимо 25 мл кислоты и несколько часов для проведения разложения. Основной эксплуатационной проблемой для данной стадии анализа является выделение большого количества ядовитых паров диоксида и триоксида серы.

Этап 3. Отгонка с паром. Полученный после стадии разложения прозрачный раствор не годится для непосредственного определения в нем аммонийного азота из большого содержания мешающих компонентов. Для отделения аммонийного азота он переводится в аммиачную форму (добавлением щелочи) и отгоняется с паром на специальных приборах, называемых дистилляторами.

Этап 4. Определения содержания аммонийного азота. Результаты по определению белка принято представлять в мг/л аммонийного азота, поэтому метод определения белка по Кьельдалю (что более распространено в пищевой промышленности) часто еще называют методом определения общего азота по Кьельдалю (используется, например, в экологическом анализе). Пересчет на содержание белка осуществляется по известному коэффициенту, который в общем случае равен 6.25, но может несколько отличаться для различных типов белка. Перегоняемый с паром аммиак собирается в колбе, в которую предварительно помещают раствор борной или серной кислоты с известной нормальностью. Полученный чистый раствор бората или сульфата аммония может быть легко оттитрован прямым или обратным методом.

В рамках этой статьи вполне осознано не рассматривались другие методики определения белка, поскольку все они вторичны и требуют калибровки по методу Кьельдаля. Несмотря на кажущуюся сложность комплекса оборудования для определения белка по Кьельдалю, использование именного этого метода анализа гарантирует достоверность результатов, в то время как предложенное приборное решение позволяет существенно увеличить воспроизводимость, снизить расход реактивов и обеспечить безопасность персонала.

Специалистами ФГБУ «Центральная научно-производственная ветеринарная радиологическая лаборатория» проводится определение белка по методу Къельдаля в пищевых продуктах и кормах с помощью автоматической установки для разложения KJELDATHERM GERHARDT и автоматической установки для перегонки с водяным паром VAPODEST-20 GERHARDT.

источник

МЕТОД КЬЕЛЬДАЛЯ

Классическим способом определения белка в зерне пшеницы является метод, разработанный в 1883 г. датским химиком Иоганном Кьельдалем. Это очень трудоемкий и продолжительный анализ, поэтому в современной лабораторной практике метод Кьельдаля часто пытаются заменить альтернативными методами, в том числе с использованием дорогостоящих программно-аппаратных комплексов.

Но метод Кьельдаля до сих пор остается единственным общепризнанным методом определения белка и чаще всего используется в качестве эталонного для калибровки и настройки других методов определения массовой доли белка и приборов для экспресс-анализа.

Набор «стекла» для определения белка методом Кьельдаля есть практически в каждой лаборатории, а альтернативные методики применяются только как вспомогательные при очень большом количестве ежедневных анализов. Для предприятия, только начинающего становление своей лаборатории,безусловно, предпочтительным является использование именно метода Кьельдаля. Метод стандартизован (ГОСТ 10846-91«Зерно и продукты его переработки. Метод определения белка»). Более чем столетняя практика применения метода Кьельдаля не нашла ему достойной альтернативы, поскольку он позволяет с высокой точностью определять количество азота, являющегося составной частью белков. Метод включает в себя несколько основных этапов: отбор и подготовку проб, мокрое озоление, отгонку с паром и определение концентрации аммония (фотометрически или титриметрически).

Процедура подготовки образца должна обеспечивать максимальную однородность, что повышает точность и воспроизводимость результата.Самым трудоемким и продолжительным этапом в методе Кьельдаля является стадия мокрого озоления образца в серной кислоте, при которой выделяется большое количество ядовитых паров диоксида и триоксида серы. Полученный после стадии разложения прозрачный раствор не годится для определения в нем аммонийного азота из-за большого содержания компонентов раствора.

Для отделения аммонийного азота он переводится в аммиачную форму (добавлением щелочи) и отгоняется с паром на дистилляторе. Дистилляторы могут также использоваться для отгонки аммонийного азота непосредственно из образцов без их предварительного разложения, что позволяет выделить содержание аммонийного азота из общего азота по Кьельдалю.

За окончательный результат определения азота принимается среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Расхождение между ними не должно превышать следующей величины: 0.051+0,014х, где X— среднее арифметическое параллельных измерений. Умножив полученную величину на коэффициент К=5,7 (для пшеницы), получаем значение допускаемого расхождения в пересчете на белок.

Пересчет на содержание белка осуществляется по известному коэффициенту,который в общем случае равен 6,25, но может несколько отличаться для различных типов белка. Несмотря на кажущуюся сложность комплекса оборудования для определения белка методом Кьельдаля, использование именно этого метода анализа гарантирует достоверность результатов. Ведущие фирмы по созданию лабораторных приборов выпустили экспресс анализаторы, позволяющие максимально механизировать процесс разложения и титрования раствора. Такое оборудование позволяет существенно увеличить воспроизводимость результатов, снизить расход реактивов и обеспечить безопасность персонала. Однако стоимость самих приборов составляет десятки тысяч евро (в отличие от набора стеклянных сосудов и холодильников).

Нестандартизованный в России, однако применяемый на договорных условиях при экспортных операциях, метод Дюма имеет широкое распространение в Европе и Америке. Метод разработан Ж. Дюма в 1831 году.

При этом методе навеску анализируемого органического соединения сжигают в кварцевой трубке в атмосфере СО 2 в присутствии СuО и металлической Сu. Объем выделившегося N 2 , измеряют в азотометре (градуированном сосуде), после чего рассчитывают содержание азота в анализируемом образце. Образующиеся наряду с азотом СО, СО 22 , Н 2 0, оксиды азота связываются в трубке (медью или ее оксидом) или поглощаются водным раствором щелочи, которым заполнен азотометр. В настоящее время разработаны и другие модификации этого метода. Например, анализируемое вещество сжигают в вакууме, продукты поступают в слой твердого Мg (СlO 4 ) 2 , затем в раствор щелочи и измерительный сосуд для установления объема выделившегося N2.

Иногда к навеске вещества добавляют различные окислители (NIO, РЬО, или их смесь в соотношении 1:1. АgМnО4, Со2О3, и другие), которые способствуют более полному и быстрому разложению вещества. Для определения объема N2, применяют инструментальные методы, в том числе газовую хроматографию. Существуют полуавтоматические приборы-анализаторы, позволяющие определять содержание азота одновременно с содержанием углерода и водорода. Основные преимущества метода Дюма (азот по Дюма) по сравнению с методом Кьельдаля (азот по Кьельдалю):

  • исключена работа с такими агрессивными реагентами, как концентрированная серная кислота и шелочь. Длявыполнения анализа по методу Дюма требуются только неагрессивные и неядовитые реагенты — окислители и восстановители: окись меди или медь, вольфрам, а также газы О2 и СО2
  • нет необходимости постоянно следить за кипящей кислотой в стеклянных сосудах, которые часто растрескиваются во время анализа или при их переносе. Таким образом, метод Дюма безопасен и не требует дорогостоящей утилизации отходов после проведения анализа.

ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД

Хорошей альтернативой титриметрии может стать фотометрическое определение аммонийного азота при помощи готовых реактивов в спектрофотометрах и фотометрах. Этот метод позволяет получить результат за считанные минуты. Например, в память спектрофотометра занесены разные методики определения аммонийного азота и азота по Кьельдалю, методы определения целого ряда металлов, различных форм азота и фосфора, практически всех важнейших анионов.

МЕТОД БИК-СПЕКТРОСКОПИИ

В настоящее время во многих странах мира для оперативного (экспрессного) анализа целого ряда показателей качества некоторых видов сельскохозяйственной продукции широко применяется метод спектроскопии в ближней инфракрасной области (БИК спектроскопия). Инструментальную базу спектрального анализа составляют ИК-анализаторы и спектрофотометры.

  • значительное сокращение времени на проведение анализа;
  • существенная экономия энергоресурсов;
  • применение недорогостоящих расходных материалов и химических реактивов;
  • менее жесткие требования к квалификации обслуживающего персонала, производящего рутинные измерения (по сравнению с их коллегами, осуществляющими традиционные лабораторные методы анализа).

От редакции

За полтора года действия ГОСТ Р 52554-2006 «Пшеница. Технические условия» накопилось много теоретических и практических вопросов, касающихся определения важнейших показателей качества зерна пшеницы — влажности, количества и качества клейковины, содержания белка. О проблемах определения количества клейковины мы писали в МОС № 11 -2008, С. 34—35. Данный материал посвящен определению массовой доли белка.

источник

Компания «RBAnalytica» располагает внушительным опытом поставок данных систем, и на личном опыте описывает данный метод и шаги работы.

Доброго времени суток, Уважаемые коллеги!

Вот еще один успешный запуск поставляемого нами оборудования ! Не разглашая коммерческую тайну, без имен и городов, предлагаем Вам ознакомиться с нашим кратким экскурсом и фотоотчетом.

Что же такое «Метод Кьельдаля» ?

Метод Кьельдаля — единственный общепризнанный арбитражный метод определения белка был разработан в 1883 году пивоваром Иоганном Кьельдалем.

Сущность методики заключается в том, что образец продукта разлагается (сжигается) серной кислотой в присутствии катализатора, после чего полученный после разложения связанный в виде сульфата аммония азот, определяется титрованием. В таком виде метод все еще используется и сегодня, хотя существует ряд усовершенствований для ускорения процесса и получения более точных результатов

Почему же методу Къельдаля, не смотря на более чем 130-летнюю историю, до сих пор нет достойной альтернативы? Причиной тому — высокая специфичность выбранной реакции окисления белка серной кислотой, в результате которой разрушаются пептидные связи в его молекуле и образуются ионы аммония, которые затем могут быть легко проанализированы стандартными методами. Однако воспроизводимость и точность метода Кьельдаля в существенной степени зависит от опыта аналитика. Стремясь свести к минимуму влияние человеческого фактора на результаты анализа, ускорить выполнение методики и повысить ее безопасность, ведущие производители аналитического оборудования разработали специализированные комплекты оборудования для анализа по методу Кьельдаля. Метод включает в себя несколько основных этапов:

-отгонку с паром и определение концентрации аммония

1 этап. Минерализация:

Для превращения органического азота в аммонийную соль используется метод мокрого озоления (минерализация) исходного продукта концентрированной серной кислотой.

Использование специализированных приборов минерализаторов для озоления в концентрированной серной кислоте преследует следующие цели:

Скорость минерализации сильно зависит от температуры реакции. В обычном классическом методе Кьельдаля поддержание температуры на уровне 400-450оС – серьезная проблема, легко решаемая при использовании специально разработанного минерализатора (Дигестора)

На личном опыте, смею советовать использование Минерализатора в 2 этапа (для избежания вспенивания пробы)

· Сжигаем пробу на протяжении 30 мин при температуре 250 С

· Сжигаем пробу на протяжении 40 мин при температуре 420 С

Для безопасности собственного здоровья, рекомендую использовать (Нейтрализатор)Скруббер в связке с рециркуляционным насосом

С этим оборудованием, Вы так же можете ознакомится на нашем сайте

2 этап. Отгонка аммиака

Для разложения сульфата аммония, добавляется избыток щелочи( 33%), и аммиак отгоняется с водяным паром. Отогнанный аммиак поглощается борной кислотой.

Дистилляционные аппараты предназначены для количественной отгонки аммиака и добавления необходимых количеств реактивов и полностью соответствуют требованиям, прописанным в официальных методиках анализа. Автоматизация всех позволяет сократить время дистилляции одной пробы до 5 минут. Например, автоматические дистилляторы после установки пробирки в рабочее положение (пробирка должна быть не горячей, но и не остывать,что бы проба не кристаллизовалась, оптимальная температура примерно 35-40 С, остудить до того пока пробирку можно взять в руку) управляют множеством процессов: разбавление образца, добавление щелочи, отгонка в течение заданного времени с заданной мощностью

3 этап. Титрование.

Если ежедневное количество проб при определении белка не большое, то будет достаточно самого простого варианта: магнитная мешалка и бюретка (она может быть обычная стеклянная или цифровая).

Несмотря на сложность комплекса оборудования для определения белка по Кьельдалю,использование именного этого метода анализа гарантирует достоверность результатов, в то время как предложенное приборное решение позволяет существенно увеличить воспроизводимость,снизить расход реактивов и обеспечить безопасность персонала.

Преимущества PLURIMA от других производителей. (На наш взгляд)

На сегодняшний день, ряд производителей аппаратов Къельдаля самый разнообразный, после общения с практиками, решил поделится и с Вами, а чем же PLURIMA лучше остальных?

· Газоотводная система (пристройка над колбами в минерализаторе) производители других марок допускают ошибку не придавать внимание мелочам, которые в итоге играют не малую роль при выборе прибора, так и в нашем случае, слишком твердые уплотнители над колбами через некоторое время не закрывают собой колбу, в виду чего испарения серной кислоты попадают во внешнюю среду, уплотнитель должен быть мягкий, для лучшего уплотнения колбы. (советую обращать на это внимание)

· Доступное меню на большом сенсорном дисплее — в меню буквально расписаны все необходимые Вам шаги для получения максимально быстрого и качественного результата

· Автоматизация процессов — даже в младшем модельном ряде, производитель постарался вместить максимум автоматизации процесса, а именно добавление щелочи и очистка колбы, а так же промывка системы для очистки остатков ранее проведенного анализа.

Не по наслышке, а собственноручно убедился в этом лично. Желаю Вам хороших приобретений и правильного выбора. Обращайтесь к нам за консультациями, за помощью и за советом!

С уважением,технический директор «RBAnalityca»

источник

А знаете ли вы, что……

метод Кьельдаля, несмотря на его сложность, до сих пор остается единственным общепризнанным арбитражным методом определения белка!

Метод был разработан в 1883 году пивоваром Иоганном Кьельдалем. Сущность методики заключается в том, что образец продукта разлагается (сжигается) серной кислотой в присутствии катализатора, после чего полученный после разложения связанный в виде сульфата аммония азот определяется титрованием. В таком виде метод все еще используется и сегодня, хотя существует ряд усовершенствований для ускорения процесса и получения более точных результатов.

Метод Кьедаля очень трудоемкий и затратный по времени, поэтому в современной лабораторной практике метод часто пытаются заменить альтернативными методами определения белка. Но метод Кьельдаля, несмотря на его сложность, до сих пор остается единственным общепризнанным арбитражным методом определения белка, и чаще всего используется в качестве эталонного для калибровки и настройки других методик анализа. По этой причине аппараты для определения белка по методу Кьельдаля есть практически в каждой лаборатории по анализу пищевой продукции.

Почему же методу Къельдаля, не смотря на более чем 130-летнюю историю, до сих пор нет достойной альтернативы? Причиной тому — высокая специфичность выбранной реакции окисления белка серной кислотой, в результате которой разрушаются пептидные связи в его молекуле и образуются ионы аммония, которые затем могут быть легко проанализированы стандартными методами. Однако воспроизводимость и точность метода Кьельдаля в существенной степени зависит от опыта аналитика. Стремясь свести к минимуму влияние человеческого фактора на результаты анализа, ускорить выполнение методики и повысить ее безопасность, ведущие производители аналитического оборудования разработали специализированные комплекты оборудования для анализа по методу Кьельдаля. Метод включает в себя несколько основных этапов: подготовку проб, мокрое озоление, отгонку с паром и определение концентрации аммония (фотометрически или титриметрически). Для каждого этапа предусмотрены свои аппаратные решения, которые в настоящее время практически полностью заменили действия, выполняемые лаборантом вручную.

Читайте также:  Конформационный анализ белков теория и приложения

МЕТОД КЬЕЛЬДАЛЯ И РЕКОМЕНДУЕМОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

Для превращения органического азота в аммонийную соль используется метод мокрого озоления (минерализация) исходного продукта концентрированной серной кислотой.

Использование специализированных приборов для озоления в концентрированной серной кислоте преследует следующие цели:

а) скорость минерализации сильно зависит от температуры реакции. В обычном классическом методе Кьельдаля поддержание температуры на уровне 400-450 о С – серьезная проблема, легко решаемая при использовании специально разработанного минерализатора фирмы Velp Scientifica. Время реакции снижается в несколько раз.

б) полнота и скорость озоления сильно зависит от воспроизводимости температурных режимов. Специальные дигесторы Velp Scientifica полностью решают эту проблему благодаря микропроцессорному контролю температуры и специальной конструкции нагревательных гнезд.

в) в стандартном методе Къельдаля озоление серии из нескольких образцов требует значительного пространства на рабочем столе. В небольшом корпусе специализированного дигестора Velp Scientifica можно одновременно анализировать серии из 6, 8, 12 или 20 проб.

Для разложения сульфата аммония добавляется избыток щелочи, и аммиак отгоняется с водяным паром. Отогнанный аммиак поглощается борной кислотой.

Дистилляционные аппараты Velp Scientifica предназначены для количественной отгонки аммиака и добавления необходимых количеств реактивов и полностью соответствуют требованиям, прописанным в официальных методиках анализа.

Автоматизация всех позволяет сократить время дистилляции одной пробы до 3-4 минут.

Например, автоматический дистиллятор UDK 159 после установки пробирки в рабочее положение управляет всеми процессами: разбавление образца, добавление щелочи, отгонка в течение заданного времени с заданной мощностью, добавление в титровальную ячейку борной кислоты, колориметрическое титрование, удаление остатков дистилляции, расчет результатов анализа. Управление осуществляется через сенсорный дисплей, данные всех проведенных анализов сохраняются в памяти прибора, запуск всех процессов производится одной кнопкой в соответствии с выбранной программой.

Если ежедневное количество проб при определении белка не большое, то будет достаточно самого простого варианта: магнитная мешалка и бюретка (она может быть обычная стеклянная или цифровая). Для титрования большого количества проб и для повышения точности результатов рекомендуется использовать внешние автоматические титраторы, которые можно подключить к UDK 149 или использовать полностью автоматический дистиллятор UDK 159, со встроенным колориметрическим титратором.

Несмотря на сложность комплекса оборудования для определения белка по Кьельдалю, использование именного этого метода анализа гарантирует достоверность результатов, в то время как предложенное приборное решение позволяет существенно увеличить воспроизводимость, снизить расход реактивов и обеспечить безопасность персонала.

источник

При выборе наиболее оптимального метода определения белка в пищевых продуктах особое внимание следует уделить его безопасности для оператора и окружающей среды, времени анализа, вопросу подготовки специалиста, соответствию международным стандартам и пр. Кроме того, выбор должен базироваться на возможностях лаборатории в подборе оборудования, соответствующего поставленным задачам.

Метод был разработан в 1883 году датским химиком Иоганном Кьельдалем в лаборатории Carlsberg. Он позволяет количественно определять содержание органического белка в пробе. Основан на разрушении пептидной связи с последующим высвобождением молекулы азота и его количественного анализа с помощью титрования.

Классический метод Кьельдаля предусматривает три простых этапа: разложение, дистилляцию и титрование. После титрования использованное количество титранта соответствует концентрации азота, который был в образце. Перерасчет на белок происходит с помощью коэффициента перерасчета F (6,25 = 0,16 г азота на 1 г белка). Полное время анализа одного составляет образца составляет около 2 часов. Метод достаточно чувствительный, предел определения – 0,1 мг азота.

Нагреватели, колбы, стеклянные холодильники – когда метод только открыли, все исполнялось исключительно в ручном режиме. Сегодня же все три этапа – разложение, дистилляция и титрование – могут быть легко выполнены с помощью автоматических систем для анализа белка по Кьельдалю:

  • Минерализатора для разложения образца.
  • Дистиллятора для отгонки аммиака.
  • Скруббера для нейтрализации газов.
  1. Это референтный метод, который соответствует всем международным стандартам.
  2. Доступность оборудования, возможность поэтапной комплектации. Например, сначала можно приобрести анализатор, а потом дистиллятор.
  3. Все современные приборы анализа белка по методу ИК-спектрометрии калибруются на основе метода Кьедаля как эталонного.

Создан химиком Жаном Батистом Дюма в 1848 году. Метод обеспечивает определение общего азота в образце благодаря его полному сжиганию в сфере кислорода. Является альтернативой методу Кьельдаля. Но кроме органического определяет еще и неорганический азот.

Как и по Кьельдалю, так и по Дюма используются коэффициенты пересчета азота на белок. После открытия метод Дюма широкого распространения не получил. Возможно из-за того, что физически выполнить его сложнее. Он предполагает очень высокую температуру сгорания – около 1000-1300 ⁰С.

Сегодня различные производители предлагают анализаторы по этому методу. Как они работают?

Вы берете образец (достаточно 100 мг, чтобы провести анализ) и заворачиваете его в фольгу. Он сгорает при высокой температуре. Далее образец восстанавливается в следующей камере, где есть соединения меди. Потом азот проходит очищение: побочные продукты сгорания абсорбируются путем прохождения через скрубберы. В результате получаем чистый восстановленный азот, который определяется с помощью детектора теплопроводимости (TCD).

  1. Нет необходимости использовать прекурсоры, а значит, оформлять горы документации.
  2. Отсутствие потери азота на стадии переноса образцов.
  3. Существенно короче время анализа, включая этап пробоподготовки: Дюма – до 1 часа, Кьельдаля – до 3 часов.
  4. Исключение ошибки оператора. Забота о его здоровье и состоянии окружающей среды.

Метод Кьельдаля

Высокая производительность Относительно низкая производительность Короткое время анализа Значительные затраты времени Отсутствие больших затрат на обслуживание Доступное по стоимости оборудование Работает без присмотра Требует вмешательство оператора Отсутствие кислот или другой мокрой химии Использование кислот и щелочей Отсутствие вредных выбросов Дорогостоящая утилизация выбросов

Инфракрасное излучение с помощью светофильтров открыл Уильям Гершель в 1800 году. Прорыв в NIR-спектрометрии был сделан благодаря работе Уильяма Эбнея и Эдварда Фестинга. Они первыми сняли ИК-спектр органической жидкости в диапазоне 1-1,2 µм в 1881 году.

В основе метода лежит пропускание или отражение в ближнем инфракрасном диапазоне и последующее сравнение полученного спектра с результатами базы данных калибровок.

  1. Значительное меньшие затраты времени по сравнению с другими методами: полный анализ можно сделать за 10 минут.
  2. За короткое время можно получить большое количество показателей.
  3. Отсутствие расходных материалов или реактивов.
  4. Малые затраты труда.
  5. Высокая точность может быть достигнута постоянным усовершенствованием калибровок.

Этот метод наиболее востребован на производстве цельнозерновых, комбикормов и мукомольной продукции.

Лидер среди предлагаемого на рынке оборудования NIR-спектрометрии – Infratec 1241/Nova от компании FOSS. Наличие в приборе большой базы калибровок, а также специальных модулей и кювет позволяет очень точно определять: влажность, белок, жир, зольность, клейковину, крахмал, бушельный вес, абсорбционную способность муки после помола и многие другие показатели.

Этап Продукты/Напитки Корма для животных
R&D Разработка продукта Разработка рецептуры
Хранение Определение качества сырья, проверка товаров Определение качества сырья, проверка товаров
Производство Контроль промежуточных этапов производства Оптимизация рецептуры
Готовая продукция Проверка соответствия состава маркировке Соответствие маркировке

Особенно важно использовать эффективный экспресс-метод для готовой продукции. Это дает возможность за короткий промежуток времени увидеть, насколько завершенным является ваш конечный продукт.

  • Метод ИК-спектрометрии предполагает анализ без разрушения образца.
  • Отсутствует пробоподготовка, а результаты вы получите уже через 20-40 секунд.
  • При анализе содержания белка методом ИК-спектрометрии не нужны расходные материалы.
  • Нет необходимости специально обучать оператора – все операции здесь предельно просты.
  • Прибор вы можете использовать как в лаборатории, так и на производстве.
  • Отсутствие прекурсоров и вреда для окружающей среды избавляет от необходимости оформления большого количества документов.
  • В отличие от двух других описанных методов ИК-спектрометрия не предполагает использования высоких температур.
Обозначения Кьельдаля Дюма ИК-спектрометрия
Представление образца Разрушение (сжигание) Разрушение (сжигание) Без разрушения
Пробоподготовка Да Да Отсутствует
Время анализа 2-4 ч 5 мин (подготовка – 1 час) 20-40 с
Необходимость
расходных материалов
Да Да Отсутствует
Подготовка специалиста Высокая Высокая Низкая или отсутствует
Место анализа Лаборатория Лаборатория Лаборатория или производство
Необходимость прекурсоров Да Нет Нет
Работа с высокой температурой Да (420 ⁰С) Да (900 ⁰С) Нет
Вред для окружающей среды Высокий Средний Отсутствует

Таким образом, владея полной информацией о возможностях и недостатках каждого метода и оценив задачи и объем работы собственной лаборатории, производитель сможет выбрать наиболее подходящий метод количественного определения белка и соответствующее оборудование для его надлежащего выполнения. А значит – доказать качество и установить правильную цену на свою продукцию.

Анар Рахметов,
эксперт группы пищевых технологий

источник

На протяжении последних лет отечественная пищевая промышленность развивается весьма динамично. Эта тенденция является, несомненно, позитивной, потому что предопределяет формирование зрелого внутреннего рынка пищевых продуктов, усиление конкуренции и, как следствие, повышение их качества. Действительно, при возможности широкого выбора претендовать на потребительский спрос может лишь тот товар, который отвечает высоким требованиям качества. Вот почему в последние годы производители продуктов питания уделяют все более пристальное внимание вопросам контроля за качеством сырья и конечного продукта, причем не только давно известные, но и молодые предприятия, с первых ступеней развития бережно относящиеся к своей репутации.

Одним из важнейших показателей качества продукции, определяющим ее пищевую ценность, является содержание белка. Классическим способом определения белка является метод, разработанный еще в 1883 году датским химиком Иоганном Кьельдалем, который в последствии был назван его именем. Это очень трудоемкий и продолжительный анализ, и потому в современной лабораторной практике метод Кьельдаля часто пытаются заменить альтернативными методами определения белка, в том числе, с использованием дорогостоящих программно-аппаратных комплексов. Но метод Кьельдаля, несмотря на его сложность, до сих пор остается единственным общепризнанным арбитражным методом определения белка, и чаще всего используется в качестве эталонного для калибровки и настройки других методик анализа сырья и готовой продукции. По этой причине аппараты для определения белка по методу Кьельдаля есть практически в каждой лаборатории по анализу пищевой продукции, а альтернативные методики применятся только как вспомогательные при очень большом количестве ежедневных анализов. Для предприятия, только начинающего становление своей лаборатории, безусловно, предпочтительным является именно метод Кьельдаля.

Почему же методу Къельдаля, не смотря на более чем 120-летнюю историю, до сих пор не найдено достойной альтернативы? Причиной тому – высокая специфичность выбранной реакции окисления белка серной кислотой, в результате которой разрушаются пептидные связи в его молекуле и образуются ионы аммония, которые в последующем и могут быть легко проанализированы стандартными методами. Однако воспроизводимость и точность метода Кьельдаля в существенной степени зависит от опыта аналитика. Стремясь свести к минимуму влияние человеческого фактора на результаты анализа, ускорить выполнение методики и повысить ее безопасность, ведущие производители аналитического оборудования разработали специализированные комплекты оборудования для анализа по методу Кьельдаля. Метод включает в себя несколько основных этапов: отбор и подготовку проб, мокрое озоление, отгонку с паром и определение концентрации аммония (фотометрически или титриметрически). Для каждого этапа предусмотрены свои аппаратные решения, которые в настоящее время фактически стали стандартом де-факто и практически полностью заменили действия, выполняемые лаборантом вручную.

Необходимое условие получения точных результатов анализа по Кьельдалю – тщательная подготовка образцов. Процедура подготовки проб должна обеспечивать гомогенизацию образца, т. к. размер частиц в анализируемых пробах не должен превышать 1 мм. Однородность образца повышает воспроизводимость метода, а также позволяет уменьшить объём пробы. Обычно при использовании частиц малых размеров повышается скорость озоления. Для измельчения мягких образцов (таких как субстрат или сами грибы) рекомендуется использование специальных лабораторных мельниц, но чаще всего бывает достаточно обычной кофемолки. Взвешивание образцов для последующего анализа по Къельдалю должно проводиться на аналитических весах с точностью до 0,1 мг, например KERN ALS 120-4. Важно знать влажность образца и всегда анализировать либо предварительно высушенные образцы, либо образцы с точно установленным содержанием влаги. Для определения содержания влаги рекомендуется использовать термогравиметрические анализаторы, такие как KERN MRS 120-3 или его аналоги, имеющие погрешность на уровне 0.05-0.1%.

Самым трудоемким и продолжительным этапом в методе Кьельдаля является стадия мокрого озоления, в результате которого происходит полное “сжигание” образца в серной кислоте. Однако использовать для озоления чистую серную кислоту нецелесообразно из-за низкой скорости протекания процесса. Скорость озоления и разрушения образца зависят не только от свойств кислоты, но и от температуры обработки. Чем выше температура, тем меньше времени уходит на разложение. При использовании чистой серной кислоты температура озоления ограничивается, в основном, её точкой кипения (338°С), в то время как для полного разложения необходима более высокая температуры. Скорость мокрого озоления можно значительно увеличить за счет добавления солей и катализаторов. В классическом приборе Кьельдаля на каждый грамм образца обычно необходимо 25 мл кислоты и несколько часов для проведения разложения, в то время как, например, в блочных термореаторах серии DK (пр-ва итальянской фирмы VELP), благодаря повышенной температуре разложения (420°С) и оптимизации процесса термообработки, для разложения 1 грамма вещества требуется в среднем 30 минут и лишь 10 мл кислоты. Термореактор DK позволяет не только снизить расход серной кислоты, но и уменьшить расход гидроксида натрия, используемого для последующей нейтрализации разложившегося образца. Основной эксплуатационной проблемой для данной стадии анализа является выделение большого количества ядовитых паров диоксида и триоксида серы. Для сбора и нейтрализации вредных выбросов рекомендуется использовать специальный поглотитель, такой как скрюбер SMS, и вакуумный насос, например, кольцевой водоструйный насос JP. Эффективность системы SMS+JP настолько высока, что позволят использовать термореакторы DK без вытяжного шкафа, хотя наличие последнего все же желательно.

Полученный после стадии разложения прозрачный раствор не годится для непосредственного определения в нем аммонийного азота из большого содержания мешающих компонентов. Для отделения аммонийного азота он переводится в аммиачную форму (добавлением щелочи) и отгоняется с паром на специальных приборах, называемых дистилляторами. Компания VELP, один из ведущих производителей это типа аппаратов, предлагает несколько вариантов дистилляторов, отличающихся уровнем автоматизации и функциональным наполнением: от простейшего UDK126D с ручным управлением, который используется при необходимости проведения нескольких определений белка в день, до полностью автоматического программируемого UDK152 со встроенным фотометрическим титратором, производительность которого составляет до 20 проб в час и позволяет полностью исключить участие оператора на 3-ем и 4-ом этапах анализа. Дистилляторы могут также использоваться для отгонки аммонийного азота непосредственно из образцов без их предварительного разложения, что позволяет выделить содержание аммонийного азота из общего азота по Кьельдалю.

Результаты по определению белка принято представлять в мг/л аммонийного азота, поэтому метод определения белка по Кьельдалю (что более распространено в пищевой промышленности) часто еще называют методом определения общего азота по Кьельдалю (используется, например, в экологическом анализе). Пересчет на содержание белка осуществляется по известному коэффициенту, который в общем случае равен 6.25, но может несколько отличаться для различных типов белка. Перегоняемый с паром аммиак собирается в колбе, в которую предварительно помещают раствор борной или серной кислоты с известной нормальностью. Полученный чистый раствор бората или сульфата аммония может быть легко оттитрован прямым или обратным методом. Если ежедневно производится анализ небольшого количество проб, то можно довольствоваться обычным бюреточным титрованием, но для титрования большого количества проб и для повышения точности результатов рекомендуется использовать автоматические титраторы. Хорошей альтернативой титриметрии может стать фотометрическое определение аммонийного азота при помощи готовых реактивов. Так компания HACH-LANGE предлагает спектрофотометры и фотометры серии DR, которые комплектуются наборами реагентов, позволяющих получить результат за считанные минуты. Например, в память спектрофотометра DR/2500 помимо 5 различных методик определения аммонийного азота и азота по Кьельдалю, занесено еще более 100 различных методов определения целого ряда металлов, различных форм азота и фосфора, практически всех важнейших анионов.

В рамках этой статьи вполне осознано не рассматривались другие методики определения белка, поскольку все они вторичны и требуют калибровки по методу Кьельдаля. Несмотря на кажущуюся сложность комплекса оборудования для определения белка по Кьельдалю, использование именного этого метода анализа гарантирует достоверность результатов, в то время как предложенное приборное решение позволяет существенно увеличить воспроизводимость, снизить расход реактивов и обеспечить безопасность персонала. Указанные в качестве примеров модели приборов характеризуются, прежде всего, приемлемой ценой, высокой надежностью и, главное, имеют большой практический опыт эксплуатации на множестве пищевых производств в различных регионах России, хотя для реализации метода Кьельдаля конечно могут использовать приборы и других производителей, выбор которых зависит от предпочтений и финансовых возможностей конкретной лаборатории.

Читайте также:  Качественный и количественный анализ белка

источник

excel, 171 Кб. От 30 сентября, 2019

Здесь содержится самая разная информация,
в основном для обслуживания сайта.

  • Информация по продукции
    • рН-метр-термометр «Нитрон-рН»
    • Анализатор пива «Колос-1»
    • Анализатор спиртосодержащих напитков «Колос»
      • Краткое описание показателей и таблица
    • Анализаторы молока «Клевер-2», «Клевер-2М»
      • Достоинства анализаторов Клевер
    • Биомер
    • Программы редкие
    • Видео
  • Увлечения сотрудников
    • Как мы ходили смотреть БЕЛУХУ . 🙂
    • Путешествие за горизонт. Укок 2009
    • Хакасия 2009 или как мы проехали, прошли и проплыли 4100 км.
      • ФОТО
    • Алтай-Тыва-Хакасия. Сентябрь 2008
      • ФОТО
    • Алтай зимой. Январь 2008
      • ФОТО
    • Дорогами Алтая. Сентябрь 2007
      • ФОТО
    • Алтай июль 2007. Туда куда не доехали в 2006
    • Эльбрус март 2007
    • Поездка на Алтай, обзорная. 27.08.06
    • Корпоративный отдых. ОБЖ и пейнтбол, 06.06.2005.
    • Горные лыжи. Поездка на гору «Гладенькая», 15.04.2005.
      • Фото молоко
      • Добавка ПМ
    • ФОТО НА ВЫНОС
  • Статьи для покупателей
    • Готовые наборы
      • Что такое «Наборы»?
      • Специализированные наборы
      • Наборы для анализа по ГОСТ
    • Лаборатория, молочный завод
    • Фермерское хозяйство
    • Молоко, контролируемые показатели
    • Шесть вопросов про молочные анализаторы
    • Лаборатория (приемка молока)
    • Основные причины сбоев в работе приборов
    • Особенности анализа обработанного молока
    • Анализатор Колос-2. Тонкости работы.
    • Определение жира по Герберу. Кислотный метод.
    • Решение аналитических задач
    • Определение белка в пищевых продуктах
    • Анализатор молока. Сравнить
    • Анализ молока. Как должно быть
    • СОМАТОС vs Соматические клетки
    • Применение стандартных образцов для проведения поверки анализаторов Клевер-2 (2М)
    • ФАЛЬСИФИКАТ vs ГОСТ Р 52253-2004
    • ГОСТ 32255-2013. Читаем вместе.
    • Теория градуировки
    • Кто заплатит за погрешность
    • Термоустойчивость молока
    • Как оно тикает. Разбираем коррекцию градуировки

Звоните: (383) 308-75-00 — многоканальный. 8-800-3-506-708 — из России бесплатно.
Пишите: info@biomer.ru

Адрес: Новосибирская область, ВАСХНИЛ (п. Краснообск), ул. Восточная, д. 15, оф. 203

Информация, представленная на сайте, не является публичной офертой

источник

Наиболее распространенным методом определения общего азота в биологическом материале является метод Кьельдаля. Основное его достоинство заключается в том, что он позволяет определить суммарный азот с высокой точностью. Несмотря на ряд модификаций, которые претерпел метод за свою историю, он, сохранив специфичность, стал стандартным методом определения азота. Однако из-за того, что отдельные участки его трудно поддаются автоматизации, метод и в настоящее время остается довольно трудоемким и длительным.

Принцип действия. При определении общего азота по Кьельдалю органическое вещество минерализуют при высокой температуре концентрированной серной кислотой. При этом органическое вещество окисляется в присутствии катализатора до СО2 и Н2О, а весь азот переходит в аммиак и связывается с серной кислотой, образуя сульфат аммония:

органическое (NН4)24 +СО2 + Н2О

Раствором щелочи нейтрализуют избыток серной кислоты и высвобождают из сернистого аммония аммиак:

(NН4)24 + 2NаОН Nа24 + 2 NН3 + 2 Н2О,

который затем отгоняется с парами воды и улавливается стандартным раствором борной кислоты.

При взаимодействии аммиака и кислоты образуется борат аммония NН4Н2ВО3:

33ВО34 + + Н2ВО3

Борат титруют стандартным раствором серной кислоты, причем избыток Н3ВО3 не мешает определению:

Н + + Н2ВО3 — Н3ВО3.

Отгон аммиака давлением водяных паров и титрование ведут на приборе конструкции В.М. Сереньева (см. рисунок 2), где можно совместить две заключительные стадии с целью ускорения определения азота.

Используемые для сжигания исследуемого материала катализаторы должны содержать сернокислый калий для повышения температуры сжигания вещества до оптимального значения.

Из-за трудоемкости процедуры выделения белка в анализируемой практике часто определяют так называемый сырой белок (сырой протеин), используя данные по содержанию общего азота (белкового и небелкового), считая его условно белковым. Так как содержание азота в белках колеблется в довольно широких пределах, а в среднем составляет 16%, то для пересчета азота на белок часто берут усредненный коэффициент – 6,25 (100:16 = 6,25). Этот коэффициент не является постоянным и в зависимости от содержания азота в белке у разных культур может изменяться от 5,3 до 6,25. Например, для пшеницы, ржи используют коэффициент 5,7 (100:17,5= 5,7). В целях получения сравнимых данных необходимо обязательно указывать коэффициент пересчета (N умножить на коэффициент пересчета).

Ход работы. 0,3- 0,5 г исследуемого воздушно-сухого материала отвешивают в маленькой пробирке (0,5х3 см), которую затем вставляют в резиновую трубку нужного диаметра и переносят в колбу Кьельдаля, вводя пробирку почти до основания перевернутой вверх дном колбы и опрокидывая всю систему. По разности масс пробирки с навеской и пустой пробирки (после переноса) определяют массу навески для анализа. В колбу добавляют 0,5 ± 0,05г смешанного катализатора и приливают цилиндром или дозатором 10 мл концентрированной Н2SO4. Перемешивают содержимое колбы (без встряхивания), закрывают ее стеклянной полой грушевидной втулкой или воронкой и ставят в наклонном положении (примерно 45 0 ) в гнездо нагревателя в вытяжном шкафу. Колбу осторожно нагревают, снимая или уменьшая нагрев на некоторое время каждый раз, когда обугливаемое вещество начинает сильно пениться от выделяющихся газов, в том числе оксида серы (IV). После прекращения вспенивания можно усилить нагрев до слабого непрерывного кипения. Ввиду возможных потерь азота, вследствие разложения бисульфата аммония (сернокислый аммоний разлагается на аммиак и бисульфат при 355 0 С) необходимо следить, чтобы в процессе сжигания горло колбы всегда оставалось холодным, а также за тем, чтобы на стенках колбы не оставалось темных пятен, смывая их горячей кислотой, придав колбе наклонное положение. Когда содержимое колбы приобретает зеленовато-голубой цвет без желтого оттенка, ее кипятят еще около 20 минут, после чего в охлажденную на воздухе колбу добавляют небольшое количество воды для удаления следов кислоты со стеклянной втулки и внутренней стороны верхней части колбы, закрывают колбу резиновой пробкой или герметизируют другим способом и оставляют до определения азота. Отгон аммиака производят на приборе Сереньева (см. рисунок 2).

1 – реакционный сосуд ; 2 – воронка; 3 – барботер; 4 – сосуд со щелочью; 5 – бюретка; 6,7 – спускные краны; 8 – кран на свободный доступ воздуха; 9 – ЛАТР; 10 – штатив; 11 – электроды

Рисунок 2 – прибор Сереньева для определения азота

Методика работы на приборе Сереньева. После заполнения бюретки титрованным раствором до нулевой отметки, подачи воды к водоструйному насосу и холодильнику барботера 7 и подключения электродов подготовленного к работе сосуда через ЛАТР 9 в сетьзакрывают краны в следующей последовательности: нижний барботера 7, затем верхний, сообщая барботер с реактором 8 и, наконец, кран реактора 6. В барботер 3 вносят из бюретки 5 примерно 1/4 часть (1-2 мл) предполагаемого для титрования стандартного раствора 0,02н серной кислоты, содержащей индикатор Гроака.

В реактор 1 через фиксированную воронку подают минерализованный образец, обеспечив полноту переноса и отсутствие следов кислоты на воронке дистиллированной водой. При этом следят за тем, чтобы объем перенесенной жидкости был как можно меньшим, поскольку в этом случае время анализа уменьшается. Осторожно добавляют 33%-ный раствор гидроксида натрия до почернения смеси (работают в защитных очках).

Поступление аммиака с парами воды из реактора в барботер должно сопровождаться синхронным добавлением титрованного раствора (обеспечивается вручную) до границы перехода окраски в барботере с зеленой до лиловой (промежуточная окраска – сероватого тона). Постоянство лиловой окраски в течение 20–60 с (временный интервал зависит от скорости отгонки) свидетельствует о конце титрования. В бюретке отмечают объем израсходованного стандартного раствора и показание заносят в лабораторный журнал.

При необходимости продолжить работу после очередного измерения (например, проведение холостого опыта после анализа испытуемого образца или наоборот) уменьшают нагрев, открывают краны, сообщая систему с атмосферой, в последовательности реактор — барботер (верхний кран 6,8) – барботер (нижний кран 7). После слива жидкости из барботера и реактора промывают фиксированную воронку последнего дистиллированной водой (до 50 мл). Затем краны закрывают в обратной последовательности, заполняют бюретку стандартным раствором – и прибор вновь готов к работе.

По окончании работы отключают ЛАТР, открывают кран реактора 6, затем верхний кран барботера 8. После истечения жидкости из реактора промывают фиксированную воронку водой, закрывают верхний кран барботера 8, затем кран реактора 6 и заполняют реактор водой. Вновь открывают краны, сообщая систему с атмосферой, в последовательности реактор – барботер (верхний кран 6,8) – барботер (нижний кран 7) – предохранительная склянка. Отключают насос и перекрывают водопроводную воду для охлаждения. После слива жидкости из реактора и барботера извлекают подвижную часть затвора (пробку) крана, промывают кран водой, просушивают, смазывают борным вазелином и собирают кран.

Расчет содержания азота на сухое вещество в исследуемом материале проводится по формуле

, (2)

где N – содержание азота в пересчете на сухое вещество, %;

V — количество титрованного раствора 0,02н Н24, израсходованного на титрование за вычетом поправки на реактивы (контрольная проба), мл;

n – заданная нормальность титрованного раствора;

k — поправка на нормальность титрованного раствора;

g – навеска анализируемой пробы, г;

W – влажность исследуемого вещества, %;

0,014 – титр1н раствора серной кислоты по азоту, г/см 3 .

Расчет содержания азота на воздушно — сухое в исследуемом материале проводится по формуле

, (3)

где N – содержание азота в пересчете на воздушно-сухое вещество, %;

V– количество титрованного раствора, израсходованного на титрова- ние за вычетом поправки на реактивы (контрольная проба), мл;

n – заданная н — нормальность титрованного раствора;

k – поправка на н — нормальность титрованного раствора;

g – навеска анализируемой пробы, г;

0,014 – титр1н раствора серной кислоты по азоту, г/см 3 .

Содержание белка рассчитывают путем умножения полученных значений азота на соответствующий коэффициент пересчета.

Материалы и реактивы: зерно, мука, солод; концентрированный раствор серной кислоты; 33%-ный раствор гидроксида натрия; смешанный индикатор Гроака (см. приложение Б, п.6); титрованный 0,02н раствор серной кислоты с индикатором Гроака и борной кислотой (см. приложение Б, п.7); селеновый катализатор (см. приложение Б, п.8).

Оборудование: колбы Кьельдаля; универсальная индикаторная бумага; цилиндры на 5, 10 мл; стеклянные втулки, воронки; пипетки на 20 мл; стаканы на 100 мл; промывалки; бумажные фильтры; пробирки с резиновой трубкой; прибор Сереньева для отгонки аммиака, защитные очки.

источник

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное агентство по образованию

Саратовский государственный технический университет

методы Определения БЕЛКОВ

по курсу «Технология пищевых производств»

для студентов специальности 260601.65

Саратовского государственного технического университета

Цель работы: изучение методов определения белковых веществ в пищевых продуктах.

Среди азотистых веществ, входящих в состав пищевых про­дуктов, важнейшая роль принадлежит белкам.

Белками или белковыми веществами называются сложные высокомолекулярные полимеры, молекулы которых построены из остатков аминокислот.

Аминокислота – это гетерофункциональное соединение. Простейшая формула аминокислоты: R-CH-COOH-NH2-. — NH2 – аминогруппа, обладает основными свойства белков; — COOH – карбоксильная группа – обладает кислотными свойствами; R – радикал, влияет на пространственную конфигурацию молекул белка. Остатки аминокислот в молекуле белка соединяются при помощи полипептидной связи – CO-NH-. Белки наиболее важные и сложные по химической структуре среди веществ, входящих в пищевые продукты. Полипептидные цепи белков строятся из десятков и сотен молекул, причем не одной, а разных аминокислот, образуя цепь они могут соединяться в различной последовательности, что приводит к огромному многообразию комбинаций аминокислотных остатков в полипептидных цепях.

Состав белков: содержание углерода – 50-55%; водорода – 6,5-7,3%; кислорода – 21,5-23,5%; азота – 15-18%. Также в состав белков входит селен, фосфор.

1) в зависимости от формы молекулы белка: глобулярные и фибриллярные;

2) по строению: простые (протеины) – при гидролизе распадаются до аминокислот и сложные (протеиды) – при гидролизе распадаются на аминокислоты и простетическую группу;

3) по растворимости: растворимые и не растворимые в солевых растворах;

4) по выполняемым функциям: белки выполняют каталитические функции (ферменты); регуляторные (гормоны); структурные (коллаген); двигательные; транспортные (гемоглобин); защитная (иммуноглобулин).

Их основное зна­чение заключается в незаменимости другими компонентами пи­щи. Белки составляют основу процессов жизнедеятельности орга­низма. Необходимость их постоянного обновления лежит в осно­ве обмена веществ.

Белки в организме выполняют структурную (построение тка­ней и клеточных компонентов) и функциональную (ферменты, гормоны, дыхательные пигменты и др.) роль.

Дефицит белка в пищевом рационе повышает восприимчи­вость организма к инфекционным заболеваниям, нарушает про­цессы «кроветворения», обмен липидов, витаминов и др. У детей при белковой недостаточности замедляются рост и умственное развитие.

Длительный избыток белка в питании также отрицательно сказывается на жизнедеятельности организма, вызывая перевозбудимость нервной системы, нарушение обменных процессов, пе­регрузку печени и почек.

В ежедневном рационе взрослого человека белки должны со­ставлять около 14% общей калорийности, сочетаясь в определен­ном соотношении с другими пищевыми веществами.

Известно, что растительные белки усваиваются организмом не полностью по сравнению с животными. Так, белки молока и яиц усваиваются на 96%, белки рыбы и мяса – на 95%, белки хлеба из муки пшеничной I и II сортов — на 85%, белки карто­феля, хлеба из обойной муки, бобовых — на 70%. Учитывая, что растительные белки менее полноценны по составу незаменимых аминокислот, чем животные, потребление определенного количе­ства животных белков совершенно необходимо. Для взрослого человека доля животных белков в среднем должна составлять около 55% общего количества белка в рационе.

Технологические свойства белков.

1. Белки – амфотерные соединения. При определенном значении ph=4,6-4,7 (изоэлектрическая точка белка) число положительных и отрицательных зарядов одинаково. Белки в данной точке электронейтральны, а их растворимость и вязкость наименьшая. Эту способность белка снижать растворимость при достижении электронейтральности широко используют в пищевой промышленности, например при производстве сыра и творога.

2. Гидратация белков. Белки присоединяют воду, то есть проявляют гидрофильные свойства, при этом они набухают, увеличивается их масса и объем, причем набухание может сопровождаться частичным растворением белков. На поверхности молекулы белка содержаться группы: карбоксинальная, аминная, пептидная, эти группы притягивают к себе молекулы воды и образуют защитную гидратную оболочку. В результате молекулы белков не могут соединяться друг с другом, то есть агрегироваться. В изоэлектрической точке данная оболочка разрушается, молекулы белков соединяются друг с другом, а эти агрегаты могут выпадать в осадок. При изменение среды макромолекулы белков становятся заряженными, их способность присоединять воду меняется, при ограниченном набухании белковые растворы образуют сложные смеси, называемые студнями. Набухший в воде белок пшеничной муки образует клейковину. Студни и клейковина обладают свойствами упругости и эластичности, пластичности и ползучести, т. е. свойствами твердого и жидкого тела. Свойство набухания играет большую роль в пищевой технологии (набухание зерна при замочке, муки при замесе теста).

3. Денатурация – это изменение пространственной ориентации белковой молекулы, не сопровождающееся разрывом ковалентных связей. Денатурация может вызываться повышением температуры, механическим и химическим воздействием, ультразвуком, ионизирующим облучением и другими факторами. При этом процессе изменяются физические свойства белка: уменьшается способность к гидратации, снижается растворимость, теряется его биологическая активность, меняется форма макромолекулы. Денатурация белков играет важную роль в технологических процессах, связанных с образованием структурных систем полуфабрикатов и готовых продуктов (хлеба, макаронных, кондитерских и других изделий).

4. Гидролиз белков. Протекает под действием ферментов ступенчато с образование промежуточных продуктов: пептонов, полипептидов, дипептидов, аминокислот. Процесс присоединения группы – OH — к карбоксильной группе.

5. Пенообразование – способность белков образовывать эмульсии в системе жидкость-газ, называемые пенами. Белки как пенообразователи широко используются при изготовлении многих кондитерских изделий.

6. Меланоидинообразование – это свойство объясняется взаимодействием аминогруппы белка с карбонильными группами сахаров. Эта реакция сопровождается образованием меланоидинов, то есть веществ, обладающих различным окрашиванием и ароматом.

Массовую долю белка в пищевых продуктах определяют по количеству общего азота методом Кьельдаля. С развитием фото — и спектрофотометрии были разработаны методы количественного определения белка, основанные на его способности давать окра­шенные соединения с некоторыми реагентами. Среди них следует отметить метод Лоури, биуретовый метод. Находят применение также физико-химические методы, в основу которых положены специфические свойства белка: образование различной степени помутнения в зависимости от концентрации белка в растворе сульфосалициловой кислоты (нефелометрический метод), способ­ность белка адсорбировать некоторые красители и другие свойства белка.

Все перечисленные методы могут быть отнесены к ускорен­ным. При относительно небольших затратах времени они харак­теризуются достаточно высокой точностью и простотой определе­ния. В настоящих методических указаниях изложены методы количест­венного определения белка: Кьельдаля, биуретовый, нефелометрический, рефрактометрический и метод формольного титрования.

Определение массовой доли белка методом Кьельдаля

Метод основан на минерализации навески продукта при нагревании с концентрированной серной кислотой в присутствии катализато­ров. При этом углерод и водород органических соединений окис­ляются до диоксида углерода и воды, азот, освобождаемый в ви­де аммиака, соединяется в колбе с серной кислотой, образуя сульфат аммония. Схематично происходящие реакции могут быть представлены следующим образом:

RCHNH2COOH +H2SO4 =СО2+ SO2 + H2O + NH3.

На последующей стадии дистилляции раствор сульфата ам­мония обрабатывают концентрированным раствором гидроксида натрия, при этом аммиак освобождается и улавливается титро­ванным раствором серной кислоты. Избыток серной кислоты оттитровывают раствором гидроксида натрия. Метод Кьельдаля применяют в нескольких модификациях, отличающихся в основ­ном условиями минерализации. Для ускорения процесса вводят различные катализаторы: оксид меди, селен, свинец и другие, повышают температуру кипения серной кислоты добавлением со­лей, сульфата калия или натрия, сочетают добавление катализа­тора и солей при сжигании навески.

Методом Кьельдаля в любой модификации определяется ко­личество общего азота. Массовая доля белка вычисляется умно­жением полученной величины общего азота на переводной коэф­фициент 6,25, исходя из того, что в белках в среднем содержится 16% азота. Условность полученных результатов при таком пере­счете очевидна, так как не весь азот пищевого продукта находит­ся в форме белка и, кроме того, процентное содержание азота в белках подвержено колебаниям как в сторону повышения, так и в сторону понижения от 16%. В некоторых продуктах азотистые вещества небелкового характера достигают значительных коли­честв (мышечная ткань рыбы – 15%, мясо животных – 10–16% от общего количества азотистых веществ).

Следовательно, для получения более точных результатов не­обходимо либо при пересчете общего азота на белок использо­вать различные коэффициенты в зависимости от процентного со­держания азота в белках отдельных продуктов: мясо и овощи – 6,25; пшеница, рожь, горох и др. – 5,7; гречиха, рис – 6,0; моло­ко – 6,37 и т. д., либо белковый азот определять отдельно специ­альными методами.

В колбу Кьельдаля помещают последовательно несколько стеклянных бусинок или кусочков фарфора, около 10 г серно-кислого калия, 0,04 г серно-кислой меди. В бюксу с крышкой отмеривают 5 см3 молока, крышку закрывают и взвешивают. Молоко из бюксы переливают в колбу. Пустую бюксу вновь взвешивают и по разнице между массой бюксы с молоком и массой пустой бюксы устанавли­вают массу взятого молока. В колбу добавляют 20 см3 серной кислоты, вливая осторожно по стенкам колбы, смывая с них капли моло­ка. Колбу закрывают грушеобразной стеклянной пробкой и осторожно круговыми движениями перемешивают содержимое колбы.

Колбу ставят на нагревательный прибор в наклонном положении под углом 45° и осторожно нагревают.

Продолжают нагревание колбы до тех пор, пока не прекратится пенообразование и содержимое колбы не станет жидким.

Затем сжигание продолжают при более интенсивном нагрева­нии. Степень нагревания считают достаточной, когда кипящая кис­лота конденсируется в середине горловины колбы Кьельдаля.

Время от времени содержимое колбы перемешивают, смывая обуглившиеся частицы со стенок колбы. Нагревание продолжают до тех пор, пока жидкость не станет совершенно прозрачной и прак­тически бесцветной (при применении в качестве катализатора оки­си ртути) или слегка голубоватой (при применении и качестве катализатора серно-кислой меди).

После осветления раствора нагревание продолжают в течение 1,5 ч, после чего колбе дают остыть до комнатной температуры. Добавляют

150 см3 дистиллированной воды и несколько кусочков свежепрокаленной пемзы, перемешивают и снова охлаждают.

В коническую колбу отмеривают 50 см3 раствора борной кисло­ты, добавляют 4 капли индикатора и перемешивают. Коническую колбу соединяют с холодильником с помощью аллонжа и резино­вой пробки так, чтобы конец аллонжа был ниже поверхности раствора борной кислоты в конической колбе. Колбу Кьельдаля соеди­няют с холодильником при помощи каплеуловителя, проходящего через одну пробку с делительной воронкой. Градуированным ци­линдром отмеривают 80 см3 раствора гидроокиси натрия (при при­менении в качестве катализатора красной окиси ртути используют раствор гидроокиси натрия, содержащий сульфид натрия) и через делительную (или капельную) воронку вносят его в колбу Кьельдаля. Сразу же после выливания раствора закрывают кран делительной воронки для избежания потери образующегося аммиака.

Содержимое колбы Кьельдаля осторожно смешивают круговы­ми движениями и нагревают до кипения. При этом необходимо избегать пенообразования.

Продолжают перегонку до тех пор, пока жидкость не начнет вскипать толчками. При этом регулируют степень нагрева так, чтобы время дистилляции было не менее 20 мин. Убедиться в полноте перегонки аммиака можно путем дополнительной перегонки в новую порцию борной кислоты (20 см3) в течение 5 мин. Окраска раствора борной кислоты должна оставаться без изменения. При перегонке не допускают нагревание раствора борной кислоты в конической колбе. Слишком сильное охлаждение (ниже +10 °С) также нежелательно, так как оно может вызвать переброс жидкости из конической колбы в колбу Кьельдаля.

Перед окончанием перегонки опускают коническую колбу так, чтобы конец аллонжа оказался над поверхностью раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2 мин.

Прекращают нагревание и отсоединяют аллонж. В коническую колбу смывают внешнюю и внутреннюю поверхности аллонжа не­большим количеством дистиллированной воды.

Титруют дистиллят раствором соляной кислоты до перехода зе­леного цвета в серый. При избытке титранта раствор приобретает фиолетовый цвет.

Параллельно проводят контрольный анализ так же, как и основ­ной, применяя 5 см3 дистиллированной воды вместо молока. Коли­чество повторностей контрольного анализа должно быть не ме­нее 5. Контрольный анализ проводится в каждой серии определе­ний количества белка и при каждой замене реактивов.

Проведение ускоренного анализа

В кварцевую пробирку помещают компоненты, указанные в пер­вом абзаце. Осторожно круговыми движениями перемешивают содержимое пробирки. Затем вносят в пробирку 20 см3 перекиси водорода, не допуская вспенивания.

Пробирку ставят в гнездо алюминиевого блока, помещенного на электроплитку. Устанавливают регулятор нагрева плитки в среднее положение. После прекращения вспенивания содержимого пробирки устанавливают регулятор нагрева плитки в положение, соответству­ющее максимуму. Нагревание продолжают до тех пор, пока жид­кость не станет прозрачной и бесцветной или слегка голубоватой. Затем пробирку охлаждают и присоединяют к перегонному аппара­ту (рис. 1).

Рис. 1. Прибор для отгонки аммиака:

1 – плитка электрическая; 2 – колба коническая вместимостью 2000 см3; 3 – воронка делительная; 4 – каплеуловитель; 5 – пробирка кварцевая; 6 – холодильник; 7 – колба коническая вместимостью 250 см3

В коническую колбу вместимостью 250 см3 отмеривают мерным цилиндром 20 см3 раствора борной кислоты, добавляют 3-4 капли раствора двойного индикатора.

Отмеривают мерным цилиндром 60 см3 раствора гидроокиси на­трия и осторожно, не допуская выбросов, переливают его через де­лительную воронку в пробирку. Кран воронки сразу закрывают. Открывают зажим на линии подачи пара из конической колбы вмес­тимостью 2000 см3 и направляют пар в пробирку.

Перегонку ведут до достижения объема конденсата от 50 до 70 см3.

Конденсат титруют раствором соляной кислоты до перехода зе­леного цвета в серый. При избытке титранта раствор приобретает фиолетовый цвет.

Параллельно проводят контрольный анализ, используя вместо молока 5 см3 дистиллированной воды.

Массовую долю белка X в процентах вычисляют по формуле:

,

где 1,4 – количество азота, эквивалентное 1 см3 раствора соляной кислоты с молярной концентрацией с (HCl)=0,1 моль/дм3, мг/см3; N – коэффициент, численно равный величине молярной концентрации раствора соляной кислоты, выраженный мг/см3; V1 – объем раствора соляной кислоты, израсходованный на титрование дистиллята в основном анализе, см3;

V0 – объем раствора соляной кислоты, израсходованный на титрование дистиллята в контрольном анализе, см3; 6,38 – коэффициент пересчета массовой доли общего азота на массовую долю общего белка; m – масса молока, взятая на анализ, г.

За окончательный результат испытания при анализе по Кьельдалю принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 0,03%.

Определение массовой доли белка биуретовым методом

Спе­цифической реакцией на содержание белка является биуретовая реакция, так как ее дают полипептидные связи. Она получила свое название от производного мочевины — биурета, который об­разует в щелочном растворе медного купороса окрашенное комп­лексное соединение. Интенсивность окрашивания пропорциональ­на содержанию пептидных связей, а, следовательно, и концент­рации белка в растворе.

Биуретовую реакцию дают все белки, пептоны и полипепти­ды, начиная с тетрапептидов.

Эта реакция длительное время использовалась как качественная реакция на белок. В дальнейшем она стала применяться для количественного определения белка в различных объектах. Биуретовый метод применяют в различных модификациях, раз­личающихся условиями экстрагирования белка, способами вне­сения биуретового реактива и техникой колориметрирования.

Ниже приводится биуретовый метод определения массовой доли белка в муке в модификации Дженнингса, экспериментальная проверка которого выяви­ла ряд его преимуществ перед другими модификациями.

Биуретовый реактив – 15 см3 10 н. раствора КОН и 25 г сегнетовой соли, взятой с погрешностью ±0,01 г, растворяют примерно в 900 см3 дистиллирован­ной воды в мерной колбе вме­стимостью 1000 см3. Медленно добавляют при постоянном перемешивании 30 см3 4 %-ного раствора CuSO4, отмерен­ных цилиндром, и доводят объем колбы до метки дистил­лированной водой.

Взвешивают около 1,5 г муки с погрешностью ±0,001 г и помещают в сухую коническую колбу вместимостью 250—300 см3, снабженную пробкой. Отмеривают цилиндром с ценой деления 0,1 см3 под тягой 2 см3 четыреххлористого углерода для извлечения жира из образца, добавляют пи­петкой 100 см3 биуретового реактива. Закрытую пробкой колбу встряхивают на механическом встряхивателе в течение 60 мин. Далее вытяжку центрифугируют в течение 10 мин при частоте вращения

4500 мин-1. Прозрачный центрифугат помещают в кю­веты фотоэлектроколориметра с толщиной слоя раствора 5 мм. Измерение оптической плотности производят при длине волны 550 нм.

По величине оптической плотности белковой вытяжки опреде­ляют содержание белка в навеске (мг) с помощью калибровоч­ной кривой

(рис. 2). Рассчитывают массовую долю белка (в %) на сухие вещест­ва муки.

Запись в лабораторном журнале

Величина оптической плотности (D)

Содержание белка в навеске муки

(по калибровочной кривой)(n/1000)………………г

Массовая доля белка в 100 г сухих веществ(М)…%

Построение калибровочной кривой – для по­строения калибровочной кривой подбирают образцы муки с раз­личной массовой долей белка в диапазоне, встречающемся в реальных условиях (от 8 до 20%). Интервал в содержании белка образцов должен находиться в пределах не более 1%. Количест­во образцов не должно быть менее 10. С увеличением их числа точность определений возрастает.

Затем приведенным выше методом Дженнингса определяют оптическую плотность белковых вытяжек всех образцов.

При построении кривой на оси абсцисс откладывают величи­ны оптической плотности, а на оси ординат – содержание белка в навеске в мг.

Рис. 2. Калибровочная кривая (биуретовый метод)

Определение массовой доли белка нефелометрическим мето­дом

Метод основан на измерении интенсивности светового пото­ка, рассеянного твердыми или коллоидными частицами, находящимися в растворе во взвешенном состоянии. По интенсивности светорассеяния, определяемой нефелометром, судят о концентра­ции исследуемого вещества.

В настоящее время находят широкое использование фото­электрические нефелометры.

Растворы высокомолекулярных соединений, например раство­ры белков, способны при определенных условиях в присутствии некоторых химических реагентов опалесцировать. Одним из та­ких реагентов является сульфосалициловая кислота. Концентра­ция белка в этом случае может быть определена по интенсивно­сти опалесценции.

Продукты гидролиза белка – пептоны, аминокислоты и дру­гие азотосодержащие вещества – не опалесцируют.

Экспериментальной проверкой установлено, что нефелометрический метод с использованием сульфосалициловой кислоты отличается быстротой, высокой точностью, простотой и хорошей корреляцией с методом Кьельдаля.

Около 0,5 г исследуемой муки взвешивают с погрешностью ±0,001 и помещают в коническую колбу вместимостью 250—300 см3, снабженную пробкой. В колбу добавляют из бюретки 50 см 0,05 н. раствора гидроксида натрия. Закрытую пробкой колбу встряхивают на механическом встряхи­вателе в течение 15 мин. Затем вытяжку центрифугируют 10 мин при частоте вращения 6000 мин-1. 5 см3 прозрачного центрифугата пипеткой переносят в мерную колбу на 50 см3 и содержимое колбы доводят до метки сульфосалициловой кислотой.

При нефелометрическом анализе получение правильных ре­зультатов в значительной мере зависит от методики получения суспензии, в частности от порядка смешивания растворов, скоро­сти смешивания. Поэтому после добавления сульфосалициловой кислоты колбу быстро переворачивают 2—3 раза (не более), раствор наливают в кювету с толщиной слоя 5 мм и измеряют величину оптической плотности раствора при длине волны 550 нм. Замеры следует производить сразу после добавления кислоты, так как частицы белка быстро агрегируют.

Массовую долю белка определяют по калибровочной кривой

(рис. 3). Построение ее ведут так же, как и при биуретовом методе.

Запись в лабораторном журнале аналогична записи, данной к биуретовому методу. По полученным данным делают заключение.

Рис. 3. Калибровочная кривая (нефелометрический метод)

Метод основан на установлении разности показателей преломления исследуемого вещества и раствора, полученного после осаждения белков раствором хлористого кальция при кипячении.

Отмеривают пипеткой 5 мл исследуемого вещества (молока) в пробирку, добавляют 5-6 капель 4%-ного раствора хлористого кальция. Пробирку закрывают пробкой и помещают в баню с кипящей водой на

10 мин. Затем содержимое фильтруют через складчатый фильтр. В прозрачном фильтрате, а также в исходном молоке определяют на рефрактометре показатель преломления при 200С. Содержание белка в молоке (в %) рассчитывают по формуле

,

где а – содержание белка, %; – показатель преломления молока

при 200С; – показатель преломления фильтрата при 200С;

0,002045 – коэффициент, позволяющий выразить полученную разность показателей преломления, % от общего белка.

Метод формольного титрования

Сущность реакции формалина на белок заключается в том, что альдегидная группа формалина взаимодействует с аминогруппой белка, которая теряет свои основные свойства, в связи с чем кислые свойства белка усиливаются. Количество титруемых карбоксильных групп будет эквивалентно количеству связанных формальдегидом аминных групп.

Схематично эти реакции могут быть представлены в следующем виде:

Образующаяся в этой реакции метиленаминокислота является сильной кислотой. Процесс титрования этой является сильной кислотой. Процесс титрования этой кислоты щелочью протекает таким образом:

Отмеривают пипеткой 10 мл исследуемого молока и вносят его в коническую колбу вместимостью 100 мл, добавляют 10-12 капель 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина и титруют 0,1 н. раствором NaOH до слабо-розового окрашивания, не исчезающего при взбалтывании. После этого в колбу приливают из бюретки 2 мл 30-40%-ного раствора формалина, свежее нейтрализованного щелочью до слабо-розового окрашивания по фенолфталеину.

Содержимое колбы взбалтывают, молоко обесцвечивается, записывают показание бюретки и продолжают титрование до окраски жидкости, соответствующей окраске молока до прибавления формалина.

Показания бюретки вновь записывают и устанавливают количество миллилитров щелочи, пошедшее на второе титрование. Затем рассчитывают содержание белка в молоке.

V1 – количество 0,1 н. раствора NaOH, израсходованное до прибавления формалина, мл;

V2 – общее количество 0,1 н. раствора NaOH, израсходованное после прибавления формалина, мл;

(V2-V1) – количество 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на нейтрализацию карбоксильных групп, мл;

(V2-V1)·1,92 – общее количество белка в молоке, %;

(V2-V1)·1,51 – содержание казеина в молоке, %.

Примечание. 1,92 и 1,51 – экспериментально установленные коэффициенты для пересчета оттитрованных карбоксильных групп на процентное содержание белка в молоке.

СОДЕРЖАНИЕ И ОФОРМЛЕНИЕ ОТЧЕТА О РАБОТЕ

Отчет о лабораторной работе оформляется каждым студентом. Текст пишется темными чернилами, эскизы могут выполняться карандашом, графики результатов экспериментов строятся в масштабе.

Содержание отчета излагается в порядке, указанном в работе, и должно включать:

— название работы, цель работы, краткое содержание;

Законченные и оформленные отчеты студенты предъявляют преподавателю до начала выполнения следующей работы.

1. Каково значение белков для организма человека. Их классификация.

3. Каков принцип определения, белка по методу Кьельдаля и каковы его достоинства и недостатки?

4. В чем заключается принцип биуретового метода определения белка?

5. В чем заключается принцип нефелометрического метода определения белка?

6. В чем заключается принцип нефелометрического метода определения белка?

7. В чем заключается принцип рефрактометрического метода определения белка?

8. Методика определения белков в молоке методом формольного титрования.

1. Пищевая химия: Лабораторный практикум: учеб. пособие для вузов /

2. Лабораторный практикум по общей технологии пищевых производств / под ред. . М.: Агропромиздат,

3. Фалунина практикум по общей технологии пищевых продуктов / . М.: Пищевая промышленность, 19с.

4. Назаров технология пищевых производств /

. М.: Легкая и пищевая технология, 19с.

др.; под ред. . 4-е изд., исправ. и доп. СПб.: ГИОРД,

6. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / под ред. , . М.: Брандес, Медицина, 19с.

источник