Меню Рубрики

Анализ антител к основному белку миелина

Миелин – это многослойная мембрана, которая окружает нервные волокна центральной и периферической нервной системы и образуется из плазматической мембраны олигодендроцитов центральной нервной системы и леммоцитов периферической нервной системы. Антитела ( IgG , IgA и IgM ) к основному белку миелина наблюдаются у значительной части детей с расстройствами аутичного спектра. Положительный результат говорит об аутоиммунности. [14]

Расширенная вирусная/иммунологическая панель при расстройствах аутичного спектра

Работая с Аристо Вождани, к. м. н., директором лаборатории Immunosciences Lab ., я обнаружила, что следующие анализы могут помочь в оценке иммунной системы детей с расстройствами аутичного спектра и подборе эффективного лечения.

Главная панель исследований при аутизме[15]

— пептиды стрептококка, IgG (М5, М12, М19)
— антитела к глиадину ( IgG , IgM , IgA )
— антитела к казеину ( IgG , IgM , IgA )
— антитела к Hg -связывающему антигену (фибрилларину) ( IgG , IgM , IgA )
— антитела к дипептидилпептидазе ( DPP IV ) ( IgG , IgM , IgA )
— антитела к основному белку миелина ( IgG , IgM , IgA )
— антитела к анти-нейрофиламенту
— металлотионеин (клеточный уровень)
— активность НК-клеток
— антитела к кори ( IgG , IgM )
— иммуноглобулины ( IgG , IgM , IgA )
— вирусная панель #3:
вирус Варицелла-зостер ( IgG )
Цитомегаловирус ( IgG , IgM )
Вирус Эпштейна-Барра или VGA ( IgG , IgM )
Вирусы герпеса 1 и 2 типа ( IgG , IgM )
Вирус герпеса 6 типа ( IgG , IgM )

Стоимость $1544, 50% скидка за весь комплекс анализов = $772 при предварительной оплате (по состоянию на 03/2004). Необходимое количество крови: 2 желтых пробирки (обе вакуумные), 1 красная пробирка (вакуумная)

История болезни — Сьюзи

В 1998 году меня попросили заняться высокофункционирующей 16-летней аутичной девочкой, мать которой считала, что ее дочь, возможно, страдает от какого-то «вируса в мозге». Я сказала матери, что никогда раньше не лечила никого от «вирусов в мозге» и посоветовала обратиться к другому доктору в этом районе, который занимался иммунными расстройствами и вирусами как одной из причин аутизма, но она упорствовала. Я всегда буду благодарна этой матери, так же как и остальным дотошным родителям, которые вынудили меня читать и учиться, чтобы помочь их детям. Я вернулась к учебникам, исследованиям и некоторым новым источникам, таким как публикации и неформальные заметки Терезы Бинсток по патогенам, вирусам и аутоиммунности. Пока я готовилась работать со Сьюзи, я начала изучать всю возможную информацию по этой сложной проблеме.

Сьюзи была (и остается) симпатичной хрупкой девушкой, которой я на вид дала бы скорее 14 лет, чем 16 – ее возраст на тот момент. Ее мать, учитель/писатель, которая стала домохозяйкой после рождения Сьюзи, описала мне целую команду репетиторов, которые приходили ежедневно, включая выходные, а также прочие мероприятия и огромные усилия, которые она прикладывала годами, чтобы ее дочь училась в общеобразовательной школе. Хотя Сьюзи и соответствовала уровню своего класса, она, как первоклашка, прилагала огромные усилия, чтобы не расстроить родителей и учителей. При этом в социальном плане она была замкнутой, не имела друзей, молодые люди никогда не интересовались ей, хотя она была миловидна и обладала привлекательной, хотя и юношеской фигурой. Она казалась немного мечтательной и рассеянной, хотя довольно неплохо отвечала на вопросы по существу. У нее были странные пристрастия в еде – она годами отказывалась есть вместе со всеми и ограничивала себя всего лишь несколькими продуктами. Что касается ее истории болезни, ее мать сказала, что Сьюзи развивалась нормально примерно до четырех лет, когда она заболела краснухой, обычно легко и быстро протекающей детской болезнью, которая вызывается вирусом герпеса 6 типа и характеризуется сыпью. После болезни она стала вести себя по-другому и, хотя она не перестала говорить, казалось, что она учится не так хорошо, как другие дети в ее классе. Мать показала мне фотографии Сьюзи за все годы — на руках и ногам Сьюзи можно было заметить периодически появлявшуюся небольшую сыпь, похожую на короткие обострения краснухи. (Оказалось, что у нее была хроническая бессимптомная инфекция вируса герпеса 6 типа, которая периодически обострялась).

Я назначила стандартные анализы, которые все были в пределах нормы, ввела Сьюзи комплекс пищевых добавок (на что она согласилась) и предложила изменить рацион (на что ее было трудно уговорить). Гораздо легче посадить трех- или четырехлетних детей на БГБК-диету, чем подростка! Я консультировалась с доктором Ари Вождани, директором лаборатории Immunosciences в Беверли Хиллз, — он оказался еще одним человеком, который очень помог мне разобраться с вирусами и иммунной системой. Он порекомендовал мне сделать расширенную вирусную панель и анализ на цитотоксичность НК-клеток помимо общего анализа крови, биохимии и гормонов щитовидной железы, которые я уже назначила. Ее анализы показали положительный IgG (прошлое или хроническое инфицирование) и IgM (недавнее инфицирование или обострение) к вирусу герпеса 6 типа (краснуха). У нее также оказались слишком низкие показатели цитотоксичности НК-клеток, что означало, что в иммунной системе имелось нарушение первой линии защиты, которая борется с вирусами. Я была удивлена, но мать Сьюзи – нет. Она одна из многих умных матерей, которые встречались мне с тех пор, как я начала работать с «особыми» детьми.

Я уже ввела Сьюзи небольшую дозу SSRI , надеясь немного снять ее страх перед общением, и казалось, она стала чуть более коммуникабельной. Она уже несколько месяцев получала SSRI и комплекс питательных веществ, когда я ввела ей Ацикловир (антивирусный препарат, эффективный при многих вирусов герпеса и Варицелла-Зостер, и в разной степени эффективный при вирусе Эпштейна-Барра и вирусе герпеса 6 типа). Затем мы перешли на модификацию Ацикловира, Вальтрекс, который имеет другую степень усвоения и, по имеющимся данным, в 6 раз эффективнее. Я назначала Вальтрекс многим взрослым пациентам с герпесными инфекциями в течение многих лет и знала, что он очень безопасен.

Примерно через неделю или десять дней после начала Вальтрекса в Сьюзи произошли поразительные изменения. Ее глаза прояснились, она стала менее отрешенной, более сообразительной и в целом более эмоциональной, завела друзей. Казалось, как будто ее одноклассники никогда не видели ее раньше. В течение трех месяцев она стала нормальным непослушным подростком, что совершенно поразило ее родителей и удивило репетиторов, которые занимались с ней годами. Вскоре она стала протестовать против такого количества занятий и, несмотря на то, что большую часть из них отменили, она как обычно продолжала получать оценки В и С, что приятно удивило ее родителей. Впервые в жизни она начала привлекать внимание мальчиков и, как и все нормальные школьники, участвовать в обычных школьных интригах со своими радостями и несчастьями. У нее все еще оставались некоторые трудности в обучении, но положительные изменения во всех сферах ее жизни были очевидны для всех, кто знал ее до лечения. Ее родители были в восторге и благодарны за ее «возвращение». Интуитивные догадки матери, что у Сьюзи были проблемы медицинского характера, наконец были оправданы в глазах отца Сьюзи, врача, который видел причину поведения Сьюзи исключительно в ее низкой обучаемости, которую нужно было скорректировать при помощи дополнительных занятий (как они поступили и с ее старшей сестрой).

Сьюзи принимала SSRI всего несколько месяцев, а Вальтрекс (1500 мг в сутки) 18 месяцев; ее титры к вирусам снижались, тогда как количество НК-клеток увеличилось. Периодически в ходе лечения она принимала Transfer Factor и натуральное антивирусное средство Монолаурин (Лаурицидин). Даже после стабилизации показателей мать Сьюзи не хотела прекращать прием Вальтрекса несмотря на то, что Сьюзи ненавидела стандартные анализы крови, которые она сдавала для проверки состояния печени в ходе лечения (печень была в порядке). Наконец, к моменту окончания школы мы постепенно отменили все лекарства. Она также устала он необходимости принимать такое количество пищевых добавок, когда стала чувствовать лучше. Когда осенью прошлого года она уезжала сдавать экзамен в один частный художественный колледж, у нее все еще оставались несколько эксцентрические привычки в еде, но мы все примирились с этим. Несколько месяцев назад родители звонили мне и сообщили, что Сьюзи получала оценки «В» в колледже и постоянно встречалась с парнем, который нравился ее родителям. Я считаю, что диагноз «аутизм» больше неприменим к ней, хотя некоторые странности в еде все еще сохраняются. Что интересно, я считаю, что такие странные привычки в еде не очень отличаются от привычек многих девушек ее возраста, которых больше заботит стройность, чем правильное питание.

источник

Определение в крови аутоантител к антигенам миелина, используемое для диагностики, оценки прогноза и контроля лечения рассеянного склероза и других демиелинизирующих заболеваний центральной нервной системы.

Аутоантитела к антигенам миелина

Myelin specific autoantibodies

Непрямая реакция иммунофлюоресценции.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

  • Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Демиелинизирующие заболевания центральной нервной системы – это гетерогенная группа болезней, характеризующихся разрушением миелиновой оболочки (демиелинизацией) нервных волокон головного и спинного мозга. Наиболее ярким представителем этой группы заболеваний является рассеянный склероз. В настоящий момент демиелинизирующие заболевания рассматриваются как аутоиммунные заболевания, преимущественно опосредованные Т-клетками, однако в последнее время появляются новые данные и о роли гуморального ответа, опосредованного аутоантителами к антигенам ЦНС. Наиболее хорошо изучены антитела к антигенам миелина – белково-липидной оболочки аксонов нейронов. Определение в крови аутоантител к антигенам миелина может использоваться для диагностики, оценки прогноза и контроля лечения рассеянного склероза и других демиелинизирующих заболеваний ЦНС. Различают несколько вариантов антител к антигенам миелина:

1. Антитела к гликопротеину миелина олигодендроцитов (anti-myelin oligodendrocyte glycoprotein, Anti-MOG)

На долю белка под названием гликопротеин миелина олигодендроцитов (MOG) приходится всего лишь 0,05 % всех белков в составе миелина. MOG, однако, располагается во внешнем слое миелиновой оболочки, что делает его легкодоступным антигеном для атаки аутоантителами. В действительности MOG является мишенью как для гуморального, так и для клеточного аутоиммунного ответа. Физиологическая роль MOG до конца неясна, хотя, по-видимому, он необходим для «склеивания» миелиновых волокон. MOG также способен связывать C1q фрагмент комплемента и, таким образом, участвовать в регуляции классического пути активации комплемента. Показано, что антитела к MOG непосредственно приводят к демиелинизации, то есть обладают энцефалитогенными свойствами. Важно отметить, что антиген MGO имеет несколько конформаций, различающихся между собой по степени иммуногенности. Наиболее выраженную демиелинизацию вызывают антитела, направленные против гликозилированных эпитопов MGO.

Антитела к MGO обнаруживаются в крови и спинномозговой жидкости пациентов с рассеянным склерозом, но также могут быть выявлены и у здоровых людей. Интересно, что анти-MGO чаще обнаруживаются в случаях детского рассеянного склероза (у детей младше 10 лет).

Некоторыми исследованиями доказано, что уровень анти-MGO отражает активность рассеянного склероза и поэтому может быть использован для прогноза и контроля лечения заболевания. Также показано, что здоровые люди, в крови которых обнаруживаются анти-MGO, имеют несколько повышенный риск развития рассеянного склероза в будущем.

2. Антитела к основному белку миелина (anti-myelin basic protein, anti-MBP)

Основной белок миелина (MBP) – это один из главных компонентов внутреннего слоя миелиновой оболочки. Располагаясь внутри, MBP менее доступен для аутоантител при условии, что миелиновое волокно не повреждено. Антитела к MBP обнаруживаются в повышенной концентрации в крови и спинномозговой жидкости пациентов с рассеянным склерозом. В отличие от анти-MGO, анти-MBP не обладают энцефалитогенными свойствами и их роль в патогенезе рассеянного склероза не ясна. Некоторыми учеными показано, что анти-MBP в сочетании с анти-MGO могут быть использованы в качестве маркеров ранней трансформации клинического изолированного синдрома (КИС) в рассеянный склероз.

3. Антитела к миелин-ассоциированному гликопротеину (anti-myelin associated glycoprotein, anti-MAG)

На долю белка под названием миелин-ассоциированный гликопротеин (MAG) приходится около 3 % всех белков в составе миелина. Однако MAG, как и гликопротеин миелина олигодендроцитов MOG, располагается во внешнем слое миелиновой оболочки и поэтому доступен для аутоантител. Анти-MAG хорошо известен в качестве клинико-лабораторного маркера периферических нейропатий, связанных с моноклональными гаммапатиями и другими лимфопролиферативными заболеваниями. Показано, что эти аутоантитела также обнаруживаются у пациентов с рассеянным склерозом и могут быть связаны с прогрессированием этого заболевания.

4. Антитела к галактоцереброзидазе (anti-galactocerebrosidase, anti-Galc)

Галактоцереброзидаза (Galc) – это самый главный липидный компонент миелина, на долю которого приходится около 30 % миелина. Так же как и анти-MGO, анти-Galc способны непосредственно приводить к демиелинизации. Анти-Galc более характерны для ремитирующего-рецидивирующего варианта рассеянного склероза и не обнаруживаются у здоровых лиц. Так как анти-Galc нехарактерны для ранних стадий рассеянного склероза (клинически изолированный синдром) и чаще выявляются при прогрессировании заболевания, некоторыми учеными предложено использовать этот маркер для определения стадии заболевания.

5. Антитела к протеолипидному протеину (anti-proteolipid protein, anti-PLP)

Протеолипидный протеин (PLP) – еще один из основных компонентов миелина. Антитела к PLP обнаруживаются в повышенной концентрации в крови и спинномозговой жидкости пациентов с рассеянным склерозом.

6. Антитела к фосфатидилхолину (anti-phosphatidylcholine)

В составе олигоклональных иммуноглобулинов, определяемых в ликворе больных рассеянным склерозом, могут быть обнаружены специфические антитела класса IgM, избирательно взаимодействующие с фосфатидилхолином. Эти аутоантитела связаны с более агрессивным течением болезни и поэтому могут использоваться в качестве прогностического маркера.

Читайте также:  Качественный анализ белков и аминокислот

Следует еще раз подчеркнуть, что антитела к антигенам миелина неспецифичны для рассеянного склероза. Они также обнаруживаются и при некоторых других демиелинизирующих заболеваниях (например, при болезни Марбурга и остром диссеминированном энцефаломиелите) и в постинсультном состоянии. По этой причине их используют в качестве дополнительных клинико-лабораторных маркеров рассеянного склероза и других заболеваний центральной нервной системы.

Для чего используется исследование?

  • Для диагностики, прогноза и контроля лечения рассеянного склероза и других демиелинизирующих заболеваний центральной нервной системы.

Когда назначается исследование?

  • При наличии симптомов рассеянного склероза: нарушения зрения (помутнение, двоение в глазах), чувства слабости, онемения, покалывания в руках и ногах, нарушения равновесия, учащения мочеиспускания, особенно если симптомы носят перемежающий характер и наблюдаются у молодой женщины;
  • при получении неоднозначных результатов магнитно-резонансного исследования головного мозга (МРТ).

Титр: Что может влиять на результат?

  • Возраст: антитела к антигенам миелина более характерны для детского рассеянного склероза;
  • наличие сопутствующих заболеваний: антитела к антигенам миелина могут длительно обнаруживаться после инсульта.



  • Антитела к антигенам миелина являются неспецифичными маркерами рассеянного склероза и других демиелинизирующих заболеваний;
  • результаты анализа следует интерпретировать с учетом дополнительных клинических, лабораторных и инструментальных данных.
[13-058] Диагностика рассеянного склероза (изоэлектрофокусирование олигоклонального IgG в ликворе и сыворотке)

Кто назначает исследование?

Невролог, врач общей практики.

  • Lalive PH. Autoantibodies in inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Swiss Med Wkly. 2008 Nov 29;138(47-48):692-707. doi: /aop/smw-aop12283. Review.
  • Marie Cathrin Mayer, Edgar Meinl. Glycoproteins as targets of autoantibodies in CNS inflammation: MOG and more. Ther Adv Neurol Disord. 2012 May; 5(3): 147–159.
  • Mirshafiey A, Kianiaslani M. Autoantigens and autoantibodies in multiple sclerosis. Iran J Allergy Asthma Immunol. 2013 Aug 28;12(4):292-303.

источник

Основной белок миелина (получение моноклональных антител, разработка иммуноферментного анализа и клинико-лабораторное применение) Семенова Анна Вячеславовна

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Диссертация — 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

240 руб. | 75 грн. | 3,75 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Автореферат — 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Семенова Анна Вячеславовна. Основной белок миелина (получение моноклональных антител, разработка иммуноферментного анализа и клинико-лабораторное применение) : диссертация . кандидата медицинских наук : 03.00.04 / Семенова Анна Вячеславовна; [Место защиты: Научно-исследовательский институт физико-химической медицины].- Москва, 2002.- 133 с.: ил.

ГЛАВА 1. Обзор литературы. «Основной белок миелина диагностике демиелинизирумнциж процессов ЦВСИ

1.1. Структура и функции миелина 7

1.2. Основной белок миелина. Структура, функции, физико-химические свойства. 12

1.3. Биологическая роль ОБМ. 20

1.4. ОБМ в филогенезе и онтогенезе. 22

1.5. Клинико-диагностическое значение ОБМ 24

ГЛАВА 2 Материалы и методы

2.1. Характеристика изучаемого материала . З 3

2.2. Методы очистки антигенов 33

2.3. Получение антисывороток к ОБМ и их анализ. 36

2.4. Методы иммунохимического анализа. 37

2.5. Методы количественного определения белков. 39

2.6. Иммуноферментный анализ. 40

2.7. Иммунофлюоресцентный анализ 52

2.8. Общая клиническая характеристика обследованных детей. 53

ГЛАВА 3 Разработка способа получения обм и изучение его физико-химических свойств .

3.2. Изучение физико-химических свойств и химической характеристики ОБМ 74

ГЛАВА 4 Получение гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к обм .

4.1 Получение гибридом продуцирующих моноклональные анти-ОБМ- антитела . 77

4.2. Получение моноклональных анти-ОБМ-антител из асцитической 78

ГЛАВА 5 Иммуноферментный анализ обм в биологических жидкостях человека .

5 1. Разработка иммуноферментного анализа ОБМ в биологических жидкостях и экстрактах из тканей человека и животных 86

5.2. Разработка иммуноферментного анализа анти-ОБМ-АТ в биологических жидкостях человека и животных. 89

5.3. Результаты иммунохимического определения ОБМ и антител к нему в сыворотке крови детей с перинатальной патологией ЦНС. 92

ГЛАВА 6. Обсуждение полученных результатов. 104

Практические рекомендации 115

Основополагающие исследования, посвященные изучению структуры миелина, были выполнены в 70-80 годы прошлого века [37, 51, 59, 93, 104, 105, 114, 169, 183, 240, 247, 283]. Согласно этим работам, уникальная структура миелина формируется путем спирального обвития аксонов нейронов отростками миелинобразующих клеток [101]. В пределах серого вещества головного мозга определяется крайне незначительное количество миелина. Процесс миелинизации в центральной нервной системе (ЦНС) и периферической нервной системе (ПНС) в целом сходен, однако имеются некоторые различия. В миелинизации нервных проводников в ЦНС принимают участие олигодендроглиоциты, при этом каждый из них может образовывать сегменты миелиновой оболочки сорока и более аксонов[51] В пределах ПНС миелинизация происходит с участием шванновских клеток, при этом каждая миелинобразующая клетка имеет связь только с одним аксоном [107]. Сегменты миелина прерываются на всем протяжении аксона перехватами Ранвье, в области которых происходит непосредственное соприкосновение аксолеммы нервного волокна с внеклеточным пространством. Расстояния между такими перехватами в пределах ЦНС и ПНС различны и составляют 10,7 и 10,9 нм соответственно [101].

Отростки миелинобразующих клеток содержат небольшое количество цитоплазмы, включающей единичные митохондрии и значительное количество микротрубочек. В процессе обвития цитоплазма вытесняется из отростков в тело клетки, приводя к формированию дупликатуры плазматической мембраны. При этом происходит тесное соприкосновение внутренних поверхностей мембран, с образованием так называемой главной плотной линии (major dense line), толщиной 2-3 нм. Наружные поверхности мембраны также соприкасаются и образуют промежуточную линию

Для миелиновой оболочки ПНС в большей степени, чем для ЦНС характерно наличие так называемых насечек (щелей) Шмидта-Лантермана [107]. Они представляют собой участки, на которых цитоплазматические поверхности мембраны не соприкасаются между собой, образуя своеобразные «карманы» В них содержится цитоплазма и немногочисленные клеточные органеллы. Насечки Шмидта-Лантермана присутствуют в каждом слое миелина. Мембрана миелинобразующих клеток представляет собой бислой, образованный липидами и белками, однако количественный и качественный состав ее компонентов существенно отличается от других мембран. Миелиновая мембрана сильно насыщена водой и характеризуется высоким соотношением липид : белок. Липиды миелина составляют порядка 75-80% его сухой массы, на долю белков приходится всего 25-30%. Миелин спинного мозга имеет более высокое по сравнению с головным мозгом соотношение липид . белок [74, 101].

Среди липидов миелина большую часть (43%) составляют фосфолипиды; галакто-липиды и холестерин представлены приблизительно в равном соотношении — 29 и 28% соответственно [74]. Галактолипиды являются специфичными маркерами миелинобразующих клеток, в то время как фосфолипиды (плазмалоген, фосфатидилхолин, сфингомиелин, фосфатидил-серин и инозитфосфатиды), представлены и в других тканях [184].

С возрастом происходит изменение состава миелина [74]. Миелин взрослого человека содержит значительно большее количество галактолипидов и сниженное количество лецитина по сравнению с ранним возрастом. В целом в течение жизни происходит постепенное увеличение количества низкомолекулярных липидов и параллельное снижение содержания высокомолекулярных

В структуре миелиновой мембраны присутствует два вида белков — внутренние (intrinsic proteins) и внешлие (extrinsic proteins) Первые прочно связаны с мембраной, пронизывая ее насквозь, вторые связаны слабее и локализуются на поверхности [47]. Миелиновая мембрана представляет собой асимметричное образование, как по химическому составу, так и по электрическому заряду На ее внеклеточной поверхности располагаются углеводные остатки гликопротеинов и гликолипидов, при этом С-конец гликопротеинов находится на цитоплазматической стороне мембраны, тогда как полисахаридный остаток экспонирован на экстрацеллюлярной поверхности [37, 47, 101].

Основной функцией миелина является обеспечение быстрого проведения нервного импульса по тем аксонам, которые он окружает Мембраны клеток, формирующих миелин, плотно соприкасаются, что создает высокое сопротивление и малую электрическую емкость, обеспечивая, таким образом, эффективную изоляцию аксона и предотвращая продольное распространение импульса Миелин прерывается только в области перехватов Ранвье, расстояние между которыми может варьировать от 0,2 до 1 мм и более в крупных аксонах. В связи с тем, что ионные токи не могут проходить сквозь миелин, вход и выход ионов осуществляется лишь в области перехватов, где расположены кальциевые каналы. Это ведет к увеличению скорости проведения нервного импульса [51]. Известно, что в миелинизированном волокне она пропорционально его диаметру, тогда как в немиелини-зированном — квадратному корню из его диаметра. В целом, по миелинизированным волокнам импульс проводится приблизительно в SO раз быстрее, чем по немиелинизирован-ным [276].

Миелин представляет собой метаболически активную структуру, в которой постоянно происходит синтез и преобразование компонентов. Помимо передачи нервного импульса, он участвует в транспорте ионов, поддержании собственной структуры, питании того нервного волокна, которое он окружает, а также выполняет по отношению к нему структурообразующую и защитную функции [37, 74].

При исследовании синтеза миелина обычно измеряют активность вовлеченных ферментов (в условиях in vitro), а также отслеживают метаболизм меченых предшественников его компонентов in vivo и в клеточных и тканевых культурах [16, 32, 37]. Процесс миелинизации имеет характерные черты, общие для всех видов животных и человека. Он начинается в ПНС, переходя далее на спинной мозг Головной мозг подвергается миелинизации в последнюю очередь [51]. При этом, как в ЦНС, так и на периферии, остается значительное количество немиелинизированных волокон

У человека миелинизация начинается во втором триместре беременности и продолжается на протяжении взрослой жизни Миелинизация ЦНС, особенно переднего мозга, происходит наиболее интенсивно после рождения Процесс миелинизации начинается с быстрой пролиферации глии и ее дифференцировки с выстраиванием вдоль аксонов [48, 49, 111]. Интенсивность молекулярно-биологических и биохимических процессов, сопряженных с интенсивностью процесса миелинизации, отмечаемой на морфологическом уровне, проявляется, в частности, в интенсивности биосинтеза ДНК в клетках, образующих миелин Так, на гестационных сроках около 20-30 недель отмечается своеобразный «взрыв» экспрессии ДНК в олигодендроглиоцитах В период между 40-й неделей гестации и шестью месяцами постнатальной жизни содержание общей ДНК в переднем мозге возрастает вдвое; далее, от шести месяцев до двух лет постнатальной жизни, уровень ДНК в миелин-образующих клетках ЦНС повышается еще на 50 %, после чего биосинтез ДНК в глиальных клетках происходит уже относительно равномерно

Для приготовления экстракта использовали спинной мозг крупного рогатого скота, забор которого проводился в течение первых 12 часов после забоя Подобное ограничение связано с тем, что по истечении данного промежутка времени активация аутолитических процессов в тканях и клетках приводит к значительной деградации их структур, что критически отражается на состоянии выделяемого нами антигена. Спинной мозг отделяли от твердой и сосудистой оболочек, после чего гомогенизировали на гомогенизаторе «ЕТА0010» (Германия) при 10000 об/мин в дистиллированной воде. Объемное соотношение ткани спинного мозга и дистиллированной воды составляло 1 : 2. Полученный гомогенат использовался в дальнейшей работе. Делипидизация Начальные этапы экстракции ОБМ были связаны с процедурой делипидизации, которая осуществлялась путем троекратного суспендирования гомогената в хлороформ -зтанольной смеси (2 1) Каждый раз проводилось центрифугирование суспензии (5000 g в течение 20 минут) и сбор осадка, содержащего белковую фракцию. Осадок, собранный в результате последнего центрифугирования, суспендировали в ацетоне, охлажденном до -ь4С, а затем центрифугировали (5000 g, в течение 20 минут) с целью отделения белкового осадка от фракции липидов, содержащейся в супернатанте. Полученный осадок тщательно отмывали путем трех кратного ресуспендирования в 20 объемах дистиллированной воды с последующей фильтрацией через бумажный фильтр. Кислотная экстракция На следующем этапе работы проводили кислотную экстракцию ОБМ из делипиди-рованной белковой фракции, полученной на предыдущей стадии. Для этого отфильтрованный осадок суспендировали в дистиллированной воде (объемное соотношение осадок : дистиллированная вода -1:5). При постоянном перемешивании суспензии на магнитной мешалке по каплям добавляли IN HCL до рН 3,0. Суспензию инкубировали на мешалке в течение 60 минут Отделяли осадок центрифугированием при 6000 g в течение 40 минут. Собирали надосадочную фракцию, которую использовали в дальнейшей работе. Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография применялась нами как первый этап очистки белка. В качестве ионообменного носителя мы использовали катионообменник — СМ-52 целлюлозу («Whatman», England) Нами проводилась хроматография по Baumstark, предусматривающая выполнение процедуры в «объеме» Условия проведения работы подробно изложены в главе 3 Гидрофобная хроматография На следующем этапе очистки ОБМ применялась гидрофобная хроматография, основанная на взаимодействии гидрофобных группировок сорбента и соответствующего домена белка [199] В своей работе мы использовали фенил-сефарозу («Pharmacia Biotech», Sweden) Процедура выполнялась с помощью комплекта хроматографической аппаратуры фирмы «LKB», Sweden Условия проведения процедуры изложены в главе 3 Г ел ь-фил ьтрация Основные принципы метода были изложены J Porath и F Flodin в 1959 году [207]. Авторы впервые применили в своей работе сефадексы — гели, разработанные фирмой «Pharmacia Biotech» (Sweden) В своей работе мы применяли гель-фильтрацию как в препаративных, так и в аналитических целях. С помощью данного метода проводился окончательный этап очистки антигена, что дало возможность получения препарата высокой степени чистоты. На данном этапе работы нами также проводилось определение молекулярной массы выделенного ОБМ. В качестве носителя мы использовали Toyopearl HW-50 Fine («TSK», Japan). Калибровка колонки проводилась с помощью белковых стандартов фирмы «Sigma» (USA). Процедура выполнялась в колонке фирмы «LKB» (Sweden). Детекция ОБМ, элюированного с носителя проводилась иммунохимически. Условия проведения процедуры изложены в главе 3. Аффинном хроматография. Метод основан на избирательном взаимодействии белков, подлежащих фракционированию, со специфическими лигандами, иммобилизованными на носителе [8]. Иммуноаффинная хроматография нами проводилась для получения препаратов ан-ти-ОБМ-антител на следующих этапах — получения поликлональных анти-ОБМ-АТ из моноспецифических кроличьих АС; получения моноклональных анти-ОБМ-АТ из асцитической жидкости мышей. получения поликлональных анти-ОБМ-АТ из сыворотки больных рассеянным склерозом, забор которой проводился в стадии обострения. В качестве матрицы применяли активированную бромцианом сефарозу — CNBr-сефарозу 4В («Pharmacia Biotech», Sweden) ОБМ, выделенный согласно приведенному выше протоколу, «сшивали» с носителем по общеизвестной методике Weir D. [280], в модификации Чехонина В.П. [13], подробное изложение процедуры имобилизации приводится в главе 4. Работа, связанная с проведением аффинной хроматографии выполнялась нами с использованием комплекта хроматографической аппаратуры фирмы «LKB», Sweden. Условия ее проведения изложены в главе 4 Диск-электрофорез в полиакрилалшдном геле (ПААГ). Диск — электрофоретический анализ был разработана и детально описана Ornstem L. [201] и Davis В. J. [75]. В своей работе мы применяли аналитический вариант диск-электрофореза в 7,5 % ПААГ Данная методика использовалась нами для оценки степени чистоты препарата ОБМ, получаемого на различных этапах фракционирования. Для определения соответствующих белковых зон столбики геля извлекали из трубочек, фиксировали в течение 30 минут в 12,5 % трихлоруксусной кислоте, а затем окрашивали в 0,2 % растворе Кумасси R-250 в течение 12 часов Отмывку от избытка краски и хранение, полученных образцов проводили в 7 % уксусной кислоте. Для иммунохимической верификации белковые зоны иммунопроявляли. С этой целью столбики геля разрезали в поперечном направлении, получая фрагменты шириной 2 мм каждый. Элюцию белка осуществляли 100 мкл 0,5 М веронал-мединалового буфера, рН 8,6 при 8 С, в течение 24 часов. Иммунохимическая оценка выделенных фракций проводилась с помощью слитного иммуноэлектрофореза с анти-ОБМ-антителами. Диск — электрофорез в ПЛАТ с додецилсульфатом натрия (SDS). Метод был предложен и внедрен в лабораторную практику Shapiro А. и соавт. [235]. Достоинство метода заключается в возможности определения молекулярных масс белков путем электрофореза в ПААГ после их обработки SDS или (З-меркаптоэтанолом. По сравнению с гель-фильтрацией, метод имеет несомненное преимущество, состоящее в высокой точности оценки, особенно для молекул в диапазоне молекулярных масс от 103 до 10s Да. Метод является незаменимым при исследовании субъединичного состава белковых молекул.

Читайте также:  Качественный анализ белков и аминокислоты

Существование в настояи ий момент значительного количества способов выделения ОБМ из ткани головного и спинного мозга человека и животных обосновано необходимостью получения препарата, отвечающего различным требованиям, касающимся степени его чистоты, сохранности антигенных детерминант, иммуногенности и энцефалитогенно-сти [66, 71, 77, 81, 11, 197, 219] Известные способы получения рекомбинантных препаратов белка, а также определенных его фрагментов, обладающих необходимыми для исследователей свойствами [182], несомненно, являются наиболее совершенными с точки зрения качества препарата, применяемого в аналитических и прикладных аспектах Однако, являясь крайне дорогостоящими, они имеют весьма ограниченное применение В связи с этим, перед нами стояла задача выбора наиболее адекватного способа выделения ОБМ, который бы обеспечил максимальную степень очистки получаемого препарата при оптимизации его потерь и сохранении нативных свойств белка Особое требование, касающееся степени чистоты выделяемого препарата, было продиктовано целью нашей работы, заключающейся в разработке иммуноферментного метода анализа ОБМ в биологических жидкостях человека на основе моноклональных антител

Наиболее приемлемой, максимально отвечающей вышеуказанным требованиям, с нашей точки зрения, явился способ получения ОБМ, предложенный Deibler G.E. и соавт в 1972 году [81] В процессе очистки препарата ОБМ нами была проведена модификация способа [15], позволившая в наибольшей, на наш взгляд, степени обеспечить достижение поставленных перед нами задач

Для получения препарата ОБМ был использована ткань спинного мозга крупного рогатого скота, взятого не позднее 12 часов после забоя Ткань спинного мозга тщательно очищали от сосудистых оболочек, а затем гомогенизировали на гомогенизаторе ЕТА-0010 с дистилированной водой в объмном соотношении I I Схема получения ОБМ, применявшаяся нами представлена на рисунке 5 Переходя к подробному описанию способа выделения ОБМ, необходимо отметить, что все процедуры выполнялись нами в условиях постоянной температуры +4С, поддержание которой обеспечивалось термостатируемым шкафом Coollab («Pharmacia», Sweden Нами использовалась «жесткая» схема очистки ОБМ, подразумевающая тщательную делипидизацию исходного материала с целью получения препарата белка высокой степени чистоты. Подобное требование было продиктовано необходимостью создания тест — системы на основе моноклональных антител для детекции ОБМ в биологических жидко стях, которая бы обладала высокой специфичностью Для чего исходный гомогенат ткани спинного мозга суспендировали в 10 объемах хлороформ — этанольной смеси в течение 30 минут, при соотношении компонентов 2 1 соответственно. Полученную суспензию подвергали центрифугированию при 5000 g в течение 20 минут Собирали осадок, который повторно суспендировали, а затем центрифугировали при тех же условиях. Процедуру повторяли троекратно

Полученный в результате последнего центрифугирования осадок, собирали и суспендировали в течение 30 минут в 10 объемах охлажденного ацетона. После чего проводили центрифугирование при 5000 g в течение 20 минут Осадок собирали и проводили его отмывку путем суспендирования в 20 объемах дистиллированной воды с последующей вакуумной фильтрацией через бумажный фильтр Whatman УЬ 54 Кислотная экстракция

Полученный в результате отмывки осадок суспендировали в 5 объемах дистиллированной воды, после чего доводили рН суспензии до 3,0 путем капельного добавления 1 N НС1 при постоянном помешивании на магнитной мешалке С целью получения гомогенной суспензии выдерживали ее на магнитной мешалке в течение 60 минут Последующее центрифугирование проводили при 6000 g в течение 40 минут Супернатант собирали и использовали для дальнейшей работы Ионообменная хроматография

Ионообменную хроматографию проводили с использованием катионообменной целлюлозы СМ — 52 (Whatman. England) Нами применялся вариант хроматографии в «объеме» без формирования столба носителя в колонке, предложенный ранее Baumstark Носитель уравновешивали рабочим буфером, содержащим 2 М мочевины, 0,02 М NaCl, 0,02 М sodium glycinate, рН 11,2 Непосредственно перед проведением хроматографии элюат, полученный на предыдущей стадии выделения препарата, шщелачивали путем добавления 8 М мочевины в объеме 25 % элюата, после чего проводили его смешивание с носителем Количество используемого носителя соответствовало исходному объему взятого в работу гомогената ткани спинного мозга Смесь инкубировалась на роторной мешалке в течение 15 минут, в процессе чего происходило связывание молекул ОБМ с катионами ионообменника По истечении процесса инкубации, с целью элюции неосновных белков, доводили рН смеси до 11,6 путем медленного капельного добавления 1 N NaOH Вакуумную фильтрацию с использованием бумажного фильтра Whatman Уі 5V, проводили после выдерживания смеси в течение 5 минут на роторной мешалке Полученный в результате фильтрации осадок, ресуспендировали в двух объемах рабочего буфера, после чего фильтровали Процедуру повторяли дважды На следующем этапе проводили отмывку сорбента от мочевины путем суспендиро-вания его в четырех объемах дистиллированной воды с последующей фильтрацией. Отмытый от мочевины сорбент суспендировали в двух объемах дистиллированной воды, после чего доводили рН смеси до 2,5 путем капельного добавления 1 N НС1. Инкубировали смесь на роторной мешалке в течение 5 минут, затем фильтровали. Данная процедура способствует удалению с носителя основных примесных белков, а также продуктов распада ОБМ, которые могут образовываться при условии позднего (более 12 часов после забоя) забора исходного материала Незначительное количество ОБМ также способно подвергаться элюции с носителя на этом этапе Полученный в результате фильтрации осадок, суспендировали в трех объемах 0,1 N НС1, после чего инкубировали на роторной мешалке в течение 10 минут и подвергали повторной фильтрации, отбирая фильтрат Следует отметить, что последовательное проведение двух последних стадий очистки позволяет в значительной степени повысить чистоту препарата, однако потери ОМБ при этом также возрастают на 10-12 % Согласно использованному нами протоколу выделения препарата ОБМ из ткани спинного мозга крупного рогатого скота [81 ], данная схема очистки является адекватной для последующего использования его в иммунологических исследованиях Степень чистоты препарата, полученного в результате проведенных процедур, составила около 80%, что было показано при электрофоретическом исследовании в ПААГ В то эе время следует отметить, что степень чистоты полученного препарата не соответствовала требованиям, предъявляемым нами к препарату, используемому для разработки иммуноферментного анализа В связи с этим нами были проведены дополнительные этапы очистки — гидрофобная хроматография и гель-фильтрация Гидрофобная хроматография на фепи.і-сефароіе

Полученный нами препарат ОБМ был использован в цикле иммунизации мышей линии Balb/C, схема которой детально описана в главе 2 При обнаружении адекватного титра специфических анти-ОБМ-АТ в АС иммунизированных мышей, проводился забой животных и забор селезенки с целью проведения процедуры слияния

Слияние В-лимфоцитов с предварительно подготовленными плазмоцитомными клетками, наращивание которых проводили в жидкой культуральной среде, проводили в соответствии с методом, разработанной Kohler (Ї. и Milstem С [141] в некоторой нашей модификации [15]. Детальное описание использованного нами метода приведено выше Отбор клеток, обладающих свойствами как плазмоцитомных, так и лимфоидных предшественников, проводился посредством культивирования гибридом на селективных средах

Наращивание клонов гибридных клеток проводилось на полистирольных культу-ральных планшетах фирмы «Costar» (USA) Тестирование супернатантов из лунок проводили в случаях, когда клон состоял не менее чем из 150-200 клеток Отбор секретирующих клонов проводился с помощью иммуноферментного метода В качестве посадочного АГ использовали полученный нами препарат ОБМ в концентрации 10 мкг/мл В качестве вторых AT использовали коммерческий препарат конъюгата AT барана к иммуноглобулинам мыши, меченный пероксидазой хрена («Sigma». USA) Нами проводилось троекратное тестирование Отбирали клоны гибридных клеток, дававшие нарастание титра секреции специфических анти-ОБМ-АТ в динамике В дальнейшем секретирующие клоны рассеивали в лунки планшетов для культивирования с таким расчетом, чтобы добиться нахождения в каждой из них только одной гибридной клетки

Культивирование гибридом проводили под постоянным контролем их секретирую-щей способности методом иммуноферментного метода Для наращивания отбирали клоны, являющиеся потомками одной гибридной летки и обладающие наиболее устойчивой секрецией анти-ОБМ-антител Полученные гибридомы в количестве 10 клеток вводили интраперитонеально самкам мышей линии Balb/C, в возрасте 8 недель Необходимо отметить, что за 3 недели до этого животным интраперитонеально вводили 0,5 мл пристана (2,6,10,14-тетраме-тилпентадекан, «Sigma», USA) с целью подавления у них местного иммунного ответа. Остальные гибридные клетки замораживали по аликвотам 5 х 106 кл/мл и хранили в жидком азоте Через 2 недели после интраперитонеального введения гибридных клеток, проводили забор асцитической жидкости у животных, представляющий серозный или серозно-геморрагический выпот Объем полученной асцитической жидкости от одного животного в среднем составлял 10 — 15 мл После сбора асцитическую жидкость центрифугировали в течение 10 минут при 3000g, для отделения от клеток и фибрина Супернатант использовали в дальнейшем в процедуре иммуноаффинной хроматографии на CNBr-сефарозе для выделения моноклональных анти-ОБМ-антител

Приготовление иммуноадсорбента проводили по стандартной методике [13], согласно которой 10 г CNBr-сефарозы 4В («Pharmacia Fine Chemicals») замачивали в 500 мл 0,001М раствора НС1 в течение 20 минут при комнатной температуре, затем отмывали 2 л того же раствора на стеклянном фильтре После этого к активированному таким образом носителю, добавляли препарат ОБМ, предварительно отдиализованный против 0,1М Na-карбонатного буфера, содержащего 0,5М NaCl, рН 8,3 из расчета 5-Ю мг белка на 1мл геля (при этом учитывали, что 1 г сухого порошка носителя при набухании дает 3,5 мл геля) Полученную смесь инкубировали в течение 2 часов на роторной мешалке После чего синтезированный иммуноадсорбент отмывали от избытка белка 4 л 0,1М Na-карбонатного буфера, содержащего 0,5М NaCl, рН 8, Оставшиеся активными имидокарбонатные группы носителя блокировали путем 2 часовой инкубации иммуноадсорбента с 1М раствором глицина Избыток которого отмывали попеременно 0.1М Na- карбонатного буфера, содержащего 0,5М NaCl, рН 8,3 и 0, IM Na- ацетатным буфером, содержащим 0,5М NaCl, рН 4,0 Выделение моноклональных апти-ОБМ-АТ и асцитической .жидкости методом иммуноаффинной хроматографии.

Приготовленный таким образом иммуноадсорбент вносили в колонку 1,5 х 25,0 (LKB, Sweden) Носитель уравновешивали рабочим буфером Процедура проводилась при +4 С Через колонку пропускали 50,0 мл асцита, содержащего моноклональные AT к ОБМ со скоростью 4 мл/час Проток поддерживался перистальтическим насосом «Microperpex S» (LKB, Sweden) Рециркуляцию асцитической жидкости через имуноад-сорбционную колонку проводили в течение 12 часов После нанесения препарата специфических антител на носитель последний отмывали от несвязавшихся белков рабочим буфером со скоростью протока 20 мл/час до достижения оптической плотности раствора на выходе из колонки не более 0,02 Величину оптической плотности контролировали с по мощью проточного спектрофотометра «Uvicord Ш» (LKB, Sweden) при длине волны 280 нм.

Графическое изображение элюцнцнонного профиля моноклоиальных анти-ОБМ-АТ при иммуноаффинной хроматографии. После выхода каждой фракции немедленно проводили ее защелачивание сухим ТРИС до рН 7.0. Наличие моноклоиальных антител во фракциях дополнительно верифицировали иммунохимически путем иммунодиффузионного анализа образцов с коммерческим препаратом антител к иммуноглобулинам мыши («Dako», USA).

Собранные фракции, содержащие моноклональные анти-ОБМ-АТ диализовали против дистиллированной воды в течение 2 часов при комнатной температуре. После чего концентрировали методом ультрафильтрации на мембране ХМ-100A («Amicon», USA) до 2 мл. Отдиализованный препарат лиофилизировали и использовали в дальнейшем для разработки иммуноферментного анализа.

Иммунодиффузионный анализ препарата анти-ОБМ-антител, выделенных их асци-тической жидкости мышей с коммерческими препаратами антител к иммуноглобулинам мыши различных классов и подклассов («Dako», USA), позволил отнести полученный нами препарат анти-ОБМ антител к иммуноглобулинам класса G1. Молекулярная масса полученных антител определялась методами гель-фильтрации и диск-электрофореза в ПААГ с SDS с последующей иммунохимической верификацией. Молекулярная масса моноклоиальных анти-ОБМ-антител равнялась 160 ± 7,8 кДа.

Читайте также:  Конформационный анализ белков теория и приложения

источник

Введение. Несмотря на обособленность центральной нервной системы, она подвержена активному воздействию иммунных факторов. Цитокины, хемокины, факторы роста регулируют работу мозга, запуская сложные сигнальные каскады [2, 7, 8]. Широкий диапазон неврологических симптомов при аутоиммунных системных заболеваниях позволяет рассматривать их как модельные системы для изучения патогенетической роли иммунных механизмов поражения центральной и периферической нервной системы [6].

Потенциальными мишенями для аутоиммунной агрессии могут быть различные антигены нервной ткани, включая миелин, в том числе ассоциированный с гликопротеином, и его основной белок, ганглиозиды, белок ядер нейрональных клеток и другие. [4].

Патология нервной системы при ревматических заболеваниях (РЗ) нередко определяет прогноз, клиническую картину заболевания и качество жизни больных, а также требует обязательного сочетанного применения базисной противовоспалительной терапии, ангио- и нейропротекторов. При ревматоидном артрите (РА) наиболее угрожающие центральные неврологические осложнения в виде шейной миелопатии, гидроцефалии и вертебробазиллярной окклюзии с нарушением функции стволовых структур возникают в результате атлантоаксиального смещения артритически пораженного одноименного сустава, причем степень подвывиха атлантоосевых суставов более выражена у больных РА, получающих кортикостероиды [1].

Поражение нервной системы при РА проявляется и в виде периферической полинейропатии. У больных развиваются парестезии, чувство жжения в области нижних и верхних конечностей, снижается тактильная и болевая чувствительность, появляются двигательные расстройства. При активном течении РА иногда наблюдаются симптомы полиневрита с сильными болями в конечностях, чувствительными или двигательными нарушениями, атрофией мышц. Возможны нарушения вегетативной нервной системы, проявляющиеся гипер- или гипотермией, повышенным потоотделением, трофическими расстройствами.

Несмотря на достигнутые успехи в диагностике и лечении указанной патологии, задача своевременной постановки диагноза, назначения адекватной терапии и контроля за ее эффективностью часто бывает осложнена. Вариабельность клинической картины осложняет диагностику, что, в свою очередь, не позволяет выработать оптимальную терапевтическую тактику.

Как показали новейшие разработки, иммуноферментный метод анализа (ИФА) с использованием иммобилизированных магнитосорбентов (МС) на основе антигенов нуклеиновой, липидной и белковой природы в полной мере отвечает указанным требованиям. Неоспоримые преимущества метода заключаются в первую очередь в повышении стабильности иммобилизированного биополимера, а также возможности регенерировать сорбент, что ведет к значительному экономическому эффекту. Кроме того, иммобилизация биологически активных веществ в поверхностном слое гранулы создает высокую концентрацию антигена именно в реакционно-активной зоне, что повышает чувствительность твердофазных методов анализа. Включение магнитного материала в гранулы дает возможность ускорить и упростить манипуляции на всех этапах исследования, улучшая качественные характеристики определений и увеличивая число обрабатываемых проб. Указанные преимущества делают этот метод экономичным и легко применимым в практической медицине.

Антителообразование к антигенам нервной ткани при РЗ представляет собой малоизученную проблему. Выбор их не случаен.

Одним из механизмов возможно образование аутоантител и циркулирующих иммунных комплексов к этим структурам. Подобные механизмы играют роль в экспериментальном энцефаломиелите. В связи с этим нам кажется интересным изучение антителообразования к основным антигенам нервной ткани. Миелиновая оболочка — существенный элемент нервной ткани. Она окружает аксоны и дендриты периферической нервной системы, клеточные тела в нервных ганглиях, нервные волокна белого вещества центральной нервной системы.

Белки миелиновой оболочки — основной белок (30% от общего белка миелина) и протеолипидная белковая фракция (до 50%). Молекула основного белка состоит из одной цепи (170 аминокислотных остатков, последовательность установлена). Роль основного белка весьма существенна. Это следует из наблюдений над животными, у которых такой белок блокировали специфическими антителами или синтетическим октапептидом с совпадающей последовательностью аминокислот (в положении от 114 по 121). Блокада вызывает воспалительный процесс в мозге, демиелинизацию и паралич конечностей (экспериментальный аллергический энцефаломиелит). Протеолипидная белковая фракция представлена группой родственных молекул (от 12,5 до 35 кДа) и связанными с ними липидами (смесь равных количеств фосфоглицеридов и цереброзидов). Основной белок и протеолипиды представляют собой интегральные компоненты миелиновой мембраны.

В процессе работы нами были обнаружены данные о выявлении антител (АТ) к основному белку миелина (ОБМ) у 10 больных ревматоидным артритом [5], что не позволяет делать какие-либо значительные выводы по интересующей нас теме. В связи с вышеизложенным возникает вопрос, не являются ли антитела к основному белку миелина одним из пусковых механизмов развития неврологической симптоматики при ревматоидном артрите.

Целью исследования явилось усовершенствование иммунодиагностики неврологических проявлений РА с помощью иммобилизированных магнитоуправляемых сорбентов на основе основного белка миелина.

Материалы и методы. Исследовалась сыворотка 40 практически здоровых лиц (доноров областной станции переливания крови), 95 больных РА с поражениями нервной системы. Все больные были женского пола в возрасте от 17 до 45 лет (средний возраст составил 35 лет) и являлись пациентами ревматологических отделений ГУЗ ГКБ № 25 г. Волгограда и ГУЗ ГБ № 1 г. Волжского. Длительность заболевания составила от 6 месяцев до 25 лет. I степень активности выявлена у 13 пациентов; II степень активности — у 52, а III — у 8. Функциональная недостаточность суставов (ФНС) I — у 8 больных, ФНС II — у 66, а ФНС III — у 22. На 1-ом месте наблюдалась симптоматика со стороны периферической нервной системы. Так, мононейропатии были выявлены у 29 пациентов; полинейропатии — у 65; радикулопатии — у 80; цервикокраниалгии — у 51, а невралгии тройничного нерва — у 14 больных РА.

Антитела к ОБМ определяли иммуноферментным методом с использованием иммобилизированных магнитосорбентов [3]. Полученные значения выражали в единицах оптической плотности (е.о.п.) и считали положительными при превышении величин экстинции, найденных для здоровых лиц, более чем на 2σ и составили 0,069-0,012 е.о.п.

Обработка данных проводилась с использованием программного пакета STATISTICA FOR WINDOWS.

Результаты и обсуждение. При исследовании сывороток крови здоровых лиц уровень АТ к основному белку миелина составил 0,03±0,01 е.о.п. У больных РА повышенные уровни АТ к основному белку миелина при применении ELISA-теста с использованием иммобилизированных магнитосорбентов выявлены у 37 (38,9%) пациентов и составили 0,09 е.о.п. При этом во всех случаях исследуемые показатели прямо коррелировали со степенью активности заболевания (r=0,67, р=0,039). В связи с этим АТ к ОБМ можно рассматривать как своеобразный серологический маркер РЗ и использовать их в качестве дополнительных индикаторов тяжести патологического процесса.

Проведенные ранее исследования на животных показали, что блокада ОБМ специфическими антителами или синтетическим октапептидом с совпадающей последовательностью аминокислот (в положении от 114 по 121) вызывает воспалительный процесс в мозге, демиелинизацию и паралич конечностей (экспериментальный аллергический энцефаломиелит).

Была установлена связь между концентрацией АТ к ОБМ и некоторыми клиническими проявлениями указанного заболевания. Так, при РА максимальные АТ к ОБМ (табл. 1) выявлялись у пациентов с периферическим поражением нервной системы (мононейропатии и невралгии тройничного нерва). Данный факт подтверждает то, что антителообразование к ОБМ может являться одним из пусковых механизмов развития неврологической симптоматики при РА.

Различия концентрации антител к ОБМ у больных РА в зависимости от характера поражения периферической нервной системы.

источник

Таблица 59. Антитела к антигенам желудка и кишечника

Эли-Н-тест дает возможность выявить изменения в сывороточном белке содержания нейротропных антител, которые наблюдаются при травмах, инсультах, гипоксии мозга, отравлениях и других процессах, ведущих к нарушению функции нервной системы.

Этот метод выявляет отклонение содержания следующих антител:

– к белку S-100, который характеризует состояние серотониновых нейронов;

– к белку GFAP, регулирующему водно-электролитный баланс тканей мозга;

– к белку МР-55, регулирующему межклеточную адгезию;

– к белку нейроферментов – белка аксонов;

– к белку нейромедиаторов (глютамат, ГАМК, дофамин, серотонин).

Эли-ОБМ-тест выявляет изменения в содержании антител, которые взаимодействуют с основным белком миелина (табл. 60).

Таблица 60. Антитела к основному белку миелина

Повышение уровня a-антител к основному белку миелина возникает при нейропатии различного генеза, которая часто сопровождается повреждением миелиновой оболочки нервных волокон. Антимиелиновые процессы характерны для острого нарушения мозгового кровообращения. При рассеянном склерозе отмечается хронический активный демиелитизирующий процесс, который характеризуется постоянным повышением уровня a-антител к основному белку миелина, при обострениях характерны волнообразные изменения их содержания. Эли-СПР-тест – этот метод выявляет отклонения в продукции и содержании аутоантител, которые взаимодействуют с мембранными антигенами сперматозоидов при изменениях в предстательной железе и бесплодии (табл. 61).

Таблица 61. Аутоантитела к белкам сперматозоидов

Чаще всего антиспермальные антитела достигают высокого уровня при урогенитальных инфекциях как у мужчин, так и у женщин. Резкое повышение уровня антиспермальных антител является причиной мужского и женского бесплодия. В настоящее время факторы клеточного и гуморального иммунитета иммунологические лаборатории определяют с по мощью автоматизаторов. Аппарат «FACS Can» определяет факторы клеточного иммунитета, аппарат «Behring Neophelomeir 11» используется для исследования факторов гуморального иммунитета, аппарат «Uni CAP-100» выявляет многочисленные факторы аллергии.

Глава 4 Диагностическая значимость лабораторных тестов, используемых для оценки иммунного статуса

При развитии онкологических заболеваний снижение Т-лимфоцитов является плохим прогностическим признаком. Количество Т-лимфоцитов повышается в соответствии с уровнем выраженности воспалительного процесса. Снижение выраженности воспалительного процесса сопровождается нормализацией наличия Т-лимфоцитов.

Уровень В-лимфоцитов повышается в начале воспалительного процесса. В период разгара воспалительного процесса, когда увеличиваются лимфатические узлы, их содержание достигает максимального уровня. Этот показатель нормализуется при разрешении воспалительного процесса. При наличии воспалительного процесса в лимфоузлах повышение количества В-лимфоцитов свидетельствует о продолжении заболевания.

Исключение лимфолейкозов требует резкого повышения Т– и В-лимфоцитов.

Лабораторные показатели наличия регуляторных клеток Т-хелперов и Т-супрессоров имеют свои особенности.

Повышение уровня Т-хелперов и снижение Т-супрессоров происходит в начале воспалительного процесса. В период разгара воспалительного процесса регистрируется снижение содержания Т-хелперов и повышение Т-супрессоров. При разрешении воспалительного процесса происходит нормализация этих показателей.

Снижение Т-хелперов регистрируется при СПИДе, сепсисе, хронических вялотекущих воспалительных процессах.

Увеличение Т-хелперов и снижение Т-супрессоров регистрируется при аутоиммунных и аллергических заболеваниях.

Иммуноглобулины повышаются при коллагенозах, хроническом и вирусном гепатите, циррозе печени (иммуноглобулин G). Содержание иммуноглобулина класса Е регистрируется при аллергических заболеваниях.

Увеличение иммуноглобулина А регистрируется при воспалительных процессах на слизистых оболочках, их снижение является неблагоприятным прогностическим симптомом.

При повышении проницаемости стенок сосудов уровень JgG и JgA снижается. При первой встрече с антигеном прежде всего увеличивается количество JgM, а потом JgG. При вторичном контакте одновременно увеличивается содержание иммуноглобулинов классов G, M, A.

Комплементарная активность сыворотки регистрируется при любых воспалительных процессах, дефицит комплемента возникает при хронизации воспалительных процессов, снижение комплемента может отмечаться при анафилактических реакциях, шоке.

Снижение фагоцитарной активности возникает при аутоиммунных процессах, хронизации процесса.

При длительном влиянии иммунотропных факторов происходит изменение иммунитета:

I стадия – повышается уровень иммуноглобулина А;

II стадия – повышается содержание иммуноглобулинов всех классов;

III стадия – уровень иммуноглобулинов нормализуется или снижается, уменьшается содержание Т-хелперов, развивается вторичный иммунодефицит;

IV – снижается уровень всех классов гамма-глобулинов, G-, A-, M-, Т-хелперов.

Методы, выявляющие изменения в иммунной системе до клинических проявлений:

– определение числа лейкоцитов;

– определение числа лимфоцитов;

– определение Т– и В-лимфоцитов;

– определение регуляторных клеток;

– определение поглотительной способности нейтрофилов;

– определение содержания иммуноглобулинов G, A, M;

– определение уровня антител к тиреоглобулину;

– определение ревматоидного фактора.

По окончании иммунологического обследования результаты анализируют и получают следующие сведения:

– состояние иммунного статуса;

– уровень защитных сил организма;

– оценка прогноза заболевания.

Иммунологическое обследование рекомендуется проводить в динамике не менее 2–3 раз с интервалом в 5–7 суток. Иммунограмма является информативной лишь с учетом клинических проявлений заболевания.

Таблица 62. Пути и формы иммунного ответа (Solvay Pharma)

Примерная схема внеочередного донесения о поствакцинальных осложнениях

Диагноз: поствакцинальное осложнение на

Тяжелые аллергические осложнения со стороны нервной системы:

Лечебное учреждение (адрес):

Дата обращения за медицинской помощью:

Место работы (детское учреждение, школа):

Информация передана (должность, Ф.И.О., телефон):

Вариант схемы составления акта (В. К. Таточенко)

1. Наименование учреждения, адрес:

Место работы (детское учреждение):

Препарат получен в количестве:

Условия и температурный режим хранения (в области, городе, районе, месте применения):

4. Нарушение процедуры вакцинации:

– взятие вакцины из вскрытой ампулы;

5. Число лиц, привитых данной серией (в районе, области) или число использованных доз препарата:

6. Наличие у привитых реакций на вакцинацию:

7. Сведения о состоянии здоровья привитого

Кем осмотрен перед прививкой:

Температура перед вакцинацией:

Индивидуальные особенности (заболевания, недоношенность, травмы, предшествующее лечение кортикостероидами и др.):

Перенесенные заболевания (у детей с указанием даты и продолжительности болезни, в особенности предшествующего последнего заболевания):

Наличие заболеваний аллергического характера (реакции на продукты, медикаменты и др.):

Отмечаются, были ли судороги у ребенка, родителей и других родственников:

Проведенные ранее прививки с указанием даты, дозы и серии:

Имели ли место у ближайших родственников реакции на прививки, и какой характер они носили:

Другие данные (контакт с инфекционными больными, факторы перегревания, переохлаждения):

источник