Меню Рубрики

Нейтрализующие антитела к интерферону бета анализ

Лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1 фл.
активное вещество:
интерферон бета-1b 0,3 мг
(соответствует 9,6 млн МЕ)
вспомогательные вещества: альбумин человеческий; маннитол
В 1 мл приготовленного раствора содержится 0,25 мг (8 млн МЕ) рекомбинантного интерферона бета-1b
В 1 мл водного растворителя для приготовления раствора для инъекций содержится 5,4 мг натрия хлорида

Лиофилизат: лиофилизированная масса белого цвета.

Растворитель: прозрачный, свободный от частиц раствор.

Восстановленный раствор: раствор от слегка опалесцирующего до опалесцирующего, бесцветный или светло-желтого цвета.

Активное вещество препарата Бетаферон ® (интерферон бета-1b) обладает противовирусной и иммунорегулирующей активностью. Механизмы действия интерферона бета-1b при рассеянном склерозе окончательно не установлены. Однако известно, что биологический эффект интерферона бета-1b опосредуется его взаимодействием со специфическими рецепторами, которые обнаружены на поверхности клеток человека. Связывание интерферона бета-1b с этими рецепторами индуцирует экспрессию ряда веществ, которые рассматриваются в качестве медиаторов биологических эффектов интерферона бета-1b. Содержание некоторых из этих веществ определяли в сыворотке и фракциях клеток крови больных, получавших интерферон бета-1b. Интерферон бета-1b снижает связывающую способность и экспрессию рецепторов к гамма-интерферону, усиливает их распад. Кроме того, интерферон бета-1b повышает супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови.

После п/к введения в рекомендуемой дозе 0,25 мг концентрация интерферона бета-1b в крови низкая или вообще не определяется.

После п/к введения 0,5 мг Бетаферона ® здоровым добровольцам Cmax в плазме составляет около 40 МЕ/мл через 1–8 ч после инъекции. В этом исследовании абсолютная биодоступность Бетаферона ® при п/к введении — примерно 50%. При в/в применении клиренс и T 1/2 препарата из сыворотки — в среднем 30 мл/мин/кг и 5 ч соответственно.

Введение Бетаферона ® через день не приводит к повышению уровня препарата в плазме крови, его фармакокинетические параметры в течение курса терапии также не меняются.

При п/к применении Бетаферона ® в дозе 0,25 мг через день у здоровых добровольцев уровни маркеров биологического ответа (неоптерин, бета2-микроглобулин и иммуносупрессивный цитокин IL-10) значительно повышались по сравнению с исходными показателями через 6–12 ч после введения первой дозы препарата. Cmax достигалась через 40–124 ч и оставалась повышенной на протяжении 7-дневного (168 ч) периода исследования.

Как при ремиттирующем, так и при вторично-прогрессирующем рассеянном склерозе лечение Бетафероном ® снижает частоту (на 30%) и тяжесть клинических обострений болезни, число госпитализаций и потребность в лечении стероидами, а также удлиняет продолжительность ремиссии.

У больных с вторично-прогрессирующим рассеянным склерозом лечение Бетафероном ® позволяет задержать дальнейшее прогрессирование заболевания и наступление инвалидности, в т.ч. тяжелой (т.е. когда больные вынуждены постоянно пользоваться инвалидным креслом) на срок до 12 мес. Этот эффект наблюдается у больных как с обострениями заболевания, так и без обострений, а также с любым индексом инвалидизации (в исследовании участвовали пациенты с оценкой от 3,0 до 6,5 баллов по расширенной шкале инвалидизации EDSS).

Результаты МРТ головного мозга больных ремиттирующим и вторично-прогрессирующим рассеянным склерозом на фоне лечения Бетафероном ® подтверждают значительное положительное влияние препарата на тяжесть патологического процесса, а также значительное уменьшение образования новых активных очагов.

клинически изолированный синдром (КИС) (единственный клинический эпизод демиелинизации, позволяющий предположить рассеянный склероз, при условии исключения альтернативных диагнозов) с достаточной для назначения внутривенных кортикостероидов выраженностью воспалительного процесса — для замедления перехода в клинически достоверный рассеянный склероз (КДРС) у пациентов с высоким риском его развития. Общепринятого определения высокого риска нет. По данным исследования, к группе высокого риска развития КДРС относятся пациенты с моноочаговым КИС (клиническими проявлениями 1 очага в ЦНС) и ≥9 Т2-очагами на МРТ и/или накапливающим контрастное вещество очагами. Пациенты с многоочаговым КИС (клиническими проявлениями >1 очага в ЦНС) относятся к группе высокого риска развития КДРС независимо от количества очагов на МРТ;

ремиттирующий рассеянный склероз (РРС) — для уменьшения частоты и тяжести обострений у амбулаторных больных (т.е. пациентов, способных ходить без посторонней помощи) при наличии а анамнезе не менее 2 обострений за последние 2 года с последующим полным или неполным восстановлением неврологического дефицита;

вторично-прогрессирующий рассеянный склероз с активным течением заболевания, характеризующимся обострениями или выраженным ухудшением неврологических функций в течение последних двух лет — для уменьшения частоты и степени тяжести клинических обострений болезни, а также для замедления темпов прогрессирования заболевания.

гиперчувствительность к природному или рекомбинантному бета-интерферону или человеческому альбумину в анамнезе;

При следующих заболеваниях:

заболевания сердца, в частности сердечная недостаточность III–IV стадии (по классификации NYHA), кардиомиопатия;

депрессии и/или суицидальные мысли ( в т.ч. в анамнезе), эпилептические припадки в анамнезе;

анемия, тромбоцитопения, лейкопения;

возраст до 18 лет (в связи с отсутствием достаточного опыта применения).

Противопоказано при беременности. Однако неизвестно, способен ли Бетаферон ® вызывать повреждения плода при лечении беременных женщин или влиять на репродуктивную функцию человека. В контролируемых клинических исследованиях у больных рассеянным склерозом отмечались случаи самопроизвольного аборта. В исследованиях у макак резус человеческий интерферон бета-1b оказывал эмбриотоксическое действие и в более высоких дозах вызывал увеличение частоты абортов. Женщинам репродуктивного возраста во время лечения этим препаратом следует пользоваться адекватными методами контрацепции. В случае наступления беременности во время лечения Бетафероном ® или планировании беременности, следует рекомендовать прекращение лечения.

Неизвестно, экскретируется ли интерферон бета-1b с грудным молоком. Учитывая потенциальную возможность развития серьезных нежелательных реакций у младенцев, находящихся на грудном вскармливании, следует прекратить грудное вскармливание или отменить препарат.

Ниже перечислены нежелательные явления, наблюдавшиеся с частотой 2% и выше, чем в группе плацебо (неактивного препарата) у пациентов, которые в ходе клинических испытаний получали Бетаферон ® в дозе 0,25 мг или 0,16 мг/м 2 через день продолжительностью до трех лет.

Общие реакции: реакция в месте инъекции, астения (слабость), комплекс гриппоподобных симптомов, головная боль, повышение температуры тела, озноб, боль в животе, боль в груди, боль различной локализации, общее недомогание, некроз в месте инъекции.

Сердечно-сосудистая система: периферический отек, вазодилатация, заболевания периферических сосудов, гипертензия, сильное сердцебиение, тахикардия.

Пищеварительная система: тошнота, запор, диарея, диспептические явления.

Кровь и лимфатическая система: лимфоцитопения ( 3 ), нейтропения ( мм 3 ), лейкопения ( мм 3 ); лимфаденопатия.

Метаболические и алиментарные нарушения: повышение уровня ферментов в крови: ACT и АЛТ — в 5 раз от исходного. Увеличение массы тела.

Опорно-двигательная система: миастения, артралгия, миалгия, судороги в ногах.

Нервная система: гипертонус, головокружение, бессонница, нарушение координации, беспокойство, нервозность.

Дыхательная система: одышка.

Кожа: сыпь, кожные заболевания, повышенное потоотделение, алопеция.

Мочеполовая система: императивные позывы к мочеиспусканию, учащенное мочеиспускание, у женщин — метроррагия (ациклические кровотечения), меноррагия (длительные менструальные кровотечения), дисменорея (болезненные месячные), у мужчин — импотенция, заболевания предстательной железы.

Представленный ниже список побочных эффектов основан на наблюдении за применением Бетаферона ® после выхода на рынок.

Частота побочных эффектов классифицируется следующим образом: очень часто — ≥10%, часто — * . Частота этих симптомов со временем снижается. Редко — общее недомогание, боли в груди, снижение массы тела.

Местные реакции: очень часто — реакции в месте инъекции (гиперемия, локальный отек)*, воспаление*, боль*. Иногда — некроз кожи*.

Со временем при продолжении лечения частота реакций в месте введения препарата обычно снижается.

Кровь и лимфатическая система: иногда — анемия, тромбоцитопения, лейкопения. Редко — лимфаденопатия.

Эндокринные нарушения: редко — нарушения функции щитовидной железы, гипертиреоз, гипотиреоз.

Метаболические нарушения: редко — повышение уровня триглицеридов.

Нервная система: иногда — мышечный гипертонус, депрессия. Редко — судороги, спутанность сознания, возбуждение, эмоциональная лабильность, суицидальные попытки, анорексия.

Сердечно-сосудистая система: иногда — артериальная гипертензия. Редко — кардиомиопатия, тахикардия, сердцебиение.

Органы дыхания: редко — одышка, бронхоспазм.

Желудочно-кишечный тракт: иногда — тошнота и рвота. Редко — панкреатит.

Печень и желчевыводящие пути: иногда — повышение активности ACT, AЛT. Редко — повышение активности гамма-глютамилтранспептидазы, уровня билирубина, гепатит.

Кожа и подкожная клетчатка: иногда — алопеция, крапивница, зуд кожи, кожные высыпания. Редко — изменение цвета кожи, повышенная потливость.

Скелетная мускулатура: иногда — миалгии.

Женская репродуктивная система: редко — нарушения менструального цикла.

Аллергические реакции: редко — анафилактические реакции.

* — частота возникновения побочных явлений указана на основании данных клинических исследований.

Специальные исследования взаимодействия Бетаферона ® с другими препаратами не проводились.

Эффект применения Бетаферона ® в дозе 0,25 мг (8 млн ME) через день на метаболизм лекарственных средств у больных рассеянным склерозом неизвестен.

На фоне применения Бетаферона ® кортикостероиды и АКТГ , назначаемые на срок до 28 дней при лечении обострений, переносятся хорошо. Применение Бетаферона ® одновременно с другими иммуномодуляторами, помимо кортикостероидов или АКТГ , не изучалось.

Интерфероны снижают активность печеночных цитохром Р450-зависимых ферментов у человека и животных. Необходимо соблюдать осторожность при назначении в комбинации с препаратами, имеющими узкий терапевтический индекс, клиренс которых в значительной степени зависит от печеночной системы цитохрома Р450 (например противоэпилептические средства, антидепрессанты). Необходимо соблюдать осторожность при одновременном применении любых препаратов, влияющих на систему кроветворения.

Лечение Бетафероном ® следует начинать под наблюдением врача, имеющего опыт лечения рассеянного склероза.

В настоящее время остается нерешенным вопрос о продолжительности терапии Бетафероном ® . В клинических исследованиях длительность лечения у больных ремиттирующим и вторично-прогрессирующим рассеянным склерозом достигала 5 и 3 лет соответственно. Длительность курса определяется врачом.

Приготовление инъекционного раствора

А. Упаковка препарата, содержащая флаконы и предварительно наполненные шприцы: для растворения лиофилизиронанного порошка интерферона бета-lb для инъекций используют прилагаемые готовый шприц с растворителем и иглу.

Б. Упаковка препарата, содержащая флаконы, предварительно наполненные шприцы, адаптер для флакона с иглой и спиртовые салфетки: для растворения лиофилизированного порошка интерферона бета-lb для инъекций используют прилагаемые готовый шприц с растворителем и адаптер для флакона с иглой.

Во флакон с Бетафероном ® вводят 1,2 мл растворителя (раствор натрия хлорида 0,54%). Порошок должен раствориться полностью без встряхивания. Перед применением следует осмотреть готовый раствор, при наличии частиц или изменении цвета раствора его нельзя применять.

В 1 мл приготовленного раствора содержится рекомендуемая доза Бетаферона ® — 0,25 мг (8 млн. ME).

Если в положенное время укол не был сделан, то необходимо ввести препарат сразу же, как только представится возможность. Следующую инъекцию производят через 48 ч.

При введении Бетаферона ® в/в в дозе до 5,5 мг (176 млн МЕ) 3 раза в неделю взрослым пациентам с онкологическими заболеваниями не было выявлено серьезных нежелательных явлений.

Бетаферон ® содержит человеческий альбумин, поэтому существует весьма незначительный риск передачи вирусных заболеваний. Теоретический риск передачи болезни Крейтцфельдта-Якоба также считается крайне маловероятным.

Изменения лабораторных показателей. Кроме стандартных лабораторных анализов, назначаемых при ведении пациентов с рассеянным склерозом, перед началом терапии Бетафероном ® , а также регулярно во время проведения лечения рекомендуется проводить развернутый анализ крови, включая определение лейкоцитарной формулы, числа тромбоцитов и биохимического анализа крови, а также проверять функцию печени (например активность ACT, AЛT и ГГТП). При ведении пациентов с анемией, тромбоцитопенией, лейкопенией (одиночной или комбинированной) может потребоваться более тщательный мониторинг развернутого анализа крови, включая определение количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и лейкоцитарной формулы.

Желудочно-кишечные нарушения. В редких случаях на фоне применения Бетаферона ® наблюдалось развитие панкреатита, в большинстве случаев связанное с наличием гипертриглицеридемии.

Нарушения функции печени и желчевыводящих путей. Клинические исследования показали, что терапия Бетафероном ® часто может приводить к бессимптомному повышению печеночных трансаминаз, которое в большинстве случаев выражено незначительно и носит преходящий характер.

Как и при лечении другими бета-интерферонами, тяжелые поражения печени (включая печеночную недостаточность) при применении Бетаферона ® наблюдаются редко. Наиболее тяжелые случаи отмечались у пациентов, подвергшихся воздействию гепатотоксичных лекарственных препаратов или веществ, а также при некоторых сопутствующих заболеваниях (например злокачественные заболевания с метастазированием, тяжелые инфекции и сепсис, злоупотребление алкоголем).

При лечении Бетафероном ® необходимо осуществлять мониторинг функции печени (включая оценку клинической картины). Повышение уровня трансаминаз в сыворотке крови требует тщательного наблюдения и обследования. При значительном повышении трансаминаз в сыворотке крови или появлении признаков поражения печени (например желтухи) следует отменить препарат. При отсутствии клинических признаков поражения печени или после нормализации уровня печеночных ферментов возможно возобновление терапии Бетафероном ® с наблюдением за функцией печени.

Эндокринные нарушения. Пациентам с дисфункцией щитовидной железы рекомендуется проверять функцию щитовидной железы (гормоны щитовидной железы, ТТГ) регулярно, а в остальных случаях — по клиническим показаниям.

Заболевания сердечно-сосудистой системы. Бетаферон ® необходимо применять с осторожностыо у больных с заболеваниями сердца, в частности при сердечной недостаточности III–IV стадии по классификации NYHA , поскольку такие пациенты не были включены в клинические исследования.

Если на фоне лечения Бетафероном ® развивается кардиомиопатия и предполагается, что это связано с применением препарата, то лечение Бетафероном ® следует прекратить.

Заболевания нервной системы. Больных необходимо информировать о том, что побочным эффектом Бетаферона ® могут быть депрессия и суицидальные мысли, при появлении которых следует немедленно обратиться к врачу.

В двух контролируемых клинических исследованиях с участием 1657 пациентов с вторично-прогрессирующим рассеянным склерозом не было выявлено достоверных различий частоты развития депрессии и суицидальных мыслей при применении Бетаферона ® или плацебо. Тем не менее, следует проявлять осторожность при назначении Бетаферона ® больным с депрессивными расстройствами и суицидальными мыслями в анамнезе. При возникновении подобных явлений на фоне лечения, следует рассмотреть вопрос о целесообразности отмены Бетаферона ® .

Бетаферон ® необходимо применять с осторожностыо у больных с эпилептическими припадками в анамнезе.

Общие нарушения и состояние места инъекции. Могут наблюдаться серьезные аллергические реакции (редкие, но проявляющиеся в острой и тяжелой форме, такие как бронхоспазм, анафилаксия и крапивница).

При появлении признаков повреждения целостности кожи (например истечения жидкости из места инъекции) пациенту следует обратиться к врачу прежде, чем он продолжит выполнение инъекций Бетаферона ® .

У пациентов, получавших Бетаферон ® , наблюдались случаи некроза в месте инъекции (см. «Побочные эффекты»). Некроз может быть обширным и распространяться на мышечные фасции, а также жировую ткань и, как следствие, приводить к образованию шрамов. В некоторых случаях требуется удаление омертвевших участков или, реже, пересадка кожи. Процесс заживления при этом может занимать до 6 мес.

При появлении множественных очагов некроза лечение Бетафероном ® следует прекратить до полного заживления поврежденных участков. При наличии одного очага, если некроз не слишком обширен, использование Бетаферона ® может быть продолжено, поскольку у некоторых пациентов заживление омертвевшего участка в месте инъекции происходило на фоне применения Бетаферона ® .

С целью снижения риска развития реакции и некроза в месте инъекции, больным следует рекомендовать:

— проводить инъекции, строго соблюдая правила асептики;

— каждый раз менять место инъекции;

— вводить препарат строго подкожно.

Периодически следует контролировать правильность выполнения самостоятельных инъекций, особенно при появлении местных реакций.

Нейтрализующие антитела. Как и при лечении любыми другими препаратами с содержанием белка, при применении Бетаферона ® существует возможность образования антител. В ряде контролируемых клинических исследований производился анализ сыворотки крови каждые 3 мес для выявления развития антител к Бетаферону ® . В этих исследованиях было показано, что нейтрализующие антитела к интерферону бета-lb развивались у 23–41% пациентов, что подтверждалось как минимум двумя последующими позитивными результатами лабораторных тестов. У 43–55% из этих пациентов в последующих лабораторных исследованиях было выявлено стабильное отсутствие антител к интерферону бета-1b.

Не было доказано, что наличие нейтрализующих антител сколько-нибудь значительно влияет на клинические результаты, включая данные МРТ . С развитием нейтрализующей активности не связывалось появление каких-либо побочных реакций.

Решение о продолжении или прекращении терапии должно основываться на показателях клинической активности заболевания, а не на статусе нейтрализующей активности.

Читайте также:  Сдать анализы антитела к кардиолипину

Иммунные нарушения. Применение цитокинов у больных с моноклональной гаммапатией иногда сопровождалось системным повышением проницаемости капилляров с развитием шока и летальным исходом.

Применение у детей. Систематического изучения эффективности и безопасности Бетаферона ® у детей и подростков до 18 лет не проводилось.

Влияние на способность управлять автомобилем и работать с механизмами Специальные исследования не проводились. Нежелательные явления со стороны ЦНС могут влиять на способность управлять автомобилем и работать с механизмами, В связи с этим необходимо соблюдать осторожность при занятии потенциально опасными видами деятельности, требующими повышенного внимания.

Порошок лиофилизированный для приготовления раствора для инъекций. Во флаконах, в комплекте с растворителем в шприцах или флаконах со спиртовыми салфетками или без них; в коробке 5 или 15 комплектов.

источник

Контролированное по плацебо рандомизированное исследование по применению интерферона бета-1 b в лечении второй, прогрессирующей фазы рассеянного склероза

Опубликовано в журнале:
Международный Медицинский Журнал »» 4 / 2000 Европейская исследовательская группа по применению интерферона бета-1b в лечении второй, прогрессирующей фазы рассеянного склероза под руководством Людвига Каппоса

Отделение невропатологии, Университетская больница Базеля, Базель, Швейцария

Обоснование исследования. Благоприятное действие интерферона бета наблюдалось ранее только у пациентов в фазе чередования ремиссий и обострений рассеянного склероза (PC). Но до сих пор не оценивалась роль этого препарата при второй, прогрессирующей фазе данного заболевания (ВП-РС), эффективного лекарственного лечения которой до сих пор разработано не было.

Методы. В настоящем многоцентровом, с двойным сокрытием информации, контролированном по плацебо исследовании амбулаторные больные с баллом 3,0-6,5 по Расширенной шкале статуса инвалидности (Extended Disability Status Scale — EDSS) получали либо 8 млн. ME (IV) интерферона бета-1b подкожно через день, либо плацебо сроком до 3 лет. Эффективность лечения оценивалась, главным образом, по сроку до подтвержденного усугубления инвалидности величиной в 1,0 EDSS, которое сохранялось в течение 3 месяцев, либо величиной в 0,5 балла, если исходно EDSS составляла 6,0-6,5. Заранее запланированный промежуточный анализ безопасности и эффективности в популяции, получавшей лечение, был проведен после того, как все пациенты уже участвовали в исследовании, по крайней мере, 2 года.

Результаты. 358 больных с ВП-РС были распределены на получение плацебо, а 360 — на прием интерферона бета-1b; 57 пациентов (31 из группы плацебо и 26 из группы, получавшей интерферон бета-1b) были потеряны из наблюдения. Выявлено в высокой степени достоверное различие в пользу интерферона бета-1b по сроку до наступления подтвержденного усугубления инвалидности (р=0,0008). Интерферон бета-1b задерживал прогрессирование на 9-12 месяцев в период исследования 2-3 года. Соотношение различия для подтвержденного прогрессирования составило 0,65 (95% доверительный интервал 0,52-0,83). Этот благоприятный эффект наблюдался как при повторных рецидивах, так и при неуклонном прогрессировании заболевания без рецидивов. Положительные результаты были получены и судя по времени до прикованности к креслу-каталке, а также в отношении частоты и тяжести рецидивов, числа курсов стероидов, числа госпитализаций и данных магнитно-резонансной томографии. Применение препарата было безопасным, характер и частота побочных действий соответствовали предшествующему опыту с интерфероном бета-1b. Исследование было прекращено после того, как промежуточные результаты позволили ясно судить об эффективности.

Выводы. Терапия интерфероном бета-1b задерживает прогрессирование у больных с ВП-РС. Этот препарат представляет собой первое средство, оказывающее терапевтический эффект при ВП-РС.

Введение в 1993 году интерферона бета-1b в схемы лечения рассеянного склероза (PC) явилось значительным шагом вперед в помощи таким больным [I]. Имеется 3 препарата, содержащих интерферон бета, и испытания III фазы каждого из них показали снижение частоты рецидивов на 18-34% у больных с PC в фазе чередований рецидивов и ремиссий [1-3]. Такое уменьшение активности заболевания сопровождалось поразительным влиянием на патологические изменения, выявляемые при магнитно-резонансной томографии (МРТ), в особенности, на развитие новых участков поражения, накапливающих контрастное вещество.

У больных с PC и у их врачей большую озабоченность вызывает усугубление инвалидности, когда наступает вторая, прогрессирующая (ВП-РС) фаза заболевания. При ВП-РС беспомощность пациента становится доминирующим фактором, который определяет уровень и стоимость необходимого ухода [4]. Результаты трех исследований [1-3] указывают на то, что интерферон (3 задерживает усугубление инвалидности, но на основании их данных трудно достоверно судить об этом эффекте. Дело в том, что больные в этих работах были в ранней стадии заболевания с очень слабой степенью инвалидности или вообще без нее, что отражалось в низких баллах по Расширенной шкале статуса инвалидности (Extended Disability Status Scale — EDSS). При этом было маловероятно, что у этих больных инвалидность начнет нарастать в ближайшие 2-3 года. У пациентов с самыми низкими показателями EDSS (0-3,0), скорее, отражала легкие функциональные нарушения, а не инвалидность [5, 6]. В единственной работе, в которой срок до развития стойких изменений в EDSS использовался как главный показатель исхода, больные в начале исследования имели только самые низкие баллы EDSS, и длительность этой работы была минимальной.

Инвалидность при PC обусловлена двумя различными, хотя во многих случаях действующими одновременно механизмами: когда рецидив не проходит полностью (неполная ремиссия), или когда болезнь исподволь неуклонно прогрессирует. Эти механизмы, возможно, имеют в своей основе различные патоморфологические изменения [7]. При чередовании рецидивов и ремиссий неполное восстановление после рецидива — единственная причина нарастающей беспомощности пациента, в то время как у больных с вторичным прогрессирующим PC инвалидизация обусловлена как рецидивами, так и неуклонным, постепенным прогрессированием.

В 1994 году мы начали контролированное по плацебо, многоцентровое, европейское исследование для изучения эффекта интерферона бета-1b на прогрессирование заболевания у больных с ВП-РС [8]. Главные клинические результаты, полученные при промежуточном анализе, представлены в настоящей статье.

Методы Организация исследования

Настоящая работа — это европейское, многоцентровое, двойное-слепое, контролированное по плацебо исследование двух групп больных с ВП-РС, получающих лечение параллельно (одновременно). Предполагалось, что данное исследование будет состоять из 36-месячного периода терапии с последующим наблюдением без лечения в течение 3 месяцев. Посещения больных планировались в 1, 3, 5 и 15 дни 1-3 месяцев, а затем каждые 3 месяца до месяца 36 (то есть, до конца лечения), и еще раз — на 39 месяце (то есть, в конце периода наблюдения без лечения). Больные посещали врачей и вне этого графика — при возникновении рецидивов и других, не связанных с PC заболеваний, при этом диагнозы и проводимое лечение документировались. За пациентами наблюдали путем регулярных обследований до конца настоящей работы, за исключением тех больных, которые решали больше не участвовать в ней, или если связь с ними терялась по другим причинам.

Это исследование координировалось управляющим комитетом исследователей и представителей спонсоров. На протяжении всего времени проведения работы от них скрывались получаемые результаты. Обработка данных и весь статистический анализ производился во внешнем учреждении. Независимый консультативный комитет изучил результаты промежуточного анализа безопасности, который провели после того, как все пациенты уже участвовали в данном исследовании, по крайней мере, в течение 24 месяца.

Пациенты и лечение

Амбулаторные больные, подходящие для рандомизации, имели клинически или лабораторно подтвержденный диагноз PC [9]. Под вторичным прогрессированием подразумевали период ухудшения, независимого от рецидивов, который сохранялся, по крайней мере, в течение 6 месяцев, и следовал за периодом чередования рецидивов и ремиссий. Допускалось возникновение на этом фоне дополнительных рецидивов [10]. Возраст больных составлял 18-55 лет. Исходный балл EDSS колебался от 3,0 до 6,5 включительно. При этом у них за предшествующие 2 года были зарегистрированы либо ≥ 2 рецидивов, либо повышение балла EDSS на ≥ 1,0. Лечение иммунодепрессантами или иммуномодуляторами и другая мнимая терапия по поводу PC не позволялись в течение определенного времени до вступления в исследование. Полностью критерии включения больных в настоящую работу были опубликованы ранее [8]. Пациенты давали письменное согласие после соответствующего разъяснения.

По центральной схеме рандомизации назначали плацебо или интерферон бета-1b группам больных по 6 человек в соотношении 1/1. Согласно протоколу исследования, доступ к шифру был строго ограничен. Подкожно вводили через день 0,5 мл. интерферона бета-1b (4 млн. ME) или плацебо в течение первых 2 недель, с последующим повышением разовой дозы до 1,0 мл. (8 млн. ME интерферона бета-1b или плацебо). Интерферон бета-1b было невозможно отличить от плацебо. Лечение должно было прекращаться при неприемлемых побочных эффектах или при значительных отклонениях лабораторных показателей, при беременности, использовании запрещенных врачом медикаментов, или если шифр предавался огласке.

При появлении симптомов, сходных с таковыми при гриппе, а также при повышенной чувствительности больного к лихорадке назначались нестероидные противовоспалительные препараты или парацетамол. Системные стероиды применялись по стандартной схеме (1г. метилпреднизолона внутривенно в течение 3 дней с последующим оральным приемом преднизона, либо преднизолона с постепенным понижением дозы или без такого понижения), причем лечение этими препаратами проводилось только при рецидивах. За каждый год участия в исследовании пациент получал не более 3 курсов терапии стероидами.

Эффективность оценки и сокрытие информации

Подсчет баллов функциональных систем и EDSS проводился так, как было описано Kurtzke [5]. Эти баллы отражали работу отдельных неврологических систем: зрительной, пирамидальной, мозжечковой, стволовой, чувствительной, систем управления кишечником и мочевым пузырем, системы коры головного мозга (психической) и других. EDSS предусматривает оценку по 20 оценкам-баллам — от 0 (норма) до 10 (смерть от PC), при этом баллы считаются так: 0, 1 и далее баллы возрастают на 0,5 (1,5, 2,0 и т. д.) вплоть до 10; они основаны на сочетании оценки функциональных систем в баллах, а также на степени независимости больного при передвижении и в быту. Расплывчатость определений в первоначальных публикациях об этих системах привела к тому, что разные лица, проводившие оценку, давали разные результаты [II]. Поэтому врачи, вычислявшие EDSS в настоящем исследовании, прошли обучение в главном методическом центре по EDSS. Это обеспечило стандартные подходы в оценке отдельных функциональных систем, дальности передвижения и баллов EDSS [12].

Для более надежного обеспечения одинаковых подходов к оценке EDSS методический центр по EDSS проводил обучение специалистов до начала исследования и ежегодно во время него; им предоставляли видеопленки, учебники и пособия. Те специалисты, которые впервые приступали к оценке уже во время осуществления настоящей работы, обязательно сначала проходили подготовку в указанном методическом центре. Когда было возможно, один и тот же специалист, оценивающий EDSS, проводил все заранее определенные неврологические тесты у данного больного в течение всего срока настоящего исследования.

Чтобы избежать того, чтобы информация о характере лечения раскрывалась бы из-за весьма характерных побочных эффектов интерферона бета-1b [1, 2], назначаемые лечащие врачи отвечали только за общий медицинский уход, оценку безопасности лечения и за терапию рецидивов. В то же время, врачи, оценивающие EDSS осуществляли стандартизованные неврологические тесты; они не получали никакой потенциально раскрывающей информации от лечащих врачей; им позволяли разговаривать с больным только в той мере, насколько это было необходимо для проведения неврологических тестов. Во время оценки EDSS все возможные места инъекций были закрыты. Врачи, определявшие балл EDSS, отдельно хранили документацию по неврологическому обследованию, по баллам функциональных систем и по EDSS.

Для выяснения, насколько успешным было сокрытие информации, в конце исследования лечащих врачей, а также специалистов, оценивавших EDSS, и больных просили ответить на специальный вопросник.

Инвалидность

Главным критерием оценки служило время от начала исследования до первого запланированного ежеквартального посещения, при котором фиксировалось повышение EDSS, по крайней мере, на 1,0 (или на 0,5 при исходном EDSS 6,0-6,5), при условии, что такое повышение подтверждалось и при следующем запланированном посещении 3 месяца спустя (по крайней мере, через 70 дней). Посещение на 33 месяце было последним, после которого можно было получить подтверждение (на 36 месяце). Баллы EDSS, записанные во время рецидива, подтвержденного врачом-исследователем, рассматривались как ценные лишь в тех случаях, когда они были собраны после 90-го дня текущего рецидива.

Другим, связанным с EDSS показателем был срок, который проходил до прикованности больного к креслу-каталке (а именно, до достижения балла EDSS ≥ 7,0). Для этого критерия не требовалось подтверждения, поскольку ожидалось, что число больных при исходном EDSS £6,0, у которых EDSS достигнет ≥ 7,0, окажется гораздо меньше, и что это состояние будет происходить гораздо позднее, чем наступление ухудшения в EDSS, являвшегося главным критерием. Дополнительными показателями являлись: доля больных с подтвержденным прогрессированием, доля больных, которые становились прикованными к креслу-каталке, и балл EDSS при завершающем обследовании.

Показатели, связанные с рецидивами

Под рецидивом понимали острое или подострое возникновение, либо повторное возникновение неврологического нарушения, непосредственно перед которым в течение 30 дней неврологическое состояние не изменялось, улучшалось или медленно ухудшалось. Диагноз «рецидив» ставился, только если ухудшение держалось не менее 24 часов, при этом у больного должны были отсутствовать лихорадка и прочие признаки инфекции. Такой диагноз был правомочен только в то время, когда больному не проводили отмены стероидного препарата. Больных просили обращаться в центр по проведению исследования при возникновении любого симптома, подозрительного на рецидив. Лечащий врач проводил оценку рецидива, в том числе, записывал дату его начала, симптомы и степень тяжести (слабо выраженный, умеренный и тяжелый), а также исследовал состояние функциональных систем, вычислял баллы EDSS для рецидива. Только те рецидивы, которые были подтверждены лечащими врачами, считались пригодными для анализа эффективности терапии.

Изучались следующие показатели, связанные с рецидивом: ежегодная частота рецидивов (их число, разделенное на число дней в исследовании, умножалось на 365), срок до первого рецидива и доля больных с умеренным или тяжелым рецидивом.

Изучение других показателей

Оценивались связанные с PC применение стероидов и госпитализации. Ежегодно проводилась МРТ. У 125 больных (v 61 из группы, получавшей плацебо, и у 64, которым вводился интерферон бета-1b) МРТ выполнялась ежемесячно в период с 0 по 6 месяцы и с 18 по 24 месяцев, при этом обязательно использовались T1-взвешенные сканы с контрастированием гадолинием. Магнитно-резонансные томограммы анализировались в едином учреждении, причем каждый год оценивался объем поражения и появление новых активных патологических очагов.

При регулярных обследованиях у больных проводили анализ на нейтрализующие антитела к интерферону бета-1b с помощью теста с протеином МхА [13]; анализ считался положительным при двух последовательных титрах 1:20 или более.

О степени безопасности приема препарата судили по неблагоприятным реакциям, по функции жизненно важных органов, а также по данным физикального обследования и необходимости в назначении других препаратов. Стандартные лабораторные анализы проводились в центральной лаборатории при каждом очередном посещении врача. Электрокардиографию выполняли в начале и в конце исследования. При каждом ежеквартальном обследовании для оценки изменений настроения и риска суицида применялась шкала рейтинга депрессии по Montgomery и Asberg (Montgomery Asberg Depression Rating Scale — MADRS) [14], которая основывается на наблюдениях врача.

Статистический анализ

Общее количество больных, необходимое для исследования, было определено, исходя из допущения, что доля пациентов с подтвержденным прогрессированием в группе, получавшей плацебо, через 3 года составит 50%. Ожидалось, что терапевтическая разница 12,5% будет выявлена с помощью двустороннего логарифмического-рангового теста (log-rank test) при а=0,029 и мощности 80% при использовании метода Pocock для поправки на запланированный промежуточный анализ. Требовалось 355 больных на каждую группу, с учетом поправки на ожидаемые 20% потерь больных. Поправка а для промежуточного анализа эффективности позднее основывалась на адаптации по DeMets к «затратам a» [a spending] (а=0,048 для конечного анализа и а=0,0133 для промежуточного анализа, принимая за информационную фракцию 83% данных EDSS). Весь статистический анализ основывался на популяции, которую предполагалось пролечить, включая все данные о всех рандомизированных пациентах без каких-либо ограничений.

Читайте также:  Сдать анализы на антитела герпеса

Исходные характеристики анализировались с помощью рангово-суммарного теста (rank-sum test) по Wilcoxon для сравнения порядковых (ordinal) и непрерывных показателей, и с помощью теста точности по Fisher для сравнения дихотомичных или непорядковых (non-ordinal) категорийных переменных.

Показатели эффективности анализировались посредством непараметрических методов, учитывающих нелинейность шкалы EDSS [6]. Основной метод оценки срока, прошедшего до подтвержденного прогрессирования, был анализ ковариации (covariапсе) [15] с поправкой на центр (т.е., на клинику, где проводилось исследование) и на исходный балл EDSS. Применялась также стратификационная поправка на центр. Логарифмические-ранговые баллы для оценки информации по наблюдению за больными после подтвержденного прогрессирования сравнивались между группами с использованием расширенного таста по Mantel-Haenszel со стратификационной поправкой на центр.

Производилась оценка выживаемости больных, при этом их группы, получавшие разные препараты, сравнивались между собой с помощью логарифмического-рангового теста Mantel-Cox, стратифицированного для исходных категорий EDSS (£3,5, 4,0-5,5 и ≥ 6). Соотношение различия оценивалось путем использования «кусочной» (piecewise) модели логистической регрессии, включающей факторы, кроме лечения: исходный балл EDSS, исследовательский центр и время [16]. В расширенные модели включались такие факторы, как продолжительность PC, возраст, пол и площадь поверхности тела, при этом проверялось их взаимодействие с лечением. Было также изучено прогрессирование, подтвержденное спустя 3 и 6 месяцев, независимо от сопутствующих рецидивов. Другие показатели эффективности анализировались по таким тестам, как тест Mantel-Haenszel, расширенный тест Mantel-Haenszel или логарифмический-ранговый тест Mantel-Cox с поправкой на исходный балл EDSS, а также на рецидив до начала исследования, исходную картину МРТ или на то, какой исследовательский центр наблюдал данного больного (таблица 1).

Продольный (longitudinal) анализ с обобщающими оценочными уравнениями применялся для того, чтобы ответить на вопрос, связано ли появление нейтрализующих антител с ослаблением эффекта лечения [17]. Как для построения таблиц, так и для проведения анализа использовалась программа SAS (версия 6,12).

Таблица 1. Основные статистические методы.

Показатель эффективности Статистические методы Стратификация/ поправка на коварианты Подтверждающее моделирование
Срок до подтвержденного прогрессирования Непараметрический анализ ковариантов (первичный)
Логарифмический-ранговый тест Mantel-Cox (вторичный)
Центр/Исходная EDSS

Исходная EDSS *

«Кусочная» (piecewise) логистическая модель
Срок до прикованности к креслу-каталке Логарифмический-ранговый тест Mantel-Cox Исходная EDSS *
Доля больных, которые стали прикованными к креслу-каталке Тест Mantel-Haenszel Исходная EDSS * «Кусочная» (piecewise) логистическая модель
Ежегодная частота рецидивов Непараметрический анализ ковариантов Центр/Рецидив в предыдущие годы
Процентное изменения за год объема поражения на Т2 МРТ Непараметрический анализ ковариантов Центр/Исходный объем поражения
Число новых активных поражений в месяцы 1-6 и 19-24 Непараметрический анализ ковариантов Центр/Исходное число поражений
Доля больных с подтвержденным прогрессированием Тест Mantel-Haenszel Исходная EDSS * Логистическая модель
Изменение EDSS относительно исходного уровня Расширенный тест Mantel-Haenszel Исходная EDSS *
EDSS в конце исследования Расширенный тест Mantel-Haenszel Исходная EDSS *
Срок до первого рецидива Логарифмический-ранговый тест Mantel-Cox Центр
Доля больных с умеренным или тяжелым рецидивом Тест Mantel-Haenszel Центр
Доля больных, применяющих стероиды Тест Mantel-Haenszel Центр
Доля госпитализированных больных Тест Mantel-Haenszel Центр
Число связанных с PC госпитализаций на 1 больного Расширенный тест Mantel- Haenszel Центр

* Исходные категории EDSS : ≤ 3,5, 4,0-5,5 и ≥ 6. Поправка на центр — поправка на клинику, участвующую в исследовании. Результаты Популяция исследования

Как показано на схеме 1, 718 из 768 больных, выявленных в 32 европейских клинических центрах, рандомизированно распределялись на получение интерферона бета-1b (n[число больных]=360) или на прием плацебо (п=358). Среднее время наблюдения при промежуточном анализе равнялось 892 дням исследования в группе плацебо и 901 дню в группе интерферона бета-1b. Это составляло 85% информации по EDSS, которую ожидалось получить за 3 года проведения работы. Группы больных были сходны между собой по всем исходным показателям (таблица 2). Из них 57 пациентов (31 получавших плацебо [8,7%] и 26 принимавших интерферон бета-1b [7,2%]) вышли из исследования (таблица 3). Причины, по которым это произошло, существенно между группами не различались. В целом 130 больных (66 получавших плацебо и 64 принимавших интерферон бета-1b) прекратили лечение, но за ними продолжали наблюдение согласно протоколу (таблица 3). Суммарно 531 больной (группа плацебо 261 [72,9%], группа интерферона бета-1b 270 [75,0%] либо завершил 3 года терапии, либо все еще проходил лечение на момент промежуточного анализа (схема 1).

Cхема 1. Схема исследования.

Больше отклонений от протокола зафиксировано в группе плацебо (73 пациентов [23,5%], чем в группе интерферона бета-1b (58 больных [17,2%]. Причины для отклонений от протокола были одинаково распределены между группами. Исключение составило существенно более частое использование запрещенных медикаментов в группе плацебо (33 по сравнению с 15 пациентами в группе интерферона бета-1b, р=0,0071), в том числе: избыточные дозы стероидов, лечение иммунодепрессантами или явное для пациента (с открытой этикеткой) применение интерферона бета. Только 11 отклонений от протокола были связаны с определением EDSS.

Группы существенно различались по следующим причинам прекращения лечения: неблагоприятные эффекты на фоне терапии (плацебо 15 [4,2%], интерферон бета-1b 45 [12,5%]); неохотное сотрудничество больного с врачами или его отказ от лечения (плацебо 19 [5,3%], интерферон бета-1b 8 [2,2%]); неэффективность испытуемого медикамента, по мнению врача или пациента (плацебо 44 [12,3%], интерферон бета-1b 23 [6,4%]) — таблица 3.

Таблица 2. Популяция больных (исходные характеристики).

Плацебо (n=358)* Интерферон бета-1b (n=360)*
Средний возраст (СО, годы) 40,9 (7,2) 41,1 (7,2)
Женщины 64,2% 58,1%
Средняя продолжительность заболевания (СО, годы) 13,4 (7,5) 12,8 (6,6)
Средний срок после постановки диагноза PC с повышенным риском рецидивов (СО, годы) 8,2 (6,1) 8,1 (5,6)
Средний срок после появления признаков прогрессирующего ухудшения (СО, годы) 3,8 (3,4) 3,8 (2,7)
Средний срок после постановки диагноза ВП-РС (СО, годы) 2,1 (2,2) 2,2 (2,4)
Средняя исходная EDSS EDSS по категориям
≤ 3,5
4,0-5,5
≥ 6,0
5,2(1,1)
47(13,1%)
142 (39,7%)
169 (47,2%)
5,1(1,1)
67(18,6)
140 (38,9)
153 (42,5%)
Пациенты без рецидива в течение 2 лет перед исследованием** 101 (28,2%) 115(31,9%)

* Нет статистического различия между группами (р>0,05).
** Данные отсутствуют у 7 пациентов (4 в группе плацебо, 3 в группе, пролеченной интерфероном бета-1b), которые были включены в подгруппу больных без рецидива. СО — стандартное отклонение.

Таблица 3. Причины выхода из исследования и прекращения лечения.

источник

Не менее 3 часов после последнего приема пищи. Можно пить воду без газа.

Нейтрализующие антитела – антиинтерфероновые антитела, вырабатывающиеся в ответ на введение препаратов интерферона (ИФН). Влияние ИФН на клетки-мишени осуществляется в ходе их связывания с рецепторами на поверхности клеток. Нейтрализующие антитела (НАТ) препятствуют связыванию ИФН с рецепторами клетки-мишени. У НАТ-позитивных пациентов существенно снижается противовирусная и антипролиферативная активность ИФН, т.е. снижается эффективность терапии.

Показания к назначению исследования:

  • Неэффективность препаратов интерферона при длительном приеме.

Референсные значения: не обнаружено.

Обращаем Ваше внимание на то, что интерпретация результатов исследований, установление диагноза, а также назначение лечения, в соответствии с Федеральным законом ФЗ № 323 «Об основах защиты здоровья граждан в Российской Федерации», должны производиться врачом соответствующей специализации.

» [«serv_cost»]=> string(4) «2280» [«cito_price»]=> NULL [«parent»]=> string(2) «29» [10]=> string(1) «1» [«limit»]=> NULL [«bmats»]=> array(1) array(3) string(1) «N» [«own_bmat»]=> string(2) «12» [«name»]=> string(31) «Кровь (сыворотка)» > > >

Биоматериал и доступные способы взятия:
Тип В офисе
Кровь (сыворотка)
Подготовка к исследованию:

Не менее 3 часов после последнего приема пищи. Можно пить воду без газа.

Нейтрализующие антитела – антиинтерфероновые антитела, вырабатывающиеся в ответ на введение препаратов интерферона (ИФН). Влияние ИФН на клетки-мишени осуществляется в ходе их связывания с рецепторами на поверхности клеток. Нейтрализующие антитела (НАТ) препятствуют связыванию ИФН с рецепторами клетки-мишени. У НАТ-позитивных пациентов существенно снижается противовирусная и антипролиферативная активность ИФН, т.е. снижается эффективность терапии.

Показания к назначению исследования:

  • Неэффективность препаратов интерферона при длительном приеме.

Референсные значения: не обнаружено.

Обращаем Ваше внимание на то, что интерпретация результатов исследований, установление диагноза, а также назначение лечения, в соответствии с Федеральным законом ФЗ № 323 «Об основах защиты здоровья граждан в Российской Федерации», должны производиться врачом соответствующей специализации.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Copyright ФБУН Центральный НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, 1998 — 2019

Центральный офис: 111123, Россия, Москва, ул. Новогиреевская, д.3а, метро «Шоссе Энтузиастов», «Перово»
+7 (495) 788-000-1, info@cmd-online.ru

! Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

источник

Способ определения нейтрализующих антител в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета

Владельцы патента RU 2626832:

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета (ИФНβ). Для этого применяют цитопатический тест с использованием чувствительной к вирусу энцсфаломиокардита мышей (ЕМС) культуры клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ). Определение HAT к препарату ИФНβ проводят при помощи реакции нейтрализации антивирусной активности методом титрования сыворотки рефрактерного к лечению соответствующим препаратом пациента, определением HAT к препарату ИФНβ. Проводят культивирование клеток ФЛЭЧ в условиях 37±2°С в атмосфере CO2 5,0±0,5% и 90±5% влажности в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в течение 1 суток в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета в количестве 20-50 тыс.кл./яч. В день постановки теста разводят контрольную ЭТС и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз. Затем в ячейках круглодонного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в нсобогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕ/мл; в ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенные в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС. Инкубируют планшет 1 час в условиях CO2-инкубатора. Далее удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента. Проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов, далее в необогащенную сывороткой основу среды DMEM вносят вирус-индикатор ЕМС или VSV (вирус энцефаломиокардита мышей/вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана») в дозе составляющей 10 2±0,25 ТЦД50 в 0,1 мл. Проводят инкубирование в термостате 22-24 часа. Через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности сыворотки пациента по формуле: HAT (НЕ/мл)=А (МЕ/мл)×Z, где А (МЕ/мл) — максимальная нейтрализуемая активность препарата ИНФ-бета, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры ФЛЭЧ, выраженная в международных единицах на 1 мл; Z — разведение сыворотки пациента. Использование данного способа позволяет оценку эффективности лечения препаратами у пациентов, в течение длительного времени подвергавшихся лечению препаратами ИФНβ путем количественного определения ИНФβ нейтрализующих антител. 1 з.п. ф-лы, 3 пр., 2 табл.

Изобретение относится к иммунологии, медицине, а именно к лабораторной диагностике наличия и количественной оценки уровня нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом (PC), получавших терапию препаратами интерферона-бета (ИФНβ). Описанный способ исследования направлен на оценку эффективности лечения препаратами у пациентов, в течение длительного времени подвергавшихся лечению препаратами ИФНβ. Практическим результатом диагностической процедуры с использованием заявленного способа является коррекция выбранной схемы лечения по назначению/замене и количеству используемого препарата.

Рассеянный склероз (PC) — хроническое, этиологически мультифакториальное прогрессирующее демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы [1, 2]. Превентивная терапия, основанная на применении препаратов интерферона бета (ИФНβ) и используемая с 1990-х годов, позволила совершить поистине революционный переворот и изменить течение и прогноз этой болезни. Она проводится в период ремиссии и стабилизации (вне обострения PC) и нацелена на предупреждение обострений при прогрессировании инвалидизации, при ремиттирующем и вторично прогрессирующем течении болезни [1, 2, 3].

ИФНβ (1а и 1b), используемые в терапии PC, как продукты генноинженерных технологий, являются белковыми субстанциями. В этой связи они потенциально иммуногенны. HAT против ИФНβ возникают в результате нарушения иммунотолерантности, ассоциированной с процессами повторного представления антигена [2, 4]. Эффекторами иммунного ответа на введение терапевтических препаратов ИФНβ выступают т.н. нейтрализующие антитела (HAT), блокирующие активность молекул ИФН на этапе их связывания со специфическими рецепторами [5]. Сообщается, что HAT могут быть обнаружены в крови пациентов с PC, получающих ИФНβ, уже по прошествии 3-6 мес после инициации лечения [1, 4]. Частота их появления зависит от используемых препаратов ИФН-бета. Так, по данным Т.Е. Шмидт и Н.Н. Яхно (2010), HAT к ИФНβ-1b появляются у 28-45% больных, к ИФНβ-1а для подкожного введения — у 11-24%, а к ИФНβ-1a для внутримышечного введения — лишь у 2-5% пациентов [1, 2].

В различных публикациях сообщается, что у НАТ-позитивных пациентов с PC (особенно с высокими титрами) существенно снижается эффективность терапии ИФНβ [1, б].

Определение HAT является чрезвычайно трудоемким процессом, поскольку использование скрининг-исследований на основе методы ELISA, белкового иммуноблота, радиоиммунопреципитации или аффинной хроматографии не позволяет дифференцировать обнаруженную активность связывания ИФНβ между связывающими антителами (CAT) и HAT [1]. Поэтому выявление HAT основано на специфических функциональных клеточных тестах.

При исследовании HAT in vitro D. Hess и соавт. (2007, 2009) использовали тест, получивший название «индукции МхА» [1, 7, 8]. Этот метод позволяет определить способность HAT, присутствующих в сыворотке крови пациентов, к снижению ИФНβ-индуцированной экспрессии специфического маркера ИФН — МхА (в форме мРНК или на белковом уровне). МхА — это белок резистентности к миксовирусам. Предполагается, что мРНК маркера МхА является наиболее чувствительным показателем при исследовании HAT; он получает все большее распространение [1,4].

В настоящее время перспективным методом исследования является так называемое люциферазное исследование, основанное на использовании клеток фибросаркомы человека с внесенной люциферазной кассетой гена-репортера (при наличии HAT связывания молекулы ИФНβ с соответствующим рецептором и активации трансклеточного сигнального механизма с последующей транкрипцией гена люциферазы не происходит) [1,9].

К традиционным методам определения активности HAT к ИФНα, β и γ относится биологическое тестирование путем титрования сыворотки пациента с ИФН-содержащим препаратом на газоне культуры клеток с последующей обработкой тест-вирусом и исследования эффектов цитопатических свойств патогена [10]. Практическое применение данного метода основано на владении основами техники культивирования клеток эукариот и вирусологических исследований.

Из уровня техники известны патенты с описанием лечебного эффекта ИФН-НАТ при системных заболеваниях аутоимунной природы.

Патент RU 2431638 «Моноклональные антитела против интерферона-альфа» описывает разработку фармакологического препарата HAT, которые избирательно нейтрализуют биоактивность по крайней мере двух подтипов белка интерферона-альфа (ИФНα). Антитела согласно изобретению эффективны для выявления подтипов ИФНα в образце или ткани и/или для терапевтического применения, включающего в себя лечение и/или улучшение состояния при связанных с ИФНα заболеваниях, таких как системная красная волчанка, диабет типа I, псориаз, СПИД и реакция «трансплантат против хозяина».

Читайте также:  Сдал анализ на антитела к вич

Аналогичное по направлению применения и способу реализации изобретение описано в патенте RU 2314317 «АНТИТЕЛА ПРОТИВ ИНТЕРФЕРОНА-АЛЬФА». Использование изобретения позволяет одновременно подавлять биологическую активность, по крайней мере, семи подтипов ИФНα человека, а именно ИФНα1, ИФНα2, ИФНα4, ИФНα5, ИФНα8, ИФНα10, ИФНα21, что может найти применение в диагностике и терапии различных заболеваний человека, опосредуемых ИФНα, таких как инсулинозависимый сахарный диабет или системная красная волчанка.

Наиболее близкий к заявленному способу определения ИФНβ-НАТ с использованием постоянной линии клеток фибросаркомы трансфецированных репортерной системой активности ИФНβ основан на измерении индуцированной экспрессии гена люциферазы и требует наличия специальных реактивов и оборудования [Lallemand С, Meritet J.F., Erickson R., et al., Quantification of neutralizing antibodies to human type I interferons using division-arrested frozen cells carrying an interferon-regulated reporter-gene, J. Interferon Cytokine Res., V. 28, N 6, 393-404, 2008].

Несмотря на возрастающую актуальность проблемы, в доступной базе данных отсутствуют патенты, связанные с описанием системам обнаружения HAT против лекарственных субстанций, обладающих потенциальной иммуногенностью.

Задача изобретения: своевременное выявление и количественное определение интерферон-нейтрализующих антител (ИФН-НАТ).

Технический результат изобретения: обеспечивается качественное и количественное определения ИНФβ нейтрализующих антител, основанное на оценке индуцированного тест-вирусом цитопатического эффекта в отношении чувствительных культур прикрепляемых клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) и бессывороточной линии клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки (Vero-SF).

Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлен способ определения нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета (ИФНβ), характеризующийся применением цитопатического теста с использованием чувствительной к вирусу энцсфаломиокардита мышей (ЕМС) культуры клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ), причем определение HAT к препарату ИФНβ проводят при помощи реакции нейтрализации антивирусной активности методом титрования сыворотки рефрактерного к лечению соответствующим препаратом пациента, определением HAT к препарату ИФНβ путем культивирования клеток ФЛЭЧ в условиях 37±2°С в атмосфере CO2 5,0±0,5% и 90±5% влажности в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в течение 1 суток в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета в количестве 20-50 тыс.кл./яч., а в день постановки теста разводят контрольную ЭТС и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз; затем в ячейках круглодонного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в нсобогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕ/мл; в ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенные в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС; инкубируют планшет 1 час в условиях СО2-инкубатора; удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента; проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов, далее в необогащенную сывороткой основу среды DMEM вносят вирус-индикатор ЕМС или VSV (вирус энцефаломиокардита мышей/вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана») в дозе, составляющей 10 2±0,25 ТЦД50 в 0,1 мл; проводят инкубирование в термостате 22-24 часа; через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности сыворотки пациента по формуле: HAT (НЕ/мл)=А (МЕ/мл)×Z, где: А (МЕ/мл) — максимальная нейтрализуемая активность препарата ИНФ-бета, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры ФЛЭЧ, выраженная в международных единицах на 1 мл; Z — разведение сыворотки пациента.

Способ может отличаться использованием чувствительных к вирусу везикулярного стоматита (VSV) клеток бессывороточной линии Vero-SF, причем в качестве среды культивирования клеток и последующего внесения вируса используют бессывороточную среду для прикрепляемых клеток Гибрис-1-П.

Изобретение реализуется за счет комбинированного введения сыворотки пациентов с ИФНβ в сосуды с чувствительными к ИФН клеточными культурами и последующей обработкой тест-вирусом. Наличие HAT в сыворотке блокирует активность ИФН и способствует цитодеструктивному поражению монослоя тест-культуры клеток. Таким образом, определение HAT к препарату ИФНβ связано с реакцией нейтрализации индуцируемой антивирусной активности методом биологического титрования с сывороткой рефрактерного к лечению соответствующим препаратом пациента. В целом заявленный способ определения нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета (ИФНβ), основан на применении цитопатического теста с использованием чувствительной к вирусу энцефаломиокардита мышей (ЕМС) культуры псеадолинии клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ). Проведенные авторами исследования показали, что использование чувствительных к вирусу везикулярного стоматита (VSV) клеток бессывороточной линии Vero-SF демонстрирует более точные и стабильные результаты теста при определении активности HAT.

С целью проведения теста определения HAT к препарату ИФНβ получают газон клеток тест-культуры (ФЛЭЧ, Vero-SF) путем посева и инкубации в течение 1 суток в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета 20-50 тыс.кл./яч в условиях (37±2)°С, атмосфере С02 (5,0±0,5)% и (90±5)% влажности, в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) для клеток ФЛЭЧ или Гибрис-1-П для клеток Vero-SF. В день постановки теста разводят контрольную (эмбриональную телячью — ЭТС) и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз; затем в ячейках круглодонного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в необогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕ/мл; в ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенных в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС; инкубируют планшет 1 час в условиях СО2-инкубатора; удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента; проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов. Для выявления/количественного определения ИФНβ-НАТ, в необогащенной сывороткой основе среды DMEM или бессывороточной среде Гибрис-1-П, вносят рабочую дозу тест-вируса или вируса-индикатора EMC/VSV (вирус энцефаломиокардита мышей/вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана»), составляющую 10(2±0,25) ТЦД50 в 0,1 мл; проводят инкубирование в термостате 22-24 ч; через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности в сыворотке пациента; при этом определяется максимальная концентрация препарата, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры в соответствие со схемой, представленной в Примере 1.

Определение HAT к препарату ИФНβ проводят при помощи реакции нейтрализации антивирусной активности методом биологического титрования с сывороткой рефрактерного к лечению соотв. препаратом пациента, с использованием культуры клеток псевдолинии ФЛЭЧ (фибробласты легких эмбриона человека). Для этого клетки ФЛЭЧ культивируют в условиях (37±2)°С в атмосфере СО2 (5,0±0,5)% и (90±5)% влажности в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) течение 1 сут в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета в количестве 20-50 тыс./яч. В день постановки теста разводят контрольную (эмбриональную телячью — ЭТС) и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз.

В ячейках круглодонного 96-луночного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в необогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕ/мл.

В ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенных в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС. Инкубируют планшет 1 час в условиях СО2-инкубатора. Удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента. Проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов.

Для выявления/количественного определения ИФНβ-НАТ, в необогащенной сывороткой основе среды DMEM вносится рабочая доза тест-вируса или вируса-индикатора EMC/VSV (вирус энцефаломиокардита мышей/вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана»), составляющая 10 (2±0,25) ТЦД50 в 0,1 мл. Проводится инкубирование в термостате 22-24 ч. Через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности в сыворотке пациента. При этом определяется максимальная концентрация препарата, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры ФЛЭЧ.

Общая схема титрования препарата ИФНβ с исследуемой сывороткой крови пациента представлена в Табл. 1.

Активность нейтрализующих антител в сыворотке пациента выражается ее нейтрализующей активностью (НА), выраженной в нейтрализующих единицах:

где А (МЕ/мл) — максимальная нейтрализуемая активность препарата ИНФ-бета, выраженная в международных единицах на 1 мл; Z — разведение сыворотки пациента (10 или 20-кратное).

Отличается использованием адаптированной бессывороточной линии клеток Vero-SF (ООО НПП «ПанЭко»). Поддержание линии и все манипуляции при исследовании проводят в специальной бессывороточной среде для прикрепляемых клеток «Гибрис-1-П» (ООО НПП «ПанЭко»). Использование постоянной линии Vero-SF позволяет максимально стандартизовать метод «цитопатического теста» в условиях контролируемого роста клеток в бессывороточной среде, а также отсутствия дополнительных интерферирующих и связывающих сывороточных субстанций ксеногенного происхождения. Наиболее близкий к заявленному способу определения ИНФ-бета-НАТ с использованием постоянной линии клеток фибросаркомы трансфецированных репортерной системой активности ИНФ-бета основан на измерении индуцированной экспрессии гена люциферазы и требует наличия специальных реактивов и оборудования [11].

В качестве тест-вируса для заражения клеток Vero-SF в бессывороточной среде «Гибрис-1-П» эффективен вирус везикулярного стоматита VSV (штамм «Индиана»).

Все манипуляции по нейтрализации препарата ИФНβ, индукции противовирусной резистентности клеток, инфекции тест-вирусом, учета результатов исследования проводят аналогично описанным в Примере 1.

Проводили исследование статуса ИФНβ-НАТ в сыворотке крови 28 больных PC, получавших длительное лечение препаратами ИНФ-бета.

У всех пациентов был поставлен диагноз PC, согласно обновленным критериям W.J. MacDonald в модификации 2010 г., (ремиттирующее течение у 23 пациентов, вторично-прогредиентное течение (ВПТ), у 5 в стадии неполной ремиссии заболевания. Все пациенты проходили лечение в неврологическом отделении Моники.

Результаты объективного неврологического обследования оценивались по общепринятой шкале клинической оценки функционального состояния проводящих систем при этом заболевании, предложенной J.Kurtzke, и шкале инвалидизации EDSS (Expanded Disability Status Scale). Пациенты: женщины n=16, мужчины n=12, с продолжительностью болезни 7,63±4,87 лет, легкой и в основном средней степени тяжести ремиттирующего течения (EDSS в ремиссии в среднем составила 2,96±1,14 баллов); тяжелой степени при ВПТ (EDSS 6,2±0,27 баллов).

Пациенты получали препараты рекомбинантного ИФНβ-1b в дозе 8-9 млн ME. Все пациенты были разделены на 3 группы в зависимости от продолжительности приема препарата: 1 группа — 0.5-1 год; 2 группа — 1-2 года; 3 группа — более 2 лет.

Проведено определение содержания HAT в сыворотках пациентов по результатам реакции нейтрализации антивирусной активности препарата ИФНβ методом цитопатического теста. Оценку анти-ИФНβ нейтрализующей активности (НА) в сыворотках пациентов проводили параллельно на клеточных культурах ФЛЭЧ и Vero-SF и измеряли в нейтрализующих единицах (НЕ/мл) (см. Пример 1). Результаты определения статуса ИНФβ-НАТ у пациентов всех 3 групп представлены в Табл. 2.

Данные нашего исследования показывают, что вероятность образования специфических HAT и их содержание в сыворотке периферической крови пациентов увеличивается в течение более длительного применения ИФНβ препаратов. В связи с этим определение статуса ИФНβ-НАТ является важным критерием оценки эффективности ИФН-терапии при PC.

С точки зрения патентной ценности в рамках заявки на изобретение, полученные результаты демонстрируют высокую сходимость результатов цитопатического теста для систем тестирования использующих диплоидные клетки ФЛЭЧ и бессывороточную культуру постоянной клеточной линии Vero-SF. Отмечено, что использование бессывороточной системы тестирования обеспечивает более высокие показатели нейтрализующей активности сыворотки пациентов при низких титрах лекарственного препарата ИФНβ. Это, очевидно, связано с увеличенным временем репликации вируса в клетках бессывороточной культуры Vero-SF. Вместе с тем линия клеток приматов Vero-SF является наиболее удобным инструментом вследствие неограниченной способности к пассированию в контролируемых условиях бессывороточного культивирования.

1. Б.И. Бурсагова, и др., Проблема нейтрализующих антител в терапии рассеянного склероза, Педиатрическая фармакология, т. 8, №5, 61-64, 2011.

2. Шмидт Т.Е., Яхно Н.Н. Рассеянный склероз: руководство для врачей. 2-е изд. — М.: МЕДпресс-информ, 2010. — 272 с.

3. Damal К., Stoker Е., Foley J.F. Optimizing therapeutics in the management of patients with multiple sclerosis: a review of drug efficacy, dosing, and mechanisms of action. Biologies, V. 7, 247-258, 2013.

4. Sorensen P.S. Neutralizing antibodies against interferon-beta, Ther. Adv. Neurol. Disord. — 2008; 1: 62-78.

5. Noronha A., Neutralizing antibodies to interferon, Neurology, V. 68, N 12, 16-22, 2007.

6. Bertolotto A., Capobianco M, Amato MP, et al., Guidelines on the clinical use for the detection of neutralizing antibodies (NAbs) to IFN beta in multiple sclerosis therapy: report from the Italian Multiple Sclerosis Study group, Neurol. Sci., V. 35, N 2, 307-16, 2014.

7. Hesse D., Sorensen P. S. Using measurements of neutralizing antibodies: the challenge of IFN-beta therapy, Eur. J. Neurol., V. 14, 850-859, 2007.

8. Hesse D., Sellebjerg F., Sorensen P.S. Absence of MxA induction by interferon beta in patients with MS reflects complete loss of bioavailability, Neurology, V. 73, 372-377, 2009.

9. Farrell, R., Espasandin, M., Lakdawala, et al., Incorporation of an interferon-beta neutralizing antibody assay into routine clinical practice. Mult. Scler., V. 17, 1333-1340, 2011.

10. Massart C, Gibassier J., Oger J., et al., Neutralizing antibodies to interferon beta in multiple sclerosis: analytical evaluation for validation of a cytopathic effect assay. Clin. Chim. Acta, V. 377, 185-191, 2006.

1. Способ определения нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета (ИФНβ), характеризующийся применением цитопатического теста с использованием чувствительной к вирусу энцсфаломиокардита мышей (ЕМС) культуры клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ), причем определение HAT к препарату ИФНβ проводят при помощи реакции нейтрализации антивирусной активности методом титрования сыворотки рефрактерного к лечению соответствующим препаратом пациента, определением HAT к препарату ИФНβ путем культивирования клеток ФЛЭЧ в условиях 37±2°С в атмосфере CO2 5,0±0,5% и 90±5% влажности в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в течение 1 суток в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета в количестве 20-50 тыс.кл./яч., а в день постановки теста разводят контрольную ЭТС и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз; затем в ячейках круглодонного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в нсобогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕ/мл; в ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенные в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС; инкубируют планшет 1 час в условиях CO2-инкубатора; удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента; проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов, далее в необогащенную сывороткой основу среды DMEM вносят вирус-индикатор ЕМС или VSV (вирус энцефаломиокардита мышей/вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана») в дозе, составляющей 10 2±0,25 ТЦД50 в 0,1 мл; проводят инкубирование в термостате 22-24 часа; через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности сыворотки пациента по формуле HAT (НЕ/мл)=А (МЕ/мл)×Z, где А (МЕ/мл) — максимальная нейтрализуемая активность препарата ИНФ-бета, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры ФЛЭЧ, выраженная в международных единицах на 1 мл; Z — разведение сыворотки пациента.

2. Способ по п. 1 отличающийся использованием чувствительных к вирусу везикулярного стоматита (VSV) клеток бессывороточной линии Vero-SF, причем в качестве среды культивирования клеток и последующего внесения вируса используют бессывороточную среду для прикрепляемых клеток Гибрис-1-П.

источник